Name: Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj skalowalną metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. Protokół wykorzystuje filtrację i chromatografię wykluczenia wielkościowego, umożliwiając badania in vivo oraz zastosowania terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane powyżej były wspierane przez grant szkoleniowy NIH TL1 TR002549-03. Dziękujemy doktorom Johnowi C. Tiltonowi i Zachary'emu Troyerowi (Case Western Reserve University) za ułatwienie dostępu do analizatora wielkości cząstek; Lew Brown (Spectradyne) za pomoc techniczną w analizie danych dotyczących rozkładu wielkości cząstek; Dr. Davidowi Putnamowi z Cornell University za dostarczenie plazmidu pClyA-GFP14; oraz dr Markowi Goulianowi z University of Pennsylvania za dostarczenie nam E. coli MP113.

<ol><li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li>
<li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li>
<li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197(2009).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand%3A+a+retrospective+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li>
<li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15%2Flactadherin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088(2018).</li>
<li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W powyższym protokole opisano metodę, która jest skalowalna i niezawodnie izoluje EV od różnych bakterii Gram-ujemnych/dodatnich i tlenowych/beztlenowych. Ma kilka potencjalnych punktów zatrzymania podczas całej procedury, chociaż lepiej unikać izolowania EV z kondycjonowanych pożywek bakteryjnych dłużej niż 48 godzin.
Po pierwsze, polega na hodowli bakterii w celu wytworzenia kondycjonowanej pożywki bakteryjnej. Stwierdzono, że wydłużenie czasu hodowli do co najmniej 48 godzin i zastosowanie ...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanometryczne struktury przypominające liposomy, składające się z lipidów, białek, glikanów i kwasów nukleinowych, wydzielane zarówno przez komórki prokariontowe, jak i eukariotyczne1. Od pierwszych badań wizualizujących uwalnianie EVs z bakterii Gram-ujemnych2, liczba przypisywanych bakteryjnym EVs (o średnicy 20-300 nm) funkcji biologicznych stale rosła w ostatnich dziesięcioleciach. Ich funkcje obejmują przenoszenie oporności na antybiotyki3, tworzenie biofilmu4, quorum sensing5 oraz dostarczanie toksyn6. Rośnie również zainteresowanie wykorzystaniem bakteryjnych EVs w celach terapeutycznych, szczególnie w wakcynologii7 i terapii nowotworów8.
Mimo rosnącego zainteresowania badaniami nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV), wciąż istnieją wyzwania techniczne dotyczące metod ich izolacji. W szczególności istnieje zapotrzebowanie na metody izolacji, które są powtarzalne, skalowalne i kompatybilne z różnymi organizmami wytwarzającymi EV. Aby stworzyć jednolity zbiór zasad planowania i raportowania metod izolacji oraz badań nad EV, International Society for Extracellular Vesicles publikuje i aktualizuje dokument stanowiska MISEV9. Ponadto konsorcjum EV-TRACK udostępnia otwartą platformę do raportowania szczegółowych metodologii izolacji EV stosowanych w publikowanych artykułach, aby zwiększyć przejrzystość tych procesów10.
W niniejszym protokole zaadaptowano wcześniejsze metodologie stosowane do izolacji EV z hodowli komórek ssaków11,12, aby umożliwić izolację EV z hodowli komórek bakteryjnych. Dążyliśmy do zastosowania metod pozwalających na izolację EV z różnych mikroorganizmów, które mogą być skalowalne oraz zapewniają równowagę między czystością a wydajnością izolacji EV (zgodnie z omówieniem w dokumencie pozycji MISEV9). Po usunięciu komórek bakteryjnych i debris za pomocą wirowania i filtracji, pożywka hodowlana jest zagęszczana albo poprzez ultrafiltrację z wykorzystaniem urządzenia odśrodkowego (dla objętości do ~100 mL), albo za pomocą TFF napędzanej pompą (dla większych objętości). Następnie EV są izolowane metodą SEC przy użyciu kolumn zoptymalizowanych do oczyszczania małych EV.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd procesu izolacji bakteryjnych EV. Skróty: EV = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; TFF = filtracja przepływowa styczna; SEC = chromatografia wykluczania rozmiarów; MWCO = próg odcięcia masy cząsteczkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Jako organizm modelowy wykorzystano komensalny szczep Escherichia coli pochodzenia mysiego (t.j. E. coli MP113), który zmodyfikowano w celu ekspresji nanolucyferazy związanej z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV) poprzez fuzję z cytolizyną A, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami14. Zastosowane tutaj metody umożliwiają przetwarzanie co najmniej kilku litrów kultur bakteryjnych i skuteczną separację białek związanych z EV od białek niezwiązanych z EV. Ponadto metoda ta może być stosowana w przypadku innych gatunków bakterii gram-dodatnich i gram-ujemnych. Wszystkie istotne dane z opisanych eksperymentów zostały przekazane do bazy wiedzy EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table><tbody><tr><td>Płaskie, cienkościenne probówki PCR 0,5 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>3430</td><td>ważne jest, aby używać cienkościennych probówek PCR, aby uzyskać dokładne odczyty z wodnym roztworem Qubit</td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu (formaldehydu)</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Polipropylenowe butelki wirówkowe Fiberlite</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1495</td><td></td></tr><tr><td>Butelki wirówki polipropylenowej Fiberlite 500 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1493</td><td></td></tr><tr><td>65 mm Polipropylenowy adapter do butelek okrągłodennych/stożkowych</td><td>Beckman Coulter</td><td>392077</td><td>Umożliwia Vivacell dopasowanie do rotora</td></tr><tr><td>Akkermansia mucinophila</td><td></td><td>ATCC BAA-835</td><td></td></tr><tr><td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-20 Wirówka XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Nie jest już sprzedawana przez Beckman. Avanti J-26XP jest najbliższym współczesnym modelem.</td></tr><tr><td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td><td>ATCC</td><td>29148</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium breve</td><td>NCIMB</td><td>B8807</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium dentium</td><td>ATCC</td><td>27678</td><td></td></tr><tr><td>Napar z mózgu serca (BHI)</td><td>bulion Himedia</td><td>M2101</td><td>Po autoklawowaniu do komory beztlenowej wprowadzono zarówno bulion BHI, jak i agar, uzupełniony menadionem (1 &mikro; g/L), hematyna (1,2 &mikro; g/l) i chlorowodorek L-cysteiny (0,05%). Następnie inkubowano je przez co najmniej 24 godziny w warunkach beztlenowych przed inokulacją szczepami bakterii beztlenowych.</td></tr><tr><td>Wkład mikroprzepływowy C-300</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19032105</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy</td><td>FEI firma</td><td>Tecnai G2 SpiritBT</td><td></td></tr><<tr><td>em>Escherichia coli HST08 (kompetentne komórki Stellera)</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MP1</td><td>Dr. Mark Goulian (prezent)</td><td></td><td>bakterie komensalne pochodzące z jelit myszy</td></tr><tr><td>Adapter Fiberlite 500 ml do 250 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>010-0151-05</td><td>używany z rotorem Fiberlite, aby umożliwić użycie butelek o pojemności 250 ml do mniejszych rozmiarów początkowej kultury bakteryjnej</td></tr><tr><td>Wirnik wirówki Fiberlite o stałym kącie</td> nachylenia <td>ThermoFisher</td><td>F12-6x500-LEX</td><td>pasuje do butelek 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, miedź</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>nauki FCF-400-CU</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (klasa EM, 10% roztwór wodny)</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>Hematin</td><td>ChemCruz</td><td>207729B</td><td>Roztwór podstawowy sporządzono w 0,2 M roztworze L-histydyny jako&nbsp; 1,2 mg/ml</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Infinite M Nano+</td><td>Tecan</td><td></td><td>To urządzenie zostało użyte do pomiaru fluorescencji mCherry</td></tr><tr><td>In-Fusion&nbsp; HD Cloning Plus</td><td>Takara</td><td>638909</td><td>Do klonowania frakcji PCR do wektorów liniowych</td></tr><tr><td>PCR JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Lauria Bertani (LB) bulion, Miller</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-cysteiny</td><td>J.T. Baker</td><td>2071-05</td><td>Należy go zważyć i dodać bezpośrednio do autoklawowanego podłoża BHI wewnątrz beztlenowego </td></tr><tr><td>Komora Masterflex Złączka, polipropylen, Prosta, żeńska Adapter Luer do węża, 1/8" ID; 25/PK</td><td>cole-parmer - specjalne</td><td>HV-30800-08</td><td>adaptery przyłączeniowe do obwodu przewodów filtracyjnych</td></tr><tr><td>Złączka Masterflex, polipropylenowa, prosta, męska Przejściówka Luer na wąż z króćcem, 1/8" ID; 25/PK</td><td>cole-parmer - specjalne</td> adaptery przyłączeniowe <td>HV-30800-24</td><td>do obwodu</td></tr> <tr><td>przewodów filtracyjnychAnalogowy napęd konsolowy Masterflex L/S, od 20 do 600 obr./min</td><td>Masterflex</td><td>HV-07555-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load Głowica do przewodów precyzyjnych, 4-rolkowa, obudowa PARA, rotor SS</td><td>Masterflex</td><td>EW-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, PharmaPure, L/S 16; 25 stóp</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06435-16</td><td>rurka o niskim stopniu wiązania/niskiego wypłukiwania</td></tr><tr><td>Menadione (witamina K3)</td><td>MP</td><td>102259</td><td>Roztwór podstawowy został wykonany w etanolu jako 1 mg / ml</td></tr><tr><td>MIDIKROS 41,5 CM 100 K MPES 0,5 MM FLL X FLL 1 / PK</td><td>Urządzenie Repligen</td><td>D04-E100-05-N</td><td>TFF, którego użyliśmy do przefiltrowania do 2 litrów supernatantu kultury E. coli</td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Ten zestaw testowy służył do pomiaru luminescencji białka reporterowego nluc</td></tr><tr><td>NanoLuc (Nluc) Przeciwciało lucyferazy, klon 965808</td><td>R& D Systems</td><td>MAB10026</td><td></td></tr><tr><td>mikrofluidyka nCS1 rezystancyjny czujnik impulsów</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCS1 Viewer</td> Oprogramowanie do analizy <td>spektradyny</td><td></td><td>do rozkładu wielkości cząstek</td></tr><tr><td>OneTaq 2x Master Mix ze standardowym buforem</td><td>NEB</td><td>M0482</td><td>Główna mieszanina polimerazy DNA używana do przeprowadzania rutynowych reakcji PCR w celu sprawdzenia kolonii</td></tr><tr><td>Białko LoBind, 2,0 mL, PCR czyste probówki</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492</td><td>Główna mieszanina polimerazy DNA służąca do przeprowadzania reakcji PCR potrzebnych do klonowania</td></tr><tr><td>qEV oryginalna, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>maksymalna objętość ładowania 0,5 mL</td></tr><tr><td>qEV rack</td><td>Izon</td><td></td><td>do użytku z kolumnami SEC qEV-oryginalna qEV-2</td></tr><tr><td>, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>maksymalna objętość załadunku 2 ml</td></tr><tr><td>fluorometru kubitowego</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Item nie jest już dostępny. Najbliższym dostępnym produktem jest fluorometr Qubit 4.0 (kat. Nie. Q33238)</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek kubitowych</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33211</td><td>Zestaw do przechowywania w temperaturze pokojowej. Wzorce są przechowywane w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Lynx 4000</td><td>ThermoFisher</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne To</td><td></td><td>urządzenie służyło do pomiaru bioluminescencji nanolucyferazy</td></tr><tr><td>Stericup Quick-release-GP Sterylny system filtracji próżniowej (150, 250 lub 500 ml)</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE</td><td>Można użyć jednego lub wielu filtrów, aby dostosować się do objętości roboczych. Z naszego doświadczenia wynika, że możesz filtrować dwa razy więcej niż podana jest liczba podana w rozmiarze produktu.</td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Komora anaerobowa winylowa</td><td>Coy Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivacell 100, 100 000 MWCO PES</td><td></td><td>Filtry</td> strzykawkowe Whatman <td></td></tr><tr><td>Anotop 10 Plus (0,02 mikrona)</td><td>MiliporeSigma</td><td>WHA68093002</td><td>do filtrowania rozcieńczalnika MRPS</td></tr></tbody></table>

skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z escherichia coli i innych bakterii

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Różne gatunki bakterii wydzielają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) o długości ~20-300 nm, składające się z lipidów, białek, kwasów nukleinowych, glikanów i innych cząsteczek pochodzących z komórek rodzicielskich. EV funkcjonują jako wektory komunikacji wewnątrz- i międzygatunkowej, przyczyniając się jednocześnie do interakcji między bakteriami a organizmami gospodarza w kontekście infekcji i kolonizacji. Biorąc pod uwagę mnogość funkcji przypisywanych EV w zdrowiu i chorobie, rośnie zainteresowanie izolowaniem EV do badań in vitro i in vivo. Postawiono hipotezę, że rozdzielenie EV na podstawie właściwości fizycznych, a mianowicie wielkości, ułatwiłoby izolację pęcherzyków z różnych kultur bakteryjnych. 
Proces izolacji składa się z wirowania, filtracji, ultrafiltracji i chromatografii wykluczania wielkości (SEC) w celu izolacji EV z kultur bakteryjnych. Zastosowano etap filtracji o przepływie stycznym (TFF) napędzany pompą w celu zwiększenia skalowalności, umożliwiając izolację materiału z litrów początkowej hodowli komórkowej. Escherichia coli wykorzystano jako system modelowy eksprymujący nanolucyferazy związane z EV i niezwiązane z EV mCherry jako białka reporterowe. Nanolucyferaza została ukierunkowana na EV poprzez fuzję jej N-końca z cytolizyną A. Wczesne frakcje chromatograficzne zawierające EV o długości 20-100 nm z towarzyszącą cytolizyną A - nanoLuc różniły się od późniejszych frakcji zawierających wolne białka. Obecność nanolucyferazy związanej z EV została potwierdzona za pomocą znakowania immunozłotem i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ten przebieg izolacji EV ma zastosowanie do innych gatunków bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich związanych z ludzkimi jelitami. Podsumowując, połączenie wirowania, filtracji, ultrafiltracji/TFF i SEC umożliwia skalowalną izolację pojazdów elektrycznych od różnych gatunków bakterii. Zastosowanie ustandaryzowanego przepływu pracy izolacji ułatwi badania porównawcze mikrobiologicznych EV u różnych gatunków.

Aby ocenić, które frakcje chromatografii SEC były wzbogacone w EV, na kolumnę SEC naniesiono 2 ml *E. coli* położone na medium hodowlanym warunkowanym przez MP1, które zostało skoncentrowane 1000-krotnie za pomocą TFF, a następnie pobrano kolejne frakcje. Za pomocą MRPS stwierdzono, że frakcje 1-6 zawierały najwięcej EV (Rysunek 2A). Kolejne frakcje zawierały bardzo mało pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), składając się zamiast tego z białek wolnych od EV (Ryc...

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Protokół ten jest ważny, ponieważ zapewnia sposób izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od różnych bakterii w wysoce powtarzalny sposób. Wspaniałą rzeczą w tej technice jest to, że można ją wykorzystać do izolowania EV z dość dużych środowisk kultur bakteryjnych, co umożliwi badania in vivo. Chociaż dane, które pokazujemy, odzwierciedlają zastosowania przedkliniczne, można przewidzieć, że protokół ten może zostać dostosowany do produkcji bakteryjnych EV do celów terapeutycznych.Metodę tę można zastosować do dowolnego skalowalnego systemu hodowli komórkowej z niewielkimi modyfikacjami. Ze względu na skalowalność protokołu ważne jest, aby mieć filtry o odpowiedniej wielkości i kolumny SEC, aby obsłużyć pożądane początkowe objętości hodowli komórek bakteryjnych. Procedury demonstrują Sadie Johnson, asystentka technologa w laboratorium dr Justina Lathii, Dionysius Watson, onkolog w laboratorium dr Justina Lathii i Akeem Santos, technolog badawczy w moim laboratorium.Zacznij od zaszczepienia pojedynczych kolonii Escherichia coli w 250 do 1000 mililitrach bulionu Luria-Bertani lub LB, używając sterylnej pętli. Następnie inkubuj kulturę tlenowo w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obrotach na minutę i 37 stopniach Celsjusza. Po 48 godzinach inkubacji sklarować pożywkę bakteryjną, przenosząc kultury komórkowe do czystych 500-mililitrowych polipropylenowych butelek wirówkowych w celu odwirowania w wirniku o dużej pojemności o stałym kącie nachylenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 5 000 razy G przez 15 minut.Przenieść supernatant do czystych butelek wirówkowych, ostrożnie wlewając do odwirowania w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut. Następnie przenieś supernatant do 0,2-mikronowego urządzenia filtrującego z polieterosiulfonu o odpowiedniej wielkości i podłącz urządzenie filtrujące do ściennego źródła podciśnienia. Jeśli szybkość filtracji znacznie spadnie, przenieś niefiltrowany materiał do nowego urządzenia.Przefiltrowane podłoże może być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc lub może być natychmiast poddane dalszej obróbce. W celu sprawdzenia, czy komórki zdolne do życia zostały całkowicie usunięte, należy rozprowadzić porcję przefiltrowanego supernatantu na odpowiednich płytkach agarowych i upewnić się, że po inkubacji w warunkach optymalnych dla szczepu bakteryjnego nie ma żadnych kolonii. W celu zagęszczenia przefiltrowanej pożywki o objętości 100 mililitrów, należy załadować 90 mililitrów przefiltrowanej pożywki hodowlanej do zbiornika odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów i odwirować pożywkę w wahadłowym wirniku kubełkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 2 000 razy G przez 15 do 30 minut, aż objętość w górnym zbiorniku zostanie zagęszczona do mniej niż 0,5 mililitra.Aby uzupełnić zbiornik pozostałą przefiltrowaną pożywką hodowlaną, usuń przepływ z dna urządzenia w celu ponownego zrównoważenia. Jeśli lepkość stężonej pożywki w zbiorniku jest widocznie zwiększona, rozcieńczyć pożywkę PBS i ponownie zagęścić przez odwirowanie, aby zredukować wszelkie pęcherzyki niezewnątrzkomórkowe lub białka EV mniejsze niż granica masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Następnie przenieś skoncentrowaną pożywkę do niskobiałkowej probówki wiążącej, aby przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc Aby zagęścić przefiltrowane medium o objętości większej niż 100 mililitrów, wybierz odpowiednią wielkość filtracji z przepływem stycznym lub urządzenie TFF z odciętą masą cząsteczkową 100 kilodaltonów.Po zmontowaniu obwodu filtracyjnego, jak wyjaśniono w manuskrypcie, przepompuj 200 mililitrów PBS do naczynia z podziałką, aby określić odpowiednią prędkość odpowiadającą pożądanemu natężeniu przepływu. Po ustawieniu prędkości należy cyrkulować przefiltrowane kondycjonowane medium z prędkością około 200 mililitrów na minutę w temperaturze pokojowej i zebrać cząsteczki mniejsze niż 100 kilodaltonów, przechodząc przez membranę ultrafiltracyjną jako odpad w oddzielnym naczyniu, aż objętość kondycjonowanego medium zostanie zmniejszona do 100 do 200 mililitrów. Kolejno rozcieńczyć przefiltrowaną objętość dwukrotnie PBS i kontynuować cyrkulację pożywki z pompą w mniejszych naczyniach, aby skoncentrować objętość do 75 do 100 mililitrów, a następnie do 25 mililitrów i 10 mililitrów.Wyjmij rurkę zasilającą ze zbiornika próbki i pompy, aby oczyścić filtr w celu odzyskania maksymalnej ilości próbki. Przenieś zagęszczoną próbkę do 15-mililitrowego odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów i odwiruj w wahadłowym wirniku kubełkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 2 000 razy G w odstępach od 15 do 30 minut, aż objętość pożywki w górnym zbiorniku spadnie poniżej dwóch mililitrów. Przenieś skoncentrowaną pożywkę do niskobiałkowej probówki wiążącej, aby przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.W celu wyizolowania EV należy przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości lub SEC, używając małej kolumny z 10-mililitrową objętością złoża dla mniej niż 100 mililitrów materiału wyjściowego i większej kolumny z 47-mililitrową objętością złoża dla ponad 100 mililitrów materiału wyjściowego. Na kilka godzin przed eksperymentem doprowadź kolumnę SEC i PBS do temperatury pokojowej, a następnie ustabilizowaj kolumnę w pozycji pionowej za pomocą standardowego stojaka laboratoryjnego i uchwytu. Przed podłączeniem do kolumny SEC należy uwodnić zbiornik próbki, pozwalając pięciu mililitrom PBS przepłynąć przez frytę do pojemnika na odpady.Następnie odkręć korek wlotowy kolumny, aby dodać dwa mililitry PBS do zbiornika próbki i ostrożnie podłącz zbiornik do kolumny, gdy PBS kapie przez frytę. W celu zrównoważenia kolumny dodaj 47 mililitrów PBS do zbiornika próbki, a następnie odkręć dno kolumny SEC. Następnie pozwól, aby cały załadowany bufor próbki przepłynął przez kolumnę i odrzuć przepływ.Po załadowaniu dwóch mililitrów próbki do zbiornika na próbkę, pozwól, aby próbka całkowicie weszła do kolumny i zbierz przepływ. Natychmiast dodać PBS do zbiornika na próbkę w objętości 14,25 mililitra minus objętość próbki, aby umożliwić przepływ roztworu przez kolumnę, odrzucając ilość równą objętości pustej kolumny. Następnie umieść dwumililitrową mikroprobówkę o niskim poziomie wiązania bezpośrednio pod kolumną SEC, aby zebrać pierwszy przepływ lub frakcję pierwszą po przepuszczeniu dwóch mililitrów PBS przez kolumnę.Kontynuuj dodawanie dwóch mililitrów PBS do zbiornika próbki, aby zebrać każdą kolejną frakcję. Zebrane frakcje należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub minus 80 stopni Celsjusza w przypadku długotrwałego przechowywania. W celu przeprowadzenia badania sterylności zebranych frakcji EV należy zaszczepić trzy mililitry pożywki hodowlanej 100 mikrolitrami frakcji, które mają być użyte w testach.Następnie hoduj pożywkę w optymalnych warunkach, obserwując zmętnienie przez co najmniej trzy dni. Alternatywnie, próbki frakcji można nałożyć na płytki agarowe zawierające pożywkę używaną do hodowli bakterii wytwarzających, a następnie sprawdzić, czy nie tworzy się kolonia. Następnie przechowuj EVs, przenosząc od 25 do 50% pojedynczych lub połączonych frakcji do probówek wiążących białka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.Reprezentatywna analiza wykazała elucję Escherichia coli MP1 EV we wczesnych frakcjach chromatograficznych. Frakcje od 1 do 6 zawierały najwięcej EV, o średniej średnicy mniejszej niż 100 nanometrów. Jednocześnie kolejne frakcje zawierały białka wolne od EV i bardzo mało EV.Wzbogacenie i wielkość EV zostały potwierdzone za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, szczególnie w ułamkach od dwóch do sześciu. Zaobserwowano, że frakcje wzbogacone w EV od dwóch do siedmiu miały wysoką aktywność nanolucyferazy, ale tylko bardzo niski sygnał fluorescencyjny z mCherry niezwiązanego z EV w porównaniu z późniejszymi frakcjami. Znakowanie immunozłotem potwierdziło związek EV nanolucyferazy we frakcjach od dwóch do pięciu.Możliwość zastosowania protokołu do innych gatunków bakterii oceniono poprzez wyizolowanie EV z kultur różnych bakterii beztlenowych. Zaobserwowano, że wczesne frakcje chromatograficzne od pierwszej do czwartej były wzbogacone dla EV, o średnicy mniejszej niż 100 nanometrów. Złożony wlew mózgowo-sercowy (BHI) zawierał cząstki wielkości EV w ilości mniejszej niż 25% całkowitej wydajności EV.Ważne jest, aby używać urządzeń TFF, które są w stanie poradzić sobie z początkową objętością hodowli komórek bakteryjnych. Technika ta pozwala nam wygenerować wystarczającą liczbę EV, aby zadać pytania biologiczne dotyczące ich funkcji w złożonych modelach zwierzęcych.

scalable-isolation-purification-extracellular-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

W tym filmie demonstrujemy technikę - chromatografię wykluczania wielkości - do oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV pochodzących od bakterii. Pęcherzyki te są sferycznymi strukturami o rozmiarach nano i są dzielone na duże i małe subpopulacje na podstawie ich wielkości za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Poznaj skalowalną metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. Protokół wykorzystuje filtrację i chromatografię wykluczenia wielkościowego, umożliwiając badania in vivo oraz zastosowania terapeutyczne.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Przeglądaj więcej filmów