Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Protokół ten jest ważny, ponieważ zapewnia sposób izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od różnych bakterii w wysoce powtarzalny sposób. Wspaniałą rzeczą w tej technice jest to, że można ją wykorzystać do izolowania EV z dość dużych środowisk kultur bakteryjnych, co umożliwi badania in vivo. Chociaż dane, które pokazujemy, odzwierciedlają zastosowania przedkliniczne, można przewidzieć, że protokół ten może zostać dostosowany do produkcji bakteryjnych EV do celów terapeutycznych.

Metodę tę można zastosować do dowolnego skalowalnego systemu hodowli komórkowej z niewielkimi modyfikacjami. Ze względu na skalowalność protokołu ważne jest, aby mieć filtry o odpowiedniej wielkości i kolumny SEC, aby obsłużyć pożądane początkowe objętości hodowli komórek bakteryjnych. Procedury demonstrują Sadie Johnson, asystentka technologa w laboratorium dr Justina Lathii, Dionysius Watson, onkolog w laboratorium dr Justina Lathii i Akeem Santos, technolog badawczy w moim laboratorium.

Zacznij od zaszczepienia pojedynczych kolonii Escherichia coli w 250 do 1000 mililitrach bulionu Luria-Bertani lub LB, używając sterylnej pętli. Następnie inkubuj kulturę tlenowo w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obrotach na minutę i 37 stopniach Celsjusza. Po 48 godzinach inkubacji sklarować pożywkę bakteryjną, przenosząc kultury komórkowe do czystych 500-mililitrowych polipropylenowych butelek wirówkowych w celu odwirowania w wirniku o dużej pojemności o stałym kącie nachylenia w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 5 000 razy G przez 15 minut.

Przenieść supernatant do czystych butelek wirówkowych, ostrożnie wlewając do odwirowania w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut. Następnie przenieś supernatant do 0,2-mikronowego urządzenia filtrującego z polieterosiulfonu o odpowiedniej wielkości i podłącz urządzenie filtrujące do ściennego źródła podciśnienia. Jeśli szybkość filtracji znacznie spadnie, przenieś niefiltrowany materiał do nowego urządzenia.

Przefiltrowane podłoże może być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc lub może być natychmiast poddane dalszej obróbce. W celu sprawdzenia, czy komórki zdolne do życia zostały całkowicie usunięte, należy rozprowadzić porcję przefiltrowanego supernatantu na odpowiednich płytkach agarowych i upewnić się, że po inkubacji w warunkach optymalnych dla szczepu bakteryjnego nie ma żadnych kolonii. W celu zagęszczenia przefiltrowanej pożywki o objętości 100 mililitrów, należy załadować 90 mililitrów przefiltrowanej pożywki hodowlanej do zbiornika odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów i odwirować pożywkę w wahadłowym wirniku kubełkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 2 000 razy G przez 15 do 30 minut, aż objętość w górnym zbiorniku zostanie zagęszczona do mniej niż 0,5 mililitra.

Aby uzupełnić zbiornik pozostałą przefiltrowaną pożywką hodowlaną, usuń przepływ z dna urządzenia w celu ponownego zrównoważenia. Jeśli lepkość stężonej pożywki w zbiorniku jest widocznie zwiększona, rozcieńczyć pożywkę PBS i ponownie zagęścić przez odwirowanie, aby zredukować wszelkie pęcherzyki niezewnątrzkomórkowe lub białka EV mniejsze niż granica masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Następnie przenieś skoncentrowaną pożywkę do niskobiałkowej probówki wiążącej, aby przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc Aby zagęścić przefiltrowane medium o objętości większej niż 100 mililitrów, wybierz odpowiednią wielkość filtracji z przepływem stycznym lub urządzenie TFF z odciętą masą cząsteczkową 100 kilodaltonów.

Po zmontowaniu obwodu filtracyjnego, jak wyjaśniono w manuskrypcie, przepompuj 200 mililitrów PBS do naczynia z podziałką, aby określić odpowiednią prędkość odpowiadającą pożądanemu natężeniu przepływu. Po ustawieniu prędkości należy cyrkulować przefiltrowane kondycjonowane medium z prędkością około 200 mililitrów na minutę w temperaturze pokojowej i zebrać cząsteczki mniejsze niż 100 kilodaltonów, przechodząc przez membranę ultrafiltracyjną jako odpad w oddzielnym naczyniu, aż objętość kondycjonowanego medium zostanie zmniejszona do 100 do 200 mililitrów. Kolejno rozcieńczyć przefiltrowaną objętość dwukrotnie PBS i kontynuować cyrkulację pożywki z pompą w mniejszych naczyniach, aby skoncentrować objętość do 75 do 100 mililitrów, a następnie do 25 mililitrów i 10 mililitrów.

Wyjmij rurkę zasilającą ze zbiornika próbki i pompy, aby oczyścić filtr w celu odzyskania maksymalnej ilości próbki. Przenieś zagęszczoną próbkę do 15-mililitrowego odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów i odwiruj w wahadłowym wirniku kubełkowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 2 000 razy G w odstępach od 15 do 30 minut, aż objętość pożywki w górnym zbiorniku spadnie poniżej dwóch mililitrów. Przenieś skoncentrowaną pożywkę do niskobiałkowej probówki wiążącej, aby przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

W celu wyizolowania EV należy przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości lub SEC, używając małej kolumny z 10-mililitrową objętością złoża dla mniej niż 100 mililitrów materiału wyjściowego i większej kolumny z 47-mililitrową objętością złoża dla ponad 100 mililitrów materiału wyjściowego. Na kilka godzin przed eksperymentem doprowadź kolumnę SEC i PBS do temperatury pokojowej, a następnie ustabilizowaj kolumnę w pozycji pionowej za pomocą standardowego stojaka laboratoryjnego i uchwytu. Przed podłączeniem do kolumny SEC należy uwodnić zbiornik próbki, pozwalając pięciu mililitrom PBS przepłynąć przez frytę do pojemnika na odpady.

Następnie odkręć korek wlotowy kolumny, aby dodać dwa mililitry PBS do zbiornika próbki i ostrożnie podłącz zbiornik do kolumny, gdy PBS kapie przez frytę. W celu zrównoważenia kolumny dodaj 47 mililitrów PBS do zbiornika próbki, a następnie odkręć dno kolumny SEC. Następnie pozwól, aby cały załadowany bufor próbki przepłynął przez kolumnę i odrzuć przepływ

Po załadowaniu dwóch mililitrów próbki do zbiornika na próbkę, pozwól, aby próbka całkowicie weszła do kolumny i zbierz przepływ. Natychmiast dodać PBS do zbiornika na próbkę w objętości 14,25 mililitra minus objętość próbki, aby umożliwić przepływ roztworu przez kolumnę, odrzucając ilość równą objętości pustej kolumny. Następnie umieść dwumililitrową mikroprobówkę o niskim poziomie wiązania bezpośrednio pod kolumną SEC, aby zebrać pierwszy przepływ lub frakcję pierwszą po przepuszczeniu dwóch mililitrów PBS przez kolumnę.

Kontynuuj dodawanie dwóch mililitrów PBS do zbiornika próbki, aby zebrać każdą kolejną frakcję. Zebrane frakcje należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub minus 80 stopni Celsjusza w przypadku długotrwałego przechowywania. W celu przeprowadzenia badania sterylności zebranych frakcji EV należy zaszczepić trzy mililitry pożywki hodowlanej 100 mikrolitrami frakcji, które mają być użyte w testach.

Następnie hoduj pożywkę w optymalnych warunkach, obserwując zmętnienie przez co najmniej trzy dni. Alternatywnie, próbki frakcji można nałożyć na płytki agarowe zawierające pożywkę używaną do hodowli bakterii wytwarzających, a następnie sprawdzić, czy nie tworzy się kolonia. Następnie przechowuj EVs, przenosząc od 25 do 50% pojedynczych lub połączonych frakcji do probówek wiążących białka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.

Reprezentatywna analiza wykazała elucję Escherichia coli MP1 EV we wczesnych frakcjach chromatograficznych. Frakcje od 1 do 6 zawierały najwięcej EV, o średniej średnicy mniejszej niż 100 nanometrów. Jednocześnie kolejne frakcje zawierały białka wolne od EV i bardzo mało EV.

Wzbogacenie i wielkość EV zostały potwierdzone za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, szczególnie w ułamkach od dwóch do sześciu. Zaobserwowano, że frakcje wzbogacone w EV od dwóch do siedmiu miały wysoką aktywność nanolucyferazy, ale tylko bardzo niski sygnał fluorescencyjny z mCherry niezwiązanego z EV w porównaniu z późniejszymi frakcjami. Znakowanie immunozłotem potwierdziło związek EV nanolucyferazy we frakcjach od dwóch do pięciu.

Możliwość zastosowania protokołu do innych gatunków bakterii oceniono poprzez wyizolowanie EV z kultur różnych bakterii beztlenowych. Zaobserwowano, że wczesne frakcje chromatograficzne od pierwszej do czwartej były wzbogacone dla EV, o średnicy mniejszej niż 100 nanometrów. Złożony wlew mózgowo-sercowy (BHI) zawierał cząstki wielkości EV w ilości mniejszej niż 25% całkowitej wydajności EV.

Ważne jest, aby używać urządzeń TFF, które są w stanie poradzić sobie z początkową objętością hodowli komórek bakteryjnych. Technika ta pozwala nam wygenerować wystarczającą liczbę EV, aby zadać pytania biologiczne dotyczące ich funkcji w złożonych modelach zwierzęcych.