Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Ogólnym celem tego eksperymentu jest porównanie dwóch metod stosowanych do izolowania wysokiej jakości DNA organellarów, zarówno DNA plastydowego, jak i mitochondrialnego z tkanki liści roślinnych, która nadaje się do sekwencjonowania nowej generacji. Metody te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak zakres różnorodności organelli w różnych taksonach oraz wpływ zmian w sekwencji lub strukturze genomu organellarów na rozwój i reakcję na stres. Porównamy dwie techniki, metodę wirowania różnicowego, która wzbogaca o jeden konkretny typ organellarów, oraz technikę metafrakcjonowania, która odzyskuje całkowite DNA organelli z mniejszych próbek zamrożonych tkanek.

Standardową procedurą uprawy sadzonek pszenicy jest sadzenie nasion w wermikulicie, w kwadratowych doniczkach z czterema do sześciu nasion w rogu. Przenieś doniczki do szklarni z 16-godzinnym cyklem świetlnym. Podlewaj rośliny każdego dnia.

Rośliny nawozić jedną czwartą łyżeczki granulowanego nawozu 20-20-20 MPK po wykiełkowaniu i ponownie po siedmiu dniach od wykiełkowania. Do uwodzenia siewek pszenicy, nasion roślin i pielęgnacji roślin jak w standardowej procedurze. Ale umieść doniczki w ciemnej komorze wzrostu.

Alternatywą dla uprawy tych sadzonek w ciemnej komorze wzrostowej jest przykrycie roślin w szklarni, ale z odpowiednią wentylacją. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyizolowanie organelli. Zbierz pięć gramów świeżej tkanki i opłucz ją w zimnej, sterylnej wodzie w schłodzonej zlewce na lodzie.

Za pomocą nożyczek pokrój tkankę liścia na około centymetrowe kawałki bezpośrednio do wstępnie schłodzonej 50-milimetrowej rurki zawierającej dwa ceramiczne cylindry mielące. Próbki należy przechowywać na lodzie przez cały czas trwania procedury. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, ważne jest, aby wymieniać nożyczki między próbkami.

Pobrać próbki do dygestorium i dodać 20 mililitrów buforu STE do każdej 50-mililitrowej probówki. Umieścić próbki we wstępnie schłodzonych kriogenicznych blokach mielących w aparacie do mielenia tkanek i mielić próbki przez 30 sekund z prędkością 1 750 obrotów na minutę. Umieścić próbki na lodzie na około jedną minutę.

Obracaj pozycje próbki i miel przez kolejne 30 sekund z prędkością 1 750 obrotów na minutę. Włóż próbki z powrotem do pojemnika na lód. Dla każdej próbki włóż lejek do czystej 50-mililitrowej rurki umieszczonej w lodzie i umieść jedną warstwę tkaniny filtracyjnej w lejku.

Wstępnie zwilż tkaninę filtracyjną pięcioma mililitrami buforu STE i zachowaj przepływ. Wlej homogenizowaną tkankę do lejka. Przepłucz rurkę mielącą 15 mililitrami buforu STE, zamknij i odwróć probówkę, aby przepłukać ścianki i pokrywkę, a następnie wlej jej zawartość do lejka.

Ostrożnie usuń kamienie ceramiczne, a następnie ściśnij i wykręć ściereczkę filtracyjną do lejka. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, należy zmieniać rękawice między próbkami. Owiń nakrętki tubek folią parafinową, aby uniknąć rozlania.

Wirować w temperaturze 2 000 x G, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety serologicznej ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu i umieścić go w 50-mililitrowej probówce wirówki o dużej prędkości ze szczelną uszczelką. Umieść małą zlewkę z lodem na wadze, rozerwij wagę i zważ każdy supernatant.

Użyj buforu STE, aby zrównoważyć probówki z dokładnością do 0,1 grama, a następnie odwirować w temperaturze 18 000 x G w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu wirowania należy umieścić próbki z powrotem w dygestorium i odrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr buforu ST do granulatu i delikatnie zawieś ponownie za pomocą miękkiego pędzla.

Dodaj 24 mililitry buforu ST, aby uzyskać końcową objętość 25 mililitrów. Delikatnie obracaj pędzlem w zawiesinie, aby wymieszać, a następnie naciśnij pędzel z boku tubki, aby usunąć cały płyn przed wyjęciem pędzla. Po zważeniu probówek odwirować w temperaturze 18 000 x G w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.

Podczas tego wirowania należy przygotować roztwór DNA 1 zgodnie z opisem w protokole tekstowym i podaszkować 200 mikrolitrów do probówki o pojemności 1,5 mililitra na próbkę. Po zakończeniu wirowania wyrzucić supernatant i osuszyć probówkę. Do każdej probówki wirówki o dużej prędkości dodaj 300 mikrolitrów buforu STE i ponownie zawieś osad za pomocą miękkiego pędzla

Umieść pędzel w przygotowanej wcześniej 1,5 mililitrowej tubce zawierającej 200 mikrolitrów roztworu DNA 1 i zakręć pędzlem, aby usunąć resztki granulek, które utknęły w pędzlu. Odpipetować roztwór DNA 1 do probówki wirówki o dużej prędkości i delikatnie zamieszać, aby wymieszać. Owiń folię parafinową wokół górnej części każdej probówki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 30 minut.

Podczas inkubacji delikatnie wymieszać, mieszając. Za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem delikatnie odpipetuj mieszaninę granulek z probówki i umieść ją w 1,5 mililitrowej probówce o niskim stopniu wiązania. Dodaj 500 mikrolitrów 400 milimolowego EDTA, pH 8,0 do probówki wirówki o dużej prędkości.

Delikatnie odpipetować, aby całkowicie usunąć resztki osadu i przenieść EDTA do probówki o niskim stopniu wiązania zawierającej mieszaninę peletów. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Wirować w temperaturze 18 000 x G, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie wyrzuć supernatant, osusz każdą probówkę i natychmiast użyj osadu do izolacji DNA. W tej metodzie DNA organellarne jest wzbogacane z całkowitego genomowego DNA, które zostało wyekstrahowane za pomocą komercyjnych kolumn do ekstrakcji DNA. Przygotuj wymaganą ilość kulek magnetycznych związanych z białkiem MBD2 FC, zgodnie z instrukcjami producenta i skaluj reakcje do użycia od jednego do dwóch mikrogramów całkowitego wejściowego DNA.

W tej demonstracji potrzeba 160 mikrolitrów kulek na jeden mikrogram całkowitego wejściowego DNA. Aby wychwycić metylowane jądrowe DNA, dodaj jeden mikrogram wejściowego DNA do probówki zawierającej 160 mikrolitrów kulek magnetycznych związanych MBD2 dla każdej pojedynczej próbki i delikatnie pipetuj w górę iw dół końcówką o szerokim otworze. Dodać odpowiednią objętość 5x buforu do płukania wiązań, aby uzyskać końcowe stężenie 1x i odpipetować próbkę w górę iw dół końcówką o szerokim otworze, kilka razy w celu wymieszania.

Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dla powodzenia ściągania w dół bardzo ważne jest dokładne wymieszanie kulek podczas inkubacji, zwłaszcza jeśli występuje znaczne zbrylanie się kulek. Aby zapobiec zbrylaniu się kulek i zapewnić ściąganie metylowanego DNA, delikatnie pipetuj próbki końcówką pipety o szerokim otworze i przesuwaj próbki dwa do trzech razy przez cały czas inkubacji.

Krótko zakręć probówkami zawierającymi mieszaninę DNA i kulek magnetycznych. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na co najmniej pięć minut, aby zebrać koraliki z boku rurek. Roztwór powinien wydawać się klarowny, zawiera niemetylowane DNA wzbogacone w organellary.

Używając końcówek o szerokim otworze, ostrożnie usunąć oczyszczony supernatant bez naruszania kulek i przenieść supernatant do czystej, nisko wiążącej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki. Próbki należy przechowywać w temperaturze 20 lub 80 stopni Celsjusza. Test Ostrej reakcji PCR zastosowano do oceny względnej liczebności trzech implikonów specyficznych dla organelli w całkowitym genomowym DNA i organellarnej frakcji DNA uzyskanej za pomocą obu metod.

Ogólnie rzecz biorąc, dane wskazują, że metoda wirowania różnicowego preferencyjnie wzbogaca mitochondria. Niemetylowana frakcja metylofrakcjonowanego całkowitego genomowego DNA wykazuje znaczne wzbogacenie obu implikonów organellarnych. Procenty odczytów zmapowanych do mitochondriów lub chloroplastów chińskiej wiosny i genomów referencyjnych pszenicy uprawianej chris są zgodne z wynikami QPCR.

Wirowanie różnicowe daje DNA, które jest bardziej wzbogacone w DNA mitochondriów, a frakcjonowanie metylowe daje DNA, które prawdopodobnie odzwierciedla natywną obfitość dwóch genomów organellarnych. Etykiety próbek, w tym E, oznaczają próbki idylowe, a NE oznaczają próbki nieidylowe. Co ciekawe, idylacja nie zmieniła liczebności organelli.

W obu metodach teoretyczne pokrycie mitochondriów lub genomów odnoszących się do chloroplastów przekracza 100-krotne pokrycie, nawet gdy 12 bibliotek dokonało aremultipleksacji. Całkowite genomowe DNA migruje jako rozproszony rozmaz w elektroforezie żelowej po polowej elektroforezie i przekracza 50 kilozasad. Frakcja jądrowa po metylofrakcjonowaniu zmniejsza swoją wielkość, ale pozostaje wyśrodkowana wokół 50 kilozasad, co sugeruje, że metylofraktiozanty DNA jest najbardziej odpowiednie do sekwencjonowania z długim odczytem.

Po opanowaniu, obie techniki ekstrakcji organellarnego DNA można wykonać w ciągu jednego do dwóch dni, od pobrania próbki do oceny produktu końcowego, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Technika metylofrakcjonowania może znacznie rozszerzyć zakres badań DNA organelli na rzadkie i trudne próbki, ponieważ ilość danych wejściowych do tkanek jest niezwykle niska. Jednak wirowanie różnicowe może być nadal preferowane, gdy do dalszych badań wymagane jest wyłącznie DNA mitochondriów.

Podobnie, etapy wirowania można dostosować tak, aby w razie potrzeby preferencyjnie ekstrahować DNA plastydowe. Obie metody ekstrakcji DNA organellarów dają DNA, które nadaje się do sekwencjonowania nowej generacji, ale frakcjonowanie metylowe daje DNA o wysokiej szybkości cząsteczkowej, które jest idealne do sekwencjonowania z długim odczytem.