Name: Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej naczyniowych wyrobów medycznych zgodnie z normą ISO 10993-4. Ta metoda pozwala ocenić aktywację komórek krwi bez wpływu sił mechanicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Pani Elenie Denks za jej pomoc techniczną.

<ol><li>International Organisation for Standardisation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIN+ISO+10993-4%3A+Biological+evaluation+of+medical+devices+-+Part+4%3A+Selection+of+tests+for+interactions+with+blood%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organisation+for+Standardisation%22%5BJournal%5D)">DIN ISO 10993-4: Biological evaluation of medical devices - Part 4: Selection of tests for interactions with blood.</a> International Organisation for Standardisation. , (2017).</li>
<li>Mayes, J. T., Schreiber, R. D., Cooper, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+the+quantitation+of+alternative+complement+pathway+activation+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and application of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitation of alternative complement pathway activation in human serum.</a> Journal of Clinical Investigation. 73 (1), 160-170 (1984).</li>
<li>Maiolini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sandwich+method+of+enzyme-immunoassay.+II.+Quantification+of+rheumatoid+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A sandwich method of enzyme-immunoassay. II. Quantification of rheumatoid factor.</a> Journal of Immunological Methods. 20, 25-34 (1978).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry%3A+The+Glass+Is+Half+Full%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry: The Glass Is Half Full.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 1-10 (2018).</li>
<li>Betke, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Slurry+Composition+on+Properties+of+Cellular+Alumina%3A+A+Computed+Tomographic+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Engineering+Materials%22%5BJournal%5D)">Impact of Slurry Composition on Properties of Cellular Alumina: A Computed Tomographic Study.</a> Advanced Engineering Materials. 19 (10), (2017).</li>
<li>Chandler, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+thrombotic+coagulation+of+the+blood%3B+a+method+for+producing+a+thrombus%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro thrombotic coagulation of the blood; a method for producing a thrombus.</a> Laboratory Investigation. 7 (2), 110-114 (1958).</li>
<li>Fink, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+blood+compatibility+of+vascular+grafts+made+of+bacterial+cellulose+in+comparison+with+conventionally-used+graft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of blood compatibility of vascular grafts made of bacterial cellulose in comparison with conventionally-used graft materials.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 97 (1), 52-58 (2011).</li>
<li>Lenz-Habijan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Thrombogenicity+of+a+Bare+and+Antithrombogenic+Coated+Flow+Diverter+in+an+In+Vitro+Flow+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+and+Interventional+Radiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Thrombogenicity of a Bare and Antithrombogenic Coated Flow Diverter in an In Vitro Flow Model.</a> Cardiovascular and Interventional Radiology. 43 (1), 140-146 (2020).</li>
<li>Olsen, A. L., Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+catheter+thrombogenicity+in+a+modified+chandler+loop+model+using+goat+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of catheter thrombogenicity in a modified chandler loop model using goat blood.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (12), 3143-3151 (2018).</li>
<li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (7), (2014).</li>
<li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871(2014).</li>
<li>Feyerabend, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+compatibility+of+magnesium+and+its+alloys%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Blood compatibility of magnesium and its alloys.</a> Acta Biomaterialia. 25, 384-394 (2015).</li>
<li>Lukas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Immobilized+Antithrombin+III+on+the+Thromboresistance+of+Polycarbonate+Urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Effect of Immobilized Antithrombin III on the Thromboresistance of Polycarbonate Urethane.</a> Materials. 10 (4), Basel, Switzerland. 355(2017).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+influence+the+hemostatic+system+by+activating+the+intrinsic+coagulation+pathway+in+an+in+vitro+Chandler-Loop+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">Aptamers influence the hemostatic system by activating the intrinsic coagulation pathway in an in vitro Chandler-Loop model.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16 (2), 161-169 (2010).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocompatibility+Testing+of+Blood-Contacting+Implants+in+a+Flow+Loop+Model+Mimicking+Human+Blood+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60610(2020).</li>
<li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+modified+chandler%2C+roller+pump%2C+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions%3A+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. 2012, 673163(2012).</li>
<li>Maa, Y. F., Hsu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+by+combined+effect+of+shear+and+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation by combined effect of shear and air-liquid interface.</a> Biotechnology and Bioengineering. 54 (6), 503-512 (1997).</li>
<li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> British Journal of Pharmacology. 153 (1), 124-131 (2008).</li>
<li>Fletcher, E. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+human+whole+blood+in+motion%2C+as+a+tool+to+predict+first-infusion+reactions+and+mechanism-of-action+of+immunotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal human whole blood in motion, as a tool to predict first-infusion reactions and mechanism-of-action of immunotherapeutics.</a> International Immunopharmacology. 54, 1-11 (2018).</li>
<li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li>
<li>Larm, O., Larsson, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-thrombogenic+surface+prepared+by+selective+covalent+binding+of+heparin+via+a+modified+reducing+terminal+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%2C+Medical+Devices%2C+and+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">A new non-thrombogenic surface prepared by selective covalent binding of heparin via a modified reducing terminal residue.</a> Biomaterials, Medical Devices, and Artificial Organs. 11 (2-3), 161-173 (1983).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubing+loops+as+a+model+for+cardiopulmonary+bypass+circuits%3A+both+the+biomaterial+and+the+blood-gas+phase+interfaces+induce+complement+activation+in+an+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interfaces induce complement activation in an in vitro model.</a> Journal of Clinical Immunology. 16 (4), 222-229 (1996).</li>
<li>Tevaearai, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trillium+coating+of+cardiopulmonary+bypass+circuits+improves+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Trillium coating of cardiopulmonary bypass circuits improves biocompatibility.</a> The International Journal of Artificial Organs. 22 (9), 629-634 (1999).</li>
<li>Ma, Y. Q., Plow, E. F., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+induces+an+intermediate+state+of+alphaMbeta2+activation+and+acts+cooperatively+with+extracellular+stimuli+to+support+maximal+adhesion+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1 induces an intermediate state of alphaMbeta2 activation and acts cooperatively with extracellular stimuli to support maximal adhesion of human neutrophils.</a> Blood. 104 (8), 2549-2556 (2004).</li>
<li>Bandyk, D. F., Galbraith, T. A., Haasler, G. B., Almassi, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+velocity+of+internal+mammary+artery+and+saphenous+vein+grafts+to+the+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Blood flow velocity of internal mammary artery and saphenous vein grafts to the coronary arteries.</a> Journal of Surgical Research. 44 (4), 342-351 (1988).</li>
<li>Gardner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+examination+of+the+fluid+mechanics+and+thrombus+formation+time+parameters+in+a+Chandler+rotating+loop+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">An examination of the fluid mechanics and thrombus formation time parameters in a Chandler rotating loop system.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 84 (4), 494-508 (1974).</li>
<li>Gaamangwe, T., Peterson, S. D., Gorbet, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+Effect+of+Blood+Sample+Volume+in+the+Chandler+Loop+Model%3A+Theoretical+and+Experimental+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Investigating the Effect of Blood Sample Volume in the Chandler Loop Model: Theoretical and Experimental Analysis.</a> Cardiovascular Engineering and Technology. 5 (2), 133-144 (2014).</li>
<li>Böswirth, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6swirth%2C+L+%22Technische+Str%C3%B6mungslehre.+8+edn%22">Technische Strömungslehre. 8 edn</a>. , Springer Vieweg. (2010).</li>
<li>Cartwright, I. J., Pockley, A. G., Galloway, J. H., Greaves, M., Preston, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+dietary+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids+on+erythrocyte+membrane+phospholipids%2C+erythrocyte+deformability+and+blood+viscosity+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids on erythrocyte membrane phospholipids, erythrocyte deformability and blood viscosity in healthy volunteers.</a> Atherosclerosis. 55 (3), 267-281 (1985).</li>
<li>Wong, K. K. L., Wu, J., Liu, G., Huang, W., Ghista, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+hemodynamics%3A+effect+of+arterial+geometry+on+hemodynamic+parameters+causing+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+biological+engineering+%26+computing%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries hemodynamics: effect of arterial geometry on hemodynamic parameters causing atherosclerosis.</a> Medical & biological engineering & computing. 58, 1831-1843 (2020).</li>
<li>Kania, R. E., Herman, P., Ar, A., Tran Ba Huy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+pitfalls+in+middle+ear+gas+studies%3A+errors+introduced+by+the+gas+permeability+of+tubing+and+additional+dead+space%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-Laryngologica%22%5BJournal%5D)">Technical pitfalls in middle ear gas studies: errors introduced by the gas permeability of tubing and additional dead space.</a> Acta Oto-Laryngologica. 125 (5), 529-533 (2005).</li>
<li>Foley, M. E., McNicol, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-vitro+study+of+acidosis%2C+platelet+function%2C+and+perinatal+cerebral+intraventricular+haemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">An in-vitro study of acidosis, platelet function, and perinatal cerebral intraventricular haemorrhage.</a> The Lancet. 1 (8024), 1230-1232 (1977).</li>
<li>Engstrom, M., Schott, U., Romner, B., Reinstrup, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+impairs+the+coagulation%3A+A+thromboelastographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Trauma%22%5BJournal%5D)">Acidosis impairs the coagulation: A thromboelastographic study.</a> The Journal of Trauma. 61 (3), 624-628 (2006).</li>
<li>Dirkmann, D., Hanke, A. A., Gorlinger, K., Peters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia+and+acidosis+synergistically+impair+coagulation+in+human+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+%26+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Hypothermia and acidosis synergistically impair coagulation in human whole blood.</a> Anesthesia & Analgesia. 106 (6), 1627-1632 (2008).</li>
<li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+%22air+bubbles%22+in+blood+after+venous+air+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li>
<li>Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bubble-induced+aggregation+of+platelets%3A+effects+of+gas+species%2C+proteins%2C+and+decompression%5BTitle%5D)+AND+%22Undersea+%26+Hyperbaric+Medicine+%3A+Journal+of+the+Undersea+and+Hyperbaric+Medical+Society%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression.</a> Undersea & Hyperbaric Medicine : Journal of the Undersea and Hyperbaric Medical Society, Inc. 20 (2), 101-119 (1993).</li>
<li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B. 66 (1), 379-390 (2003).</li>
<li>Hesh, C. A., Qiu, Y., Lam, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+microfluidics+and+the+blood-endothelium+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Vascularized microfluidics and the blood-endothelium interface.</a> Micromachines. 11 (1), Basel. 18(2019).</li>
<li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112(2014).</li>
</ol>

Fundator [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Niemcy] udzielił autorowi tego manuskryptu [Maxowi Wackerowi] wsparcia finansowego w postaci materiałów eksploatacyjnych i opłat za publikację. Fundatorzy nie odgrywali żadnej dodatkowej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Badanie to wykazało, że przedstawiony model pętli hemodynamicznej in vitro oferuje wiarygodną metodę badania kompatybilności wyrobów medycznych z krwią in vitro zgodnie z normą ISO 10993-4.
Krytyczne kroki w protokole obejmują pobranie krwi i napełnienie probówek krwią, przy czym należy unikać nadmiernego podciśnienia lub mieszania, aby zapobiec aktywacji składników krwi przez procedurę obchodzenia się z nimi. Ponadto bardzo ważne jest, aby natychmiast zamrozić próbki osocza i przechowywać je na lodzie po rozmrożeniu, ponieważ aktywacja dopełniacza i układu krzepnięcia może zostać zakłócona poprzez utrzymywanie próbek w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas.
Ponieważ model ten ma zarówno zalety, jak i wady w porównaniu z innymi modelami in vitro, podczas projektowania eksperymentów należy wziąć pod uwagę kilka czynników.
Po pierwsze, pętle mogą być różnie dopasowane do różnych konfiguracji eksperymentalnych. W przypadku, gdy konfiguracja obejmuje kontrastujące rurki o różnych średnicach wewnętrznych, należy pamiętać, że różnice w średnicy spowodują różne siły ścinające, wpływając w ten sposób na krzepnięcie i kaskadę dopełniacza7. Po drugie, w tym eksperymencie prędkość obrotowa została ustawiona na 30 obr./min. Spowoduje to przepływ krwi o prędkości około 25 cm/s, co jest porównywalne z prędkością przepływu krwi w ludzkich pomostowaniach aortalno-wieńcowych25. Szybkość odkształcania, generowana przez rotację pętli, jest głównym parametrem, który zainicjuje biochemiczne kaskady składników krwi, w tym komórek i białek bezkomórkowych. Ale ponieważ krew jest płynem nienewtonowskim, na szybkość odkształcania będzie miała również wpływ krzywizna rurki, odpowiednio długość rurek, które są zamknięte w pętlach10. Za każdym razem, gdy zmienia się prędkość obrotowa lub rozmiar pętli, należy wziąć pod uwagę, że korelacja między szybkością odkształcania a prędkością obrotową nie jest liniowa. Korelacja między prędkością obrotową a szybkością odkształcania nie jest do dziś wystarczająco zbadana i konieczne są dalsze badania w celu zbadania tych konkretnych parametrów 10,26,27. Jednak w oparciu o model laminarnej warstwy granicznej, przy danej średnicy rurki 5 mm i prędkości obrotowej 25 cm/s, przybliżone oszacowanie naprężenia ścinającego ścianki (WSS) wskazywałoby wartości między 2,20-22,00 paskali dla odległości 1,00-0,01 mm do ścianki rurki, gdy gęstość krwi szacuje się na 1060 kg*m-3, a lepkość kinetyczną ustawiono na 0,0025 paskal*s28, Lokal mieszkalny 29. Co ciekawe, również bardziej szczegółowa analiza obliczeniowa dynamiki przepływu w krzywiźnie ludzkich tętnic wieńcowych wykazała wartości WSS w zakresie od 11,33 do 16,77 paskala przy mniej więcej porównywalnych parametrach prędkości, gęstości i lepkości krwi30.
Poza tym ograniczeniem, prezentowany model pętli jest systemem bezciśnieniowym, który nie naśladuje wewnątrznaczyniowych stosunków ciśnienia krwi w ludzkim układzie naczyniowym.
Kolejnym ważnym ograniczeniem jest to, że krew ma kontakt z powietrzem wewnątrz pętli, co powoduje dodatkowe zakłócenia. Na taki kontakt krew-powietrze mają wpływ dwa parametry, do których należą przepuszczalność gazów w rurkach oraz zatrzymywanie powietrza wewnątrz pętli podczas napełniania ich krwią. Każdy materiał rury ma pewną przepuszczalność gazów, która może prowadzić do znacznych zmian stężeń gazów wewnątrz rur. Podczas gdy niektórzy autorzy twierdzą, że wynikowy wpływ przepuszczalności gazów na aktywację składników krwi pozostaje niejasny31, wiadomo, że funkcja koagulatorów krwi jest bardzo wrażliwa na zmianę pH, która może być spowodowana dyfuzją CO2 32,33,34. W tym miejscu przetestowaliśmy biokompatybilność rurek perfuzyjnych krwi w warunkach powietrza w pomieszczeniach, porównywalną ze scenariuszami klinicznymi pozaustrojowej perfuzji krwi. W celu przyszłych ulepszeń prezentowanego modelu, inkubacja całego modelu w inkubatorze CO2 i przeprowadzenie walidacji pH krwi przed i po inkubacji może być przydatne w celu dalszej standaryzacji tego modelu.
Ponadto interfejs krew-powietrze wewnątrz pętli może prowadzić do aktywacji białek osocza i frakcji komórkowych krwi35,36. Urządzenia napędzane pompą rolkową bez powietrza wewnątrz rurek mogą uniknąć problemu granicy faz krew-powietrze, ale z pewnością wywołują uszkodzenia komórek krwi ze znacznie podwyższonym poziomem hemoglobiny w porównaniu z przedstawionym tutaj modelem pętlowym, a hemoglobina w osoczu może zakłócać czułość badanych analitów w teście ELISA16. W tym badaniu wykazaliśmy, że efekt hemolityczny samego modelu pętli pozostaje minimalny przy użyciu materiałów biokompatybilnych, takich jak rurki PVC powlekane heparyną. W ten sposób model z jednej strony nie powoduje nadmiernego uszkodzenia komórek w porównaniu z modelami napędzanymi pompą, ale z drugiej strony indukuje białka osocza w wyniku kontaktu krwi z powietrzem. Warto zauważyć, że van Oeveren i in. opracowali model pętli oparty na zaworze kulowym, unikający powietrza wewnątrz pętli16. Ta obiecująca alternatywa dla przedstawionego tutaj modelu pętli może przezwyciężyć problem granicy faz krew-powietrze, jednak w porównaniu z przedstawionym tutaj modelem, adhezja płytek krwi jest nadal wyższa w przypadku modelu pętli opartej na zaworze kulowym.
Jeśli chodzi o kontrolę statyczną, należy zauważyć, że wykazano, iż szkło samo w sobie jest silnym aktywatorem układu krzepnięcia37. Jednak w prezentowanym układzie inkubacja w szklanej zlewce (kontrola statyczna) nie doprowadziła do nadmiernej aktywacji komórek gospodarza lub aktywacji układu krzepnięcia w porównaniu z poziomami wyjściowymi bezpośrednio po pobraniu krwi. Podsumowując, pomocne może być użycie na przykład rurek polipropylenowych, jeśli kontrola statyczna wykazuje wysoki poziom aktywacji.
Niezależnie od tego, czy jest to model oparty na pętli, czy napędzany pompą, te modele in vitro całkowicie pozbawione są autentycznych interakcji biologicznych, do których przyczynia się głównie nienaruszony śródbłonek, który jest idealną powierzchnią stykającą się z krwią. Uzasadnienie tego problemu jest bardziej oczywiste, gdy testowany jest wyrób medyczny, taki jak stent, który może dawać różne wyniki, pod względem aktywacji i białek osocza, podczas interakcji ze składnikami krwi w obecności śródbłonka. Okazuje się, że jest to główna wada wszystkich omawianych systemów in vitro naśladujących układ krążenia. Stąd, aby przezwyciężyć ten problem, nowe systemy mikroprzepływowe, które są całkowicie pokryte śródbłonkiem, zyskują ogromne zainteresowanie, niemniej jednak w porównaniu z przedstawionym tutaj modelem pętlowym, nadal są ograniczone, aby pomieścić mniejsze objętości krwi i minimalne natężenia przepływu38,39
W związku z tym dochodzimy do wniosku, że model pętli Chandlera pozostaje solidnym modelem do przeprowadzania standaryzowanych testów biokompatybilności naczyniowych wyrobów medycznych we krwi w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych.

Testowanie zgodności hemokompatybilności urządzeń medycznych jest kluczowym krokiem w rozwoju nowych urządzeń, takich jak stenty naczyniowe czy rurki perfuzyjne do pozaustrojowego natleniania błonowego. Do dziś modele zwierzęce są uważane za standardowe narzędzia do finalizacji procedury testowania wyrobów medycznych przed ich wdrożeniem u ludzi. W związku z tym konieczne jest znalezienie alternatywnych modeli in vitro, które jeszcze bardziej pomogą zminimalizować badania na zwierzętach. W związku z tym w tym badaniu zbadaliśmy miniaturowy model pętli hemodynamicznej in vitro. Celem przedstawionej metody jest zbadanie zgodności wyrobów medycznych z krwią in vitro zgodnie z normą ISO 10993-4.
Standard ISO 10993-4 opisuje standardowe zestawy parametrów klinicznych do zbadania na próbce krwi1. W skrócie są to zakrzepica (agregacja i liczba płytek krwi), krzepnięcie (fibrynopeptyd A, FPA), analiza hematologiczna (liczba krwinek pełnych), wskaźnik hemolizy (hemoglobina w wolnym osoczu) i układ dopełniacza (końcowy kompleks dopełniacza, sC5b9). Jednak do pomiarów można również uwzględnić dodatkowe markery, takie jak elastaza wielojądrzasta neutrofili (PMN), interleukina 6 (IL-6) i czynnik martwicy nowotworu - alfa (TNF) odzwierciedlające stan aktywacji leukocytów. Aby określić i określić ilościowo białka wolne od krążących komórek, które są obecne w osoczu krwi, test immunoenzymatyczny typu sandwich (ELISA) stanowi konwencjonalną i najbardziej wiarygodną metodę2,3. Podobnie, fenotyp i status aktywacji komórek gospodarza (np. leukocytów) można określić ilościowo, wykrywając ekspresję cząsteczek na powierzchni komórki za pomocą cytometrii przepływowej (FACS), która zapewnia odczyty oparte na zawiesinie pojedynczej komórki, gdzie znakowane fluorescencyjnie specyficzne przeciwciała wiążą się z docelowymi cząsteczkami powierzchni komórki4. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) jest również zalecana w celu określenia tworzenia się skrzepliny na badanym materiale zgodnie z normą ISO 10993-41. Metoda ta może być uzupełniona o mikrotomografię rentgenowską (μCT), w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej skrzepliny, np. jej grubości, rozmiaru i lokalizacji na renderowanym obrazie 3D5.
Uzasadnieniem dla korzystania z tego modelu hemodynamicznego in vitro jest badanie najlepszych i kompatybilnych urządzeń medycznych poprzez zrozumienie podstawowej dynamiki fizjologicznej składników krwi, takich jak płytki krwi, które są zaangażowane w pierwotną hemostazę lub leukocyty oraz ich interakcji z różnymi typami urządzeń naczyniowych. Takie systemy in vitro są bardzo pożądane, ponieważ zmniejszają potrzebę badań na zwierzętach.
Prezentowany tutaj model pętli spełnia te wymagania. Model ten został po raz pierwszy opisany przez A.B. Chandlera w 1958 roku do produkcji skrzeplin krwi i dlatego jest również nazywany modelem pętli Chandlera6. Do tej pory model ten był wykorzystywany w serii eksperymentów i modyfikacji w celu zbadania biokompatybilności wyrobów medycznych z krwią7,8,9,10,11,12,13,14. Składa się z polimerowych rurek, które są częściowo wypełnione krwią i uformowane w zamykane pętle. Pętle te obracają się w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze, aby symulować warunki przepływu naczyniowego z jego efektami hemorgeologicznymi. Alternatywne metody, takie jak modele napędzane pompą lub modele, które wykorzystują mechaniczne zawory kulowe wewnątrz pętli w celu wywołania przepływu krwi wewnątrz rurek polimerowych, zostały już opisane15,16. Jednak ogólną zaletą przedstawionej tutaj metody jest to, że siła mechaniczna przyłożona do komórek krwi i białek jest niska, co pozwala uniknąć hemolizy i nie ma kontaktu między krwią a łącznikami, co mogłoby prowadzić do turbulencji przepływu i aktywacji składników krwi. Głównymi czynnikami aktywującymi wewnątrz pętli są sam badany materiał i powietrze, które jest w niej uwięzione. Pomaga to zminimalizować źródła błędów pomiarowych i zapewnić wysoką odtwarzalność, nawet jeśli interfejs krew-powietrze może prowadzić do denaturacji białek17. Możliwe jest również badanie różnych materiałów, z których wykonane są rurki i średnice stentów, bez ograniczeń dotyczących długości lub rozmiaru, co pozwala na stosowanie rurek o różnej długości i średnicy wewnętrznej. Co więcej, możliwe jest również zbadanie hemozgodności gospodarza w przypadku niedokładnego zamknięcia pętli i ekspozycji na niepowlekaną powierzchnię rurki. Inne podobne zastosowania medyczne tego modelu pętli hemodynamicznej in vitro polegają na tym, że może on być również wykorzystany do badania interakcji między immunoterapeutykami (lekami) a składnikami krwi podczas rozwoju przedklinicznego lub indywidualnych badań przesiewowych bezpieczeństwa leków przed pierwszym badaniem klinicznym fazy I na ludziach, lub do generowania materiału skrzepliny, który może być wykorzystany w dalszych eksperymentach18, 19,20.
To badanie opisuje szczegółowy protokół testowania hemokompatybilności probówek perfuzyjnych i/lub stentów. Tutaj porównanie między niepowlekanymi i powlekanymi rurami PVC (hepPVC: powłoka heparynowa, poliPVC: powłoka z bioaktywnym polimerem). Zmniejszona aktywacja płytek krwi, ale wyższa aktywacja układu krzepnięcia (FPA) stwierdzono dla obu probówek powlekanych w porównaniu z probówkami niepowlekanymi. Zastosowane tutaj rurki hepPVC są modyfikowane kowalencyjnie związaną heparyną, aby były tromboodporne21 i zostały już wykorzystane w modelu pętli w celu optymalizacji i scharakteryzowania różnych parametrów22. Rurki z poliPVC użyte w tym badaniu są dostępnymi na rynku probówkami stosowanymi w warunkach klinicznych pozaustrojowej perfuzji krwi i są pokryte polimerem heparyny w celu zmniejszenia ich trombogenności23. Czasami w zastosowaniach klinicznych stosuje się nawet niepowlekane rury PVC. Dlatego włączyliśmy rurki lateksowe jako pozytywną grupę kontrolną, która wykazywała nadmierną aktywację płytek krwi, układu krzepnięcia i rozpuszczalnych czynników, takich jak IL-6, TNF i elastaza PMN. Powstawanie skrzepliny zauważono, gdy symulowano niedokładne zamknięcie pętli. Doprowadziło to do aktywacji układu krzepnięcia i dopełniacza, a także leukocytów i płytek krwi w porównaniu z warunkami wyjściowymi. Co więcej, kontakt krwi z zastosowanym tu materiałem stentu (stent nitinolowy z gołego metalu, pokryty impregnowanym węglem spienionym politetrafluoroetylenem) doprowadził do większej aktywacji płytek krwi i leukocytów w zakresie elastazy PMN. Ogólnie rzecz biorąc, prezentowany model nie indukował hemolizy w żadnym z badanych urządzeń naczyniowych, ponieważ były one porównywalne z warunkami wyjściowymi lub statycznymi, z wyjątkiem rurek lateksowych, w których hemoliza krwinek czerwonych (RBC) była oczywista. Co więcej, te rurki perfuzyjne można badać za pomocą obrazowania lub histologii. Chociaż oceny histologiczne mogą być wykonalne, skupiliśmy się głównie na ELISA i cytometrii przepływowej, aby przeprowadzić te eksperymenty, a tym samym umożliwić przeprowadzenie eksperymentów w oparciu o przedstawiony tutaj model dla wielu laboratoriów. W związku z tym metoda ta stanowi wykonalną metodę badania biokompatybilności naczyniowych wyrobów medycznych we krwi zgodnie z zaleceniami normy ISO 10993-4. Co więcej, metoda ta może być stosowana wszędzie tam, gdzie interakcja między krwią a materiałami powinna być badana w warunkach przepływu, naśladując warunki in vivo.

<table><tbody><tr><td>Probówka 5 ml, K3 EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>32332</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ig, &kappa;/Zestaw cząstek kompensacji kontroli negatywnej</td><td>Becton Dickinson BioSciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie przeciwciało CD45</td><td>BioLegend</td><td>368512</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek BD LSR Fortessa II</td><td>Becton Dickinson</td><td>647465</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Probówki cytrynianowe</td><td>Jednorazowy uchwyt Becton Dickinson</td><td>369714</td> BD Vacutainer Becton Dickinson 364815 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok kaniula motylkowa 21 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>367282</td><td></td></tr><tr><td>Szklanka do zlewki ROTILABO krótka 10 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X686.1</td><td></td></tr><tr><td>Szklanka do zlewki ROTILABO krótka 50 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X688.1</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet brylantowy 421 przeciwciało anty-ludzkie CD162</td><td>BioLegend</td><td>328808</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 przeciwciało antyludzkie CD41</td><td>BioLegend</td><td>303730</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka ROTINA 420 | 420 R</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>4701 | 4706</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 50 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>CHC Super modyfikowany, rurka PVC 5 mm</td><td>Corline Szwecja</td><td>1807-148</td><td>Określany jako rura hepPVC</td></tr><tr><td>Okrągły precyzyjny nóż</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Niemcy</td><td>CLS 007-20</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka zamykająca (w komplecie z taśmami napinającymi)</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Niemcy</td><td>CLS 008-20</td><td></td></tr><tr><td>Taśma elektryczna Scotch Super 33+</td><td>VWR</td><td>MMMA331933</td><td></td></tr><tr><td>ELISA MAX Deluxe Set Człowiek IL-6</td><td>BioLegend</td><td>430504</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA MAX Deluxe Human TNF-a</td><td>BioLegend</td><td>430204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 0,1 &ndash; 2,5 &micro; L, szary</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 0,5 &ndash; 10 &micro; L, szary</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 10 &ndash; 100 &micro; L, żółty</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 100 &ndash; 1 000 &micro; L, niebieski</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z epT.I.P.S. box, 20 &ndash; 200 &micro; L, żółty</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Pipette Research plus, jednokanałowa, z workiem na próbki epT.I.P.S., 0,5 &ndash; 5 mL, fioletowy</td><td>Eppendorf AG</td><td>3123000071</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Probówki FACS polistyren 5,0 ml okrągłe dno</td><td>Corning BV</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Bydło płodowe surowica Gold Plus</td><td>Bio-Sell</td><td>FBS. GP.0500</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało anty-ludzkie CD14</td><td>BioLegend</td><td>367116</td><td></td></tr><tr><td>Fluency plus stent 13,5 x 60 mm</td><td>Angiomed GmbH & Co</td><td>FVM14060</td><td></td></tr><tr><td>Free Hemoglobina fHb Odczynnik</td><td>Bioanalytics GmbH</td><td>004001-0250</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki Gibco PBS Rękawice</td> do <td>18912014</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Rękawice Vasco Nitril białe L</td><td>B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG</td><td>9208437</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice Vasco Nitril białe M</td><td>B. Braun Deutschland GmbH & Co.KG</td><td>9208429</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 25% roztwór ekwiwalentny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna, 25.000 IE w 5 ml</td><td>Rotexmedica, Trittau, Niemcy</td><td>PZN 3862340</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA dla ludzkiego fibrynopeptydu A (FPA)</td><td>H&ouml; lzel Diagnostika</td><td>abx253234</td><td></td></tr><tr><td>Kodan nalewka forte bezbarwny</td><td>Sch&uuml; lke & Mayr GmbH</td><td>104012</td><td></td></tr><tr><td>Rurka lateksowa, ID 5 mm</td><td>Laborhandel24 GmbH</td><td>305 0507</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na</td><td>pętlę ebo kunze industriedesign, Neuffen, Niemcy</td><td>CLS 009-20</td><td></td></tr><tr><td>Opaska uciskowa żylna Medimex klasyczna</td><td>ROESER Medical GmbH</td><td>310005</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Infinite 200 Pro M Plex</td><td>Tecan</td><td>TEC006418I</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek PMS-1000i</td><td>VWR</td><td>444-0041</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Metryczne rurki PVC bez ftalanów, średnica wewnętrzna 5 mm</td><td>VWR</td><td>NALG8703-0508</td><td>Określane jako rura PVC</td></tr><tr><td>Jednorazowy termometr kliniczny NexTemp (standard)</td><td>Wskaźniki medyczne</td><td>2112-20</td><td></td></tr><tr><td>Płytki ELISA Nunc MaxiSorp, niepowlekane</td><td>BioLegend</td><td>423501</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tetratlenku osmu</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10256970</tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-ludzki CD16Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-ludzkie przeciwciało CD62P (P-Selectin)</td><td>BioLegend</td><td>304906</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet, pipeta</td><td>VWR</td><td>612-1874</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet epT.I.P.S. 0,2 - 5 ml</td><td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG</td><td>5186480</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet epT.I.P.S. standard 0,1 - 10&mikro; l</td><td>Th. Geyer GmbH & Co. KG</td><td>9409410</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet epT.I.P.S. standard 2 - 200&micro; l</td><td>Th. Geyer GmbH & Co. KG</td><td>0030 000.870</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet epT.I.P.S. standard 50 - 1000&micro; l niebieski</td><td>Th. Geyer GmbH & Co. KG</td><td>0030 000.919</td><td></td></tr><tr><td>PMN (neutrofile) Elastaza ludzka Zestaw ELISA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BMS269</td><td></td></tr><tr><td>Statyw sondy ROTILABO combi</td><td>CARL ROTH</td><td>K082.1</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na jednostkę obrotową (12 gniazd 3/8 '' o zmiennej szerokości szczeliny)</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Niemcy</td><td>CLS 011-20</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC (10X)</td><td>Zbiorniki</td> na odczynniki BioLegend <td>420301</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>613-1184</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka rotacyjna</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Niemcy</td><td>CLS 010-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Safe-Lock 0,5 ml</td><td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG</td><td>5409320</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki Safe-Lock 1,5 ml</td><td>OMNILAB-LABORZENTRUM GmbH & Co. KG</td><td>5409331</td><td></td></tr><tr><td>sc5b9 Ludzki zestaw ELISA</td><td>TECOmedicalGroup</td><td>A029</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel nr 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy XL30 ESEM-FEG</td><td>Philips</td><td>n.a.Butelka</td><td></td></tr> <tr><td>z zakrętką ROTILABO Szkło bezbarwne, 1000 ml, GL 45</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X715.1</td><td></td></tr><tr><td>Butelka zakręcana ROTILABO Szkło bezbarwne, 500 ml, GL 45</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>X714.1</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta półmikro 1,6 ml</td><td>Sarstedt</td><td>67.746</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10,0 ml</td><td>Corning BV</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 25,0 ml</td><td>Corning BV</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna, 5,0 ml</td><td>Corning BV</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa, średnica wewnętrzna 8 mm, średnica zewnętrzna 12 mm</td><td>VWR</td><td>BURK8803-0812</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka do kiełków</td><td>Biozym</td><td>552034</td><td></td></tr><tr><td>Stop Roztwór do podłoża TMB</td><td>BioLegend</td><td>77316</td><td></td></tr><tr><td>Waciki, sterylne</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32055</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300296</td><td></td></tr><tr><td>Umywalka na wodę z kontrolowaną temperaturą</td><td>ebo kunze industriedesign, Neuffen, Niemcy</td><td>CLS 020-20</td><td></td></tr><tr><td>tert-butanol, 99,5%, ekstra czysty, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific 10000730</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw podłoży TMB</td><td></td><td></td> Rurka PVC BioLegend 421101 <td></td></tr><tr><td>Trillium, 5 mm ID</td><td>Medtronic</td><td>161100107100103</td><td>Określany jako rura z poliPVC</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0250</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spektrometer Lambda 2</td><td>Perkin Elmer</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Vornado Mini Vortexer</td><td>Biozym</td><td>55BV101-B-E</td><td></td></tr><tr><td>XN-3000 stacja robocza analizator krwi</td><td>Sysmex Europe</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-CT Phoenix Nanotom S</td><td>GE Sensing & Inspekcja, Wunstorf, Niemcy</td><td>n.d.</td><td></td></tr></tbody></table>

model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

W tym badaniu, hemokompatybilność rurek o wewnętrznej średnicy 5 mm wykonanych z polichlorku winylu (PVC) i pokrytych różnymi bioaktywnymi koniugatami została porównana z niepowlekanymi rurkami PVC, rurkami lateksowymi i stentem do stosowania wewnątrznaczyniowego, który został umieszczony wewnątrz rurek PVC. Ocenę hemokompatybilności przeprowadzono przy użyciu modelu pętli hemodynamicznej in vitro, który jest zalecany przez normę ISO 10993-4. Rurki pocięto na segmenty o identycznej długości i zamknięto w celu utworzenia pętli, unikając jakichkolwiek przerw w splocie, a następnie wypełniono ludzką krwią i obrócono w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Następnie pobrano krew wewnątrz probówek do analizy liczby krwinek pełnych, hemolizy (hemoglobiny wolnej osocza), układu dopełniacza (sC5b-9), układu krzepnięcia (fibrynopeptyd A) i aktywacji leukocytów (elastaza wielojądrzasta, czynnik martwicy nowotworu i interleukina-6). Aktywację komórek gospodarza określono pod kątem aktywacji płytek krwi, statusu integryny leukocytów i agregatów płytek krwi monocytów za pomocą cytometrii przepływowej. Efekt niedokładnego zamknięcia pętli badano za pomocą mikrotomografii rentgenowskiej i skaningowej mikroskopii elektronowej, które wykazały tworzenie się skrzepliny w spawie. Rurki lateksowe wykazały najsilniejszą aktywację zarówno osocza, jak i komórkowych składników krwi, co wskazuje na słabą hemokompatybilność, a następnie grupa stentów i niepowlekane rurki PVC. Powlekane rurki PVC nie wykazały znaczącego spadku stanu aktywacji płytek krwi, ale wykazały zwiększoną kaskadę dopełniacza i krzepnięcia w porównaniu z niepowlekanymi rurkami z PVC. Sam model pętli nie prowadził do aktywacji komórek ani czynników rozpuszczalnych, a poziom hemolizy był niski. W związku z tym przedstawiony model pętli hemodynamicznej in vitro pozwala uniknąć nadmiernej aktywacji składników krwi przez siły mechaniczne i służy jako metoda do badania interakcji in vitro między krwią dawcy a naczyniowymi wyrobami medycznymi.

Wszystkie przedstawione dane, z wyjątkiem wykresów FACS, zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania statystycznego. Wykresy FACS przeanalizowano przy użyciu oprogramowania do cytometrii przepływowej.
Analiza całkowitej liczby krwinek nie wykazała istotnych różnic w liczbie erytrocytów pomiędzy wszystkimi badanymi warunkami (Rycina 2). Jednak liczba płytek krwi i leukocytów była drastycznie zmniejszona w grupie lateksowej, co wskazuje na bardzo słabą biokompatybilność lateksu. Potwierdzają to zwiększone poziomy wolnej hemoglobiny w grupie lateksowej, co wskazuje na fakt, że poza grupą lateksową żadne z pozostałych urządzeń naczyniowych ani warunki nie prowadziły do rozległej hemolizy (Rycina 2). Ponadto powlekane rurki PVC, polyPVC i hepPVC, a także badany stent, nie doprowadziły do zakrzepicy w zakresie utraty płytek krwi i leukocytów, podczas gdy lateks wykazał największą utratę płytek krwi i leukocytów, a następnie niepowlekane rurki PVC, w których zaobserwowano trend spadkowy.
Podczas gdy wszystkie badane urządzenia naczyniowe prowadziły do zwiększonej aktywacji układu krzepnięcia (FPA) i komponentu dopełniacza (sC5b-9), pętle hepPVC wykazały tendencję do obniżenia poziomów FPA i sC5b-9 w porównaniu konkretnie do pętli polyPVC (Rycina 3). Co ciekawe, pętle z niepowlekanego PVC i Gap wykazały niższe poziomy FPA w porównaniu do polyPVC, choć nie osiągnięto poziomu istotności statystycznej. Niemniej jednak pętle lateksowe wykazały istotnie zwiększone poziomy FPA w porównaniu do wartości bazowych i warunków statycznych.
Zgodnie z liczbą komórek w krwi pełnej, pętle lateksowe wykazały najwyższe poziomy TNF, IL-6 oraz elastazy PMN (Rycina 4), osiągając poziom istotności statystycznej w porównaniu z pozostałymi grupami w odniesieniu do TNF i IL-6 (Rycina 4A,B), natomiast w porównaniu do warunków statycznych i wyjściowych w odniesieniu do elastazy PMN (Rycina 4C). Wyniki te wskazują na silną aktywację leukocytów przez lateks. Poziomy wyjściowe markerów aktywacji były zawsze porównywalne z warunkami statycznymi, co wskazuje na prawidłową heparynizację krwi.
Ciekawym spostrzeżeniem było to, że liczba płytek krwi i leukocytów w przypadku pętli z indukowaną szczeliną była jedynie nieznacznie obniżona przy umiarkowanej aktywacji układu krzepnięcia (FPA) oraz leukocytów (elastaza PMN), choć niewłaściwe zamknięcie pętli, skutkujące turbulencjami przepływu i kontaktem krwi z niepowlekaną, chropowatą powierzchnią cięcia, prowadziło do powstania makroskopowo widocznych skrzepów w miejscu złącza (Rycina 1F). Skrzepy oraz ich rozkład na całej powierzchni złącza były widoczne na obrazach µCT i SEM, natomiast nie stwierdzono obecności skrzepów, gdy pętle zamknięto za pomocą zewnętrznego urządzenia zamykającego, nie pozostawiając szczeliny między końcami pętli (Rycina 5).
Analizę cytometryczną przepływową komórek krwi gospodarza, zabarwionych za pomocą markerów specyficznych dla płytek krwi CD41 oraz markera aktywacji płytek CD62P, przedstawiono na Rysunku 6A,B. Tutaj rurki lateksowe wykazały niezwykle wysoką medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla CD62P na płytkach krwi, następnie stent, podczas gdy rurki z polyPVC powlekane heparyną wykazały minimalną aktywację płytek, co wskazuje na przeciwzakrzepowe właściwości rurek polyPVC. Ponadto leukocyty sklasyfikowano na podstawie CD45 oraz ziarnistości określonej przez SSC (rozproszenie boczne) na (i) granulocyty; (ii) monocyty oraz (iii) limfocyty (Rysunek 7), a ekspresję integryny CD162+ wykryto w każdej subpopulacji leukocytów, o których wiadomo, że oddziałują z CD62P na płytkach krwi24. Zauważono, że ekspresja integryn była drastycznie zredukowana na granulocytach i limfocytach w pętlach lateksowych. Wynik ten był zgodny z obniżonym poziomem całkowitej częstotliwości leukocytów w pętlach lateksowych (Rysunek 2). Ogólnie poziomy integryn były wyższe wśród monocytów w porównaniu z granulocytami i limfocytami, co wskazuje na prawdopodobieństwo oddziaływania monocytów z aktywowanymi płytkami krwi. W związku z tym oceniono również agregaty monocytowo-płytkowe poprzez zabarwienie komórek krwi CD14 (jako markerem monocytów) i CD41 (jako markerem płytek), aby ostatecznie zidentyfikować komórki podwójnie dodatnie, tzn. CD14+CD41+MPA (Rysunek 8). Zauważono tutaj, że grupa ze stentem wykazała najwyższe poziomy ekspresji CD41 na MPA, a następnie grupa lateksowa, co wskazuje na zwiększoną tendencję do tworzenia MPA, mimo obniżonej częstotliwości monocytów (&lt;1 %) w pętlach lateksowych.
<img alt="Eksperyment z dynamiki płynów z wykorzystaniem układu rurek spiralnych do analizy przepływu płynu, sekwencja schematów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Przegląd in vitro modelu pętli hemodynamicznej oraz jego modyfikacji. (A) Pętla dla eksperymentu z przerwą z zewnętrznym systemem zamykania pętli, niepozostawiająca przerwy w miejscu złączenia. (B) Pętla wykonana z rurki PVC powlekanej polyPVC ze stentem wewnątrz (strzałka). (C) Pętla wykonana z rurki lateksowej. (D) Pętla dla eksperymentu z przerwą, bez zewnętrznego systemu zamykania pętli, pozostawiająca szczelinę między końcami rurek (strzałka). (E) Pętle umieszczone w uchwycie do pętli wewnątrz kąpieli wodnej i wypełnione krwią. (F) Skrzeplina powodująca powstanie przerwy w miejscu złącza (strzałka) po rotacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe analizy komórek krwi; erytrocyty, płytki krwi, leukocyty, hemoglobina; wykres porównawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wyniki liczenia krwinek oraz stężenia hemoglobiny w osoczu. (A) Liczba erytrocytów. (B) Liczba płytek krwi. (F) Liczba leukocytów. (D) Wolna hemoglobina w osoczu. Wyniki wskazują na słabą biokompatybilność lateksu, prowadzącą do nadmiernej hemolizy. Dane przedstawiono jako wartość średnią; słupki błędów oznaczają SEM. n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący poziomy fibrinopeptydu A i sC5b-9 dla różnych materiałów; analiza oddziaływań krwi z polimerami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki aktywacji układu krzepnięcia i dopełniacza. (A) aktywacja układu krzepnięcia, mierzona poziomem fibrinopeptydu A (FPA) (B) Aktywacja układu dopełniacza, mierzona poziomami sC5b-9. Podczas gdy probówki lateksowe wywołały istotnie podwyższone poziomy FPA, aktywacja dopełniacza była silna dla wszystkich badanych materiałów. Dane przedstawiono jako wartość średnią, słupki błędów oznaczają SEM. *p&lt;0,05, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe przedstawiające poziomy cytokin (TNF, IL-6, elastazy PMN) dla różnych materiałów, wyniki metody." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Markery aktywacji leukocytów. (A) czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF). (B) Interleukina 6 (IL-6) (C) Elastaza PMN. Wyniki wskazują na zwiększoną aktywację leukocytów ze względu na podwyższone poziomy analizowanych markerów, natomiast pętle stentu doprowadziły jedynie do wzrostu poziomu elastazy PMN, a nie TNF lub IL-6. Dane przedstawiono jako wartość średnią, słupki błędów oznaczają SEM. *p&lt;0,5; **p&lt;0,01, n=1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tomografia 3D i analiza SEM struktury pierścienia. Schemat i obrazy mikroskopowe przedstawiają szczegóły strukturalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5: Obrazowanie miejsca łączenia pętli. (A) µ-tomografia komputerowa (µCT) pętli z niewłaściwym zamknięciem (przerwa). Obszary czerwone wskazują materiał zakrzepowy. (B) Renderowanie strony światowej rurki. Prostokątny obszar zaznaczenia wskazuje miejsce do badania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) (C). (D) µCT pętli z zewnętrznym urządzeniem do zamykania pętli i bez przerwy w miejscu zgrzewu, oraz (E) obrazowanie i widok powierzchni luminalnej. Nie stwierdzono obecności materiału zakrzepowego. (F) obraz SEM zaznaczonego prostokąta w (E). Na powierzchni cięcia nie stwierdzono obecności materiału zakrzepowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig05large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza aktywacji płytek krwi; wykres rozrzutu cytometrii przepływowej; porównanie średniej intensywności fluorescencji (MFI) dla CD62P na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wykres FACS dla aktywacji płytek krwi (CD62P). (A) Reprezentatywny wykres FACS (warunki podstawowe) przedstawiający poziom CD41 we krwi+ płytki krwi. (B) Wykres przedstawiający stan aktywacji płytek krwi odzwierciedlony przez średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla różnych typów urządzeń naczyniowych w porównaniu z warunkami statycznymi (RT) oraz wartościami bazowymi. Słupki danych przedstawiają wyniki pojedynczych pomiarów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagramy i wykresy słupkowe z cytometrii przepływowej; analiza komórek CD45, status integryn w granulocytach, monocytach, limfocytach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Wykres FACS dla integryny leukocytowej (CD162). (A) Reprezentatywny wykres FACS (warunki podstawowe) przedstawiający CD45 we krwi+ leukocyty i ich podgrupy (B) Wykres przedstawiający poziom CD162 w leukocytach+ średnia intensywność fluorescencji (MFI) integryn dla różnych rodzajów urządzeń naczyniowych w porównaniu z warunkami statycznymi i bazowymi. Słupki danych przedstawiają wyniki pojedynczych pomiarów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig07large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej z markerami CD14/CD41 oraz wyniki MFI przedstawione na wykresie słupkowym dla danych z próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61570/61570fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rycina 8: Wykres FACS dla agregatów płytkowych i monocytów (CD41/CD14). (A) Reprezentatywny wykres FACS (warunki podstawowe) przedstawiający bramkowanie dla monocytów krwi (CD45+/CD14+), płytki krwi (CD41+) oraz agregaty monocytów i płytek krwi (CD41+/CD14+) (B) Wykres przedstawiający CD41+ średnia intensywność fluorescencji (MFI) w agregatach monocytarno-płytkowych dla poszczególnych urządzeń naczyniowych w porównaniu z warunkami statycznymi i bazowymi. Słupki danych przedstawiają wyniki pojedynczych pomiarów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61570/61570fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Ten model pętli hemodynamicznej pozwala naukowcom testować kompatybilność urządzeń naczyniowych in vitro, takich jak rurki perfuzyjne lub stenty, w znormalizowanych warunkach. Tak więc technika ta nie wywiera żadnego wpływu na krew za pomocą siły mechanicznej, a tym samym pozwala uniknąć mylących wyników spowodowanych wewnętrzną aktywacją składników krwi.Przed przystąpieniem do eksperymentu należy przećwiczyć prawidłowy montaż części mechanicznej, perfekcyjną konstrukcję systemu zamykania pętli i powolne ładowanie krwi do pętli. Aby przygotować zespół pętli, użyj obcinaka do rur, aby wyciąć na płaskiej powierzchni kawałki rurki o długości 250 centymetrów i średnicy wewnętrznej pięciu milimetrów. I podłącz otwarte końce rurek do krótkiego kawałka rurki silikonowej, dopasowując się do zewnętrznej średnicy rurki śledczej, aby wygenerować kształt pętli.Ostrożnie dokręć blokującą łącznika taśmy napinającej i wyreguluj siłę zamykania tak, aby między dwoma zagięciami nie pozostała żadna szczelina. Jeśli śruba blokująca jest całkowicie dokręcona, a napięcie taśmy poliwęglanowej wydaje się zbyt niskie, aby zamknąć szczelinę między dwoma zagięciami, otwórz system blokujący i odetnij kilka milimetrów taśmy napinającej. Aby przygotować zespół pętli stentu, otwórz dwie pętle i wyjmij rurkę z systemu taśmy napinającej.Następnie wprowadź stent do środka rurki zgodnie z instrukcją producenta. Po wygenerowaniu odpowiedniej liczby pętli do eksperymentu, zabezpiecz pętle w kołysce pętli jednostki obrotowej, poza łaźnią wodną o temperaturze 37 stopni i przymocuj kołyskę pętli do jednostki obrotowej wewnątrz łaźni wodnej. Następnie napełnij jedną 10-mililitrową strzykawkę na każde dwie pętle krwi, które mają zostać pobrane, 150 mikrolitrami lub świeżo przygotowanym roztworem podstawowym heparyny i użyj motyla o rozmiarze 21, aby delikatnie zebrać krew do strzykawek, uważając, aby uniknąć homolizy lub aktywacji komórek z powodu nadmiernego podciśnienia.Po zebraniu całej krwi przenieś krew do szklanej zlewki i użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie wymieszać krew i heparynę. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu, w którym końcówka pipety nie jest całkowicie włożona do probówki, ostrożnie napełnij każdą pętlę pięcioma mililitrami krwi. Zamknij każdą pętlę po jej napełnieniu i upewnij się, że pętla, taśma napinająca i stojak są odpowiednio zabezpieczone.Następnie obracaj pętle przez trzy godziny z prędkością 30 obrotów na minutę. Pod koniec obrotu pozostaw pętle w stojaku na dwie minuty, aby krew zgromadziła się na dnie pętli, a następnie ostrożnie otwórz łączniki i wyciągnij krew z duplikatów do pojedynczych szklanych zlewek o pojemności 10 mililitrów. Po zebraniu całej krwi przepłucz każdą probówkę 10 mililitrami PBS i za pomocą skalpela ostrożnie odetnij jednocentymetrową próbkę od końca każdej probówki.Próbki inkubować przez noc w 2% aldehydzie glutarowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie 15-minutową inkubację i 1% tetratlenek osmu w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji tetratlenku osmu odwodnić próbki w rosnącej serii etanolu przez 20 minut na stężenie, a następnie 30-minutowe odwodnienie w 100% etanolu. Pod koniec inkubacji 100% etanolu pozostaw próbki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem próbek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej przy napięciu przyspieszenia pięciu kilowoltów, przy użyciu rentgenowskiego mikrotomografu komputerowego.Do analizy cytometrycznej przepływowej próbek krwi. Przenieś 100 mikrolitrów krwi z każdej próbki do każdej z dziewięciu pięciomililitrowych probówek FACS i utrwal próbki z dodatkiem 100 mikrolitrów 4% formaldehydu o mocy 4% na probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Po umyciu ponownie zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek na probówkę, na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.Pod koniec inkubacji przemyć próbki przez odwirowanie w jednym mililitrze PBS na probówkę i umieścić próbki bez ich supernatantów na lodzie. Aby przygotować pojedyncze kulki kompensujące plamie, dodaj cztery krople dodatnich i cztery krople ujemnych kulek do indywidualnych mililitrowych objętości buforu FACS i zwiruj roztwory, aby uzyskać jednorodne zawiesiny kulek. Dodaj 100 mikrolitrów każdego roztworu do każdej z czterech lub pięciu mililitrowych probówek FACS oznaczonych zgodnie ze wskazaniami i umyj kulki jednym mililitrem buforu FACS na probówkę.Następnie dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego koktajlu przeciwciał wirowych do każdego eksperymentu i fluorescencji minus jedną probówkę z delikatnym mieszaniem. Przez 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki jednym mililitrem świeżego buforu FACS na próbkę i ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach buforu FACS na probówkę.Przed analizą kulek na próbkach komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie ze standardowymi protokołami. Rozmieszczenie krwinek można uwidocznić na całej powierzchni splecionych dwóch pętli za pomocą mikrotomografii komputerowej i obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, podczas gdy w zamkniętych pętlach bez przerw nie obserwuje się żadnych skrzepów. Analiza morfologii krwi pełnej nie wykazuje istotnych różnic w liczbie erytrocytów między którymkolwiek z badanych stanów, liczba płytek krwi i leukocytów jest jednak drastycznie zmniejszona w grupie pętli lateksowej, a liczba wolnych hemoglobiny dramatycznie wzrasta, co wskazuje na bardzo słabą biokompatybilność lateksu.Podczas gdy wszystkie testowane urządzenia naczyniowe indukują zwiększoną aktywację układu krzepnięcia i składnika komplementarnego. Pętle PVC powlekane heparyną wykazują tendencję do obniżania poziomów obu rodzajów aktywacji w porównaniu z pętlami z PVC pokrytymi polimerem. Pętle lateksowe wykazują najwyższe poziomy elastazy TNF IL-6 i PMN, co podkreśla silną aktywację leukocytów przez lateks.CD41-dodatnie płytki krwi odzyskane z probówek lateksowych wykazują niezwykle wysoką medianę intensywności fluorescencji dla CD62P, podczas gdy zintegrowana ekspresja jest drastycznie zmniejszona na granulocytach i limfocytach. Co ciekawe, poziomy integralne są wyższe w monocytach z rurek lateksowych, co sugeruje interakcje płytek krwi aktywowane przez monocyty. Rzeczywiście, barwienie agregatów płytek krwi monocytów ujawnia zwiększoną tendencję do agregacji w pętlach lateksowych i stentowych.Pomimo zmniejszonej częstości występowania monocytów w pętlach lateksowych. Aby uniknąć wewnętrznej aktywacji składników krwi, ważne jest, aby zapewnić prawidłowe zamknięcie pętli i ostrożne obchodzenie się z krwią. Tak więc, postępując zgodnie z tą procedurą, można przeanalizować interakcję między białkami allogenicznymi lub TRUCKs a składnikami krwi, które są wykorzystywane w stanach zapalnych lub badaniach farmaceutycznych.

an-vitro-hemodynamic-loop-model-to-investigate-hemocytocompatibility

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Kontakt krwi z polimerowymi kanałami krwionośnymi inicjuje reakcję ciała obcego, która jest związana z klinicznymi powikłaniami. Tutaj opisano Aparat Pętli Chandlera, eksperymentalne narzędzie naśladujące perfuzję krwi przez te przewody. Wyrostek rekombinowanego CD47 powoduje zmniejszenie dowodów reakcji ciała obcego na tych przewodach.

Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Opisujemy zaprojektowany przez nas model komory przepływowej in vitro, który pozwala na badanie przylegania bakterii do przeszczepionych tkanek.

Model in vitro systemu perfuzyjnego z równoległymi płytkami do badania przylegania bakterii do tkanek przeszczepu

Ten protokół opisuje kompleksową ocenę hemokompatybilności urządzeń mających kontakt z krwią za pomocą laserowo wycinanych implantów nerwowo-naczyniowych. Model pętli przepływu ze świeżą, heparynizowaną krwią ludzką jest stosowany w celu naśladowania przepływu krwi. Po perfuzji różne markery hematologiczne są analizowane i porównywane z wartościami uzyskanymi bezpośrednio po pobraniu krwi w celu oceny hemokompatybilności badanych urządzeń.

Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

Poznaj model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej naczyniowych wyrobów medycznych zgodnie z normą ISO 10993-4. Ta metoda pozwala ocenić aktywację komórek krwi bez wpływu sił mechanicznych.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych (Wideo) | JoVE Journal

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Przeglądaj więcej filmów