Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym
5 czerwca 2026
Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.
Nasze badania analizują epigenetyczny skład domen pakujących chromatynę oraz to, jak czynniki regulacyjne kształtują ich strukturę i funkcję. Protokół ten jest najbardziej przydatny do badania relacji przestrzennych między celami a gęstymi środowiskami komórkowymi, takimi jak jądro. Na początek zważ albuminę surowicy bydłej, tak aby końcowe stężenie w wymaganej objętości buforowej dla eksperymentu wynosiło 3%. Dodaj albuminę surowicową do probówki wirówki.
Przechyl rurkę wirówki pod kątem 45 stopni, aby rozprowadzić kryształy albuminy surowicy bydlęcej, a następnie dodaj PBS do probówki. Zapobiega to zlepianiu się kryształów. Pozwól wszystkim kryształom albuminy surowicy bydłego rozpuścić się naturalnie w temperaturze pokojowej i unikaj wstrząsania lub wirowania.
Po całkowitym rozpuszczeniu kryształów dodaj Triton X-100, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2%. Jeśli kryształy pozostają, pipetuj roztwór w górę i w dół kilka razy, aby powoli mieszać roztwór, nie tworząc pęcherzyków. Weź żywe komórki z inkubatora. Usuń pożywkę z pożywki komórkowej z naczynia.
Umyj komórki, dodając tyle PBS, by je pokryć, a następnie pipetuj PBS. Następnie pipetować tyle roztworu utrwalającego, aby pokryć komórki i pozostawić je do utrwalenia przez 10 minut. Za pomocą wagi zważ borowodnikiem sodu, aby przygotować roztwór kalący o stężeniu 0,1%.
Dodaj borowodnik sodu do rurki wirówki. Wyciągnij pipetą roztwór utrwalacza z naczynia. Następnie dodaj do naczynia tyle PBS, aby pokryć powierzchnię komórki.
Umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki. Następnie dodaj wymaganą objętość PBS do borowodrówku sodu w rurce wirówki. Przekręć rurkę na worteks, aby wymieszać roztwór hartujący.
Wyjmij miskę z shakera i wyrzuć PBS z naczynia. Dodaj tyle roztworu hartującego, by pokryć powierzchnię naczynia. Następnie umieść talerz na shakerze na siedem minut, aby stłumić autofluorescencję w komórkach.
Resztę roztworu hartującego w rurce wirówki wyrzuć do odpowiednio oznakowanego pojemnika na ciekłe odpady chemiczne. Wyjmij miskę z shakera, a następnie usuń z niej roztwór hartujący. Następnie dodaj tyle PBS do naczynia, by pokryć powierzchnię.
Umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki. Po wysybaniu usuń PBS i powtórz mycie z PBS jeszcze dwa razy. Teraz dodaj wystarczająco dużo bufora blokującego do naczynia, aby pokryć powierzchnię.
Inkubuj naczynie na shakerze przez co najmniej godzinę, aby przeniknąć błony komórkowe i zablokować miejsca wiązania. Aby przygotować pierwotny roztwór do barwienia przeciwciał, należy przenieść wymaganą objętość buforu blokującego do nowej rurki wirówki. Dodaj wymaganą objętość pierwotnego zapasu przeciwciał do buforu blokującego, aby uzyskać końcowe stężenie określone przez producenta.
Następnie wymień bufor blokujący wystarczającą ilością pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała, aby pokryć powierzchnię naczynia i inkubuj na shakerze przez jedną do dwóch godzin lub przez noc. Po inkubacji pierwotnych przeciwciał zastąpi pierwotny roztwór przeciwciał buforem do płukania. Następnie umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki.
Powtórz mycie bufora do prania jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy prania. Przygotuj wtórny roztwór barwienia przeciwciał zgodnie z zalecanym stężeniem. Oblicz całkowitą objętość roztworu barwienia, dodając 0,5 mililitra do objętości potrzebnej do pokrycia komórek.
Przenieś obliczoną objętość z bufora blokującego do nowej rurki wirówki, aby przygotować roztwór barwiący. Następnie dodaj odpowiednią objętość zapasu przeciwciał wtórnych do buforu blokującego, aby uzyskać właściwe końcowe stężenie. Owiń rurkę wirówki zawierającą wtórny roztwór do barwienia przeciwciał folią aluminiową i wymieszaj roztwór przez pipetowanie w górę i w dół.
Dodaj do naczynia wystarczająco dużo wtórnego roztworu przeciwciała, aby pokryć powierzchnię. Umieść miskę na shakerze na 40 minut, aby przywiązać fluorofory do oznaczonych celów komórkowych. Przykryj miskę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluoroforem.
Po 40 minutach wykonaj dwa mycia PBS, jak pokazano wcześniej. Jeśli preferowane jest przechowywanie, dodaj do talerza wystarczająco dużo PBS, aby pokryć powierzchnię komórki przed przechowywaniem. Owiń naczynie parafilmem, aby zapobiec parowaniu cieczy, a następnie folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluoroforem.
Przechowywać zapakowane naczynie w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu przygotowania do zdjęcia. Protokół sekwencyjnego barwienia wygenerował reprezentatywne trójkolorowe obrazy chromatyny dSTORM dla wielu linii komórkowych, w tym komórek BJ Fibroblast, HeLa oraz MCF 10A. Pipeline analityczny został oceniony na podstawie symulowanych zbiorów danych reprezentujących normalne, jednolite rozkłady przestrzenne toroidalne i losowe zakotwiczone w pozycjach klastrów heterochromatycznych.
Wyraźne wzorce organizacji przestrzennej powodowały charakterystyczne profile histogramów odległości, gdy współrzędne lokalizacyjne analizowano względem centroidów heterochromatycznych. Symulowane przestrzennie segregowane markery w normalnej konfiguracji naczyniówki powodowały minimalną gęstość stawów, co skutkowało płaskim profilem rozkładu. Symulowane nakładające się wzory markerów w normalnej konfiguracji losowej powodowały malejącą gęstość łączeń wraz ze wzrostem odległości od punktów odniesienia.
Identyfikacja domen heterochromatyny oparta na badaniu DB umożliwiła kategoryzację na małe, średnie i duże domeny w zależności od efektywnego promienia. Ilościowa analiza odległości wykazała, że polimeraza RNA II i H3K27ac lokalizowane są w pobliżu granic heterochromatyny w małych, średnich i dużych domenach. Analiza gęstości łącznej wykazała szczytową kolokalizację H3K27ac i polimerazy RNA II tuż poza granicami klastrów heterochromatyny.
Dzięki temu protokołowi badacze mogą badać pozornie nieuporządkowaną organizację chromatyny, aby zbadać związek między jej strukturą, elementami regulacyjnymi i wynikami funkcjonalnymi. Zgodnie z tą procedurą, różne analizy obliczeniowe oparte na obrazach lub chmury punktów mogą wyodrębnić ilościowe cechy strukturalne z danych przestrzennych, w zależności od zastosowanej metody obrazowania. Naukowcy mogą rozszerzyć tę metodę oznaczania, optymalizując dodatkowe markery i wykorzystując dane wielokanałowe, aby umożliwić bardziej zaawansowane i kompleksowe analizy.
Overview
This article presents a sequential immunolabeling protocol for robust three-color single molecule localization microscopy (SMLM) in dense nuclear environments, enabling high-fidelity imaging of chromatin components. The method includes optimized buffer formulations, fluorophore selection, and antibody validation strategies to minimize crosstalk and signal degradation. It is integrated with a computational analysis pipeline that uses localizations from one target as spatial anchors to quantify inter-target distances, local densities, and multi-label co-affinity. The protocol is demonstrated in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cells and supports detailed nanoscale spatial analysis of chromatin architecture.
Key Study Components
Area of Science
- Cell Biology
- Microscopy
- Chromatin Biology
Background
- Chromatin exhibits multiscale organization from nucleosomes to micron-scale domains, requiring high-resolution and specific imaging approaches.
- Single molecule localization microscopy (SMLM), particularly STORM, enables nanoscale mapping of epigenetic marks.
- Multi-label imaging in the nucleus faces challenges such as reduced antibody accessibility, non-specific binding, and fluorophore instability.
- Existing protocols often lack robustness in dense subcellular environments like the nucleus.
Purpose of Study
- To develop a sequential immunolabeling protocol optimized for high-density nuclear environments.
- To enable robust three-color SMLM with minimal crosstalk and reduced signal degradation.
- To integrate the protocol with a computational pipeline for quantitative spatial analysis of chromatin components.
- To provide a reproducible framework for multi-component imaging in dense subcellular environments.
Methods Used
- Sequential immunolabeling with optimized buffer formulations and fluorophore selection.
- Blocking with 3% BSA, fixation, and quenching with 0.1% sodium borohydride to reduce autofluorescence.
- Primary and secondary antibody incubations with washing steps to minimize non-specific binding.
- dSTORM imaging under buffered conditions to stabilize fluorophores.
- Computational analysis using localizations from one target as seed points to measure inter-target distances and joint densities.
- DB scan-based clustering to categorize heterochromatin domains by effective radius.
Main Results
- The protocol produced representative three-color dSTORM images in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cell lines.
- Simulated data showed distinct distance histogram profiles based on spatial organization of markers relative to heterochromatin centroids.
- RNA polymerase II and H3K27ac were localized near heterochromatin boundaries across small, medium, and large domains.
- Joint density analysis revealed peak colocalization of H3K27ac and RNA polymerase II just outside heterochromatin cluster boundaries.
- The analysis pipeline enabled quantification of structural features from spatial point cloud data derived from SMLM.
Conclusions
- The sequential immunolabeling protocol enables reliable, high-fidelity three-color SMLM in dense nuclear environments.
- Integration with computational analysis allows nanoscale quantification of chromatin spatial organization.
- The method provides a reproducible framework for studying spatial relationships between chromatin components and regulatory factors.
- Researchers can extend the approach by optimizing additional markers for comprehensive multi-target analysis.
- This protocol advances the investigation of chromatin structure-function relationships in native cellular contexts.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in chromatin research: achieving robust, multiplexed super-resolution imaging in the dense nuclear environment where antibody accessibility and signal stability are major limitations. By enabling quantitative nanoscale mapping of epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in epigenetic drug discovery. The integrated computational pipeline transforms raw localization data into actionable spatial metrics, supporting predictive confidence in early-stage target hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial relationships between chromatin marks, transcription factors, and heterochromatin to clarify mechanistic hypotheses in epigenetic regulation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible framework for multiplexed target co-localization studies in dense subcellular environments.
- Predictive Value: Quantifies nanoscale proximity and co-affinity between targets, supporting target prioritization based on spatial context and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, high-fidelity three-color SMLM data suitable for assay standardization and reproducibility assessment in nuclear target engagement studies.
- Scalability: Supports extension to additional markers via sequential labeling, enabling scalable multi-parameter chromatin architecture profiling.
- Analytical Output: Produces quantifiable spatial features such as inter-target distances, local densities, and joint density profiles for downstream screening hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of chromatin organization in disease-relevant cell models, linking epigenetic target modulation to structural outcomes.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase spatial insights with preclinical validation by providing consistent, quantifiable nuclear imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking of epigenetic targets through direct visualization of their nanoscale chromatin environment and regulatory neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, where spatial chromatin context informs target druggability and mechanism of action. It enables screening-ready assay development by delivering standardized, multiplexed nuclear imaging data with quantitative outputs. The computational pipeline provides analytics-ready spatial metrics that support cross-functional comparison of compound or genetic perturbations on chromatin architecture.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible three-color SMLM data with minimized crosstalk for reliable compound effect assessment in nuclear targets.
- Analytics: Generates inter-target distance measurements, local density maps, and joint density profiles from localization data to quantify spatial relationships.
- Translational Research: Connects nanoscale chromatin organization findings to preclinical continuity through standardized, quantifiable spatial readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for multi-target nuclear imaging applicable across chromatin-focused discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through direct nanoscale spatial mapping of chromatin components and regulators.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and signal fidelity in multiplexed nuclear SMLM via optimized blocking, antibody validation, and buffer formulations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing spatial context that predicts functional target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on validated chromatin localization and co-affinity with key regulatory elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, immunostaining, and point cloud analysis for accurate data interpretation.
- Dependent on SMLM-capable instrumentation and stable fluorophore selection compatible with sequential labeling and buffering conditions.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation, blocking efficiency, and quenching protocols to minimize batch variability.
- Involves adaptation considerations for different chromatin targets, including epitope accessibility and antibody penetration in fixed dense nuclei.
- Limited by the sequential nature of staining, which increases total protocol time and requires careful optimization to avoid target loss or signal degradation over multiple rounds.
