Name: Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Poznaj metody izolacji DNA organelli roślinnych do sekwencjonowania nowej generacji. Porównaj wirowanie różniczkowe i frakcjonowanie metylacyjne pod kątem wydajności i jakości DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za finansowanie od Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych - Służby Badań Rolniczych oraz od Narodowej Fundacji Nauki (IOS 1025881 i IOS 1361554). Dziękujemy firmie R. Caspers za utrzymanie szklarni i pielęgnację roślin. Dziękujemy również Centrum Genomiki Uniwersytetu Minnesoty, gdzie przeprowadzono przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki Illumina. Jesteśmy również wdzięczni za komentarze redaktorów czasopisma i czterech anonimowych recenzentów, które jeszcze bardziej wzmocniły nasz manuskrypt. Dziękujemy również OECD za stypendium dla SK w celu zintegrowania tych protokołów we wspólnych projektach z kolegami z Japonii.

<ol><li>Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+plant+development+and+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in plant development and stress tolerance.</a> Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).</li>
<li>Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odintifier--A+computational+method+for+identifying+insertions+of+organellar+origin+from+modern+and+ancient+high-throughput+sequencing+data+based+on+haplotype+phasing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing.</a> BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).</li>
<li>Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+plant+organellar+genome+assembly%2C+based+on+whole+genome+data+from+the+454+GS+FLX+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform.</a> Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).</li>
<li>Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+of+wild+and+domesticated+rices+%28Oryza+AA+genome+species%29+based+upon+whole+chloroplast+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences.</a> Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).</li>
<li>Iorizzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+the+carrot+mitochondrial+genome+using+next+generation+sequencing+of+whole+genomic+DNA+provides+first+evidence+of+DNA+transfer+into+an+angiosperm+plastid+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome.</a> BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequences+of+organelle+genomes+from+the+medicinal+plant+Rhazya+stricta+%28Apocynaceae%29+and+contrasting+patterns+of+mitochondrial+genome+evolution+across+asterids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids.</a> BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).</li>
<li>Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+mitogenome+of+the+parasitic+plant+Viscum+scurruloideum+is+extremely+divergent+and+dynamic+and+has+lost+all+nad+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).</li>
<li>Wicke, S., Schneeweiss, G. M. Chapter 1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWicke%2C+S+%22Next+Generation+Sequencing+in+Plant+Systematics%22">Next Generation Sequencing in Plant Systematics</a>. Hörandl, E., Appelhans, M. , Koeltz Scientific Books. (2015).</li>
<li>Sloan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+ring+to+rule+them+all%3F+Genome+sequencing+provides+new+insights+into+the+%27master+circle%27+model+of+plant+mitochondrial+DNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure.</a> New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).</li>
<li>Woloszynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteroplasmy+and+stoichiometric+complexity+of+plant+mitochondrial+genomes--though+this+be+madness%2C+yet+there%27s+method+in%27t%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't.</a> J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).</li>
<li>Ahmed, Z., Fu, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+with+a+wider+applicability+to+isolate+plant+mitochondria+for+mtDNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction.</a> Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).</li>
<li>Ejaz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+scale+methods+for+the+rapid+and+efficient+extraction+of+mitochondrial+DNA+from+wheat+crop+suitable+for+down-stream+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes.</a> Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).</li>
<li>Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+plant+mitochondria+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis.</a> Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).</li>
<li>Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+extraction+and+assembly+methods+for+simultaneously+obtaining+plastid+and+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes.</a> PLoS One. 9 (9), e108291(2014).</li>
<li>Pomeroy, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+respiratory+properties+of+mitochondria+isolated+from+developing+winter+wheat+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings.</a> Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).</li>
<li>Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+organelle+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis organelle isolation and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).</li>
<li>Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1007487806583">A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower.</a> Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).</li>
<li>Pinard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+whole+genome+amplification-induced+bias+through+high-throughput%2C+massively+parallel+whole+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing.</a> BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).</li>
<li>Lamble, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+workflows+for+high+throughput+library+preparation+using+the+transposome-based+Nextera+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system.</a> BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).</li>
<li>Raley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.biorxiv.org/content/early/2014/03/25/003566">Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Tsai, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+Complexity+of+Human+Skin+Metagenomes+Using+Single-Molecule+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing.</a> MBio. 7 (1), e01948(2016).</li>
<li>Feehery, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+selectively+enriching+microbial+DNA+from+contaminating+vertebrate+host+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA.</a> PLoS One. 8 (10), e76096(2013).</li>
<li>Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+and+metagenome+sequencing%3A+Using+the+human+methyl-binding+domain+to+partition+genomic+DNA+derived+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues.</a> Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).</li>
<li>Noyszewski, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+evolution+of+the+mitochondrial+genome+in+an+alloplasmic+line+of+durum+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat.</a> BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).</li>
<li>Qiagen. QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. , 5th ed, Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2016).</li>
<li>E.M. Corporation. User Guide: Microcon Centrifugal Filter Devices. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Microcon-DNA-Fast-Flow-Centrifugal-Filter-Unit-with-Ultracel-membrane,MM_NF-MRCF0R100">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Microcon-DNA-Fast-Flow-Centrifugal-Filter-Unit-with-Ultracel-membrane,MM_NF-MRCF0R100</a> (2013).</li>
<li>Qiagen. User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2001).</li>
<li>New England BioLabs, Inc.. NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit: Instruction Manual Version 4.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/371BCB5A557C462D95D1E45E15BBFEA3/Datacards or Manuals/E2612Manual.pdf">http://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/371BCB5A557C462D95D1E45E15BBFEA3/Datacards or Manuals/E2612Manual.pdf</a> (2015).</li>
<li>Qiagen. QIAGEN Genomic DNA Handbook. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/ch/resources/">https://www.qiagen.com/ch/resources/</a> (2012).</li>
<li>PacificBiosciences. Guidelines for Using the BIO-RAD® CHEF Mapper® XA Pulsed Field Electrophoresis System. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Unsupported-Guidelines-Using-BIO-RAD-CHEFMapper-XA-Pulsed-Field-Electrophoresis.pdf">http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Unsupported-Guidelines-Using-BIO-RAD-CHEFMapper-XA-Pulsed-Field-Electrophoresis.pdf</a> (2016).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2016).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Ogihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+cereal+mitochondrial+genomes+as+revealed+by+complete+nucleotide+sequencing+of+the+wheat+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).</li>
<li>Ogihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+a+wheat+plastome+as+revealed+by+complete+sequencing+of+chloroplast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA.</a> Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).</li>
<li>International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosome-based+draft+sequence+of+the+hexaploid+bread+wheat+%28Triticum+aestivum%29+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bendich, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+chloroplasts+and+mitochondria+contain+so+many+copies+of+their+genome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?</a> Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).</li>
<li>Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+DNA+damage%2C+molecular+integrity%2C+and+copy+number+for+plastid+DNA+and+mitochondrial+DNA+during+maize+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).</li>
<li>Ma, J., Li, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+genome+copy+number+variation+and+integrity+during+moderate+maturation+of+roots+and+leaves+of+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings.</a> Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).</li>
<li>Lang, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+isolation+of+pure+and+intact+chloroplasts+and+mitochondria+from+moss+as+the+basis+for+sub-cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics.</a> Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).</li>
<li>Tobin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+plant+tissues.+Isolation+of+chloroplasts+and+mitochondria+from+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves.</a> Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).</li>
<li>PacificBiosciences. Procedure & Checklist - 10 kb to 20 kb Template Preparation and Sequencing with Low (100 ng) Input DNA. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-10-20kb-Template-Preparation-and-Sequencing-with-Low-Input-DNA.pdf">http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-10-20kb-Template-Preparation-and-Sequencing-with-Low-Input-DNA.pdf</a> (2015).</li>
<li>PacificBiosciences. Template Preparation and Sequencing Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/Guide-Pacific-Biosciences-Template-Preparation-and-Sequencing.pdf">http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/Guide-Pacific-Biosciences-Template-Preparation-and-Sequencing.pdf</a> (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Do tej pory większość badań nad sekwencjonowaniem organelli koncentruje się na tradycyjnych metodach DC w celu wzbogacenia o określone DNA. Opisano metody izolowania organelli z różnych roślin, w tym mchu40; rośliny jednoliścienne, takie jak pszenica15 i owies11; oraz rośliny dwuliścienne, takie jak rzodkiewnikpospolity (Arabidopsi) 11, słonecznik(17) i rzepak(14). Większość prot...

Sekwencjonowanie genomu to potężne narzędzie do analizy genetycznych podstaw ważnych cech roślin. Większość badań nad sekwencjonowaniem genomu koncentruje się na zawartości genomu jądrowego, ponieważ większość genów znajduje się w jądrze. Jednak genomy organellarów, w tym mitochondria (eukarionty) i plastydy (u roślin; wyspecjalizowana forma, chloroplast, działa w fotosyntezie) wnoszą istotną informację genetyczną niezbędną do rozwoju organizmu, reakcji na stres i ogólnej sprawności1. Genomy organelli są zazwyczaj włączane do całkowitej liczby ekstrakcji DNA przeznaczonych do sekwencjonowania genomu jądrowego, chociaż stosuje się również metody zmniejszania liczby organelli przed ekstrakcją DNA2. W wielu badaniach wykorzystano wyniki sekwencjonowania z całkowitej ekstrakcji gDNA w celu złożenia genomów organellarnych3,4,5,6,7. Jednakże, gdy celem badania jest skupienie się na genomach organellarnych, użycie całkowitego gDNA zwiększa koszty sekwencjonowania, ponieważ wiele odczytów jest "traconych" na rzecz sekwencji DNA jądrowego, szczególnie w roślinach o dużych genomach jądrowych. Ponadto, ze względu na duplikację i transfer sekwencji organellarów do genomu jądrowego i między organellami, rozwiązanie prawidłowej pozycji mapowania odczytów sekwencjonowania do właściwego genomu jest bioinformatyczne trudne2,8. Oczyszczanie genomów organelli z genomu jądrowego jest jedną ze strategii zmniejszania tych problemów. Dalsze strategie bioinformatyczne mogą być wykorzystane do oddzielenia odczytów, które mapują regiony homologii między mitochondriami a chloroplastami.
Chociaż genomy organelli wielu gatunków roślin zostały zsekwencjonowane, niewiele wiadomo o różnorodności genomów organellarów dostępnych w dzikich populacjach lub w hodowlanych basenach. Genomy organellarne są również znane jako dynamiczne cząsteczki, które ulegają znacznej rearanżacji strukturalnej w wyniku rekombinacji między powtarzającymi się sekwencjami9. Co więcej, wiele kopii genomu organellarnego jest zawartych w każdej organelli, a wiele organelli jest zawartych w każdej komórce. Nie wszystkie kopie tych genomów są identyczne, co jest znane jako heteroplazmia. W przeciwieństwie do kanonicznego obrazu "kręgów głównych", obecnie istnieje coraz więcej dowodów na bardziej złożony obraz struktur genomu organellarnego, w tym okręgów subgenomowych, chromosomów liniowych, konkatamerów liniowych i struktur rozgałęzionych10. Składanie genomów organelli roślinnych jest dodatkowo skomplikowane ze względu na ich stosunkowo duże rozmiary oraz znaczne odwrócone i bezpośrednie powtórzenia.
Tradycyjne protokoły izolacji organellarów, oczyszczania DNA i późniejszego sekwencjonowania genomu są często kłopotliwe i wymagają dużych ilości pobranych tkanek, przy czym jako punkt wyjścia niezbędne jest pobranie od kilku gramów do ponad setek gramów młodej tkanki liścia11,12,13,14,15,16,17. To sprawia, że sekwencjonowanie genomu organellarnego jest niedostępne, gdy tkanka jest ograniczona. W niektórych sytuacjach ilość nasion jest ograniczona, na przykład gdy konieczne jest sekwencjonowanie na podstawie pokolenia lub w męskich sterylnych liniach, które muszą być utrzymywane poprzez krzyżowanie. W takich sytuacjach organellarne DNA można oczyścić, a następnie poddać amplifikacji całego genomu. Jednak amplifikacja całego genomu może wprowadzać znaczne odchylenie sekwencjonowania, co jest szczególnym problemem przy ocenie zmienności strukturalnej, struktur subgenomowych i poziomów heteroplazmii18. Ostatnie postępy w przygotowaniu bibliotek do technologii sekwencjonowania krótkiego odczytu pozwoliły przezwyciężyć bariery związane z niskimi nakładami wejściowymi, aby uniknąć amplifikacji całego genomu. Na przykład zestaw do przygotowania biblioteki Illumina Nextera XT pozwala na użycie zaledwie 1 ng DNA jako input19. Jednak przygotowanie biblioteki standardowej do zastosowań sekwencjonowania z długim odczytem, takich jak technologie sekwencjonowania PacBio lub Oxford Nanopore, nadal wymaga stosunkowo dużej ilości wejściowego DNA, co może stanowić wyzwanie dla sekwencjonowania genomu organellarów. Ostatnio opracowano nowe protokoły sekwencjonowania z długim odczytem, opracowane przez użytkowników, aby zmniejszyć ilość danych wejściowych i ułatwić sekwencjonowanie genomu w próbkach, w których uzyskanie mikrogramowych ilości DNA jest trudne20,21. Jednak uzyskanie czystych frakcji organellarów o wysokiej masie cząsteczkowej, które zostaną wprowadzone do tych preparatów bibliotecznych, pozostaje wyzwaniem.
Staraliśmy się porównać i zoptymalizować metody wzbogacania i izolacji organellarów DNA odpowiednie dla NGS bez potrzeby amplifikacji całego genomu. W szczególności naszym celem było określenie najlepszych praktyk w celu wzbogacenia organellarnego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z ograniczonych materiałów wyjściowych, takich jak podpróbka liścia. W niniejszej pracy przedstawiono analizę porównawczą metod wzbogacania DNA organellarów: (1) zmodyfikowany, tradycyjny protokół wirowania różnicowego kontra (2) protokół frakcjonowania DNA oparty na zastosowaniu komercyjnie dostępnego podejścia pulldown białka domeny wiążącej DNA CpG-metyl22 zastosowanego do tkanki roślinnej23. Zalecamy najlepsze praktyki izolacji organellarnego DNA z tkanki liści pszenicy, które można łatwo rozszerzyć na inne rośliny i typy tkanek.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol (beta-merkaptoetanol; BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol (alkohol izopropylowy/izopropanol), bioodczynnik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>agaroza, Bio-Rad Cetified Megabase agaroza</td><td>Bio-Rad</td><td>1613108</td><td></td></tr><tr><td>waga analityczna</td><td>Mettler</td><td>Toledo AB54-S</td><td></td></tr> waga <tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>surowica bydlęca albumina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczne cylindry mielące, 3/8 cala x 7/8 cala</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Bloki kriogeniczne kompatybilne z homogenizatorem tkankowym do przechowywania probówek 50 ml</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2664</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>etanol, absolutny</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,5 M roztwór, pH 8,0</td><td>Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>system obrazowania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>żelu barwnik żelowy</td><td></td><td></td><td>Taki jak GelRed lub Ethidium</td></tr><tr><td>Bromek Tłuczek do mielenia, szeroka końcówka do probówek</td><td></td><td></td><td></td>stożkowych 2 ml</tr><tr><td>Guanidyna-HCl, roztwór 8 M</td><td>ThermoFisher</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzymy lizujące z Trichoderma harzianum</td><td>Sigma</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>G Bioscience</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>stojak magnetyczny</td><td>TermoFisher</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>probówki do mikrowirówek, LoBind 1,5 mL&nbsp;</td>Probówki do mikrowirówek <td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>, standardowe 1,5 ml bez nukleaz</td><td>Mikrowirówka Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, chłodzona</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>Legend X1R</td><td>Lub równoważny produkt, musi być w stanie osiągnąć co najmniej 18 000 x g z wirnikami do probówek 50 ml, probówek Oak Ridge i mikrowirówek 1,5 ml w</td></tr><tr><td>temperaturze pokojowej</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>lub równoważny produkt, musi być w stanie osiągnąć co najmniej 18 000 x g z rotorem dla probówek do mikrowirówek 1,5 ml i 2 ml</td></tr><tr><td>Microcon DNA Filtry odśrodkowe o szybkim przepływie</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCFOR100</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth, 1 kwadrat na próbkę przycięty tak, aby pasował do lejka</td><td>EMD Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Zestaw do wzbogacania DNA mikrobiomu New</td><td>England Biolabs</td><td>E2612L</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe doniczki i tace</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poliwinylopirolidon (PVP)</td><td>Fisher</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (np. CHEF DR III)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1703697</td><td></td></tr><tr><td>kulki oczyszczające, koraliki Agencourt AMpureXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 20/g Zestaw do ekstrakcji DNA z końcówką genomiczną</td><td>Qiagen</td><td>10223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB (bufor elucyjny)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji DNA Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>19060</td><td></td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19015</td><td></td></tr><tr><td>qPCR maszyna (np. Roche Light Cycler 480)</td><td></td>Folia uszczelniająca do płytek Roche <td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td> Roche <td></td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR, płytka 96-dołkowa</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td></td></tr><tr><td>Kubit&nbsp; probówki</td><td>testowe Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitów o szerokim spektrum</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitów o wysokiej czułości</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNazaA</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne (20 ml) i pipeta</td><td>Fisher</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Małe lejki, 1 na próbkę</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Miękki pędzel, 2 na próbkę</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder lub inny rodzaj homogenizatora tkankowego</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>Lub inny porównywalny homogenizator tkankowy. Jeśli nie masz dostępu do homogenizatora tkankowego, wystarczy zmielić go w schłodzonym moździerzu i tłuczku (szczegóły w protokole). Jednak homogenizator zapewni bardziej spójne wyniki, a całkowity czas homogenizacji zostanie skrócony.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Omnipure</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>termomikser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T2819-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>probówki obrotowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 50 ml stożkowy polipropylen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>probówki z polipropylenu szybkotnącego 50 ml&nbsp;</td><td>ThermoScientific/Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>np. probówki Nalgene Oakridge lub równoważna</td></tr> woda do <tr><td>kąpieli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wermikulitowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, sterylna i certyfikowana wolna od nukleaz&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1481</td><td></td></tr><tr><td>woda, sterylna milliQ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek dna roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Genomy organelli roślinnych zawierają duże, powtarzalne elementy, które mogą ulegać parowaniu lub rekombinacji, tworząc złożone struktury i/lub fragmenty subgenomowe. Genomy organellarne istnieją również w domieszkach w obrębie danego typu komórki lub tkanki (heteroplazmia), a obfitość podtypów może zmieniać się w trakcie rozwoju lub pod wpływem stresu (przesunięcie substechiometryczne). Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) są niezbędne do głębszego zrozumienia struktury i funkcji genomu organellarów. Tradycyjne badania sekwencjonowania wykorzystują kilka metod w celu uzyskania organellarnego DNA: (1) Jeśli używana jest duża ilość tkanki wyjściowej, jest ona homogenizowana i poddawana wirowaniu różnicowemu i/lub oczyszczaniu gradientowemu. (2) Jeśli używana jest mniejsza ilość tkanki (tj. jeśli nasiona, materiał lub przestrzeń są ograniczone), przeprowadza się ten sam proces, co w (1), po którym następuje amplifikacja całego genomu w celu uzyskania wystarczającej ilości DNA. (3) Analiza bioinformatyczna może być wykorzystana do sekwencjonowania całkowitego genomowego DNA i do analizowania odczytów organellarów. Wszystkie te metody wiążą się z nieodłącznymi wyzwaniami i kompromisami. W (1) uzyskanie tak dużej ilości tkanki wyjściowej może być trudne; w (2) amplifikacja całego genomu może wprowadzić błąd sekwencjonowania; a w (3) homologia między genomami jądrowymi i organellarnymi może zakłócać składanie i analizę. W roślinach z dużymi genomami jądrowymi korzystne jest wzbogacanie DNA w organellary w celu zmniejszenia kosztów sekwencjonowania i złożoności sekwencji w analizach bioinformatycznych. W tym miejscu porównujemy tradycyjną metodę wirowania różnicowego z czwartą metodą, dostosowanym podejściem CpG-methyl pulldown, w celu rozdzielenia całkowitego genomowego DNA na frakcje jądrowe i organellarne. Obie metody dają wystarczającą ilość DNA dla NGS, DNA, które jest wysoce wzbogacone o sekwencje organellarne, choć w różnych proporcjach w mitochondriach i chloroplastach. Przedstawiamy optymalizację tych metod dla tkanki liści pszenicy i omawiamy główne zalety i wady każdego podejścia w kontekście wprowadzania próbki, łatwości protokołu i dalszego stosowania.

Protokoły przedstawione w niniejszym manuskrypcie opisują dwie odrębne metody wzbogacania DNA organellarnego z tkanki roślinnej. Warunki tutaj zaprezentowane odzwierciedlają optymalizację dla tkanki pszenicy. Porównanie kluczowych etapów protokołów, wymaganej ilości materiału tkankowego oraz uzyskanej ilości DNA przedstawiono na Rysunku 1. Kroki protokołu DC, które przetestowaliśmy, opierają się na warunkach podobnych do opisanych wcześniej (<strong class="xf...

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest porównanie dwóch metod stosowanych do izolowania wysokiej jakości DNA organellarów, zarówno DNA plastydowego, jak i mitochondrialnego z tkanki liści roślinnych, która nadaje się do sekwencjonowania nowej generacji. Metody te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak zakres różnorodności organelli w różnych taksonach oraz wpływ zmian w sekwencji lub strukturze genomu organellarów na rozwój i reakcję na stres. Porównamy dwie techniki, metodę wirowania różnicowego, która wzbogaca o jeden konkretny typ organellarów, oraz technikę metafrakcjonowania, która odzyskuje całkowite DNA organelli z mniejszych próbek zamrożonych tkanek.Standardową procedurą uprawy sadzonek pszenicy jest sadzenie nasion w wermikulicie, w kwadratowych doniczkach z czterema do sześciu nasion w rogu. Przenieś doniczki do szklarni z 16-godzinnym cyklem świetlnym. Podlewaj rośliny każdego dnia.Rośliny nawozić jedną czwartą łyżeczki granulowanego nawozu 20-20-20 MPK po wykiełkowaniu i ponownie po siedmiu dniach od wykiełkowania. Do uwodzenia siewek pszenicy, nasion roślin i pielęgnacji roślin jak w standardowej procedurze. Ale umieść doniczki w ciemnej komorze wzrostu.Alternatywą dla uprawy tych sadzonek w ciemnej komorze wzrostowej jest przykrycie roślin w szklarni, ale z odpowiednią wentylacją. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyizolowanie organelli. Zbierz pięć gramów świeżej tkanki i opłucz ją w zimnej, sterylnej wodzie w schłodzonej zlewce na lodzie.Za pomocą nożyczek pokrój tkankę liścia na około centymetrowe kawałki bezpośrednio do wstępnie schłodzonej 50-milimetrowej rurki zawierającej dwa ceramiczne cylindry mielące. Próbki należy przechowywać na lodzie przez cały czas trwania procedury. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, ważne jest, aby wymieniać nożyczki między próbkami.Pobrać próbki do dygestorium i dodać 20 mililitrów buforu STE do każdej 50-mililitrowej probówki. Umieścić próbki we wstępnie schłodzonych kriogenicznych blokach mielących w aparacie do mielenia tkanek i mielić próbki przez 30 sekund z prędkością 1 750 obrotów na minutę. Umieścić próbki na lodzie na około jedną minutę.Obracaj pozycje próbki i miel przez kolejne 30 sekund z prędkością 1 750 obrotów na minutę. Włóż próbki z powrotem do pojemnika na lód. Dla każdej próbki włóż lejek do czystej 50-mililitrowej rurki umieszczonej w lodzie i umieść jedną warstwę tkaniny filtracyjnej w lejku.Wstępnie zwilż tkaninę filtracyjną pięcioma mililitrami buforu STE i zachowaj przepływ. Wlej homogenizowaną tkankę do lejka. Przepłucz rurkę mielącą 15 mililitrami buforu STE, zamknij i odwróć probówkę, aby przepłukać ścianki i pokrywkę, a następnie wlej jej zawartość do lejka.Ostrożnie usuń kamienie ceramiczne, a następnie ściśnij i wykręć ściereczkę filtracyjną do lejka. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, należy zmieniać rękawice między próbkami. Owiń nakrętki tubek folią parafinową, aby uniknąć rozlania.Wirować w temperaturze 2 000 x G, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety serologicznej ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu i umieścić go w 50-mililitrowej probówce wirówki o dużej prędkości ze szczelną uszczelką. Umieść małą zlewkę z lodem na wadze, rozerwij wagę i zważ każdy supernatant.Użyj buforu STE, aby zrównoważyć probówki z dokładnością do 0,1 grama, a następnie odwirować w temperaturze 18 000 x G w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu wirowania należy umieścić próbki z powrotem w dygestorium i odrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr buforu ST do granulatu i delikatnie zawieś ponownie za pomocą miękkiego pędzla.Dodaj 24 mililitry buforu ST, aby uzyskać końcową objętość 25 mililitrów. Delikatnie obracaj pędzlem w zawiesinie, aby wymieszać, a następnie naciśnij pędzel z boku tubki, aby usunąć cały płyn przed wyjęciem pędzla. Po zważeniu probówek odwirować w temperaturze 18 000 x G w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.Podczas tego wirowania należy przygotować roztwór DNA 1 zgodnie z opisem w protokole tekstowym i podaszkować 200 mikrolitrów do probówki o pojemności 1,5 mililitra na próbkę. Po zakończeniu wirowania wyrzucić supernatant i osuszyć probówkę. Do każdej probówki wirówki o dużej prędkości dodaj 300 mikrolitrów buforu STE i ponownie zawieś osad za pomocą miękkiego pędzla.Umieść pędzel w przygotowanej wcześniej 1,5 mililitrowej tubce zawierającej 200 mikrolitrów roztworu DNA 1 i zakręć pędzlem, aby usunąć resztki granulek, które utknęły w pędzlu. Odpipetować roztwór DNA 1 do probówki wirówki o dużej prędkości i delikatnie zamieszać, aby wymieszać. Owiń folię parafinową wokół górnej części każdej probówki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 30 minut.Podczas inkubacji delikatnie wymieszać, mieszając. Za pomocą końcówki pipety z szerokim otworem delikatnie odpipetuj mieszaninę granulek z probówki i umieść ją w 1,5 mililitrowej probówce o niskim stopniu wiązania. Dodaj 500 mikrolitrów 400 milimolowego EDTA, pH 8,0 do probówki wirówki o dużej prędkości.Delikatnie odpipetować, aby całkowicie usunąć resztki osadu i przenieść EDTA do probówki o niskim stopniu wiązania zawierającej mieszaninę peletów. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Wirować w temperaturze 18 000 x G, w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.Następnie wyrzuć supernatant, osusz każdą probówkę i natychmiast użyj osadu do izolacji DNA. W tej metodzie DNA organellarne jest wzbogacane z całkowitego genomowego DNA, które zostało wyekstrahowane za pomocą komercyjnych kolumn do ekstrakcji DNA. Przygotuj wymaganą ilość kulek magnetycznych związanych z białkiem MBD2 FC, zgodnie z instrukcjami producenta i skaluj reakcje do użycia od jednego do dwóch mikrogramów całkowitego wejściowego DNA.W tej demonstracji potrzeba 160 mikrolitrów kulek na jeden mikrogram całkowitego wejściowego DNA. Aby wychwycić metylowane jądrowe DNA, dodaj jeden mikrogram wejściowego DNA do probówki zawierającej 160 mikrolitrów kulek magnetycznych związanych MBD2 dla każdej pojedynczej próbki i delikatnie pipetuj w górę iw dół końcówką o szerokim otworze. Dodać odpowiednią objętość 5x buforu do płukania wiązań, aby uzyskać końcowe stężenie 1x i odpipetować próbkę w górę iw dół końcówką o szerokim otworze, kilka razy w celu wymieszania.Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dla powodzenia ściągania w dół bardzo ważne jest dokładne wymieszanie kulek podczas inkubacji, zwłaszcza jeśli występuje znaczne zbrylanie się kulek. Aby zapobiec zbrylaniu się kulek i zapewnić ściąganie metylowanego DNA, delikatnie pipetuj próbki końcówką pipety o szerokim otworze i przesuwaj próbki dwa do trzech razy przez cały czas inkubacji.Krótko zakręć probówkami zawierającymi mieszaninę DNA i kulek magnetycznych. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na co najmniej pięć minut, aby zebrać koraliki z boku rurek. Roztwór powinien wydawać się klarowny, zawiera niemetylowane DNA wzbogacone w organellary.Używając końcówek o szerokim otworze, ostrożnie usunąć oczyszczony supernatant bez naruszania kulek i przenieść supernatant do czystej, nisko wiążącej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki. Próbki należy przechowywać w temperaturze 20 lub 80 stopni Celsjusza. Test Ostrej reakcji PCR zastosowano do oceny względnej liczebności trzech implikonów specyficznych dla organelli w całkowitym genomowym DNA i organellarnej frakcji DNA uzyskanej za pomocą obu metod.Ogólnie rzecz biorąc, dane wskazują, że metoda wirowania różnicowego preferencyjnie wzbogaca mitochondria. Niemetylowana frakcja metylofrakcjonowanego całkowitego genomowego DNA wykazuje znaczne wzbogacenie obu implikonów organellarnych. Procenty odczytów zmapowanych do mitochondriów lub chloroplastów chińskiej wiosny i genomów referencyjnych pszenicy uprawianej chris są zgodne z wynikami QPCR.Wirowanie różnicowe daje DNA, które jest bardziej wzbogacone w DNA mitochondriów, a frakcjonowanie metylowe daje DNA, które prawdopodobnie odzwierciedla natywną obfitość dwóch genomów organellarnych. Etykiety próbek, w tym E, oznaczają próbki idylowe, a NE oznaczają próbki nieidylowe. Co ciekawe, idylacja nie zmieniła liczebności organelli.W obu metodach teoretyczne pokrycie mitochondriów lub genomów odnoszących się do chloroplastów przekracza 100-krotne pokrycie, nawet gdy 12 bibliotek dokonało aremultipleksacji. Całkowite genomowe DNA migruje jako rozproszony rozmaz w elektroforezie żelowej po polowej elektroforezie i przekracza 50 kilozasad. Frakcja jądrowa po metylofrakcjonowaniu zmniejsza swoją wielkość, ale pozostaje wyśrodkowana wokół 50 kilozasad, co sugeruje, że metylofraktiozanty DNA jest najbardziej odpowiednie do sekwencjonowania z długim odczytem.Po opanowaniu, obie techniki ekstrakcji organellarnego DNA można wykonać w ciągu jednego do dwóch dni, od pobrania próbki do oceny produktu końcowego, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Technika metylofrakcjonowania może znacznie rozszerzyć zakres badań DNA organelli na rzadkie i trudne próbki, ponieważ ilość danych wejściowych do tkanek jest niezwykle niska. Jednak wirowanie różnicowe może być nadal preferowane, gdy do dalszych badań wymagane jest wyłącznie DNA mitochondriów.Podobnie, etapy wirowania można dostosować tak, aby w razie potrzeby preferencyjnie ekstrahować DNA plastydowe. Obie metody ekstrakcji DNA organellarów dają DNA, które nadaje się do sekwencjonowania nowej generacji, ale frakcjonowanie metylowe daje DNA o wysokiej szybkości cząsteczkowej, które jest idealne do sekwencjonowania z długim odczytem.

optimization-comparative-analysis-plant-organellar-dna-enrichment

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Opisana tutaj jest metoda ekstrakcji, oczyszczania i kontroli jakości genomowego DNA z obligatoryjnego biotroficznego patogenu grzybowego, mączniaka prawdziwego, do użycia w długotrwałym sekwencjonowaniu genomu.

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

Ten artykuł demonstruje szczegółowy protokół izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z materiału zielnikowego, w tym ratowania wyjątkowo niskiej jakości DNA.

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Niniejszy protokół opisuje użycie technologii kodów kreskowych DNA do uwierzytelniania materiałów leczniczych pochodzenia roślinnego, oraz rośliny leczniczej Angelica sinensis (Oliv.) Jako przykład wskazano Diels.

Zastosowanie barkodowania DNA do identyfikacji roślin leczniczych

Poznaj metody izolacji DNA organelli roślinnych do sekwencjonowania nowej generacji. Porównaj wirowanie różniczkowe i frakcjonowanie metylacyjne pod kątem wydajności i jakości DNA.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów