Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR

Protokół ten służy do mapowania i rozróżniania pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondriach kukurydzy. Technika ta obejmuje etap normalizacji RNA i minimalizuje wpływ niestabilnego pięcioma głównych trifosforanów, które utrudniają wyraźne rozróżnienie między pierwotnymi i przetworzonymi transkryptami. Oprócz mitochondriów kukurydzy metoda ta może być stosowana do plastydów i innych mitochondriów roślinnych.

Zacznij od zebrania 20 gramów rozwijających się ziaren do 50-mililitrowej rurki na lodzie. Przenieś ziarna do wstępnie schłodzonego moździerza i dodaj 10 do 20 mililitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego. Całkowicie zmiel jądra, dodaj więcej buforu ekstrakcyjnego i przefiltruj zmieloną tkankę przez dwie warstwy tkaniny filtracyjnej.

Odwirować filtrat w temperaturze 8 000 razy G przez 10 minut. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić filtrat. Odwirować probówkę o stężeniu 20 000 razy G przez 10 minut.

Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach buforu do płukania. Podziel zawiesinę na pięć 1,5 mililitrowych probówek wolnych od RNaz i odwiruj je w temperaturze 14 000 razy G przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i zamrozić osad mitochondrialny w ciekłym azocie.

Ekstrahuj mitochondrialne RNA za pomocą dostępnych w handlu odczynników zgodnie z instrukcjami producenta i skonfiguruj leczenie polifosfaazą RNA z pięcioma podstawowymi. Następnie odzyskaj RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Odczynnik używany do ekstrakcji RNA jest niebezpieczny.

Zawsze pracuj z nim pod wyciągiem i zawsze noś fartuch laboratoryjny i rękawice. Przygotuj dwie reakcje cyrkularyzacji, używając takich samych ilości pięciu mitochondrialnych RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą. Inkubuj obie reakcje w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin, a następnie odzyskaj samoligatowane RNA za pomocą wcześniej używanego zestawu do oczyszczania RNA.

Zacznij od przygotowania mieszaniny starterów o równym stosunku 26 SCRT i do siedmiu innych starterów odwrotnej transkrypcji. Zbierz dwa systemy reakcji odwrotnej transkrypcji zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i inkubuj je w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 50 minut. Aby znormalizować cDNA, przygotuj dwie reakcje PCR z tą samą objętością cDNA z pięciu głównych RNA poddanych działaniu polifosfatazy lub nietraktowanych i przeprowadź reakcję w warunkach termocyklingu opisanych w manuskrypcie.

Normalizacja przez dojrzałe rRNA 26S jest kluczowym krokiem do rozróżnienia między pierwotnymi i przetworzonymi transkryptami. Porównaj obfitość dwóch produktów PCR i, jeśli to konieczne, zoptymalizuj normalizację, dostosowując ilości matrycy cDNA. Przygotuj pary reakcji PCR z odpowiednimi objętościami znormalizowanego cDNA i parą rozbieżnych starterów, takich jak w pięciu pierwszych do trzech pierwszych połączeniach docelowych transkryptów i wykonaj PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Następnie użyj żelowego zestawu do odzyskiwania DNA, aby wyizolować widoczne prążki, które są amplifikowane przez zagnieżdżony PCR. Sklonować oczyszczone w żelu produkty PCR do wektora przy użyciu standardowych technik i przeprowadzić PCR kolonii w celu wybrania dodatnich klonów zawierających docelowe wstawki. Zsekwencjonuj produkty PCR i dopasuj dane sekwencjonowania do genomu mitochondrialnego kukurydzy za pomocą podstawowego narzędzia do wyszukiwania dopasowania lokalnego lub BLAST.

Wybierz organizm kukurydza i przeszukaj bazę danych kolekcja nukleotydów. Znajdź pięć liczb pierwszych do trzech węzłów pierwszych w kolistym transkryptie i określ pozycje pięciu pierwszych i trzech pierwszych końców transkryptu. Amplifikuj fragment DNA użyty do przygotowania sondy RNA i sklonuj go do poprzednio używanego wektora, który zawiera promotor T7, 17 par zasad przed miejscem insercji.

Oznacz sondy RNA za pomocą dig-11-UTP i przeprowadź hybrydyzację RNA przy użyciu komercyjnych zestawów. Rozróżnij pierwotne i przetworzone pięć pierwszych końców, porównując koliste produkty RT-PCR uzyskane ze znormalizowanych pięciu RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą. Następnie zaprojektuj ilościowe startery RT-PCR na podstawie wyników mapowania i zweryfikuj wyniki dyskryminacji za pomocą RT-PCR.

Gen COX-2 został wykorzystany jako przykład do zademonstrowania mapowania i dyskryminacji transkryptów mitochondrialnych kukurydzy za pomocą strategii opartej na cyrkulacyjnym RT-PCR. Znormalizowane cDNA użyto jako matryc do PCR, w wyniku czego uzyskano dwie wyraźne prążki amplifikowane z pięciu głównych próbek traktowanych polifosfatazą. Dwa prążki zostały nazwane COX-2 jeden i drugi odzyskane z żelu i sklonowane do wektorów.

Wyniki Colony PCR wykazały, że dodatnie klony zawierają insercje o zmiennej wielkości, co oznacza, że końce mają heterogeniczne pięć lub trzy pierwsze końce. Wyniki sekwencjonowania wykazały, że COX-2 jeden i drugi mają te same trzy pierwsze końce w 39 nukleotydach poniżej kodonu stop, podczas gdy ich pięć pierwszych końców znajduje się odpowiednio w 992 do 1, 030 i 1, 276 do 1, 283 nukleotydach przed kodonem start. Przeprowadzono hybrydyzację blot żelowych RNA w celu zweryfikowania wyników mapowania kołowego RT-PCR i wykryto dwa główne prążki o rozmiarach podobnych do COX-2, jeden i dwa.

Kolejna para rozbieżnych starterów została zaprojektowana w celu amplifikacji trzech i czterech prążków COX-2 wykrytych za pomocą plamy żelowej RNA, ale nie za pierwszym razem w okrągłym RT-PCR. Ilościowe wyniki RT-PCR potwierdziły, że COX-2 jeden, drugi, trzeci i czwarty były wrażliwe na pięć głównych polifosfataz i że miały pierwotne pięć głównych końców. Analizę rozszerzenia startera można przeprowadzić w celu zweryfikowania pięciu wyników mapowania głównego, chociaż nie jest ona uwzględniona w tym protokole.