Name: Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj protokół sekwencyjnego immunoznakowania dla trójkolorowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki w gęstym jądrze komórkowym. Metoda umożliwia nanoskalową analizę przestrzenną chromatyny w komórkach BJ Fibroblast, HeLa i MCF 10A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez granty NIH U54CA268084, U54CA261694 i R01CA228272, granty National Science Foundation EFMA-1830961 i CBET-2430743 oraz wsparcie filantropijne od Roba i Kristin Goldman, pana Davida Sachsa oraz Christina Carinato Charitable Foundation.

<ol><li>Bond, C., Hugelier, S., Xing, J., Sorokina, E. M., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+DNA-PAINT+imaging+of+the+heterogeneity+of+late+endosome%2Flysosome+protein+composition%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%3A+The+Preprint+Server+for+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition.</a> bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).</li>
<li>Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-molecule localization microscopy.</a> Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).</li>
<li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).</li>
<li>Oddone, A., Vilanova, I. V., Tam, J., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+with+stochastic+single-molecule+localization%3A+concepts%2C+technical+developments%2C+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications.</a> Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Ricci, M. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+resolution+imaging+of+chromatin+in+pluripotency%2C+differentiation%2C+and+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming.</a> Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).</li>
<li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+reorganization+in+cells+from+diseased+fibrous+connective+tissue+in+response+to+altered+chemomechanical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues.</a> Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+characterization+of+the+hippo+signaling+pathway+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer.</a> Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+using+spectroscopic+single-molecule+localization+microscopy+with+optimal+spectral+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion.</a> Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).</li>
<li>Daugird, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+single+molecule+lattice+light+sheet+imaging+reveals+the+dynamic+relationship+between+nucleosomes+and+the+local+chromatin+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment.</a> Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).</li>
<li>Kant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transcription+and+epigenetic+reactions+synergistically+regulate+meso-scale+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization.</a> Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).</li>
<li>Esa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spectral+precision+distance+microscopy+of+chromatin+nanostructures+after+triple-colour+DNA+labelling%3A+a+study+of+the+BCR+region+on+chromosome+22+and+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome.</a> J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).</li>
<li>Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+HIV+in+infected+cells+with+FlAsH-PALM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).</li>
<li>Yushchenko, D. A., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+fluorescent+labels+for+far-field+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Far-Field+Optical+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy.</a> Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+rev+phys+chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopath%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li>
<li>Castells-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super+resolution+microscopy+reveals+how+elongating+RNA+polymerase+II+and+nascent+RNA+interact+with+nucleosome+clutches%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches.</a> Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protocols%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Nuebler, J., Fudenberg, G., Imakaev, M., Abdennur, N., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+organization+by+an+interplay+of+loop+extrusion+and+compartmental+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).</li>
<li>Davidson, I. F., Peters, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+folding+through+loop+extrusion+by+SMC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome folding through loop extrusion by SMC complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+cellular+complexity+with+transient+adapters+in+highly+multiplexed+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging.</a> Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).</li>
<li>Miron, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+arranges+in+chains+of+mesoscale+domains+with+nanoscale+functional+topography+independent+of+cohesin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin.</a> Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).</li>
<li>Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChromEMT%3A+Visualizing+3D+chromatin+structure+and+compaction+n+interphase+and+mitotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells.</a> Science. 357 (6349), eaag0025(2017).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+three-dimensional+chromatin+packing+domains+by+chromatin+scanning+transmission+electron+microscopy+%28ChromSTEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM).</a> Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).</li>
<li>Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+as+an+important+driver+of+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin as an important driver of genome organization.</a> Front Cell Dev Biol. 8, (2020).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+chromatin+imaging+and+analysis+platform+bridges+4D+chromatin+organization+with+molecular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function.</a> Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).</li>
<li>Li, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+chromatin+packing+domains+persist+after+RAD21+depletion+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D.</a> Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).</li>
<li>Mansisidor, A. R., Risca, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility%3A+methods%2C+mechanisms%2C+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights.</a> Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+topologically+associating+domains+with+ultra-low+resolution+Hi-C+data+by+graph+structural+entropy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy.</a> Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).</li>
<li>Szabo, Q., Bantignies, F., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genome+folding+into+topologically+associating+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of genome folding into topologically associating domains.</a> Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).</li>
<li>Satam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+technology%3A+current+trends+and+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing technology: current trends and advancements.</a> Biology. 12 (7), 997(2023).</li>
<li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-color+single-molecule+localization+microscopy+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin.</a> Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).</li>
<li>Almassalha, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+conformation%2C+gene+transcription%2C+and+nucleosome+remodeling+as+an+emergent+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system.</a> Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).</li>
<li>Yin, Y., Lee, W. T. C., Rothenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+data+mining+of+molecular+assemblies+in+multiplexed+high-density+super-resolution+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images.</a> Nat Comm. 10 (1), 119(2019).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+higher-order+chromatin+structures+at+different+epigenomic+states+in+single+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells.</a> Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).</li>
<li>Xu, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+higher-order+chromatin+structures+in+single+cells+using+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).</li>
<li>Otterstrom, J., Castells-Garcia, A., Vicario, C., Gomez-Garcia, P. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+how+histone+tail+acetylation+affects+DNA+compaction+within+nucleosomes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).</li>
<li>Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+buffer+for+repeatable+multicolor+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">An optimized buffer for repeatable multicolor STORM.</a> ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).</li>
<li>Weidner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+image-free+analysis+of+the+nano-organization+of+chromatin+and+other+biomolecules+by+single+molecule+localization+microscopy+%28SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM).</a> Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).</li>
<li>Nieves, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+evaluating+the+performance+of+SMLM+cluster+analysis+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms.</a> Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).</li>
<li>Hyun, Y., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+development+of+computational+cluster+analysis+methods+for+single-molecule+localization+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images.</a> Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).</li>
<li>Markaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nuclear+organization+of+transcription+and+DNA+replication%3A+a+topographical+marriage+between+chromatin+domains+and+the+interchromatin+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).</li>
<li>Gelléri, M., Sterr, M., Strickfaden, H., Cremer, C., Cremer, T., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Space-time+dynamics+of+genome+replication+studied+with+super-resolved+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+biochem%22%5BJournal%5D)">Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy.</a> Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+4D+nucleome%3A+Evidence+for+a+dynamic+nuclear+landscape+based+on+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).</li>
</ol>

Autorzy tego protokołu nie mają żadnych ujawnień ani konfliktów interesów.

Ten trzykolorowy protokół SMLM stanowi znaczący postęp w naszej zdolności do badania organizacji chromatyny w gęstym środowisku jądrowym. Sekwencyjne podejście do znakowania immunofluorescencji, połączone z analizą przestrzenną chmur punktów, która wykorzystuje szacunki lokalizacyjne jako punkty jako podstawę analizy, dostarcza naukowcom potężnego narzędzia do badania relacji nanoskalowych między różnymi modyfikacjami chromatyny a aktywną maszyną transkrypcyjną, które wcześniej były niewykrywalne za pomocą konwencjonalnych technik mikroskopii.
Strategia sekwencyjnego barwienia protokołu rozwiązuje fundamentalne wyzwania związane z obrazowaniem jądrowym z udziałem wielu celów. W przeciwieństwie do struktur cytoplazmatycznych lub związanych z membranami, które są stosunkowo rzadkie, cele chromatyny jądrowej występują w niezwykle dużej gęstości i nakładających się domenach przestrzennych. Nasze zmodyfikowane podejście blokujące, polegające na włączeniu surowicy z wtórnych przeciwciał po każdej rundzie znakowania, skutecznie zapobiega krzyżowej reakcji między parami przeciwciał, zachowując jednocześnie specyficzność docelową. Inkubacje nocne w temperaturze 4°C zapewniają pełne przenikanie przeciwciał w całej objętości jądrowej, co jest kluczowe dla osiągnięcia jednolitej gęstości znakowania niezbędnej do ilościowej analizy SMLM. Protokół ten niezawodnie generuje obrazy o rozdzielczości 15-20 nm na wielu liniach komórkowych, co czyni go szeroko stosowalnym w badaniach organizacji chromatyny.
Poniżej znajdują się wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów podczas sesji obrazowania. Jeśli jądra nie bielą, najprawdopodobniej przyczyną jest niewystarczająca intensywność lasera w próbce, co może być spowodowane niskim poziomem mocy lub nieprawidłowym kątem TIRF; w takim przypadku należy zdiagnozować problem poprzez sprawdzenie ustawienia lasera, zwiększenie mocy lasera i dokładne ustawienie kąta TIRF. Jeśli mrugnięcia w jądrze są bardzo rzadkie, ale pozostają stale jasne, oznacza to, że jądra nie zostały wystarczająco wybielone. Jeśli mrugnięcia są bardzo rzadkie, a jądra w ogóle nie są widoczne, najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest nieudane barwienie i należy sprawdzić odczynniki oraz przeciwciała przed powtórzeniem protokołu. Natomiast jeśli liczba mrugnięć jądrowych jest bardzo wysoka (co jest pożądane), potrzebny jest dłuższy czas wybielania, aż pojedyncze, dobrze rozdzielone mrugnięcia pojedynczych cząsteczek zostaną wizualnie rozpoznane. W konwencjonalnych eksperymentach SMLM odpowiednią gęstość znakowania można często oszacować za pomocą dobrze zdefiniowanych struktur odniesienia, takich jak mikrotubule; jednak chromatyna wykazuje wysoce zróżnicowaną organizację i brakuje jej jasno określonej struktury podstawowej, co utrudnia takie oszacowanie. Na podstawie optymalizacji empirycznej i wcześniejszych doświadczeń zapewniamy, że efektywna gęstość znakowania osiąga około 100 lokalizacji na μm², co umożliwia solidną rekonstrukcję domen pakowania chromatyny. W naszym protokole nie stosowaliśmy żadnych wskaźników powierniczych, ale zalecaliśmy, czy użytkownicy je mają. W naszych eksperymentach przesunięcia boczne pozostają w granicach 0,2 piksela (mniej niż ~5 nm), co można pominąć. Dlatego nie stosowaliśmy markerów powierniczych.
Wybór H3K9me3, H3K27ac oraz polimerazy RNA II dostarcza uzupełniających informacji o organizacji chromatyny na poziomie nanoskalowym. H3K9me3 służy jako idealne odniesienie przestrzenne, ponieważ tworzy dyskretne, dobrze zdefiniowane klastry reprezentujące konstytutywną heterochromatynę i można je wiarygodnie identyfikować za pomocą zautomatyzowanych algorytmów klastrowania. H3K27ac oznacza chromatynę związaną z wzmacniaczem, która aktywnie uczestniczy w regulacji genów, podczas gdy polimeraza RNA II bezpośrednio wskazuje miejsca aktywnej transkrypcji. Razem te trzy cele pozwalają zbadać, jak mechanizmy transkrypcyjne i modyfikacje chromatyny regulacyjnej organizują się względem obszarów heterochromatycznych w architekturze jądrowej.
Ramy analizy chmury punktów odpowiadają na kluczowe ograniczenia wcześniejszych badań organizacji chromatyny, umożliwiając kompleksową analizę przestrzenną w gęstych środowiskach jądrowych. Tradycyjne metody porównania parowego nie są w stanie uchwycić złożonych relacji przestrzennych, które pojawiają się, gdy wiele modyfikacji chromatyny współistnieje w tych samych obszarach jądrowych. Nasze podejście wykorzystuje wspólną analizę gęstości, aby ujawnić, gdzie H3K27ac i polimeraza RNA II współlokalizują się względem klastrów H3K9me3, dostarczając informacji ilościowych, których nie można uzyskać z oddzielnych eksperymentów dwukolorowych.
Reprezentatywne wyniki konsekwentnie pokazują spójny model organizacyjny, a nie ścisłą kompartmentalizację chromatyny. Zarówno H3K27ac, jak i polimeraza RNA II lokalizują się preferencyjnie na obrzeżach klastrów heterochromatyny w różnych rozmiarach domen, a pomiary ilościowe pokazują położenie w odległości do 10 nm od granic klastra, co wspiera ustalenia innych grup o podobnych metodach i modelach transkrypcji 23,28,35,45,46 . Analiza gęstości łącznej ujawnia, że aktywne mechanizmy transkrypcyjne i chromatyna związana z wzmacniaczami najczęściej łączą się w obszarach otaczających heterochromatyczne klastry. Wyniki te podważają proste modele separacji fazowej i wspierają zintegrowane zasady organizacyjne, w których różne modyfikacje chromatyny zachowują bliską odległość przestrzenną, zamiast tworzyć odrębne, oddzielne przedziały.
Modułowa konstrukcja protokołu umożliwia badanie różnorodnych pytań dotyczących biologii chromatyny poprzez podstawianie celów, zachowując jednocześnie te same ramy analityczne. Badania nad czasem replikacji mogą zastępować białka cyklu komórkowego, takie jak proliferacyjny antygen komórkowy jądrowy (PCNA) i mini chromosomowy maintenance (MCM), podczas gdy badania odpowiedzi na uszkodzenia DNA mogą koncentrować się na γH2AX i czynnikach naprawczych. Badania cyklu komórkowego mogą dotyczyć modyfikacji histonów zmieniających się podczas podziału, a badania różnicowania mogą koncentrować się na znakach epigenetycznych związanych z zaangażowaniem w linię genetyczną. Podejście sekwencyjnego oznaczania uwzględnia dowolną kombinację białek jądrowych lub modyfikacji chromatyny, dla których istnieją wiarygodne przeciwciała, ograniczone głównie przez zgodność spektralną i czynniki krzyżowej reaktywności. Ta elastyczność pozwala badaczom rozwiązywać fundamentalne pytania dotyczące dynamiki chromatyny podczas różnych procesów komórkowych, jednocześnie zachowując możliwości ilościowej analizy przestrzennej.

Pojawienie się mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) umożliwiło bezprecedensowe badania struktur biologicznych na skali nanometrów 1,2,3,4,5. Poza obrazowaniem pojedynczym celem, rozszerzenie na wielokolorowe SMLM jeszcze bardziej rozwinęło tę dziedzinę, umożliwiając jednoczesną wizualizację wielu gatunków molekularnych, a także relacji przestrzennych i czasowych między strukturami subdyfrakcyjnymi 6,7,8,9,10,11 . Jednak zastosowanie multipleksowanego SMLM do obficie rozmieszczonych modyfikacji histonowych pozostaje wyzwaniem ze względu na gęsty, polimerowy charakter DNA jądrowego oraz ograniczoną dostępność przeciwciał w tym środowisku 12,13,14,15,16,17,18.
Chromatyna wykazuje hierarchiczną, wieloskalową organizację obejmującą kilka rzędów wielkości długości, od zespołów nukleosomów na skalę nanometrów po architekturę jądrową w skali mikrometrów. Na największych skalach chromosomy zajmują odrębne terytoria chromosomowe, w ramach których genom jest dalej podzielony na przedziały A/B oraz domeny topologicznie powiązane (TAD), które ograniczają długotrwałe interakcje regulacyjne poprzez mechanizmy takie jak wyciąganie pętli 19,20,21,22. Na skalach poniżej 200 nm chromatyna jest zorganizowana jako nieuporządkowany polimer złożony z heterogenicznych domen pakujących (PD), a nie z oddzielnych bloków euchromatyny i heterochromatyny, przy czym obszary aktywne transkrypcyjne preferencyjnie lokalizują się na granicach PD 23,24,25,26,27,28,29. Na najmniejszych skalach (5-20 nm) chromatyna składa się z nieregularnych zespołów nukleosomów i zgęsków nukleosomów, co podkreśla brak jednolitego motywu fałdowania wyższego rzędu i podkreśla emergentny, zależny od skali charakter organizacji genomu 24,26,30. Dzięki szybkiemu rozwojowi metod opartych na sekwencjonowaniach, takich jak sekwencjonowanie immunoprecipitacji chromatyny oraz wysokoprzepustowe wychwytywanie konformacji chromatyny 19,30,31,32,33, zidentyfikowano różne cechy struktur organizacyjnych mezoskalowych chromatyny31,32. Jednak te techniki, w przeciwieństwie do obrazowania, nie rejestrują geometrii przestrzennej, którą obserwuje się dopiero po rozwiązaniu tych struktur. Metody mikroskopii elektronowej, takie jak chromatynowa mikroskopia elektronowa (ChromEM24) oraz chromatynowa skaningowa transmisja elektronowa (ChromSTEM25), wykazały, że chromatyna jest heterogeniczna i zorganizowana w domeny pakowania w skalach długości 50-200 nm 25,28,29. Chociaż techniki te umożliwiają imponującą rozdzielczość identyfikacji domen pakowania chromatyny, nie zapewniają molekularnie specyficznego mapowania, które oferuje SMLM. Gromadzenie punktów DNA do obrazowania w topografii nanoskalowej (DNA-PAINT22) oraz wieloklarna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)19umożliwiają wysokie multipleksowanie; jednak DNA-PAINT jest silnie wpływany przez podwyższony szum tła wynikający z losowych zdarzeń wiązania w środowisku jądrowym bogatym w oligonukleotydy12,34, podczas gdy tradycyjne metody FISH oparte na denaturacji termicznej wymagają zakłócenia natywnego fałdowania chromatyny. Wcześniejsze badania stosowały techniki obrazowania superrozdzielczości do badania chromatyny na tej skali długości i zidentyfikowały hybrydowy skład domen pakowania, w przeciwieństwie do wcześniejszych modeli separacji fazowej 12,23,34,35. Protokół ten wynika z wcześniej opublikowanego artykułu omawiającego biologiczne znaczenie tych odkryć34. Dlatego, dzięki wysokiej rozdzielczości i możliwościom multipleksowania, dSTORM oparty na barwieniu immunobarwnym pozostaje najbardziej opłacalną strategią do obrazowania wielokolorowej chromatyny w warunkach niemal naturalnych.
Protokół ten nie jest pierwszym, który wykazał znakowanie większej liczby niż dwóch celów jądrowych, a wcześniejsze badania oznaczały poszczególne kompleksy białkowe lub geny jako12,36. Pomimo skutecznego oznaczania modyfikacji histonów posttranslacyjnych nukleosomów, wielokolorowe znakowanie, obrazowanie i analiza SMLM w kolorowej chromatynie stanowią poważne wyzwania. Po pierwsze, immunobarwienie w gęstym środowisku chromatynowym wymaga optymalizacji stężenia przeciwciał, sekwencji inkubacyjnej oraz składu buforu, aby zapewnić odpowiednie przenikanie i wiązanie bez nadmiernego tła. Po drugie, konieczna jest kompleksowa analiza wielu znaków, ponieważ interakcje między euchromatyną, heterochromatyną i enzymami takimi jak polimeraza RNA prawdopodobnie wykraczają poza proste wykluczenia binarne. Do tej pory maksymalna liczba kolorów wykazanych w obrazowaniu chromatynowym dSTORM wynosi dwa: 18,37,38,39.
Przedstawiamy tutaj solidny protokół do obrazowania i analizy trójkolorowej chromatyny SMLM. Nasz sposób barwienia optymalizuje czas inkubacji przeciwciał i wykorzystuje ulepszone bufory obrazowania40do dłuższych sesji obrazowania dla wielu etykiet. Dodatkowo opisujemy potoki obliczeniowe do analizy odległości dwukolorowej oraz analizy gęstości łączeń trójkolorowych, umożliwiając ilościową charakterystykę zależności między heterochromatyną, euchromatyną a maszynami transkrypcyjnymi. W przeciwieństwie do wcześniejszych badań SMLM z dwukolorową chromatyną, które sugerowały rozdzielenie heterochromatyny i euchromatyny, obrazowanie trójkolorowej chromatyny ujawnia, że genom jest zorganizowany w domeny pakujące, przy czym euchromatyna i aktywna transkrypcja są lokalizowane na obrzeżach konstytutywnych rdzeni heterochromatyny34.
Protokół ten dostarcza społeczności powtarzalnych ram do wykonywania wielokolorowej chromatyny SMLM oraz ustala strategie analizy dostosowane do wielu funkcjonalnie sprzężonych celów jądrowych. Poprzez wypełnianie luk metodologicznych umożliwia systematyczne badanie organizacji domeny chromatyny na poziomie nadnukleosomalnym, uzupełniając podejścia sekwencjonowania i mikroskopii elektronowej, jednocześnie zachowując rodzimą architekturę jądrową. Ten artykuł jest rozszerzonym protokołem opublikowanego artykułu34.

<table><tbody><tr><td>Andor iXon Ultra 888 CCD mnożący elektrony;</td><td>Andor</td><td>DU-888U3-CSO-#BV&nbsp;</td><td>NA</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Używa się go do blokowania i mycia buforów. Nie przechowuj bufora blokującego opartego na BSA dłużej niż 1 miesiąc w wysokości 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., model MGL-FN-532 (532 nm) &nbsp;</td><td>PSU-H-LED &nbsp;</td><td>https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htm</td><td>NA</td></tr><tr><td>Spójna skrzynka laserowa OBIS (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm) &nbsp;</td><td>Spójność</td><td>1228877&nbsp;</td><td>Lasery kolimowały z 3&ndash; 10 kW/cm&sup3; średnia moc w próbce, minimum 10 000 klatek zebranych na kanał o długości fali with&nbsp; 10&ndash; 30&nbsp; MS&NBSP; czas nabycia.</td></tr><tr><td>DABCO (1,4-diazabicyklo-(2.2.2)-oktanowy)</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>NA</td></tr><tr><td>DBPS (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-136</td><td>NA</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Każda woda destylowana jest w porządku&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT (Ditiothreitol), 1M</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td>NA</td></tr><tr><td>Osiem dobrze komorowanych szkł osłonowych</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td>Może to być dowolna szklana płyta dna, ale objętości muszą być regulowane w zależności od naczynia.</td></tr><tr><td>Kozy antymyszy AF568</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11004</td><td>Stężenie wywarowe: 2 mg/mL Stabilność po oznakowaniu: 2&ndash; 3 dni</td></tr><tr><td>Kozy antykrólikowe AF647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21245</td><td>Stężenie zapasowe: 2 mg/mL Stabilność po oznakowaniu: 4&ndash; 5 dni</td></tr><tr><td>Kozi antyszczurzy A488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11006</td><td>Stężenie wywarowe: 2 mg/mL Stabilność po oznakowaniu: 2&ndash; 3 dni</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwotne H3K27ac</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-23516</td><td>Stężenie zapasowe: 1,0 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało główne H3K9me3 & nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB1769156</td><td>Stężenie w zapasie: 1,287 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Wysokoklarowna polimerpropylenowa stożkowa rurka 15 mL&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning &nbsp;</td><td>352096</td><td>Stosowany w roztworach utrwalających i chłodzących&nbsp;</td></tr><tr><td>Stożkowa rurka poli-propylenowa o wysokiej klarowności 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Używany do pracy 40 mL buforów blokujących i myjących</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl), 12M</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>NA</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E z systemem perfekcyjnej ostrości&nbsp;</td><td>NIikon</td><td>TI-DH 611392&nbsp;</td><td>Mikroskop odwrócony&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon SR APO TIRF, 100x powiększenie, 1,49 NA&nbsp;</td><td>Nikon</td><td><a href="https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series%C2%A0">https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series&nbsp; </a></td><td>NA</td></tr><tr><td>Zwykłe serum koziego</td><td>Abcam</td><td>AB7481-1002</td><td>Używam po pierwszej etykietie. Powinny być obecne w buforach blokujących i prających</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16 %&nbsp;</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15710</td><td>Stosuje się w roztworze utrwalającym, który powinien zostać zużyty w ciągu 2 tygodni od przygotowania. Chronić się przed światłem w kątach 4 i stopnie; C</td></tr><tr><td>Fosforanem buforowana sól fizjologiczna (PBS) 10X</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>NA</td></tr><tr><td>Pipette Tips 1000 uL</td><td>SureOne</td><td>02-707-404</td><td>Każda końcówka pipety jest w porządku, o ile odpowiednie dla objętości</td></tr><tr><td>RNAPII-PS2</td><td>Abcam</td><td>AB252855</td><td>Koncentracja w magazynie: 0,98 mg/mL</td></tr><tr><td>Borowodnik sodu</td><td>Thermo Fisher</td><td>S678-10</td><td>Używaj świeżego do chłodzenia bufora za każdym razem.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>A16037.36</td><td>NA</td></tr><tr><td>Siarczyn sodu</td><td>Sigma</td><td>S0505</td><td>NA</td></tr><tr><td>Triton X-100 10%</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>28314</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

A Multilabel Single Molecule Localization Microscopy Protocol for Investigation of Chromatin in the Dense Nuclear Environment

Mikroskopia superrozdzielcza znacznie rozwinęła naszą zdolność do badania struktur biologicznych poza granicą dyfrakcyjną, czyniąc ją niezbędną do badania gęsto upakowanych struktur jądrowych, takich jak chromatyna, lamina jądrowa oraz ciał jądrowych, takich jak jądrówki. Chromatyna wykazuje wieloskalową organizację – od nukleosomów o rozmiarze nanometrów po domeny mikronowe – co wymaga podejść do obrazowania zdolnego zarówno do wysokiej rozdzielczości, jak i specyficzności molekularnej. Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), szczególnie stochastyczna mikroskopia optyczna rekonstrukcji (STORM), umożliwia precyzyjne mapowanie znaków epigenetycznych, dostarczając kluczowych informacji o strukturze i funkcji chromatyny. Jednak obrazowanie wieloznaczne w środowisku jądrowym wiąże się z unikalnymi wyzwaniami, w tym zmniejszoną dostępnością przeciwciał, zwiększonym wiązaniem niespecyficznym oraz niestabilnością fluoroforów. Aby rozwiązać te problemy, przedstawiamy sekwencyjny protokół immunoznakowania zoptymalowany pod środowiska o wysokiej gęstości jądrowej, umożliwiający solidne trójkolorowe SMLM przy minimalnym przesłuchu i mniejszym pogorszeniu sygnału. Metoda ta obejmuje zoptymalizowane formułowania buforów, selekcję fluoroforu oraz strategie walidacji przeciwciał, aby zapewnić powtarzalne, wysokiej jakości znakowanie na wielu celach. Co ważne, integrujemy ten protokół z pipeline'em analizy obliczeniowej, który wykorzystuje lokalizacje z jednego celu molekularnego jako kotwicy przestrzenne (punkty zalążkowe) do ilościowego określania odległości między celami, lokalnych gęstości oraz wieloznacznej współafinity. Pozwala to na szczegółową analizę przestrzenną składników chromatyny na skali nano. Protokół ten służy jako powtarzalna rama do obrazowania wieloskładnikowego i analizy ilościowej w gęstych środowiskach subkomórkowych, oferując potężne narzędzie dla badaczy zajmujących się złożonymi architekturami jądrowymi, takimi jak chromatyna.

Reprezentatywne trójkolorowe obrazy chromatyny dSTORM
Proponowany protokół sekwencyjnego barwienia został przetestowany jako ważny dla różnych linii komórkowych, w tym fibroblastu BJ, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A itd. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne obrazy z komórek fibroblastu BJ, HeLa i MCF10A.
Walidacja pipeline'u analitycznego z wykorzystaniem symulowanych zbiorów danych 
Opracowanie protokołu fluorescencji immunofluorescencyjnej trójkolorowej wymagało stworzenia specjalistycznego podejścia obliczeniowego, zdolnego do obsługi złożoności wielocelowych danych nuklearnych SMLM (Rysunek 2A,2 B). Biorąc pod uwagę gęste środowisko chromatyny, gdzie wiele celów współistnieje w bliskości, wdrożyliśmy ramy analizy chmur punktów, które bezpośrednio przetwarzają współrzędne lokalizacyjne, a nie rekonstruują obrazy. To podejście wykorzystuje rozbudowane narzędzia do analizy klastrowania dostępne dla danych chmury punktów 40,41,42. Systematycznie oceniliśmy zdolność pipeline'u analitycznego do rozróżniania biologicznie istotnych wzorców przestrzennych za pomocą kontrolowanych, symulowanych zbiorów danych. Opracowano cztery typy rozkładów, aby reprezentować różne scenariusze organizacji chromatyny: rozkład normalny dla gęsto skupionych modyfikacji, rozkład jednolity dla wzorców rozproszonych, strefy wykluczenia modelujące toroidalne rozmieszczenie oraz rozkład losowy jako kontrola organizacyjna (Rysunek 2C). Te symulowane wzorce były zakotwiczone w prawdziwych pozycjach klastrów heterochromatyny uzyskanych na podstawie eksperymentalnych danych H3K9me3, zachowując realistyczne ograniczenia przestrzenne jądrowe. Ten framework analizy wykorzystuje klasteryzację DBSCAN (epsilon = 50 nm, minimum punktów = 3), która jest jedną z wielu metod analizy klastrowej w danych SMLM 40,41,42. Aby zapewnić prawidłowe parametry klasteryzacji, wcześniej opisaliśmy metodę optymalizacji dostosowaną do wykrywania domen pakowania chromatyny34. Prosimy pamiętać, że jako początkowy krok analizy użytkownicy będą musieli optymalizować parametry informujące o wyborze poprzez strukturę, środowisko i funkcję swojego celu. Tutaj granice klastrów są wyznaczane za pomocą obliczeń otoczki wypukłej, eliminując założenia dotyczące geometrii dziedziny. Nasza walidacja wykazała wyraźne rozróżnienie wszystkich symulowanych wzorców rozkładu za pomocą charakterystycznych profili histogramu odległościowego (Rysunek 2D). Każdy typ organizacji przestrzennej dawał charakterystyczne sygnatury podczas analizy lokalizacji względem centroidów heterochromatycznych. Analiza wspólnego zajmowania została przetestowana przy użyciu symulacji dual-markerów z kontrolowanymi relacjami przestrzennymi (Rysunek 2E). Przestrzennie segregowane markery (konfiguracja normalno-toroidalna) dawały minimalną gęstość łączeń, zgodnie z oczekiwaniami, co skutkowało płaskimi profilami rozkładu (Rysunek 2E). Nakładające się wzory markerów (konfiguracja normalno-losowa) powodowały malejącą gęstość łączeń wraz ze wzrostem odległości od punktów odniesienia, co odpowiadało teoretycznym przewidywaniom. Wyniki tych walidacji pokazują zdolność naszego frameworka do wykrywania i ilościowania zależności sprzężenia przestrzennego w złożonych zbiorach danych wielocelowych. Aby uzyskać więcej informacji na temat generowania tych symulowanych zbiorów danych, prosimy zapoznać się z pełną publikacją34.
Reprezentatywne wyniki analizy organizacji chromatyny
Wdrożenie naszego podejścia do analizy zwalidowanej w próbkach biologicznych ujawnia charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej, które można osiągnąć dzięki temu protokołowi. Wykorzystując komórki HeLa przetwarzane naszą metodą barwienia trójkolorowego dla H3K9me3, H3K27ac i polimerazy RNA II, demonstrujemy możliwości analityczne umożliwione przez tę metodę. Heterochromatyna H3K9me3 stanowi idealny system odniesienia, biorąc pod uwagę udokumentowane dowody na organizację koncentrycznej chromatyny w skali 200 nm z wcześniejszych badań superrozdzielczości 23,28,35. Analiza rozpoczyna się od identyfikacji domen heterochromatynowych na podstawie DBSCAN, które następnie są kategoryzowane według efektywnego promienia: małe domeny (25-40 nm), domeny średnie (40-80 nm) oraz duże domeny (80-253 nm). Ta stratyfikacja rozmiaru uwzględnia udokumentowaną heterogeniczność wymiarów domen pakujących DNA, ze średnimi domenami o promieniu około 80 nm25. Pomiary odległości wykorzystują okno przeszukiwania promienia klastra 1,5x (Rysunek 2B u góry) do rejestrowania sygnałów euchromatyny i polimerazy bliższych (Rysunek 3A,B).
Reprezentatywne wyniki pokazują, że zarówno H3K27ac, jak i polimeraza RNA II konsekwentnie lokalizują się blisko granic heterochromatyny we wszystkich kategoriach domen, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami 28,44 oraz modelami lokalizacji transkrypcji względem domen chromatynowych 23,35,45,46. Analiza ilościowa ujawnia średnie pozycje bardzo blisko peryferii domen: duże domeny wykazują H3K27ac na -1,0 nm oraz polimerazę RNA II na 8,4 nm od granic, podczas gdy mniejsze domeny wykazują porównywalne powiązania obwodowe z drobnymi różnicami pozycji. Pomiary te wskazują, że aktywne pierwiastki chromatyny koncentrują się na granicy między domenami represyjnymi a permissywnymi, a nie są całkowicie wykluczane. Wspólna analiza gęstości pokazuje zdolność protokołu do ujawniania sprzężenia przestrzennego między obiektami współoznaczonymi (rysunek 3C-F). Analiza względem domen heterochromatynowych wykazuje szczytową gęstość stawów występującą tuż poza granicami domen (r/r₀> 1), co wskazuje na preferencyjną współlokalizację polimerazy H3K27ac-RNA II w obszarach obwodowych (rysunek 3G-I). Wyniki te pokazują, jak ten proces barwienia i analizy może pomóc w badaniu złożonych relacji przestrzennych w gęstych środowiskach.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69868/69868fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Trzy kolorowe obrazy użytych komórek. Trójkolorowe zdjęcia (A) fibroblastu BJ, (B) HeLa i (C) MCF10A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69868/69868fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69868/69868fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Ramy analizy ilościowej dla organizacji przestrzennej celów względem klastrów heterochromatyny. (A) Pipeline analizy dla wielokanałowych danych SMLM wykorzystanych w tym badaniu. (B) Schemat obliczeń odległości do peryferii dla zidentyfikowanych klastrów heterochromatyny oraz metoda Joint Affinity Counting. Obie metody służą do ilościowego określenia układu dwóch celów względem struktury klastra heterochromatyny. (C) Przykładowe rozkłady rozpraszania wokół specyficznych klastrów heterochromatyny użyte w badaniu34 do określenia odrębnych organizacji biologicznych struktur docelowych (skupionych w domenie, ws wokół domeny, ws niepowiązanych i losowo rozmieszczonych). (D) Odległość do histogramu peryferyjnego dla centralnie skupionych, losowo rozmieszczonych i toroidalnie rozkładających się oraz (E) Krzywe powinowactwa wspólnego dla przypadków symulacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69868/69868fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69868/69868fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Ilościowe przestrzenne zależności markerów transkrypcji wokół domen histonowych. (A) Wyniki histogramu odległości do obwodów dla przykładowych danych biologicznych wieloznakowanych komórek HeLa. Dla małych (<40 nm), średnich (40-80 nm) i dużych (>120 nm) domen dla RNAPII i (B) H3K27ac względem klastrów H3K9me3. (C-E) Przykładowe obrazy dla trzech obrazów dSTORM komórek HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p), z obrazem wstawionym i powiększonym dla jednej domeny. (F) Otoczka wypukła (czerwona) pasująca do dziedziny przedstawionej w E, z strefą analizy na szaro. (G) Wykresy powinowactwa dla RNAPII względem H3K27ac i H3K27ac (H) względem RNAPII w analizie ROI dla wszystkich domen w danych średniej wielkości w zbiorze danych. (I) Wspólna gęstość RNAPII i H3K27ac w analizie ROI dla wszystkich średniej wielkości dziedzin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69868/69868fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Super-resolution microscopy has dramatically advanced our ability to interrogate biological structures beyond the diffraction limit, making it ...

Nasze badania analizują epigenetyczny skład domen pakujących chromatynę oraz to, jak czynniki regulacyjne kształtują ich strukturę i funkcję. Protokół ten jest najbardziej przydatny do badania relacji przestrzennych między celami a gęstymi środowiskami komórkowymi, takimi jak jądro. Na początek zważ albuminę surowicy bydłej, tak aby końcowe stężenie w wymaganej objętości buforowej dla eksperymentu wynosiło 3%. Dodaj albuminę surowicową do probówki wirówki.Przechyl rurkę wirówki pod kątem 45 stopni, aby rozprowadzić kryształy albuminy surowicy bydlęcej, a następnie dodaj PBS do probówki. Zapobiega to zlepianiu się kryształów. Pozwól wszystkim kryształom albuminy surowicy bydłego rozpuścić się naturalnie w temperaturze pokojowej i unikaj wstrząsania lub wirowania.Po całkowitym rozpuszczeniu kryształów dodaj Triton X-100, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2%. Jeśli kryształy pozostają, pipetuj roztwór w górę i w dół kilka razy, aby powoli mieszać roztwór, nie tworząc pęcherzyków. Weź żywe komórki z inkubatora. Usuń pożywkę z pożywki komórkowej z naczynia.Umyj komórki, dodając tyle PBS, by je pokryć, a następnie pipetuj PBS. Następnie pipetować tyle roztworu utrwalającego, aby pokryć komórki i pozostawić je do utrwalenia przez 10 minut. Za pomocą wagi zważ borowodnikiem sodu, aby przygotować roztwór kalący o stężeniu 0,1%.Dodaj borowodnik sodu do rurki wirówki. Wyciągnij pipetą roztwór utrwalacza z naczynia. Następnie dodaj do naczynia tyle PBS, aby pokryć powierzchnię komórki.Umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki. Następnie dodaj wymaganą objętość PBS do borowodrówku sodu w rurce wirówki. Przekręć rurkę na worteks, aby wymieszać roztwór hartujący.Wyjmij miskę z shakera i wyrzuć PBS z naczynia. Dodaj tyle roztworu hartującego, by pokryć powierzchnię naczynia. Następnie umieść talerz na shakerze na siedem minut, aby stłumić autofluorescencję w komórkach.Resztę roztworu hartującego w rurce wirówki wyrzuć do odpowiednio oznakowanego pojemnika na ciekłe odpady chemiczne. Wyjmij miskę z shakera, a następnie usuń z niej roztwór hartujący. Następnie dodaj tyle PBS do naczynia, by pokryć powierzchnię.Umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki. Po wysybaniu usuń PBS i powtórz mycie z PBS jeszcze dwa razy. Teraz dodaj wystarczająco dużo bufora blokującego do naczynia, aby pokryć powierzchnię.Inkubuj naczynie na shakerze przez co najmniej godzinę, aby przeniknąć błony komórkowe i zablokować miejsca wiązania. Aby przygotować pierwotny roztwór do barwienia przeciwciał, należy przenieść wymaganą objętość buforu blokującego do nowej rurki wirówki. Dodaj wymaganą objętość pierwotnego zapasu przeciwciał do buforu blokującego, aby uzyskać końcowe stężenie określone przez producenta.Następnie wymień bufor blokujący wystarczającą ilością pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała, aby pokryć powierzchnię naczynia i inkubuj na shakerze przez jedną do dwóch godzin lub przez noc. Po inkubacji pierwotnych przeciwciał zastąpi pierwotny roztwór przeciwciał buforem do płukania. Następnie umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki.Powtórz mycie bufora do prania jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy prania. Przygotuj wtórny roztwór barwienia przeciwciał zgodnie z zalecanym stężeniem. Oblicz całkowitą objętość roztworu barwienia, dodając 0,5 mililitra do objętości potrzebnej do pokrycia komórek.Przenieś obliczoną objętość z bufora blokującego do nowej rurki wirówki, aby przygotować roztwór barwiący. Następnie dodaj odpowiednią objętość zapasu przeciwciał wtórnych do buforu blokującego, aby uzyskać właściwe końcowe stężenie. Owiń rurkę wirówki zawierającą wtórny roztwór do barwienia przeciwciał folią aluminiową i wymieszaj roztwór przez pipetowanie w górę i w dół.Dodaj do naczynia wystarczająco dużo wtórnego roztworu przeciwciała, aby pokryć powierzchnię. Umieść miskę na shakerze na 40 minut, aby przywiązać fluorofory do oznaczonych celów komórkowych. Przykryj miskę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluoroforem.Po 40 minutach wykonaj dwa mycia PBS, jak pokazano wcześniej. Jeśli preferowane jest przechowywanie, dodaj do talerza wystarczająco dużo PBS, aby pokryć powierzchnię komórki przed przechowywaniem. Owiń naczynie parafilmem, aby zapobiec parowaniu cieczy, a następnie folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluoroforem.Przechowywać zapakowane naczynie w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu przygotowania do zdjęcia. Protokół sekwencyjnego barwienia wygenerował reprezentatywne trójkolorowe obrazy chromatyny dSTORM dla wielu linii komórkowych, w tym komórek BJ Fibroblast, HeLa oraz MCF 10A. Pipeline analityczny został oceniony na podstawie symulowanych zbiorów danych reprezentujących normalne, jednolite rozkłady przestrzenne toroidalne i losowe zakotwiczone w pozycjach klastrów heterochromatycznych.Wyraźne wzorce organizacji przestrzennej powodowały charakterystyczne profile histogramów odległości, gdy współrzędne lokalizacyjne analizowano względem centroidów heterochromatycznych. Symulowane przestrzennie segregowane markery w normalnej konfiguracji naczyniówki powodowały minimalną gęstość stawów, co skutkowało płaskim profilem rozkładu. Symulowane nakładające się wzory markerów w normalnej konfiguracji losowej powodowały malejącą gęstość łączeń wraz ze wzrostem odległości od punktów odniesienia.Identyfikacja domen heterochromatyny oparta na badaniu DB umożliwiła kategoryzację na małe, średnie i duże domeny w zależności od efektywnego promienia. Ilościowa analiza odległości wykazała, że polimeraza RNA II i H3K27ac lokalizowane są w pobliżu granic heterochromatyny w małych, średnich i dużych domenach. Analiza gęstości łącznej wykazała szczytową kolokalizację H3K27ac i polimerazy RNA II tuż poza granicami klastrów heterochromatyny.Dzięki temu protokołowi badacze mogą badać pozornie nieuporządkowaną organizację chromatyny, aby zbadać związek między jej strukturą, elementami regulacyjnymi i wynikami funkcjonalnymi. Zgodnie z tą procedurą, różne analizy obliczeniowe oparte na obrazach lub chmury punktów mogą wyodrębnić ilościowe cechy strukturalne z danych przestrzennych, w zależności od zastosowanej metody obrazowania. Naukowcy mogą rozszerzyć tę metodę oznaczania, optymalizując dodatkowe markery i wykorzystując dane wielokanałowe, aby umożliwić bardziej zaawansowane i kompleksowe analizy.

a-multilabel-single-molecule-localization-microscopy-protocol-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek przylegających przy użyciu tesselacji Voronoi danych z mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki, znanej objętości, rozmiaru genomu oraz etapu cyklu komórkowego.

Mapowanie bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Protokół ten zapewnia szczegółowe operacje dotyczące przygotowania próbek, zbierania danych oraz analizy widm fluorescencji wewnętrznej DNA.

Spektroskopowe obrazowanie cząsteczek DNA z użyciem kontrastu wewnętrznego

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Poznaj protokół sekwencyjnego immunoznakowania dla trójkolorowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki w gęstym jądrze komórkowym. Metoda umożliwia nanoskalową analizę przestrzenną chromatyny w komórkach BJ Fibroblast, HeLa i MCF 10A.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Przeglądaj więcej filmów