Name: Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę generowania zdefiniowanych mutacji heterozygotycznych i homozygotycznych przy użyciu CRISPR-Cas9 w ludzkich komórkach macierzystych. Technika ta umożliwia tworzenie izogenicznych linii komórkowych do badań nad funkcją genów i chorobami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez fundusze z National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health poprzez granty U01HL099656 (P.G. i D.L.F.) oraz U01HL134696 (P.G. i D.L.F.).

1. Projektowanie i budowa przewodnika RNA (gRNA)
UWAGA: Każdy gRNA składa się z dwóch oligonukleotydów o długości 60 par zasad (bp), które są wyżarzane w celu wytworzenia dwuniciowego (ds) oligonukleotydu o gęstości 100 pz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-C). Czas na projektowanie, generowanie i testowanie wydajności cięcia gRNA wynosi około 2 tygodni (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
<ol>
	<li>Wybierz region DNA interesujący Cię do edycji genomu i zidentyfikuj 3-4 sekwencje 23 pz, które pasują do formatu 5'-G(N19)NGG-3'. Sekwencje te powinny znajdować się w odległości nie większej niż 20 pz od obszaru zainteresowania. 
	UWAGA: Celowanie można wykonać na nici sense lub anti-sense.</li>
	<li>Oceń sekwencje gRNA pod kątem redundancji genomu i prawdopodobieństwa niecelowania, korzystając z zasobu takiego jak CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>Włącz sekwencję docelową 20 pz (z wyłączeniem motywu sąsiadującego z protospacerem lub PAM) do dwóch 60-merowych oligonukleotydów, jak pokazano (sekwencje mają od 5 'do 3', a czerwony i zielony są odwrotnymi dopełniaczami, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Zamów dwa oligonukleotydy 60 pz od wybranego dostawcy. Po otrzymaniu oligonukleotydów zawiesić każdy z nich do końcowego stężenia 100 μM w ddH2O. Wykonać zapas roboczy o wielkości 10 μM.</li>
	<li>Wyżarz dwa oligonukleotydy i wygeneruj fragment dsDNA o długości 100 pz za pomocą polimerazy DNA (tabela materiałów). Połączyć 5 μl oligonukleotydu 10 μM i 5 μl 10 μM odwróconego oligonukleotydu w probówce paskowej do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 min. Schłodzić reakcję przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Skonfiguruj PCR zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przeprowadzić amplifikację PCR w termocyklerze, stosując parametry przedstawione w tabeli 2.</li>
	<li>Wizualizuj produkty PCR na 1,5% (w/v) bromku etydyny (EtBr) w żelu agarozowym elektroforezowanym pod napięciem 80-100 V przez 40 minut. Wytnij pasmo 100 pz (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A), wizualizowane na kasetonie LED, z żelu za pomocą żyletki i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Projektowanie starterów PCR do badań przesiewowych
<ol>
	<li>Wykonaj badania przesiewowe edytowanego DNA przy użyciu starterów PCR do przodu i do tyłu, które są specjalnie zaprojektowane do amplifikacji regionu 400-500 pz interesującego genu (Tabela 2). Użyj DNA wyizolowanego z dowolnej kontrolnej linii iPSC, aby potwierdzić czysty amplikon podczas wykonywania przesiewowego PCR.</li>
	<li>Wizualizacja produktów PCR na żelu 1,5% (w/v) po elektroforezie w napięciu 80-100 V przez 1 h. 
	UWAGA: Sekwencjonowanie edytowanych klonów odbywa się przy użyciu zagnieżdżonego startera, który został zaprojektowany po potwierdzeniu zestawu starterów przesiewowych. Próbki są wysyłane do źródła komercyjnego w celu sekwencjonowania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie plazmidu wektorowego gRNA_cloning
<ol>
	<li>Aby zlinearyzować wektor klonujący, weź probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml i dodaj 1-5 μg DNA wektora gRNA_cloning wraz z 4 μl buforu enzymu restrykcyjnego AflII i 1,5 μl enzymu restrykcyjnego AflII. Doprowadzić reakcję do 24 μlddH2O. Wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (O/N).</li>
	<li>Elektroforeza na 1% żelu agarozowym przy 80-100 V przez 1 h i pasma akcyzowe (przewidywana wielkość pasma to ~3519 pz).</li>
	<li>Wyodrębnij i oczyść jak w kroku 1.6.</li>
</ol>
4. Składanie wektora gRNA
<ol>
	<li>Ustaw reakcje i złóż fragmenty DNA za pomocą zestawu montażowego (tabela materiałów) w proporcjach 1:5 wektora klonowania gRNA strawionego AflII do oczyszczonej w żelu wstawki 100 pz, jak opisano w tabeli 3.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 50 °C przez 15 minut. Rozcieńczyć reakcję w stosunku 1:3 w ddH2O i użyć 3 μl do przemiany bakteryjnej, zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Płytki na płytkach z kanamycyną LB/agarem.</li>
	<li>Wybierz 3-5 kolonii na gRNA. Zaszczepić każdą kolonię w 4 ml LB i hodować O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym.</li>
	<li>Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do izolacji plazmidu miniprep i zsekwencjonuj każde gRNA przy użyciu następujących starterów, aby zapewnić pomyślne klonowanie: Naprzód: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Rewers: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.</li>
</ol>
5. Przetestuj skuteczność cięcia gRNA
<ol>
	<li>Płytki hESC na napromieniowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w 6-dołkowej płytce, jak wcześniej opisano21. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, przygotuj główną mieszankę transfekcji opisaną w Tabeli 4.</li>
	<li>Mieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodawać kroplami do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin (z wymianą pożywki po 24 godzinach).</li>
	<li>Zebrać komórki do sortowania po 48 godzinach.
	<ol>
		<li>Usunąć MEF enzymatycznie (tabela materiałów) za pomocą 3-minutowej inkubacji RT.</li>
		<li>Przepłukać komórki 1x pożywką hESC (Tabela 5) i zeskrobać do pożywki hESC + 10 μM dichlorowodorku Y-27632 (tabela materiałów).</li>
		<li>Osadzać komórki w 300 x g przez 3 minuty i ponownie zamieszać w 0,5 ml pożywki hESC + 10 μM dichlorowodorku Y-27632.</li>
		<li>Przefiltrować do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę z sitkiem o pojemności 35 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), włącz żywe komórki i posortuj komórki dodatnie w kolorze zielonego białka fluorescencyjnego (GFP).</li>
	<li>Przenieść maksymalnie 1,5 x 104 posortowane komórki bezpośrednio do naczynia o średnicy 10cm2 pokrytego matrycą błony podstawnej w stosunku 1:3 (tabela materiałów) i napromienionych MEF w pożywce hESC (tabela 5) zawierającej dichlorowodorek Y-27632.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę codziennie za pomocą pożywki hESC (Tabela 5) bez dichlorowodorku Y-27632 i ręcznie wybieraj klony po 10-15 dniach, gdy kolonie mają średnicę ~1 mm.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety P200 i mikroskopu ostrożnie zeskrob pojedynczy klon i wciągnij komórki do pipety.</li>
		<li>Rozproszyć komórki, delikatnie pipetując 3-4 razy w 96-dołkowej płytce w pożywce pobranej z kolonią.</li>
		<li>Dozować do probówek paskowych PCR w celu przesiewania i granulować komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut. Wybierz 20 kolonii na gRNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Pokaz klonów
<ol>
	<li>Wyizolować DNA przez inkubację osadów komórkowych w 20 μl buforu proteinazy K (Tabela 5) (1 h w temperaturze 55 °C i 10 min w temperaturze 95 °C) i energicznie wirować. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.</li>
	<li>Przeprowadzić przesiewową reakcję PCR (sekcja 2) w całkowitej objętości 20 μl, używając mieszanki wzorcowej zawierającej startery przeznaczone do amplifikacji obszaru zainteresowania i 5 μl trawienia proteinazy K. Użyj genomowego DNA wyizolowanego z linii komórkowej, która była edytowana genowo jako kontrola.</li>
	<li>Oceń zmiany wielkości produktów PCR po 1-godzinnej elektroforezie przy napięciu 70-90 V na 2,5% (w/v) żelu agarozowym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, C). Każda różnica w wielkości wskazuje na łupliwość.</li>
</ol>
7. Precyzyjna edycja genomu w pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu jednoniciowego oligo DNA (ssODNs)
<ol>
	<li>Zaprojektuj 100 bp ssODN skoncentrowane wokół najbardziej wydajnej sekwencji gRNA, która ma najlepszą wydajność cięcia.</li>
	<li>Zapobiegaj ponownemu rozszczepieniu rekombinowanego ODN poprzez wprowadzenie cichych mutacji w sekwencji gRNA. Wystarczy pojedyncza cicha mutacja w sekwencji PAM, ale jeśli nie jest to możliwe, zadziałają 3-4 ciche mutacje. 
	UWAGA: Aby ułatwić badania przesiewowe docelowych klonów, idealnym rozwiązaniem jest wprowadzenie miejsca restrykcyjnego w obrębie ~20 pz sekwencji gRNA.</li>
	<li>Zaprojektuj jeden ODN z pożądanymi zmianami zasadowymi, aby utworzyć mutację będącą przedmiotem zainteresowania i jeden ODN bez zmian zasadowych. 
	UWAGA: Zmiany te nie powinny być większe niż ~20 pz od przewidywanego miejsca cięcia CRISPR/CAS9, ponieważ rekombinacja znacznie spada przy większych odległościach.</li>
	<li>Zamów dwa ssODN od wybranego dostawcy i ponownie zanurz je w wodzie, aby uzyskać zapas 1 μg/μl. Przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
8. Ustawienia transfekcji
<ol>
	<li>Aby transfekować plazmidy ssODN i CRISPR-CAS9, należy umieścić docelową linię komórkową w 6-dołkowym naczyniu na napromieniowanych MEF-ach, aby osiągnąć 70-80% konfluencji po inkubacji O/N.</li>
	<li>Ustawić reakcję transfekcji zgodnie z opisem w tabeli 6. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze suchej masy. Mieszaninę reakcji transfekcji dodawać kroplami do komórek.</li>
	<li>Po 48 godzinach przygotować komórki do sortowania komórek zgodnie z opisem w sekcji 5.3.</li>
	<li>Zbieraj kolonie ~10 dni po posianiu pojedynczych komórek za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Przenieść 100 μl komórek do jednego dołka na 24- lub 48-dołkowej płytce uprzednio pokrytej żelatyną i napromienionych MEF w pożywce hESC dichlorowodorkiem Y-27632. Pozostałe 100 μl należy wykorzystać do izolacji DNA, jak opisano w punkcie 6.</li>
</ol>
9. Sprawdzanie mutacji w pojedynczych koloniach
<ol>
	<li>Aby sprawdzić, czy integracja ssODN przebiegła pomyślnie, należy pobrać 5 μl DNA wyizolowanego z każdej kolonii w celu przeprowadzenia PCR przy użyciu starterów przesiewowych zaprojektowanych w sekcji 2. Oczyść produkty PCR (tabela materiałów) i przygotuj trawienie enzymem restrykcyjnym przy użyciu unikalnego miejsca enzymatycznego utworzonego w ssODN. 
	UWAGA: To trawienie obejmuje również bufor enzymu restrykcyjnego i zalecane przez producenta stężenie enzymu restrykcyjnego w objętości 40 μl.</li>
	<li>Wymieszać reakcję pipetując i inkubować w temperaturze zalecanej przez producenta przez 1-3 godziny.</li>
	<li>Wizualizację strawionych produktów PCR na 1,5% (w/v) żelu agarozowym EtBr elektroforezowanym pod napięciem 80-100 V przez 40 minut. Jeśli nastąpiła pomyślna integracja ssODN, sekwencjonuj specyficzne mutacje za pomocą zagnieżdżonego startera.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations%3A+Lessons+from+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm%2C+Development+of+the+Pancreas%2C+and+Functionality+of+Pancreatic+%CE%B2+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li>
<li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole wykazano zastosowanie CRISPR-CAS9 wraz z dwoma matrycami naprawczymi ssODN do generowania specyficznych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Metoda ta pozwoliła na pomyślne wygenerowanie izogenicznych linii komórkowych wyrażających heterozygotyczne zmiany genomowe ze skutecznością bliską 10%. Protokół ten został zoptymalizowany zarówno dla ludzkich ESC, jak i iPSC hodowanych na napromieniowanych MEF-ach, które wspomagają wzrost i przeż...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są cennymi narzędziami do modelowania chorób ludzkich ze względu na ich zdolność do odnowy, przy jednoczesnym zachowaniu zdolności do generowania typów komórek o różnych liniach1,2,3,4. Modele te otwierają możliwość zbadania funkcji genów i zrozumienia, w jaki sposób określone mutacje i fenotypy są powiązane z różnymi chorobami5,6. Jednak, aby zrozumieć, w jaki sposób konkretna zmiana jest powiązana z określonym fenotypem, ważne jest użycie sparowanych izogenicznych linii kontrolnych i zmutowanych komórek w celu kontrolowania zmienności między liniami7,8. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i nukleazy palca cynkowego zostały wykorzystane do generowania mutacji insercji lub delecji (indeli) w różnych modelach genetycznych, w tym w komórkach pierwotnych; Ale te nukleazy mogą być kłopotliwe w użyciu i drogie9,10,11,12,13,14. Odkrycie zgrupowanej, regularnie rozmieszczonej krótkiej powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-CAS9 zrewolucjonizowało tę dziedzinę ze względu na wydajność tworzenia indel w praktycznie każdym regionie genomu, prostotę użycia i obniżenie kosztów15,16,17,18,19.
Wyzwaniem w korzystaniu z technologii edycji genomu opartej na CRISPR-CAS9 było generowanie lub korygowanie określonych mutacji w jednym allelu bez tworzenia mutacji indel w drugim allelu20. Głównym celem tego protokołu jest przezwyciężenie tego wyzwania poprzez zastosowanie dwóch jednoniciowych matryc naprawczych oligonukleotydów (ssODN) w celu zmniejszenia tworzenia się indelu w drugim allelu. Oba ssODN są zaprojektowane tak, aby zawierały ciche mutacje, aby zapobiec ponownemu cięciu przez nukleazę CAS9, ale tylko jeden zawiera zmianę będącą przedmiotem zainteresowania. Metoda ta zwiększa efektywność generowania specyficznej heterozygotycznej modyfikacji genetycznej bez indukowania tworzenia indeli w drugim allelu. Korzystając z tego protokołu, eksperymenty z edycją genów w sześciu niezależnych lokalizacjach genomowych wykazują precyzyjne wprowadzenie pożądanej zmiany genomowej w jednym allelu bez tworzenia indel w drugim allelu i zachodzi z ogólną wydajnością ~10%. Opisany protokół został zaadaptowany z Maguire et al.21.

<table><tbody><tr><td>5-ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkową</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe naczynia do hodowli tkanek polistyrenowych</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna AflII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 podłoże</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td></td><td></td><td></td>do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)</tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw montażowy Gibsona</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB Płytki agarowe zawierające 50 &mu; g/ml kanamycyny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina Odczynnik macierzysty</td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Czynnik wzrostu o zmniejszonej wartości (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakcja żelu nukleospinowego i zestaw do czyszczenia PCR</td><td>740609</td><td></td><td>Macherey-Nagel</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCas9_GFP wektor</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>Probówki paskowe do PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności i 5 razy; Bufor Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Szybki zestaw minipreparatu plazmidu</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM elektrokompetentne komórki Escherichia coli</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC Pożywka</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Enzym ekspresowy TrypLE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek/inhibitor ROCK (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem crispr-cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste oferują potężny system do badania funkcji genów i modelowania specyficznych mutacji związanych z chorobą. Generowanie precyzyjnych heterozygotycznych modyfikacji genetycznych jest trudne ze względu na tworzenie indel za pośrednictwem CRISPR-CAS9 w drugim allelu. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który pomaga przezwyciężyć tę trudność, używając dwóch szablonów naprawczych, w których tylko jeden wyraża pożądaną zmianę sekwencji, podczas gdy oba szablony zawierają ciche mutacje, aby zapobiec ponownemu cięciu i tworzeniu się indel. Metodologia ta jest najbardziej korzystna dla edycji genów kodujących regiony DNA w celu wygenerowania izogenicznych linii kontrolnych i zmutowanych ludzkich komórek macierzystych do badania chorób i biologii człowieka. Ponadto przeprowadzono optymalizację metodologii transfekcji i badań przesiewowych w celu zmniejszenia nakładu pracy i kosztów eksperymentu edycji genów. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ma szerokie zastosowanie w wielu projektach edycji genomu z wykorzystaniem modelu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generowanie gRNA i przesiewanie pod kątem indeli
Każde gRNA zostanie sklonowane do wektora plazmidowego i wyekspresowane przy użyciu promotora U6. Do linearyzacji plazmidu (addgene #41824) wykorzystuje się enzym restrykcyjny AflII , którego miejsce cięcia znajduje się za promotorem U6. Fragment o długości 10 bp, powstały po wyżyglowaniu dwóch 60-bp oligosów, jest klonowany do wektora ekspresyjnego gRNA za pomocą metody assembly DNA. Po otrzymaniu plazmidów gRNA są one...

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Badania nad funkcją genów i chorobami są utrudnione przez niekrewniaczą naturę populacji ludzkiej. Różne tła genetyczne specyficznych dla pacjenta i kontrolnych linii komórkowych iPS mogą wpływać na efektywność różnicowania i fenotypy występujące w danym teście funkcjonalnym. Wykorzystanie genetycznie identycznych lub izogenicznych linii, w przypadku których jedyną różnicą jest konkretna mutacja będąca przedmiotem zainteresowania, ma kluczowe znaczenie dla przezwyciężenia tych problemów.Wiele chorób u ludzi jest spowodowanych mutacjami heterozygotycznymi, które mogą być trudne do wygenerowania za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Wynika to z generowania mutacji indel w niedocelowym allelu, które mogą występować z bardzo dużą częstotliwością. Nasza technika rozwiązuje ten problem dzięki użyciu dwóch szablonów naprawczych, z których tylko jeden zawiera mutację, która nas interesuje.Każdy badacz próbujący tej techniki powinien być wykwalifikowany w hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Demonstracja wideo zbierania kolonii będzie pomocna w pokazaniu prawidłowej wielkości i morfologii, a także techniki stosowanej do zbierania i przesiewania. Demonstracją tej procedury będzie Leo Cardenas.Na początek umieść ludzkie ESC na napromieniowanych MEF-ach w 6-dołkowej płytce. Przygotuj główną mieszankę transfekcji. Wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, dodaj mieszankę wzorcową transfekcji kroplami do każdej studzienki z komórkami i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Zmieniaj nośnik co 24 godziny. Aby zebrać komórki, najpierw inkubuj komórki z Triple E przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby enzymatycznie usunąć MEF.Dodać 0,5 mililitra pożywki HESC z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Osadzaj komórki w ilości 300 razy g przez trzy minuty i ponownie zawiesić w 0,5 mililitra ludzkiego podłoża ESC z 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Przefiltruj zawiesinę komórek do pięciomililitrowej probówki przez nasadkę sitka o średnicy 35 mikronów.Korzystając z sortowania komórek aktywowanych fluorescencją, włącz żywe komórki i posortuj zielone fluorescencyjne komórki dodatnie pod względem białek. Następnie przenieś maksymalnie 1,5 razy 10 do czterech posortowanych komórek bezpośrednio do 10-centymetrowej płytki pokrytej jedną do trzech macierzy błony podstawnej i napromieniowanymi MEF oraz ludzkim podłożem ESC zawierającym inhibitor ROCK. Zmieniaj pożywkę codziennie, używając ludzkiej pożywki ESC bez inhibitora ROCK.Po 10 do 15 dniach kolonie mają około jednego do dwóch milimetrów średnicy. Pod mikroskopem użyj pipety P200, aby ostrożnie zeskrobać pojedynczy klon i pobrać komórki do pipety. Rozproszyć komórki w studzience na 96-dołkowej płytce, delikatnie pipetując trzy do czterech razy w pożywce pobranej z kolonią.Następnie wybierz 20 kolonii dla każdego przewodnika RNA i dozuj do probówek paskowych PCR w celu przeprowadzenia badań przesiewowych. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut. Teraz inkubuj granulki komórek w 20 mikrolitrach buforu proteinazy K, aby energicznie wyizolować DNA i wirować.Wirować przy 10 000 razy G przez pięć minut. Następnie wykonaj przesiewowy PCR edytowanego DNA. Dodać do probówek 20 mikrolitrów mieszanki wzorcowej, w tym startery do przodu i do tyłu, przeznaczone do amplifikacji obszaru zainteresowania, a także pięć mikrolitrów trawienia proteinazy K.Użyj genomowego DNA wyizolowanego z kontrolnej linii iPSC, aby potwierdzić czysty amplikon podczas wykonywania przesiewowego PCR. Oceń zmiany wielkości produktów PCR po jednej godzinie elektroforezy przy napięciu od 70 do 90 woltów na żelu agarozowym o napięciu 2,5% objętości. Każda różnica w wielkości wskazuje na łupliwość.Aby transfekować jednoniciowy oligo DNA i plazmidy CRISPR-Cas9, należy umieścić docelową linię komórkową w 6-dołkowym naczyniu na napromieniowanych MEF-ach, aby osiągnąć 70 do 80% konfluencji po ponad całonocnej inkubacji. Ustawić reakcję transfekcji zgodnie z opisem. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj kroplami mieszaninę reakcji transfekcji do komórek. Po 48 godzinach przygotuj komórki do sortowania komórek jak poprzednio. Około 10 dni po posianiu pojedynczych komórek użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby pobrać kolonie do probówek paskowych do PCR i do dołka 12-dołkowej płytki wstępnie pokrytej żelatyną i MEF.Przenieść 100 mikrolitrów komórek do każdej studzienki na 24- lub 48-dołkowej płytce, uprzednio pokrytej żelatyną i napromieniowanych MEF w ludzkim pożywce ESC z inhibitorem ROCK. Użyj pozostałych 100 mikrolitrów do izolacji DNA. Aby sprawdzić, czy integracja pojedynczej nici oligo DNA, należy pobrać pięć mikrolitrów DNA wyizolowanych z każdej kolonii, aby przeprowadzić PCR przy użyciu wcześniej zaprojektowanych starterów przesiewowych.Oczyść produkty PCR i przygotuj 40 mikrolitrów trawienia enzymem restrykcyjnym przy użyciu unikalnego miejsca enzymatycznego utworzonego w jednoniciowym oligo DNA. Wymieszać reakcję pipetując i inkubować w temperaturze zalecanej przez producenta przez jedną do trzech godzin. Następnie wyobraź sobie strawione produkty PCR dodane za pomocą barwnika ładującego na żelu agarozowym bromku etydyny o sile 1,5% objętości, elektroforezy pod napięciem od 80 do 100 woltów przez 40 minut.Jeśli nastąpiła udana integracja jednoniciowego oligo DNA, sekwencjonuj specyficzne mutacje za pomocą zagnieżdżonego startera. W tym badaniu, w celu budowy przewodnika RNA, z 1,5% żelu agarozowego wycięto pasmo 100 par zasad. Po transfekcji komórek zwizualizowano walidację cięcia przewodnikowego RNA przy użyciu 2,5% żelu agarozowego.Produkt PCR ze 180 parami zasad wykazał nieoszlifowaną kontrolę i różne klony z przesunięciami pasm wskazującymi na tworzenie się indel. Różne przewodniki RNA miały różną wydajność cięcia. Aby uniknąć ponownego cięcia edytowanych alleli przez CRISPR-Cas9, sekwencja PAM została zmodyfikowana przy użyciu cichej mutacji G do A.Cicha mutacja w sekwencji PAM wygenerowała unikalne miejsce restrykcyjne, które pomaga w badaniach przesiewowych pod kątem udanej integracji z jednym lub dwoma allelami. Linie komórek macierzystych z edytowanym genomem mogą być wykorzystywane w dalszym różnicowaniu i testach funkcjonalnych w celu zbadania wpływu danej mutacji na rozwój i chorobę człowieka. Metodologia ta pozwala na generowanie izogenicznych linii komórkowych ze specyficznymi heterozygotycznymi lub homozygotycznymi mutacjami, związanymi z wieloma różnymi chorobami człowieka.Te modele chorób torują drogę do rozwoju nowych terapii komórkowych, a także oferują platformy do odkrywania leków.

generation-defined-genomic-modifications-using-crispr-cas9-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje technikę edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) za pomocą nukleazy palca cynkowego. Ponieważ hPSC mogą być potencjalnie różnicowane w różne typy komórek, technologia ta jest pomocna w badaniach patologicznych i farmakologicznych in vitro w sposób specyficzny dla pacjenta.

Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Poznaj metodę generowania zdefiniowanych mutacji heterozygotycznych i homozygotycznych przy użyciu CRISPR-Cas9 w ludzkich komórkach macierzystych. Technika ta umożliwia tworzenie izogenicznych linii komórkowych do badań nad funkcją genów i chorobami.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Przeglądaj więcej filmów