Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Badania nad funkcją genów i chorobami są utrudnione przez niekrewniaczą naturę populacji ludzkiej. Różne tła genetyczne specyficznych dla pacjenta i kontrolnych linii komórkowych iPS mogą wpływać na efektywność różnicowania i fenotypy występujące w danym teście funkcjonalnym. Wykorzystanie genetycznie identycznych lub izogenicznych linii, w przypadku których jedyną różnicą jest konkretna mutacja będąca przedmiotem zainteresowania, ma kluczowe znaczenie dla przezwyciężenia tych problemów.

Wiele chorób u ludzi jest spowodowanych mutacjami heterozygotycznymi, które mogą być trudne do wygenerowania za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Wynika to z generowania mutacji indel w niedocelowym allelu, które mogą występować z bardzo dużą częstotliwością. Nasza technika rozwiązuje ten problem dzięki użyciu dwóch szablonów naprawczych, z których tylko jeden zawiera mutację, która nas interesuje.

Każdy badacz próbujący tej techniki powinien być wykwalifikowany w hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Demonstracja wideo zbierania kolonii będzie pomocna w pokazaniu prawidłowej wielkości i morfologii, a także techniki stosowanej do zbierania i przesiewania. Demonstracją tej procedury będzie Leo Cardenas.

Na początek umieść ludzkie ESC na napromieniowanych MEF-ach w 6-dołkowej płytce. Przygotuj główną mieszankę transfekcji. Wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, dodaj mieszankę wzorcową transfekcji kroplami do każdej studzienki z komórkami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zmieniaj nośnik co 24 godziny. Aby zebrać komórki, najpierw inkubuj komórki z Triple E przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby enzymatycznie usunąć MEF.

Dodać 0,5 mililitra pożywki HESC z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Osadzaj komórki w ilości 300 razy g przez trzy minuty i ponownie zawiesić w 0,5 mililitra ludzkiego podłoża ESC z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Przefiltruj zawiesinę komórek do pięciomililitrowej probówki przez nasadkę sitka o średnicy 35 mikronów.

Korzystając z sortowania komórek aktywowanych fluorescencją, włącz żywe komórki i posortuj zielone fluorescencyjne komórki dodatnie pod względem białek. Następnie przenieś maksymalnie 1,5 razy 10 do czterech posortowanych komórek bezpośrednio do 10-centymetrowej płytki pokrytej jedną do trzech macierzy błony podstawnej i napromieniowanymi MEF oraz ludzkim podłożem ESC zawierającym inhibitor ROCK. Zmieniaj pożywkę codziennie, używając ludzkiej pożywki ESC bez inhibitora ROCK.

Po 10 do 15 dniach kolonie mają około jednego do dwóch milimetrów średnicy. Pod mikroskopem użyj pipety P200, aby ostrożnie zeskrobać pojedynczy klon i pobrać komórki do pipety. Rozproszyć komórki w studzience na 96-dołkowej płytce, delikatnie pipetując trzy do czterech razy w pożywce pobranej z kolonią.

Następnie wybierz 20 kolonii dla każdego przewodnika RNA i dozuj do probówek paskowych PCR w celu przeprowadzenia badań przesiewowych. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut. Teraz inkubuj granulki komórek w 20 mikrolitrach buforu proteinazy K, aby energicznie wyizolować DNA i wirować.

Wirować przy 10 000 razy G przez pięć minut. Następnie wykonaj przesiewowy PCR edytowanego DNA. Dodać do probówek 20 mikrolitrów mieszanki wzorcowej, w tym startery do przodu i do tyłu, przeznaczone do amplifikacji obszaru zainteresowania, a także pięć mikrolitrów trawienia proteinazy K.

Użyj genomowego DNA wyizolowanego z kontrolnej linii iPSC, aby potwierdzić czysty amplikon podczas wykonywania przesiewowego PCR. Oceń zmiany wielkości produktów PCR po jednej godzinie elektroforezy przy napięciu od 70 do 90 woltów na żelu agarozowym o napięciu 2,5% objętości. Każda różnica w wielkości wskazuje na łupliwość.

Aby transfekować jednoniciowy oligo DNA i plazmidy CRISPR-Cas9, należy umieścić docelową linię komórkową w 6-dołkowym naczyniu na napromieniowanych MEF-ach, aby osiągnąć 70 do 80% konfluencji po ponad całonocnej inkubacji. Ustawić reakcję transfekcji zgodnie z opisem. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj kroplami mieszaninę reakcji transfekcji do komórek. Po 48 godzinach przygotuj komórki do sortowania komórek jak poprzednio. Około 10 dni po posianiu pojedynczych komórek użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby pobrać kolonie do probówek paskowych do PCR i do dołka 12-dołkowej płytki wstępnie pokrytej żelatyną i MEF.

Przenieść 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki na 24- lub 48-dołkowej płytce, uprzednio pokrytej żelatyną i napromieniowanych MEF w ludzkim pożywce ESC z inhibitorem ROCK. Użyj pozostałych 100 mikrolitrów do izolacji DNA. Aby sprawdzić, czy integracja pojedynczej nici oligo DNA, należy pobrać pięć mikrolitrów DNA wyizolowanych z każdej kolonii, aby przeprowadzić PCR przy użyciu wcześniej zaprojektowanych starterów przesiewowych.

Oczyść produkty PCR i przygotuj 40 mikrolitrów trawienia enzymem restrykcyjnym przy użyciu unikalnego miejsca enzymatycznego utworzonego w jednoniciowym oligo DNA. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować w temperaturze zalecanej przez producenta przez jedną do trzech godzin. Następnie wyobraź sobie strawione produkty PCR dodane za pomocą barwnika ładującego na żelu agarozowym bromku etydyny o sile 1,5% objętości, elektroforezy pod napięciem od 80 do 100 woltów przez 40 minut.

Jeśli nastąpiła udana integracja jednoniciowego oligo DNA, sekwencjonuj specyficzne mutacje za pomocą zagnieżdżonego startera. W tym badaniu, w celu budowy przewodnika RNA, z 1,5% żelu agarozowego wycięto pasmo 100 par zasad. Po transfekcji komórek zwizualizowano walidację cięcia przewodnikowego RNA przy użyciu 2,5% żelu agarozowego.

Produkt PCR ze 180 parami zasad wykazał nieoszlifowaną kontrolę i różne klony z przesunięciami pasm wskazującymi na tworzenie się indel. Różne przewodniki RNA miały różną wydajność cięcia. Aby uniknąć ponownego cięcia edytowanych alleli przez CRISPR-Cas9, sekwencja PAM została zmodyfikowana przy użyciu cichej mutacji G do A.

Cicha mutacja w sekwencji PAM wygenerowała unikalne miejsce restrykcyjne, które pomaga w badaniach przesiewowych pod kątem udanej integracji z jednym lub dwoma allelami. Linie komórek macierzystych z edytowanym genomem mogą być wykorzystywane w dalszym różnicowaniu i testach funkcjonalnych w celu zbadania wpływu danej mutacji na rozwój i chorobę człowieka. Metodologia ta pozwala na generowanie izogenicznych linii komórkowych ze specyficznymi heterozygotycznymi lub homozygotycznymi mutacjami, związanymi z wieloma różnymi chorobami człowieka.

Te modele chorób torują drogę do rozwoju nowych terapii komórkowych, a także oferują platformy do odkrywania leków.