Name: Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj metodę mapowania pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii RT-PCR. Technika ta obejmuje normalizację RNA, która redukuje wpływ niestabilnego 5'-trifosforanu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects of Guangzhou City (grant nr 201804020015, H.N.) oraz China Agricultural Research System (grant no. CARS-04-PS09, H.N.).

1. Projekt podkładu
<ol>
	<li>Projektowanie starterów specyficznych dla genów do odwrotnej transkrypcji (RT) za pomocą oprogramowania do projektowania starterów PCR (tabela materiałów) w oparciu o ogólne zasady projektowania starterów17. 
	nuta: Startery RT są wysoce specyficzne dla docelowych transkryptów i są na ogół zakotwiczone w części 5' sekwencji kodujących (dojrzałe mRNA i prekursorowe RNA) lub ~500-600 nt poniżej przewidywanego końca 5' (18S i 26S rRNA).</li>
	<li>Zaprojektuj pary rozbieżnych starterów w celu amplifikacji kolistych transkryptów przez cRT-PCR. 
	UWAGA: Sparowane rozbieżne startery flankują skrzyżowanie 5'-3' kolistych transkryptów, a ich pozycje różnią się między analizowanymi docelowymi transkryptami (ryc. S1). Niektóre transkrypcje mają długie UTR-y; na przykład nad2-1 5' UTR i rps4-1 3' UTR to odpowiednio 1,985 i 1,826/1,834 nt1. Jeśli oba startery są zakotwiczone w regionie kodowania, trudno będzie wzmocnić docelowe transkrypty. Z kolei niektóre UTR-y są krótkie; na przykład 3' UTR nad2-1 i nad4-1 to odpowiednio 34/35 i 29–31 nt1. Jeśli sparowane startery znajdują się daleko od sekwencji kodujących, PCR zakończy się niepowodzeniem. Ogólnie rzecz biorąc, dla każdego docelowego transkryptu projektowane są dwie pary rozbieżnych starterów, podczas gdy wiele par może być koniecznych do mapowania tych, których wzorce transkrypcji są skomplikowane i/lub UTR są bardzo długie.</li>
	<li>Zaprojektuj pary zbieżnych starterów do przygotowania sond RNA dla Northern blot. 
	nuta: Sparowane startery znajdują się w regionie kodującym docelowego genu, a wielkość produktu PCR powinna mieścić się w zakresie od 100 do 1000 pz. Każdy starter do przodu powinien zawierać miejsce enzymu restrykcyjnego, aby zminimalizować sekwencje wektorów w otrzymanych sondach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie surowego mitochondria z rozwijających się ziaren kukurydzy
<ol>
	<li>Wysterylizuj tłuczki, moździerze, szklane lejki, probówki i końcówki w autoklawie i wysusz je w piekarniku.</li>
	<li>Wszystkie procedury należy wykonać w temperaturze 4 °C lub na lodzie i wstępnie schłodzić wszystkie roztwory.</li>
	<li>Przygotować 100 ml buforu ekstrakcyjnego (EB), składającego się z 0,3 M sacharozy, 5 mM pirofosforanu tetrasodu, 10 mM KH2PO4, 2 mM EDTA, 1% [w/v] poliwinylopirolidonu 40, 1% [w/v] albuminy surowicy bydlęcej, 5 mM L-cysteiny i 20 mM kwasu askorbinowego. Dostosuj do pH 7,3 za pomocą KOH i sterylizuj przez filtrację.</li>
	<li>Przygotować 100 ml buforu do przemywania (WB) składającego się z 0,3 M sacharozy, 1 mM EGTA i 10 mM MOPS (kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego). Dostosuj do pH 7,2 za pomocą NaOH i sterylizuj przez filtrację. 
	nuta: Zaleca się przygotowanie EB i WB przy użyciu dejonizowanegoH2O, poddanego działaniu DEPC.</li>
	<li>Zebrać 20 g rozwijających się ziaren po 11–20 dniach od zapylenia (DAP) do probówki o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie, a następnie przenieść ziarna do wstępnie schłodzonych moździerzy. 
	nuta: Stosować proporcje 100 ml EB na 20 g ziaren kukurydzy.</li>
	<li>Dodaj 10-20 ml lodowatego EB do każdego moździerza i całkowicie zmiel ziarna.</li>
	<li>Dodaj więcej EB i przefiltruj zmielone tkanki przez dwie warstwy tkaniny filtracyjnej (tabela materiałów).</li>
	<li>Odwirować filtrat o stężeniu 8 000 x g przez 10 minut i wyrzucić osad.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować go przy 20 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad w 6 ml WB.</li>
	<li>Zawiesinę podzielić na pięć probówek wolnych od RNaz o pojemności 1,5 ml i odwirować je przy 14 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, zamrozić osad mitochondrialny w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja mitochondrialnego RNA
<ol>
	<li>Ekstrahować mitochondrialne RNA za pomocą dostępnego w handlu odczynnika (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. 
	ostrożność: Ten odczynnik zawiera fenol i izotiocyjanian guanidyny. Pracuj z nim pod wyciągiem i noś fartuch laboratoryjny i rękawice.</li>
	<li>Rozpuść wyizolowany mitochondrialny RNA w dejonizowanymH2Opoddanym działaniu DEPC i oszacuj stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów). 
	nuta: Ogólnie rzecz biorąc, ~250 μg mitochondrialnego RNA uzyskuje się z 20 g ziaren kukurydzy 15-DAP.</li>
	<li>Przygotuj jeden żel agarozowy składający się z 1x buforu TAE (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego, 1mM EDTA), 1,5% agarozy (tabela materiałów) i 1x barwnik do barwienia jądrowego (tabela materiałów).</li>
	<li>Dodaj odpowiednią objętość 10-krotnego buforu ładującego (0,5% błękitu bromofenolowego, 0,5% cyjanolu ksylenu FF i 50% glicerolu) i załaduj mieszaninę mitochondrialnego RNA / buforu ładującego na 1,5% żelu agarozowym.</li>
	<li>Uruchom żel w 1x buforze TAE przy 5-6 V/cm przez 20-25 minut i oceń integralność mitochondrialnego RNA, obrazując żel za pomocą systemu dokumentacji żelu (tabela materiałów). 
	nuta: Obecność dwóch odrębnych prążków (~3,510 i ~1,970 nt odpowiednio dla mitochondrialnych 26S i 18S rRNA kukurydzy) jest akceptowalnym standardem dla nienaruszonego mitochondrialnego RNA. Aby wykluczyć możliwą degradację, integralność RNA powinna być badana podczas wielu etapów cyklicznego przygotowania RNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Leczenie polifosfatazą RNA 5'
<ol>
	<li>Ustawić leczenie polifosfatazą RNA 5' (tabela i materiały) (tabela 1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30–60 minut.</li>
	<li>Odzyskaj RNA poddane działaniu polifosfatazy 5' za pomocą zestawu do oczyszczania RNA (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.3 do 3.5.</li>
</ol>
5. Cyrkularyzacja RNA
<ol>
	<li>Przygotować dwie reakcje cyrkularyzacji przy użyciu takich samych ilości mitochondrialnych RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą 5' (Tabela 2) i inkubować obie reakcje w temperaturze 16 °C przez 12–16 godzin.</li>
	<li>Odzyskaj dwa zestawy samoligaturowanych RNA przy użyciu tego samego zestawu, co w kroku 4.2. 
	nuta: Należy zauważyć, że tylko część mitochondrialnego RNA będzie samoligaturowana, a odzyskane RNA będzie mieszaniną liniowych i kolistych transkryptów.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.3 do 3.5.</li>
</ol>
6. Odwrotna transkrypcja
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj dwa zestawy cDNA z tych samych ilości krążących RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą 5' (200 ng).</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę podkładów, dodając w równych proporcjach 26S-CRT i do 7 innych starterów RT. 
	nuta: Końcowe stężenie mieszaniny podkładowej powinno wynosić 1 μM.</li>
	<li>Przygotować dwie mieszaniny wstępne, łącząc odczynniki wymienione w tabeli 3, inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie schładzać na lodzie przez 2 minuty.</li>
	<li>Zebrać dwa układy reakcyjne RT (tabela 4) i inkubować je w temperaturze 42 °C przez 50 minut.</li>
	<li>Podgrzewać obie reakcje RT w temperaturze 70 °C przez 5 minut, a następnie schłodzić je na lodzie.</li>
</ol>
7. Normalizacja
<ol>
	<li>Przygotuj dwie reakcje PCR, dodając tę samą objętość matrycowych cDNA pochodzących z RNA traktowanych lub nietraktowanych polifosfatazą 5', rozbieżnych starterów flankujących połączenie 5'-3' kolistego 26S rRNA (tj. 26S-CF1 i -CR1) itd. (Tabela 5).</li>
	<li>Przeprowadź obie reakcje w termocyklerze (tabela materiałów) w warunkach opisanych w tabeli 6.</li>
	<li>Przygotuj jeden żel agarozowy składający się z 1x buforu TAE, 1,0% agarozy i 1x barwnika do barwienia jądrowego.</li>
	<li>Dodaj 2 μl 10-krotnego buforu ładującego (0,5% błękitu bromofenolowego, 0,5% cyjanolu ksylenu FF i 50% glicerolu) do każdego z dwóch produktów PCR i załaduj je do żelu.</li>
	<li>Uruchom żel w 1x buforze TAE przy 5–6 V/cm przez 30–40 minut i zobrazuj go za pomocą tego samego systemu dokumentacji żelu, co w kroku 3.5.</li>
	<li>Porównaj obfitość dwóch produktów PCR za pomocą oprogramowania komputerowego (Tabela materiałów, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A) i zoptymalizuj normalizację, zmieniając ilości matrycowych cDNA, jeśli to konieczne.</li>
</ol>
8. Amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Przygotować pary reakcji PCR, dodając odpowiednią objętość znormalizowanych cDNA i parę rozbieżnych starterów flankujących połączenie 5'-3' docelowych transkryptów (Tabela 7). 
	nuta: Ilość matrycowych cDNA używanych do amplifikacji docelowych transkryptów metodą PCR jest określana na podstawie wyników normalizacji 26S rRNA.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcje PCR zgodnie z programem opisanym w tabeli 8.</li>
	<li>Powtórz kroki od 7.3 do 7.5.</li>
	<li>Zmień na zagnieżdżone startery rozbieżne i zweryfikuj wyniki PCR w pierwszej rundzie, powtarzając kroki 8.1 i 8.2.</li>
	<li>Powtórz kroki od 7.3 do 7.5.</li>
	<li>Odzyskaj wystające prążki, które można powtórzyć w dwóch rundach amplifikacji PCR za pomocą żelowego zestawu do odzyskiwania DNA (tabela materiałów).</li>
</ol>
9. Określenie terminów transkrypcji
<ol>
	<li>Sklonuj oczyszczone żelem produkty PCR do wektora o końcu (tabela materiałów) przy użyciu standardowych technik.</li>
	<li>Wykonaj colony PCR, aby wybrać dodatnie klony zawierające docelowe inserty i zsekwencjonować je komercyjnie. 
	nuta: Dodatnie klony zawierające wstawki o zmiennym rozmiarze są zwykle wykrywane z pojedynczego odzyskanego prążka, ponieważ wiele transkryptów w stanie ustalonym w mitochondriach roślinnych ma heterogeniczne końce 5' i/lub 3'1,12.</li>
	<li>Dopasuj dane sekwencjonowania do genomu mitochondrialnego kukurydzy za pomocą podstawowego narzędzia do wyszukiwania dopasowania lokalnego (BLAST) Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI). Wybierz organizm "kukurydza (taxid:4577)" i wyszukaj w bazie danych "Kolekcja nukleotydów (nr/nt)".</li>
	<li>Znajdź skrzyżowanie 5'-3' kolistego transkryptu i określ pozycje końców transkryptu 5' i 3'.</li>
	<li>Oblicz rozmiar docelowych transkrypcji.</li>
</ol>
10. Weryfikacja wyników mapowania cRT-PCR za pomocą hybrydyzacji RNA Gel Blot
UWAGA: Hybrydyzacja w żelu RNA odbywa się za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela Materiałów), który zawiera odczynniki do znakowania transkrypcji RNA digoksygeniną (DIG) i polimerazą RNA T7, hybrydyzacji i wykrywania immunologicznego. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z protokołami dostarczonymi w tym zestawie. Upewnij się, że do całej procedury używany jest tylko sprzęt wolny od RNazy.
<ol>
	<li>Amplifikować fragment DNA użyty do przygotowania sondy RNA i sklonować go do tego samego wektora, co w kroku 9.1, który zawiera promotor T7 17 pz przed miejscem insercji.</li>
	<li>Zlinearyzuj konstrukt za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, odzyskaj zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (tabela materiałów) i rozpuść go w dejonizowanym H2O poddanym działaniu DEPC.</li>
	<li>Oznacz sondy RNA za pomocą DIG-11-UTP za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml 10x buforu MOPS (0,2 M MOPS, 50 mM octanu sodu i 10 mM EDTA) przy użyciu dejonizowanego H2O poddanego działaniu DEPC. Dostosuj do pH 7,0 przez NaOH i sterylizuj przez filtrację.</li>
	<li>Dodać 2-3 objętości buforu ładującego (50% formamidu, 6,2% formaldehydu, 1x MOPS, 10% glicerolu i 0,1% błękitu bromofenolowego) do mitochondrialnego RNA przygotowanego w krokach 3.1–3.3.</li>
	<li>Denaturować próbkę RNA/mieszaninę buforu ładującego w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie schłodzić na lodzie przez 1 minutę.</li>
	<li>Przygotuj denaturowany żel agarozowy (2% formaldehydu, 1,2% agarozy i 1x MOPS) i załaduj próbkę RNA/mieszaninę buforu ładującego do żelu (1-2 μg mitochondrialnego RNA na studzienkę).</li>
	<li>Uruchom żel w 1x MOPS przy 3–4 V/cm przez ~4 godziny.</li>
	<li>Przygotuj 2 L 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu, pH 7,0). Potraktuj go 0,1% DEPC przez noc i sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Przepłukać żel dwukrotnie w 20x SSC (za każdym razem 15 min) i przenieść żelowe RNA do membrany nylonowej (Tabela materiałów) przez transfer kapilarny z 20x SSC przez 10–16 godzin.</li>
	<li>Utrwalić RNA na membranie, piecząc w temperaturze 120 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Wykonaj hybrydyzację RNA i detekcję immunologiczną za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
11. Dyskryminacja pierwotnych i przetworzonych końców 5'
<ol>
	<li>Rozróżnij pierwotne i przetworzone końce 5', porównując produkty cRT-PCR otrzymane ze znormalizowanych RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą 5'. 
	nuta: W przypadku pierwotnych transkryptów, obfitość produktów PCR z RNA potraktowanego polifosfatazą 5' jest znacznie wyższa niż w przypadku odpowiednika niepoddanego działaniu substancji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, "Gen A" i <silna klasa = "xfig" >Figura 4A). Jednak w przypadku przetworzonych transkryptów, porównywalny poziom produktów PCR zostałby amplifikowany z dwóch zestawów mitochondrialnych RNA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, 'Gen B').</li>
	<li>Projektowanie starterów RT-qPCR w oparciu o wyniki mapowania cRT-PCR.</li>
	<li>Sprawdź wyniki dyskryminacji cRT-PCR za pomocą RT-qPCR. 
	nuta: Dwie próbki cDNA pochodzące z RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą 5' są normalizowane przez produkty RT-qPCR dojrzałego rRNA 26S.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+transcription+initiation+to+5%27-end+formation+of+mitochondrial+steady-state+transcripts+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize.</a> RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).</li>
<li>Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+wheat+mitochondrial+mRNA+termini+and+comparison+with+breakpoints+in+DNA+homology+among+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants.</a> Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).</li>
<li>Calixte, S., Bonen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally-specific+transcripts+from+the+ccmFN-rps1+locus+in+wheat+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).</li>
<li>Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+promoters+are+a+common+feature+of+mitochondrial+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).</li>
<li>Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+PROCESSING+FACTOR2+is+required+for+5%27+end+processing+of+nad9+and+cox3+mRNAs+in+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22ThePlant+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana.</a> ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).</li>
<li>Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcript+length+polymorphisms+are+a+widespread+phenomenon+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).</li>
<li>Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerous+transcription+initiation+sites+exist+for+the+maize+mitochondrial+genes+for+subunit+9+of+the+ATP+synthase+and+subunit+3+of+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).</li>
<li>Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+mitochondrial+cox2+gene+has+five+promoters+in+two+genomic+regions%2C+including+a+complex+promoter+consisting+of+seven+overlapping+units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).</li>
<li>Yan, B., Pring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+initiation+sites+in+sorghum+mitochondrial+DNA+indicate+conserved+and+variable+features%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features.</a> Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).</li>
<li>Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+maize+mitochondrial+atp1+promoter+as+determined+by+linker-scanning+and+point+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).</li>
<li>Rapp, W. D., Stern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+11+nucleotide+sequence+contains+an+essential+promoter+element+of+the+maize+mitochondrial+atp1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene.</a> The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).</li>
<li>Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+mitochondrial+mRNA+termini+in+Arabidopsis+thaliana%3A+t-elements+contribute+to+5%27+and+3%27+end+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).</li>
<li>Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+5%27+ends+of+plant+mitochondrial+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs.</a> Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).</li>
<li>Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+protein+arginine+methyltransferase+3+is+required+for+ribosome+biogenesis+by+affecting+precursor+ribosomal+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).</li>
<li>Wang, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+Urb2+protein+is+required+for+kernel+development+and+vegetative+growth+by+affecting+pre-ribosomal+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing.</a> New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).</li>
<li>Maloney, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+in+maize+mitochondrial+26S+rRNA+of+a+short+5%27-end+sequence+possibly+involved+in+transcription+initiation+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing.</a> Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).</li>
<li>Green, R. M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+RM+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).</li>
<li>Canino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+encodes+four+tRNase+Z+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes.</a> Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).</li>
<li>Gobert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Arabidopsis+organellar+protein+has+RNase+P+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural%2C+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity.</a> Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).</li>
<li>Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRORP+proteins+support+RNase+P+activity+in+both+organelles+and+the+nucleus+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis.</a> Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).</li>
<li>Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+RNA+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast RNA metabolism.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W poprzednim badaniu całkowite i mitochondrialne RNA z hodowli zawiesinowej rzodkiewnika wykorzystano do mapowania mitochondrialnych końców transkryptu za pomocą cRT-PCR i uzyskano podobne wyniki12. Jednak tylko wzbogacony mitochondrialny RNA został użyty do mapowania mitochondrialnych końców transkryptu w wielu innych badaniach 1,2,3,9. Odkryliśmy, że wzbogacen...

W mitochondriach roślinnych wiele dojrzałych i prekursorowych RNA jest akumulowanych jako wiele izoform, a transkrypty w stanie ustalonym można podzielić na dwie grupy na podstawie różnicy na ich końcach 5'1,2,3,4. Pierwotne transkrypty mają końce 5' trifosforanowe, które pochodzą z inicjacji transkrypcji. Natomiast przetworzone transkrypty zawierają monofosforan 5' generowany przez przetwarzanie potranskrypcyjne. Dyskryminacja i mapowanie tych dwóch typów transkryptów są ważne dla rozwikłania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transkrypcji i końcowego dojrzewania transkryptu.
Aby odróżnić pierwotne i przetworzone transkrypty w mitochondrium roślinnym, opracowano cztery główne strategie. Pierwszą strategią jest wstępne potraktowanie mitochondrialnych RNA pirofosfatazą kwasu tytoniowego (TAP), która przekształca trifosforan 5' w monofosforan i umożliwia cyrkularyzację pierwotnych transkryptów przez ligazę RNA. Obfitość transkryptów próbek RNA poddanych działaniu TAP i nietraktowanych jest następnie porównywana przez szybką amplifikację końców cDNA (RACE) lub koliste RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. W drugiej strategii przetworzone transkrypty są najpierw zubożone z mitochondrialnych RNA za pomocą terminatora 5'-zależnego od fosforanu egzonukleazy (TEX), a pozostałe pierwotne transkrypty są następnie mapowane przez analizę rozszerzenia starterów5,6. Trzecią strategią jest wstępne zamknięcie pierwotnych transkryptów za pomocą transferazy guanylylu, a następnie pozycja trifosforanowanych końców 5' jest określana przez wydłużenie startera wraz z analizą ochrony rybonukleazy lub nukleazy S17,8,9. Czwarta strategia, odmienna od tych, które zależą od obecności/braku trifosforanu 5', łączy transkrypcję in vitro, mutagenezę ukierunkowaną na miejsce i analizę rozszerzenia startera w celu scharakteryzowania przypuszczalnych promotorów i określenia miejsc inicjacji transkrypcji8,10,11. Stosując te strategie, w mitochondriach roślinnych określono wiele pierwotnych i przetworzonych transkryptów.
Jednak kilka badań wykazało, że trifosforan 5' pierwotnych transkryptów był niestabilny i z nieznanego powodu łatwo przekształcał się w monofosforan2,4,12,13. Problem ten utrudnia wyraźne rozróżnienie tych dwóch typów transkryptów przy użyciu technik zależnych od obecności/braku trifosforanu 5', a wcześniejsze próby systematycznego rozróżniania między pierwotnymi i przetworzonymi transkryptami w mitochondriach roślinnych nie powiodły się2,12.
W tym protokole łączymy cRT-PCR, RNA 5' polifosfatazę, RT-qPCR i Northern blot, aby systematycznie rozróżniać pierwotne i przetworzone transkrypty stabilnie zgromadzone w mitochondrium kukurydzy (Zea mays) (Rysunek 1). cRT-PCR umożliwia jednoczesne mapowanie końców 5' i 3' cząsteczki RNA i jest zwykle przystosowany do mapowania końców transkryptu u roślin2, 12,14,15. Polifosfataza RNA 5' może usunąć dwa fosforany z trifosforanowanych końców 5', co sprawia, że pierwotne transkrypty są dostępne do samoligacji przez ligazę RNA. Wcześniejsze badania wykazały, że dojrzałe 26S rRNA w kukurydzy przetworzyło koniec 5' i było niewrażliwe na polifosfatazę 5' RNA1,16. Aby zminimalizować wpływ niestabilnego trifosforanu na pierwotnych końcach 5', RNA 5' traktowane polifosfatazą i nietraktowane są normalizowane przez dojrzałe 26S rRNA, a pierwotne i przetworzone transkrypty są następnie różnicowane przez porównanie produktów cRT-PCR otrzymanych z dwóch próbek RNA. Wyniki mapowania i dyskryminacji cRT-PCR są weryfikowane odpowiednio za pomocą Northern blot i RT-qPCR. Wreszcie, alternatywne startery są używane do amplifikacji transkryptów wykrytych w Northern blot, ale nie przez cRT-PCR. Dzięki zastosowaniu tej strategii opartej na cRT-PCR, większość transkryptów w stanie ustalonym w mitochondriach kukurydzy została zróżnicowana i zmapowana1.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Aladdin, Chiny</td><td>A112880</td><td>Do przygotowania 1x bufor TAE</td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>4359659</td><td>Termocykler do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>V900134</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Biowest Agaroza</td><td>Biowest, Hiszpania</td><td>9012-36-6</td><td>Aby rozwiązać PCR Produkty i RNA</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>A1933</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>B8026</td><td>Do przygotowania buforu ładującego do elektroforezy w żelu agarozowym i Northern blot</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>V900882</td><td>Dezaktywacja RNazy</td></tr><tr><td>DIG Północny zestaw startowy</td><td>Roche, USA</td><td>12039672910</td><td>Do znakowania DIG-RNA i Northern blot. Ten zestaw zawiera odczynniki do znakowania transkrypcji RNA polimerazą DIG i T7 RNA, hybrydyzacji i detekcji chemiluminescencyjnej.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>V900106</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego i 1x buforu TAE</td></tr><tr><td></td><td>EGTA Sigma-aldrich, USA</td><td>E3889</td><td>Do przygotowania buforu płuczącego</td></tr><tr><td>System dokumentacji żelu</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>Gel Doc XR+</td><td>Do obrazowania żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>G5516</td><td>Do przygotowania buforu ładującego do elektroforezy w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>GoldView II (5,000x)</td><td>Solarbio,. Chiny</td><td>G8142</td><td>barwienie DNA</td></tr><tr><td>Hybond-N +, membrana nylonowa</td><td>Amersham Biosciences, USA</td><td>RPN119</td><td>Dla Northern blot</td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>Image Lab 3.0</td><td>Żel do obrazowania i porównaj obfitość produktów PCR.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>V900041</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Aladdin, Chiny</td><td>P112284</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>V900399</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLHP033RB</td><td>Do sterylnej ekstrakcji i myjące przez filtrację</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem, USA</td><td>475855-1R</td><td>Do filtrowania zmielonych tkanek ziarna</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>V900306</td><td>Do przygotowania buforu biegowego dla Northern blot</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2000C</td><td>Do oznaczania stężenia i czystości</td></tr><tr><td>RNA NaOH</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>V900797</td><td>Dla przygotowanie buforu płuczącego</td></tr><tr><td>pEASY-Blunt prosty wektor klonowania</td><td>TransGen Biotech, Chiny</td><td>CB111</td><td>Klonowanie pasma odzyskanego w żelu. Zawiera promotor T7 kilka punktów bazowych przed miejscem insercji.</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phanta max super-fidelity</td><td>Vazyme, Chiny</td><td>Polimeraza DNA P505</td><td>do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon 40</td><td>Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>V900008</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Primer Premier 6.24</td><td>PREMIER Biosoft, USA</td><td>Primer Premier 6.24</td><td>Do projektowania starterów do odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza PrimeScript II</td><td>Takara, Japonia</td><td>2690</td><td>Do syntezy pierwszej nici cDNA</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>12183025</td><td>Do oczyszczania</td></tr><tr><td>RNA RNA 5' polifosfatazy</td><td>Epicentrum, USA</td><td>RP8092H</td><td>Aby przekształcić 5' trifosforan w monofosforanowy</td></tr><tr><td>inhibitor RNazy</td><td>New England Biolabs, Wielka Brytania</td><td>M0314</td><td>Składnik reakcji samoligatacji RNA i leczenia polifosfatazą 5' i służy do hamowania aktywności RNazy.</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>V900212</td><td>Do przygotowania buforu biegowego dla Northern blot</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>V900058</td><td>Do przygotowania 20x SSC</td></tr><tr><td>SsoFas evaGreen supermixes</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>1725202</td><td>Do RT-qPCR</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaza 1</td><td>New England Biolabs, Wielka Brytania</td><td>M0437</td><td>Do cyrkularyzacji RNA</td></tr><tr><td>Tetrasodowy pirofosforan</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>221368</td><td>Do przygotowania buforu ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>TIANgel midi zestaw do oczyszczania</td><td>Tiangen Biotech, Chiny</td><td>DP209</td><td>Do oczyszczania fragmentów DNA z żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Aladdin, Chiny</td><td>T110601</td><td>Do przygotowania 1x bufor TAE</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15596026</td><td>Do ekstrakcji mitochondrialnego RNA.</td></tr><tr><td>Uniwersalny zestaw do oczyszczania DNA</td><td>Tiangen Biotech, Chiny</td><td>DP214</td><td>Do odzyskiwania zlinearyzowanych plastmidów z reakcji trawienia enzymu restrykcyjnego</td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenu FF</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>X4126</td><td>Do przygotowania buforu ładującego do elektroforezy w żelu agarozowym</td></tr></tbody></table>

rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na rt-pcr

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

W mitochondriach roślinnych, niektóre transkrypty w stanie ustalonym zawierają 5' trifosforan pochodzący z inicjacji transkrypcji (transkrypty pierwotne), podczas gdy inne zawierają 5' monofosforan generowany po transkrypcji (przetworzone transkrypty). Aby rozróżnić te dwa typy transkryptów, opracowano kilka strategii, a większość z nich zależy od obecności/braku trifosforanu 5'. Jednak trifosforan na pierwotnych końcach 5' jest niestabilny, co utrudnia wyraźną dyskryminację tych dwóch typów transkryptów. Aby systematycznie różnicować i mapować pierwotne i przetworzone transkrypty stabilnie zgromadzone w mitochondrium kukurydzy, opracowaliśmy strategię opartą na cyrkulacyjnym RT-PCR (cRT-PCR), łącząc cRT-PCR, leczenie polifospatazą RNA 5', ilościowy RT-PCR (RT-qPCR) i Northern blot. Jako ulepszenie, strategia ta obejmuje etap normalizacji RNA w celu zminimalizowania wpływu niestabilnego 5' trifosforanu.
W tym protokole, wzbogacone mitochondrialne RNA jest wstępnie traktowane przez polifosfatazę 5' RNA, która przekształca trifosfatat 5' w monofosforan. Po cyrkularyzacji i odwrotnej transkrypcji dwa cDNA pochodzące z RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą 5' są normalizowane przez dojrzałe rRNA kukurydzy 26S, które ma przetworzony koniec 5' i jest niewrażliwe na polifosfatazę 5'. Po normalizacji pierwotne i przetworzone transkrypty są rozróżniane poprzez porównanie produktów cRT-PCR i RT-qPCR uzyskanych z traktowanych i nietraktowanych RNA. Końce transkryptu są oznaczane przez klonowanie i sekwencjonowanie produktów cRT-PCR, a następnie weryfikowane za pomocą Northern blot.
Korzystając z tej strategii, udało się określić większość transkryptów w mitochondriach kukurydzy. Ze względu na skomplikowany wzorzec transkryptów niektórych genów mitochondrialnych, kilka transkryptów w stanie stacjonarnym nie zostało zróżnicowanych i/lub zmapowanych, chociaż wykryto je w Northern blot. Nie jesteśmy pewni, czy ta strategia jest odpowiednia do rozróżniania i mapowania transkryptów w stanie ustalonym w innych mitochondriach roślinnych lub w plastydach.

Oszacowanie wydajności cyrkularyzacji mitochondrialnego RNA
W poprzednim badaniu do mapowania końców transkryptów mitochondrialnych w Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) za pomocą cRT-PCR wykorzystano zarówno RNA całkowite, jak i mitochondrialne, a oba rodzaje RNA dały podobne wyniki mapowania12. Początkowo do mapowania końców transkryptów mitochondrialnych w kukurydzy ró...

Prezentujemy strategię opartą na cyrkularnym RT-PCR, łączącą cyrkularny RT-PCR, ilościowy RT-PCR, leczenie polifosfatazą 5' RNA i Northern blot. Protokół ten obejmuje etap normalizacji w celu zminimalizowania wpływu niestabilnego trifosforanu 5' i nadaje się do rozróżniania i mapowania pierwotnych i przetworzonych transkryptów stabilnie zgromadzonych w mitochondrium kukurydzy.

Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Protokół ten służy do mapowania i rozróżniania pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondriach kukurydzy. Technika ta obejmuje etap normalizacji RNA i minimalizuje wpływ niestabilnego pięcioma głównych trifosforanów, które utrudniają wyraźne rozróżnienie między pierwotnymi i przetworzonymi transkryptami. Oprócz mitochondriów kukurydzy metoda ta może być stosowana do plastydów i innych mitochondriów roślinnych.Zacznij od zebrania 20 gramów rozwijających się ziaren do 50-mililitrowej rurki na lodzie. Przenieś ziarna do wstępnie schłodzonego moździerza i dodaj 10 do 20 mililitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego. Całkowicie zmiel jądra, dodaj więcej buforu ekstrakcyjnego i przefiltruj zmieloną tkankę przez dwie warstwy tkaniny filtracyjnej.Odwirować filtrat w temperaturze 8 000 razy G przez 10 minut. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić filtrat. Odwirować probówkę o stężeniu 20 000 razy G przez 10 minut.Odlewać supernatant i ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach buforu do płukania. Podziel zawiesinę na pięć 1,5 mililitrowych probówek wolnych od RNaz i odwiruj je w temperaturze 14 000 razy G przez pięć minut. Wyrzucić supernatant i zamrozić osad mitochondrialny w ciekłym azocie.Ekstrahuj mitochondrialne RNA za pomocą dostępnych w handlu odczynników zgodnie z instrukcjami producenta i skonfiguruj leczenie polifosfaazą RNA z pięcioma podstawowymi. Następnie odzyskaj RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Odczynnik używany do ekstrakcji RNA jest niebezpieczny.Zawsze pracuj z nim pod wyciągiem i zawsze noś fartuch laboratoryjny i rękawice. Przygotuj dwie reakcje cyrkularyzacji, używając takich samych ilości pięciu mitochondrialnych RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą. Inkubuj obie reakcje w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin, a następnie odzyskaj samoligatowane RNA za pomocą wcześniej używanego zestawu do oczyszczania RNA.Zacznij od przygotowania mieszaniny starterów o równym stosunku 26 SCRT i do siedmiu innych starterów odwrotnej transkrypcji. Zbierz dwa systemy reakcji odwrotnej transkrypcji zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i inkubuj je w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 50 minut. Aby znormalizować cDNA, przygotuj dwie reakcje PCR z tą samą objętością cDNA z pięciu głównych RNA poddanych działaniu polifosfatazy lub nietraktowanych i przeprowadź reakcję w warunkach termocyklingu opisanych w manuskrypcie.Normalizacja przez dojrzałe rRNA 26S jest kluczowym krokiem do rozróżnienia między pierwotnymi i przetworzonymi transkryptami. Porównaj obfitość dwóch produktów PCR i, jeśli to konieczne, zoptymalizuj normalizację, dostosowując ilości matrycy cDNA. Przygotuj pary reakcji PCR z odpowiednimi objętościami znormalizowanego cDNA i parą rozbieżnych starterów, takich jak w pięciu pierwszych do trzech pierwszych połączeniach docelowych transkryptów i wykonaj PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Następnie użyj żelowego zestawu do odzyskiwania DNA, aby wyizolować widoczne prążki, które są amplifikowane przez zagnieżdżony PCR. Sklonować oczyszczone w żelu produkty PCR do wektora przy użyciu standardowych technik i przeprowadzić PCR kolonii w celu wybrania dodatnich klonów zawierających docelowe wstawki. Zsekwencjonuj produkty PCR i dopasuj dane sekwencjonowania do genomu mitochondrialnego kukurydzy za pomocą podstawowego narzędzia do wyszukiwania dopasowania lokalnego lub BLAST.Wybierz organizm kukurydza i przeszukaj bazę danych kolekcja nukleotydów. Znajdź pięć liczb pierwszych do trzech węzłów pierwszych w kolistym transkryptie i określ pozycje pięciu pierwszych i trzech pierwszych końców transkryptu. Amplifikuj fragment DNA użyty do przygotowania sondy RNA i sklonuj go do poprzednio używanego wektora, który zawiera promotor T7, 17 par zasad przed miejscem insercji.Oznacz sondy RNA za pomocą dig-11-UTP i przeprowadź hybrydyzację RNA przy użyciu komercyjnych zestawów. Rozróżnij pierwotne i przetworzone pięć pierwszych końców, porównując koliste produkty RT-PCR uzyskane ze znormalizowanych pięciu RNA traktowanych i nietraktowanych polifosfatazą. Następnie zaprojektuj ilościowe startery RT-PCR na podstawie wyników mapowania i zweryfikuj wyniki dyskryminacji za pomocą RT-PCR.Gen COX-2 został wykorzystany jako przykład do zademonstrowania mapowania i dyskryminacji transkryptów mitochondrialnych kukurydzy za pomocą strategii opartej na cyrkulacyjnym RT-PCR. Znormalizowane cDNA użyto jako matryc do PCR, w wyniku czego uzyskano dwie wyraźne prążki amplifikowane z pięciu głównych próbek traktowanych polifosfatazą. Dwa prążki zostały nazwane COX-2 jeden i drugi odzyskane z żelu i sklonowane do wektorów.Wyniki Colony PCR wykazały, że dodatnie klony zawierają insercje o zmiennej wielkości, co oznacza, że końce mają heterogeniczne pięć lub trzy pierwsze końce. Wyniki sekwencjonowania wykazały, że COX-2 jeden i drugi mają te same trzy pierwsze końce w 39 nukleotydach poniżej kodonu stop, podczas gdy ich pięć pierwszych końców znajduje się odpowiednio w 992 do 1, 030 i 1, 276 do 1, 283 nukleotydach przed kodonem start. Przeprowadzono hybrydyzację blot żelowych RNA w celu zweryfikowania wyników mapowania kołowego RT-PCR i wykryto dwa główne prążki o rozmiarach podobnych do COX-2, jeden i dwa.Kolejna para rozbieżnych starterów została zaprojektowana w celu amplifikacji trzech i czterech prążków COX-2 wykrytych za pomocą plamy żelowej RNA, ale nie za pierwszym razem w okrągłym RT-PCR. Ilościowe wyniki RT-PCR potwierdziły, że COX-2 jeden, drugi, trzeci i czwarty były wrażliwe na pięć głównych polifosfataz i że miały pierwotne pięć głównych końców. Analizę rozszerzenia startera można przeprowadzić w celu zweryfikowania pięciu wyników mapowania głównego, chociaż nie jest ona uwzględniona w tym protokole.

discrimintion-mapping-primary-processed-transcripts-maize

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj opisujemy metodę umożliwiającą jednoczesne ilościowe oznaczanie i mapowanie całego genomu rybonukleotydów w wysoce nienaruszonym DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu, łącząc enzymatyczne rozszczepienie genomowego DNA z jego alkaliczną hydrolizą i późniejszym sekwencjonowaniem 5'-końca.

Jednoczesne mapowanie i oznaczanie ilościowe rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Dwa różne protokoły szybkiej amplifikacji końców cDNA (3' RACE) opisane tutaj wykorzystują dwie różne polimerazy DNA do mapowania sekwencji, które zawierają segment otwartej ramki odczytu (ORF), kodon stop i cały 3' UTR transkryptu za pomocą RNA uzyskanego z różnych linii komórek nowotworowych.

Adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Poznaj metodę mapowania pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii RT-PCR. Technika ta obejmuje normalizację RNA, która redukuje wpływ niestabilnego 5'-trifosforanu.

Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR (Wideo) | JoVE Journal

Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR

Przeglądaj więcej filmów