Name: Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę oceny hemokompatybilności implantów naczyniowych w modelu pętli przepływu z wykorzystaniem świeżej krwi ludzkiej. Protokół umożliwia badanie markerów hematologicznych w warunkach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Za wykonanie skaningowej mikroskopii elektronowej dziękujemy Ernstowi Schweizerowi z sekcji Nauki i Technologii Materiałów Medycznych Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze. Badania były wspierane przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej w ramach Narodowego Programu Zrównoważonego Rozwoju II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) oraz przez projekt Czeskiej Fundacji Naukowej nr 18-01163S.

Procedura pobierania próbek krwi została zatwierdzona przez Komisję Etyki wydziału medycznego Uniwersytetu w Tybindze (kod identyfikacyjny projektu: 270/2010BO1). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną, świadomą zgodę na włączenie przed uczestnictwem.
1. Przygotowanie monovette z heparyną
<ol>
	<li>Zmieszać nierozcieńczoną heparynę (5 000 j.m./ml) z roztworem chlorku sodu (NaCl, 0,9%) i przygotować roztwór o stężeniu 15 j.m./ml heparyny.</li>
	<li>Dodać 900 μl rozcieńczonego roztworu heparyny do każdej obojętnej monowety (9 ml), aby uzyskać końcowe stężenie heparyny 1,5 j.m./ml po pobraniu próbki krwi. Przygotować trzy monowety na dawcę plus trzy monowety rezerwowe i przechowywać monowety zawierające heparynę w temperaturze 4 °C do czasu pobrania próbek krwi.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek krwi
<ol>
	<li>Monowety zawierające heparynę należy wyjąć z lodówki na 30 minut przed pobraniem krwi.</li>
	<li>Pobrać 27 ml próbki krwi od każdego zdrowego dawcy (n = 5) przez nakłucie żyły do pętli przepływu. Opaskę uciskową należy zakładać wyłącznie w płynnej pozycji, aby uniknąć przedwczesnej aktywacji płytek krwi i kaskady krzepnięcia krwi.</li>
	<li>Pobrać próbki krwi w trzech monowetach zawierających 900 μl roztworu heparyny (1,5 j.m./ml) i zebrać wszystkie trzy monowety w jednym pojemniku z tworzywa sztucznego, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wszystkich składników.</li>
	<li>Bezpośrednio przenieś zebraną krew heparynizowaną do trzech różnych monowetów zawierających EDTA (1,2 ml), cytrynian (1,4 ml) lub mieszaninę cytrynianu, teofiliny, adenozyny i dipirydamolu (CTAD, 2,7 ml) w celu zebrania wartości wyjściowych. Postępuj z próbkami zgodnie z opisem w sekcjach 5−8. 
	UWAGA: Aby zagwarantować niezakłócone zachowania krzepnięcia, dawcy powinni unikać przyjmowania leków wpływających na hemostazę (np. kwasu acetylosalicylowego, naproksenu i karbenicyliny) w ciągu ostatnich 14 dni, a także doustnych środków antykoncepcyjnych i palenia tytoniu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pętli przepływu
<ol>
	<li>Wytnij trzy rurki z polichlorku winylu pokryte heparyną o długości 75 cm i średnicy wewnętrznej 3,2 mm. Załaduj rurki nerwowo-naczyniowymi implantami wycinanymi laserowo z powłoką fibrynowo-heparynową lub bez. Pamiętaj, aby pozostawić jedną wannę rozładowaną jako kontrolę.</li>
	<li>Umieść jeden koniec rurki w zbiorniku wypełnionym 0.9% NaCl, podłącz rurkę do głowicy pompy, a drugi koniec włóż do cylindra miarowego.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia pompy perystaltycznej, aby osiągnąć natężenie przepływu 150 ml/min za pomocą timera podczas sprawdzania poziomu napełnienia w cylindrze miarowym.</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie testów hemokompatybilności
<ol>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 12 ml, aby napełnić probówki krwią. Niech 6 ml krwi płynnie przepłynie do każdej probówki zawierającej próbkę lub niezaładowaną kontrolę.</li>
	<li>Uformuj obwód i szczelnie zamknij rurki za pomocą silikonowej rurki łączącej o długości 0,5 cm. Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i rozpocząć perfuzję na 60 minut.</li>
</ol>
5. Analiza morfologii krwi pełnej
<ol>
	<li>Umieścić 1,2 ml krwi po pobraniu próbki (linia wyjściowa) lub po perfuzji do monowety zawierającej EDTA i ostrożnie odwrócić probówkę 5 razy.</li>
	<li>Włóż monowetę do analizatora krwi i wykonaj analizę morfologii krwi dla każdej próbki. Następnie monowety należy inkubować na lodzie przez 15-60 minut po pomiarze morfologii krwi w celu dalszej analizy, jak opisano w sekcji 7.</li>
</ol>
6. Zbieranie osocza cytrynianowego
<ol>
	<li>Napełnij monowety zawierające cytrynian 1,4 ml krwi (świeżo pobranej lub po krążeniu) i ostrożnie odwróć 5x.</li>
	<li>Wirować probówki przez 18 minut przy 1 800 x g w temperaturze pokojowej (RT). Porcjować trzy próbki frakcji osocza o objętości 250 μl do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i zamrażać próbki osocza w ciekłym azocie. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
7. Kolekcja plazmy EDTA
<ol>
	<li>Monowety należy inkubować na lodzie przez 15-60 minut po pomiarze morfologii krwi. Następnie odwirować probówki przez 20 minut w temperaturze 2 500 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu podsycić trzy próbki frakcji osocza o objętości 250 μl do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i zamrozić probówki w ciekłym azocie. Przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
8. Kolekcja plazmy CTAD
<ol>
	<li>Napełnij monowety zawierające mieszaninę CTAD 2,7 ml krwi (świeżo pobranej lub po inkubacji) i ostrożnie odwróć 5x. Następnie inkubuj monowety na lodzie przez 15-60 min. Następnie odwirować probówki przez 20 minut w temperaturze 2 500 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 700 μl środkowej frakcji osocza do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i odwirować napełnione probówki reakcyjne przez 20 minut w temperaturze 2 500 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu podsycić dwie próbki środkowej frakcji o objętości 100 μl do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i zamrozić probówki w ciekłym azocie. Przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu analizy. 
	UWAGA: Pobieranie osocza EDTA i osocza CTAD można przeprowadzić razem, ponieważ warunki pracy są takie same.</li>
</ol>
9. Pomiar ludzkiego TAT z osocza cytrynianowego
<ol>
	<li>Rozmrozić osocze cytrynianowe w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyj zestawu testu immunoenzymatycznego TAT (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta. Zrekonstruować wzorce osocza i kontrolować oraz rozcieńczyć roztwór myjący, przeciwciało sprzężone z peroksydazą anty-ludzką TAT (POD) i roztwór chromogenu. Przed rozpoczęciem badania pozostawić wszystkie odczynniki i płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej (15−25 °C) na 30 minut.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl buforu próbki do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania i dodać 50 μl buforu próbki (ślepej próby), wzorca osocza, próbki kontrolnej osocza i nierozcieńczonej próbki osocza w dwóch egzemplarzach do płytki dołka. Zamknąć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, delikatnie wstrząsając. Następnie umyj płytkę 3x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 100 μl sprzężonego z POD przeciwciała anty-ludzkiego TAT do każdej studzienki. Zamknąć płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, delikatnie wstrząsając. Następnie umyj płytkę 3x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 100 μl świeżo przygotowanego roztworu chromogenu. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć folię uszczelniającą i dodać 100 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Odczytaj gęstość optyczną (OD) za pomocą fotometru przy 490−500 nm. Dopasuj dane krzywej standardowej jako linię trendu i oblicz stężenie próbek.</li>
</ol>
10. Pomiar elastazy PMN z osocza cytrynianowego
<ol>
	<li>Rozmrozić osocze cytrynianowe w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyj zestawu ELISA z elastazą wielojądrową (PMN) zgodnie z instrukcjami producenta: zrekonstruuj kontrolę elastazy PMN i wzorzec elastazy PMN, aby przygotować krzywą wzorcową przy użyciu buforu rozcieńczającego zestawu.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór myjący zgodnie z opisem producenta. Przed rozpoczęciem badania pozostawić wszystkie odczynniki i płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej na 30 minut. Rozcieńczyć próbki osocza cytrynianu w stosunku 1:100 buforem rozcieńczającym.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu próbki (ślepa próba), krzywą wzorcową elastazy PMN (15,6−1,000 ng / ml), kontrole elastazy PMN (wysokie i niskie stężenia) i rozcieńczone próbki osocza w duplikatach do płytki studzienki. Zamknąć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut, delikatnie wstrząsając. Następnie umyj płytkę 4x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 150 μl przeciwciała sprzężonego z enzymem do każdego dołka. Zamknąć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut, delikatnie wstrząsając. Następnie umyj płytkę 4x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu substratu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Następnie usuń folię uszczelniającą i dodaj 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki.</li>
	<li>Odczytać OD za pomocą fotometru przy 450 nm z odczytem referencyjnym przy 630 nm. Dopasuj dane krzywej standardowej jako linię trendu i oblicz stężenie próbek.</li>
</ol>
11. Pomiar końcowego kompleksu dopełniacza (TCC) z osocza EDTA
<ol>
	<li>Rozmrozić osocze EDTA w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i przechowywać na lodzie po rozmrożeniu.</li>
	<li>Użyj zestawu ELISA kaskady dopełniacza SC5b-9 zgodnie z instrukcjami producenta: rozcieńczyć roztwór myjący zgodnie z opisem w protokole producenta. Przed rozpoczęciem badania pozostawić wszystkie odczynniki i płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej na 30 minut. Rozcieńczyć próbki osocza EDTA w stosunku 1:10 za pomocą buforu rozcieńczającego zestawu.</li>
	<li>Dodać 300 μl roztworu myjącego do każdego dołka, aby ponownie nawodnić powierzchnię i odessać po 2 minutach. Dodać 100 μl buforu do próbki (ślepa próba), wzorce SC5b-9, kontrole SC5b-9 (wysokie i niskie stężenia) oraz rozcieńczone próbki osocza w dwóch egzemplarzach do płytki studzienki.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Następnie umyj płytkę 5x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 50 μl przeciwciała sprzężonego z enzymem do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie umyj płytkę 5x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu substratu TMB do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.</li>
	<li>Usunąć folię uszczelniającą i dodać 100 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. Odczytaj OD za pomocą fotometru przy 450 nm. Dopasuj dane krzywej standardowej jako linię trendu i oblicz stężenie próbek.</li>
</ol>
12. Pomiar β-tromboglobuliny z osocza CTAD
<ol>
	<li>Rozmrozić osocze CTAD w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyć zestawu ELISA β-tromboglobuliny (β-TG) zgodnie z instrukcjami producenta: zrekonstruować kontrolę β-TG i wzorzec β-TG i rozcieńczyć roztwór płuczący za pomocą destylowanegoH2O. Zrekonstruować przeciwciało sprzężone z POD za pomocą dostarczonego buforu fosforanowego. Przed rozpoczęciem badania pozostawić wszystkie odczynniki i płytkę do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Przygotować krzywą wzorcową i kontrolę zgodnie z instrukcjami producenta z dostarczonym buforem fosforanowym. Rozcieńczyć próbki osocza CTAD w stosunku 1:21.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu fosforanowego (ślepa), wzorce β-TG, kontrole β-TG (wysokie i niskie stężenia) oraz rozcieńczone próbki osocza w dwóch egzemplarzach do płytki studzienki. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Następnie umyj płytkę 5x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 200 μl przeciwciała sprzężonego z enzymem do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Następnie umyj płytkę 5x 300 μl roztworu myjącego.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu substratu TMB do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności. Usunąć folię uszczelniającą i zatrzymać reakcję, dodając 50 μl 1 M kwasu siarkowego (H2SO4)do każdej studzienki.</li>
	<li>Pozostaw płytkę na 15−60 min, a następnie odczytaj OD za pomocą fotometru przy 450 nm. Dopasuj dane krzywej standardowej jako linię trendu i oblicz stężenie próbek.</li>
</ol>
13. Przygotowanie próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Wyjmij implant z rurki za pomocą kleszczy i krótko przepłucz implant, zanurzając go w 0,9% roztworze NaCl 3x.</li>
	<li>Przechowywać przez noc w roztworze aldehydu glutarowego (2% aldehydu glutarowego w buforze fosforanowym [bufor PBS bez Ca2+/Mg2+]) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnie inkubuj implanty w buforze PBS przez 10 minut. Odwodnić próbki, inkubując w etanolu o rosnącym stężeniu przez 10 minut każda: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% i 100%. Odwodnione próbki należy przechowywać w 100% etanolu do czasu dalszej analizy.</li>
	<li>Suszenie w punkcie krytycznym należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami urządzenia do suszenia lub literaturą10 tuż przed skaningową mikroskopią elektronową (SEM).</li>
</ol>
14. Skaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Przymocuj wysuszone implanty do nośnika próbki do mikroskopu skaningowego i napyl próbki złotym palladem.</li>
	<li>Wprowadzić napylone implanty do komory na próbkę. Rób zdjęcia w 100-, 500-, 1000- i 2,500-krotnym powiększeniu obszarów z reprezentatywną powierzchnią i adhezją komórek.</li>
</ol>

<ol><li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biological+evaluation+of+medical+devices%22">Biological evaluation of medical devices</a>. , ISO 10993-4 (2002).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Contacting+Biomaterials%3A+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99(2018).</li>
<li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination%3A+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li>
<li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67(2019).</li>
<li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4%3A+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li>
<li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstacles+in+haemocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584(2013).</li>
<li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004(2016).</li>
<li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hemocompatibility+testing%3A+The+importance+of+fresh+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802(2016).</li>
<li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li>
<li>JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019).</li>
<li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li>
<li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li>
<li>Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Polish+Academy+of+Sciences%3A+Technical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li>
<li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li>
<li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion%2Factivation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li>
<li>Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2FBiomedizinische+Technik%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).</li>
<li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+%22air+bubbles%22+in+blood+after+venous+air+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li>
<li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%3A+Physicochemical+and+Engineering+Aspects%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li>
<li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+modified+chandler%2C+roller+pump%2C+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions%3A+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163(2012).</li>
<li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR+American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li>
<li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li>
<li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent%3A+an+in+vitro+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li>
<li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li>
<li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Prezentowany protokół opisuje kompleksową i wiarygodną metodę badania hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią zgodnie z normą ISO 10993-4 w modelu przepływu ścinającego imitującym przepływ krwi ludzkiej. Badanie to opiera się na testach wycinanych laserowo implantów nerwowo-naczyniowych, ale można je przeprowadzić z różnymi próbkami. Wyniki pokazują, że metoda ta umożliwia szeroką analizę różnych parametrów, takich jak liczba krwinek, występowanie kilku markerów hemokompatybilności oraz mikroskopowa wizual...

Zastosowanie in vivo implantów i biomateriałów, które wchodzą w interakcję z ludzką krwią, wymaga intensywnych badań przedklinicznych skupiających się na badaniu różnych markerów układu hemostatycznego. Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna 10993-4 (ISO 10993-4) określa główne zasady oceny wyrobów mających kontakt z krwią (tj. stentów i przeszczepów naczyniowych) oraz uwzględnia konstrukcję urządzenia, użyteczność kliniczną i potrzebne materiały1.
Ludzka krew to płyn, który zawiera różne białka i komórki osocza, w tym leukocyty (białe krwinki [WBC]), erytrocyty (czerwone krwinki [RBC]) i płytki krwi, które pełnią złożone funkcje w ludzkim ciele2. Bezpośredni kontakt ciał obcych z krwią może powodować działania niepożądane, takie jak aktywacja układu odpornościowego lub krzepnięcia, co może prowadzić do stanu zapalnego lub powikłań zakrzepowych oraz poważnych problemów po implantacji3,4,5. W związku z tym walidacja zgodności hemologicznej in vitro daje możliwość wykrycia i wykluczenia wszelkich powikłań hematologicznych, które mogą być wywołane w wyniku kontaktu krwi z obcą powierzchnią6.
Prezentowany model pętli przepływu został stworzony do oceny hemokompatybilności stentów nerwowo-naczyniowych i podobnych urządzeń, stosując natężenie przepływu 150 mL/min w rurkach (średnica 3,2 mm) w celu naśladowania warunków przepływu w mózgu i średnic tętnic2,7. Oprócz konieczności stworzenia optymalnego modelu in vitro, źródło krwi jest ważnym czynnikiem w uzyskiwaniu wiarygodnych i niezmienionych wyników podczas analizy hemokompatybilności biomateriału8. Pobraną krew należy wykorzystać natychmiast po pobraniu próbki, aby zapobiec zmianom spowodowanym długotrwałym przechowywaniem. Ogólnie rzecz biorąc, należy wykonać delikatne pobieranie krwi bez zastoju za pomocą igły 21 G, aby zminimalizować wstępną aktywację płytek krwi i kaskadę krzepnięcia podczas pobierania krwi. Ponadto kryteria wykluczenia dawców obejmują osoby, które palą papierosy, są w ciąży, są w złym stanie zdrowia lub przyjmowały doustne środki antykoncepcyjne lub przeciwbólowe w ciągu ostatnich 14 dni.
To badanie opisuje model in vitro do szeroko zakrojonych testów hemokompatybilności implantów stentów w warunkach przepływu. Porównując stenty niepowlekane ze stentami powlekanymi heparyną fibryną, wyniki kompleksowych testów hemokompatybilności odzwierciedlają poprawę hemokompatybilności stentów pokrytych heparyną fibryną9. Natomiast stenty niepowlekane indukują aktywację kaskady krzepnięcia, o czym świadczy wzrost stężenia tombin-antytrombiny III (TAT) i utrata liczby płytek krwi z powodu przylegania płytek krwi do powierzchni stentu. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się zintegrowanie tego modelu hemokompatybilności jako testu przedklinicznego w celu wykrycia wszelkich niekorzystnych skutków dla układu hemostatycznego, które są powodowane przez urządzenie.

<table><tbody><tr><td>aqua ad iniectabilia</td><td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Niemcy</td><td>1088813</td><td></td></tr><tr><td>beta-TG ELISA</td><td>Diagnostica Stago, Düsseldorf, Niemcy</td><td>00950</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Rotana 460 R</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen,</td> <td>Niemcy-Cytraty</td><td></td></tr> <tr><td>monovette (1,4 ml)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>6,16,68,001</td><td></td></tr><tr><td>monovette CTAD (2,7 ml)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy</td><td>367562</td><td></td></tr><tr><td>monovette EDTA (1,2 mL)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>6,16,62,001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol rocznie (1000 mL)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Niemcy</td><td>1,31,08,61,611</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy (25 % w wodzie)</td><td>SERVA Electroforees, Heidelberg, Niemcy</td><td>23114.01</td><td></td></tr><tr><td>Powłoka heparynowa do rur</td><td>Ension, Pittsburgh, USA-Heparyna-Natrium</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(25.000 IE/ 5 mL)</td><td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Niemcy</td><td>PZN 15261203</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik wielopłytkowy Mithras LB 940</td><td>Berthold, Bad Wildbad,</td> <td>Niemcy-NaCl</td><td></td></tr> <tr><td>0,9%</td><td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Niemcy</td><td>1312813</td><td></td></tr><tr><td>Neutralne monovette (9 mL)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>2,10,63,001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PBS (bez Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna ISM444B</td><td>Cole Parmer, Wertheim, Niemcy</td><td>3475</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (100 &mikro; L)</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>3124000075</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (1000 &mikro; L)</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik plastikowy (100 mL)</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>7,55,62,300</td><td></td></tr><tr><td>PMN-elastaza ELISA</td><td>Demeditec Diagnostics, Kilonia Niemcy</td><td>DEH3311</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z polichlorku winylu</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie</td> <td>Francja-Probówki</td><td></td></tr> <tr><td>reakcyjne (1,5 ml)</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy</td><td>30123328</td><td></td></tr><tr><td>laserowe implanty nerwowo-naczyniowe</td><td>Acandis GmbH, Pforzheim</td><td>01-0011x</td><td></td></tr><tr><td>SC5b-9 ELISA</td><td>TECOmedical, Buende, Niemcy</td><td>A029</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop</td><td></td> <td>elektronowy Cambridge Instruments, Cambridge, Wielka Brytania-Taśma</td><td></td></tr> <tr><td>uszczelniająca (płytka 96-dołkowa)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10/12 mL Norm-Ject</td><td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Niemcy</td><td>10080010</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw TAT micro</td><td>Siemens Healthcare, Marburg, Niemcy</td><td>OWMG15</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Typ 1083</td><td>Gesellschaft f&uuml; r Labortechnik, Burgwedel, Niemcy</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

Rosnące wykorzystanie urządzeń medycznych (np. przeszczepów naczyniowych, stentów i cewników sercowych) do tymczasowych lub stałych celów, które pozostają w układzie krążenia organizmu, wymaga niezawodnego i wieloparametrycznego podejścia, które ocenia możliwe komplikacje hematologiczne spowodowane przez te urządzenia (np. aktywacja i niszczenie składników krwi). Kompleksowe badania kompatybilności hemokompatybilności in vitro implantów mających kontakt z krwią są pierwszym krokiem w kierunku udanego wdrożenia in vivo. Dlatego przed zastosowaniem klinicznym obowiązkowa jest obowiązkowa obowiązkowa analiza zgodnie z Międzynarodową Organizacją Normalizacyjną 10993-4 (ISO 10993-4). Prezentowana pętla przepływu opisuje czuły model do analizy wydajności hemostatycznej stentów (w tym przypadku nerwowo-naczyniowych) i ujawniania działań niepożądanych. Stosowanie świeżej ludzkiej krwi pełnej i delikatne pobieranie próbek krwi jest niezbędne, aby uniknąć wstępnej aktywacji krwi. Krew jest perfundowana przez heparynizowaną rurkę zawierającą badaną próbkę za pomocą pompy perystaltycznej z szybkością 150 ml/min w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Przed i po perfuzji analizowane są markery hematologiczne (tj. morfologia krwi, hemoglobina, hematokryt i markery plazmatyczne) wskazujące na aktywację leukocytów (elastazy wielojądrzastej [PMN]), płytek krwi (β-tromboglobulina [β-TG]), układu krzepnięcia (tombina-antytrombina III [TAT]) oraz kaskady dopełniacza (SC5b-9). Podsumowując, przedstawiamy niezbędny i niezawodny model do szeroko zakrojonych testów hemokompatybilności stentów i innych urządzeń mających kontakt z krwią przed zastosowaniem klinicznym.

Krótko podsumowując, pobrano ludzką krew pełną do monovette'ów z heparyną, a następnie połączono próbki i wykorzystano je do oceny poziomu wyjściowego liczby komórek oraz plazmatycznych markerów hemokompatybilności.
Następnie rurkę zawierającą próbki implantów naczyniowo-nerwowych napełniono i przeprowadzono perfuzję krwi przez 60 min z przepływem 150 mL/min w temperaturze 37 °C przy użyciu pompy perystaltycznej. Ponownie przeanalizowano liczbę komórek we wszystkich grupach, a próbki osocza pr...

Ten protokół opisuje kompleksową ocenę hemokompatybilności urządzeń mających kontakt z krwią za pomocą laserowo wycinanych implantów nerwowo-naczyniowych. Model pętli przepływu ze świeżą, heparynizowaną krwią ludzką jest stosowany w celu naśladowania przepływu krwi. Po perfuzji różne markery hematologiczne są analizowane i porównywane z wartościami uzyskanymi bezpośrednio po pobraniu krwi w celu oceny hemokompatybilności badanych urządzeń.

Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

Protokół ten przedstawia model badania hemokompatybilności wyrobów mających kontakt z krwią zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej. Model idealnie nadaje się do naśladowania warunków fizjologicznych, które odpowiadają implantowi, ponieważ niskie tło dla zdarzeń zakrzepowych i niskie stężenie antykoagulantów umożliwiają szeroką analizę parametrów krwi. Ta metoda jest idealna do badań biomateriałów, ponieważ zapewnia prosty sposób oceny hemokompatybilności.Ponadto może być stosowany do badań przedklinicznych. W celu obciążenia heparyną należy najpierw zmieszać 5 000 jednostek międzynarodowych nierozcieńczonej heparyny z 0,9% chlorkiem sodu, aby uzyskać 15 jednostek międzynarodowych na mililitr stężenia heparyny. Następnie dodać 900 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu heparyny do trzech obojętnych monowetów i trzech zarezerwowanych monowet na dawcę i przechowywać monowety obciążone heparyną w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Na 30 minut przed pobraniem próbki krwi umieścić monowety w temperaturze pokojowej. Kiedy monowety się ogrzeją, zbierz dziewięć mililitrów krwi do każdej z trzech monowet na dawcę, a następnie zbierz wszystkie 27 mililitrów krwi od każdego dawcy do jednego plastikowego pojemnika. Aby przygotować pętlę przepływu, załaduj co najmniej jedną rurkę na każdy stan interesującym Cię implantem laserowym do cięcia nerwowo-naczyniowego i umieść jeden koniec każdej rurki w zbiorniku wypełnionym 0,9% chlorkiem sodu.Umieść rozładowaną rurkę w zbiorniku i podłącz wszystkie rurki do głowicy pompy. Następnie włóż drugi koniec każdej rurki do cylindra miarowego i dostosuj ustawienia pompy perystaltycznej do natężenia przepływu 150 mililitrów na minutę za pomocą timera, sprawdzając poziom napełnienia w cylindrze miarowym. Do testowania hemokompatybilności użyj 12-mililitrowej strzykawki, aby napełnić każdą probówkę sześcioma mililitrami krwi.Po uformowaniu obwodu użyj silikonowej rurki łączącej o długości 0,5 centymetra, aby szczelnie zamknąć rurki i umieść rurki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom 60-minutową rurę. Do analizy morfologii krwi pełnej dodać 1,2 mililitra krwi nieperfundowanej lub 1,2 mililitra krwi z każdej probówki po perfuzji do indywidualnych monowetów zawierających EDTA.Ostrożnie odwrócić monowety pięć razy i załadować fiolki do analizatora krwi w celu przeprowadzenia analizy morfologii krwi każdej próbki. Pod koniec analizy umieść monowety na lodzie na 15-60 minut. W celu pobrania osocza cytrynianowego napełnij monowety zawierające cytrynian 1,4 mililitra krwi nieperfuzyjnej lub perfundowanej i ostrożnie odwróć każdą monowetę pięć razy.Oddzielić osocze przez odwirowanie i przenieść trzy podwielokrotności frakcji osocza o pojemności 250 mikrolitrów do pojedynczych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 mililitra. Następnie zamroź próbki osocza w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu ich analizy. W celu pobrania osocza EDTA, po inkubacji w czterech stopniach Celsjusza po pomiarze morfologii krwi, należy oddzielić osocze przez odwirowanie i przenieść trzy 250 mikrolitrowe porcje frakcji osocza do pojedynczych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 mililitra.Następnie zamroź próbki osocza w ciekłym azocie do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W celu pobrania osocza CTAD napełnij monowety zawierające CTAD 2,7 mililitra świeżo pobranej lub perfundowanej krwi i ostrożnie odwróć probówki pięć razy. Umieścić monowety na lodzie na 15-60 minut przed pobraniem osocza przez odwirowanie.Przenieś 700 mikrolitrów każdej środkowej frakcji osocza do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek reakcyjnych i ponownie odwiruj napełnione probówki reakcyjne. Następnie przenieś dwie 100-mikrolitrowe podwielokrotności środkowej frakcji do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek reakcyjnych i zamroź probówki w ciekłym azocie w celu ich przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zmierzyć poziomy TAT w próbkach osocza cytrynianu, dodaj 50 mikrolitrów buforu próbki ELISA do każdej studzienki 96-dołkowej płytki o płaskim dnie i 50 mikrolitrów próbek plazmy wzorcowej, kontrolnej osocza i nierozcieńczonej plazmy w duplikatach do odpowiednich dołków płytki.Po zamknięciu płytki inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, delikatnie wstrząsając. Pod koniec inkubacji przemyć płytkę trzykrotnie 300 mikrolitrami roztworu myjącego na studzienkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów sprzężonego z peroksydazą przeciwciała anty-ludzkiego TAT do każdej studzienki. Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem, umyć płytkę trzykrotnie 300 mikrolitrami świeżego roztworu myjącego na dołek.Po ostatnim praniu dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu chromogenu do dołka na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i odczytać gęstość optyczną na fotometrze przy 490 do 500 nanometrach, wykorzystując dane z krzywej standardowej jako linię trendu do obliczenia stężenia TAT w każdej próbce. Aby przygotować implanty do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy za pomocą kleszczyków usunąć implanty z rurek i krótko przepłukać każdy implant trzy razy w świeżym 0,9% chlorku sodu na pranie.Po ostatnim myciu przechowuj implanty w indywidualnych pojemnikach z 2% aldehydem glutarowym w PBS bez wapnia i magnezu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka inkubować implanty w indywidualnych pojemnikach PBS przez 10 minut, a następnie odwodnić implanty w rosnących stężeniach etanolu przez 10 minut na stężenie, jak wskazano. Bezpośrednio po pobraniu krwi i perfuzji nie wykrywa się zmian w liczbie białych lub czerwonych krwinek ani w wartościach hematokrytu.Jednak spadek poziomu hemoglobiny wykrywa się po perfuzji w systemie pętli przepływu. Obserwuje się również spadek liczby płytek krwi, który zwiększa się, gdy w rurkach znajduje się niepowlekany stent. Warto zauważyć, że utrata ta zmniejsza się, gdy krew jest inkubowana ze stentem pokrytym heparyną fibryny.Stężenie kompleksu TAT jest nieznacznie zwiększone w odpowiedzi na perfuzję. Jednak po dodaniu gołego metalowego stentu wykrywa się znaczny wzrost TAT, co wskazuje na głęboką aktywację układu krzepnięcia. Zastosowanie stentu pokrytego heparyną fibrynową zapobiega tej aktywacji.Perfuzja prowadzi do zwiększonej aktywacji kaskady komplementarnej, na którą nie ma wpływu obecność stentów niepowlekanych lub pokrytych fibryną i heparyną. Podobnie granulocyty neutrofilowe są aktywowane, o czym świadczy ilościowe określenie poziomów wielojądrzastej elastazy neutrofilowej. Wizualizacja za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ujawnia obecność gęstej sieci komórek krwi i białek na powierzchni niepowlekanego stentu po perfuzji, której nie obserwuje się na stentach pokrytych fibryną i heparyną.Niezwykle ważne jest potwierdzenie, że krew spełnia kryteria włączenia do badania i jak najszybsze wykorzystanie świeżo pobranej krwi. Ludzka krew może zawierać wirusy przenoszone przez krew i inne czynniki i niesie ze sobą ryzyko infekcji, dlatego należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej podczas pracy z próbkami.

hemocompatibility-testing-blood-contacting-implants-flow-loop-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Kontakt krwi z polimerowymi kanałami krwionośnymi inicjuje reakcję ciała obcego, która jest związana z klinicznymi powikłaniami. Tutaj opisano Aparat Pętli Chandlera, eksperymentalne narzędzie naśladujące perfuzję krwi przez te przewody. Wyrostek rekombinowanego CD47 powoduje zmniejszenie dowodów reakcji ciała obcego na tych przewodach.

Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

Poznaj metodę oceny hemokompatybilności implantów naczyniowych w modelu pętli przepływu z wykorzystaniem świeżej krwi ludzkiej. Protokół umożliwia badanie markerów hematologicznych w warunkach przedklinicznych.

Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

Przeglądaj więcej filmów