Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

Protokół ten przedstawia model badania hemokompatybilności wyrobów mających kontakt z krwią zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej. Model idealnie nadaje się do naśladowania warunków fizjologicznych, które odpowiadają implantowi, ponieważ niskie tło dla zdarzeń zakrzepowych i niskie stężenie antykoagulantów umożliwiają szeroką analizę parametrów krwi. Ta metoda jest idealna do badań biomateriałów, ponieważ zapewnia prosty sposób oceny hemokompatybilności.

Ponadto może być stosowany do badań przedklinicznych. W celu obciążenia heparyną należy najpierw zmieszać 5 000 jednostek międzynarodowych nierozcieńczonej heparyny z 0,9% chlorkiem sodu, aby uzyskać 15 jednostek międzynarodowych na mililitr stężenia heparyny. Następnie dodać 900 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu heparyny do trzech obojętnych monowetów i trzech zarezerwowanych monowet na dawcę i przechowywać monowety obciążone heparyną w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Na 30 minut przed pobraniem próbki krwi umieścić monowety w temperaturze pokojowej. Kiedy monowety się ogrzeją, zbierz dziewięć mililitrów krwi do każdej z trzech monowet na dawcę, a następnie zbierz wszystkie 27 mililitrów krwi od każdego dawcy do jednego plastikowego pojemnika. Aby przygotować pętlę przepływu, załaduj co najmniej jedną rurkę na każdy stan interesującym Cię implantem laserowym do cięcia nerwowo-naczyniowego i umieść jeden koniec każdej rurki w zbiorniku wypełnionym 0,9% chlorkiem sodu.

Umieść rozładowaną rurkę w zbiorniku i podłącz wszystkie rurki do głowicy pompy. Następnie włóż drugi koniec każdej rurki do cylindra miarowego i dostosuj ustawienia pompy perystaltycznej do natężenia przepływu 150 mililitrów na minutę za pomocą timera, sprawdzając poziom napełnienia w cylindrze miarowym. Do testowania hemokompatybilności użyj 12-mililitrowej strzykawki, aby napełnić każdą probówkę sześcioma mililitrami krwi.

Po uformowaniu obwodu użyj silikonowej rurki łączącej o długości 0,5 centymetra, aby szczelnie zamknąć rurki i umieść rurki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom 60-minutową rurę. Do analizy morfologii krwi pełnej dodać 1,2 mililitra krwi nieperfundowanej lub 1,2 mililitra krwi z każdej probówki po perfuzji do indywidualnych monowetów zawierających EDTA.

Ostrożnie odwrócić monowety pięć razy i załadować fiolki do analizatora krwi w celu przeprowadzenia analizy morfologii krwi każdej próbki. Pod koniec analizy umieść monowety na lodzie na 15-60 minut. W celu pobrania osocza cytrynianowego napełnij monowety zawierające cytrynian 1,4 mililitra krwi nieperfuzyjnej lub perfundowanej i ostrożnie odwróć każdą monowetę pięć razy.

Oddzielić osocze przez odwirowanie i przenieść trzy podwielokrotności frakcji osocza o pojemności 250 mikrolitrów do pojedynczych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 mililitra. Następnie zamroź próbki osocza w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu ich analizy. W celu pobrania osocza EDTA, po inkubacji w czterech stopniach Celsjusza po pomiarze morfologii krwi, należy oddzielić osocze przez odwirowanie i przenieść trzy 250 mikrolitrowe porcje frakcji osocza do pojedynczych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie zamroź próbki osocza w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W celu pobrania osocza CTAD napełnij monowety zawierające CTAD 2,7 mililitra świeżo pobranej lub perfundowanej krwi i ostrożnie odwróć probówki pięć razy. Umieścić monowety na lodzie na 15-60 minut przed pobraniem osocza przez odwirowanie.

Przenieś 700 mikrolitrów każdej środkowej frakcji osocza do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek reakcyjnych i ponownie odwiruj napełnione probówki reakcyjne. Następnie przenieś dwie 100-mikrolitrowe podwielokrotności środkowej frakcji do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek reakcyjnych i zamroź probówki w ciekłym azocie w celu ich przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zmierzyć poziomy TAT w próbkach osocza cytrynianu, dodaj 50 mikrolitrów buforu próbki ELISA do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o płaskim dnie i 50 mikrolitrów próbek plazmy wzorcowej, kontrolnej osocza i nierozcieńczonej plazmy w duplikatach do odpowiednich dołków płytki.

Po zamknięciu płytki inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, delikatnie wstrząsając. Pod koniec inkubacji przemyć płytkę trzykrotnie 300 mikrolitrami roztworu myjącego na studzienkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów sprzężonego z peroksydazą przeciwciała anty-ludzkiego TAT do każdej studzienki. Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem, umyć płytkę trzykrotnie 300 mikrolitrami świeżego roztworu myjącego na dołek.

Po ostatnim praniu dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu chromogenu do dołka na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i odczytać gęstość optyczną na fotometrze przy 490 do 500 nanometrach, wykorzystując dane z krzywej standardowej jako linię trendu do obliczenia stężenia TAT w każdej próbce. Aby przygotować implanty do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy za pomocą kleszczyków usunąć implanty z rurek i krótko przepłukać każdy implant trzy razy w świeżym 0,9% chlorku sodu na pranie.

Po ostatnim myciu przechowuj implanty w indywidualnych pojemnikach z 2% aldehydem glutarowym w PBS bez wapnia i magnezu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka inkubować implanty w indywidualnych pojemnikach PBS przez 10 minut, a następnie odwodnić implanty w rosnących stężeniach etanolu przez 10 minut na stężenie, jak wskazano. Bezpośrednio po pobraniu krwi i perfuzji nie wykrywa się zmian w liczbie białych lub czerwonych krwinek ani w wartościach hematokrytu.

Jednak spadek poziomu hemoglobiny wykrywa się po perfuzji w systemie pętli przepływu. Obserwuje się również spadek liczby płytek krwi, który zwiększa się, gdy w rurkach znajduje się niepowlekany stent. Warto zauważyć, że utrata ta zmniejsza się, gdy krew jest inkubowana ze stentem pokrytym heparyną fibryny.

Stężenie kompleksu TAT jest nieznacznie zwiększone w odpowiedzi na perfuzję. Jednak po dodaniu gołego metalowego stentu wykrywa się znaczny wzrost TAT, co wskazuje na głęboką aktywację układu krzepnięcia. Zastosowanie stentu pokrytego heparyną fibrynową zapobiega tej aktywacji.

Perfuzja prowadzi do zwiększonej aktywacji kaskady komplementarnej, na którą nie ma wpływu obecność stentów niepowlekanych lub pokrytych fibryną i heparyną. Podobnie granulocyty neutrofilowe są aktywowane, o czym świadczy ilościowe określenie poziomów wielojądrzastej elastazy neutrofilowej. Wizualizacja za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ujawnia obecność gęstej sieci komórek krwi i białek na powierzchni niepowlekanego stentu po perfuzji, której nie obserwuje się na stentach pokrytych fibryną i heparyną.

Niezwykle ważne jest potwierdzenie, że krew spełnia kryteria włączenia do badania i jak najszybsze wykorzystanie świeżo pobranej krwi. Ludzka krew może zawierać wirusy przenoszone przez krew i inne czynniki i niesie ze sobą ryzyko infekcji, dlatego należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej podczas pracy z próbkami.