Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Ten model pętli hemodynamicznej pozwala naukowcom testować kompatybilność urządzeń naczyniowych in vitro, takich jak rurki perfuzyjne lub stenty, w znormalizowanych warunkach. Tak więc technika ta nie wywiera żadnego wpływu na krew za pomocą siły mechanicznej, a tym samym pozwala uniknąć mylących wyników spowodowanych wewnętrzną aktywacją składników krwi.

Przed przystąpieniem do eksperymentu należy przećwiczyć prawidłowy montaż części mechanicznej, perfekcyjną konstrukcję systemu zamykania pętli i powolne ładowanie krwi do pętli. Aby przygotować zespół pętli, użyj obcinaka do rur, aby wyciąć na płaskiej powierzchni kawałki rurki o długości 250 centymetrów i średnicy wewnętrznej pięciu milimetrów. I podłącz otwarte końce rurek do krótkiego kawałka rurki silikonowej, dopasowując się do zewnętrznej średnicy rurki śledczej, aby wygenerować kształt pętli.

Ostrożnie dokręć blokującą łącznika taśmy napinającej i wyreguluj siłę zamykania tak, aby między dwoma zagięciami nie pozostała żadna szczelina. Jeśli śruba blokująca jest całkowicie dokręcona, a napięcie taśmy poliwęglanowej wydaje się zbyt niskie, aby zamknąć szczelinę między dwoma zagięciami, otwórz system blokujący i odetnij kilka milimetrów taśmy napinającej. Aby przygotować zespół pętli stentu, otwórz dwie pętle i wyjmij rurkę z systemu taśmy napinającej.

Następnie wprowadź stent do środka rurki zgodnie z instrukcją producenta. Po wygenerowaniu odpowiedniej liczby pętli do eksperymentu, zabezpiecz pętle w kołysce pętli jednostki obrotowej, poza łaźnią wodną o temperaturze 37 stopni i przymocuj kołyskę pętli do jednostki obrotowej wewnątrz łaźni wodnej. Następnie napełnij jedną 10-mililitrową strzykawkę na każde dwie pętle krwi, które mają zostać pobrane, 150 mikrolitrami lub świeżo przygotowanym roztworem podstawowym heparyny i użyj motyla o rozmiarze 21, aby delikatnie zebrać krew do strzykawek, uważając, aby uniknąć homolizy lub aktywacji komórek z powodu nadmiernego podciśnienia.

Po zebraniu całej krwi przenieś krew do szklanej zlewki i użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie wymieszać krew i heparynę. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu, w którym końcówka pipety nie jest całkowicie włożona do probówki, ostrożnie napełnij każdą pętlę pięcioma mililitrami krwi. Zamknij każdą pętlę po jej napełnieniu i upewnij się, że pętla, taśma napinająca i stojak są odpowiednio zabezpieczone.

Następnie obracaj pętle przez trzy godziny z prędkością 30 obrotów na minutę. Pod koniec obrotu pozostaw pętle w stojaku na dwie minuty, aby krew zgromadziła się na dnie pętli, a następnie ostrożnie otwórz łączniki i wyciągnij krew z duplikatów do pojedynczych szklanych zlewek o pojemności 10 mililitrów. Po zebraniu całej krwi przepłucz każdą probówkę 10 mililitrami PBS i za pomocą skalpela ostrożnie odetnij jednocentymetrową próbkę od końca każdej probówki.

Próbki inkubować przez noc w 2% aldehydzie glutarowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie 15-minutową inkubację i 1% tetratlenek osmu w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji tetratlenku osmu odwodnić próbki w rosnącej serii etanolu przez 20 minut na stężenie, a następnie 30-minutowe odwodnienie w 100% etanolu. Pod koniec inkubacji 100% etanolu pozostaw próbki do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem próbek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej przy napięciu przyspieszenia pięciu kilowoltów, przy użyciu rentgenowskiego mikrotomografu komputerowego.

Do analizy cytometrycznej przepływowej próbek krwi. Przenieś 100 mikrolitrów krwi z każdej próbki do każdej z dziewięciu pięciomililitrowych probówek FACS i utrwal próbki z dodatkiem 100 mikrolitrów 4% formaldehydu o mocy 4% na probówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Po umyciu ponownie zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek na probówkę, na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki przez odwirowanie w jednym mililitrze PBS na probówkę i umieścić próbki bez ich supernatantów na lodzie. Aby przygotować pojedyncze kulki kompensujące plamie, dodaj cztery krople dodatnich i cztery krople ujemnych kulek do indywidualnych mililitrowych objętości buforu FACS i zwiruj roztwory, aby uzyskać jednorodne zawiesiny kulek. Dodaj 100 mikrolitrów każdego roztworu do każdej z czterech lub pięciu mililitrowych probówek FACS oznaczonych zgodnie ze wskazaniami i umyj kulki jednym mililitrem buforu FACS na probówkę.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego koktajlu przeciwciał wirowych do każdego eksperymentu i fluorescencji minus jedną probówkę z delikatnym mieszaniem. Przez 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyć próbki jednym mililitrem świeżego buforu FACS na próbkę i ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach buforu FACS na probówkę.

Przed analizą kulek na próbkach komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie ze standardowymi protokołami. Rozmieszczenie krwinek można uwidocznić na całej powierzchni splecionych dwóch pętli za pomocą mikrotomografii komputerowej i obrazowania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, podczas gdy w zamkniętych pętlach bez przerw nie obserwuje się żadnych skrzepów. Analiza morfologii krwi pełnej nie wykazuje istotnych różnic w liczbie erytrocytów między którymkolwiek z badanych stanów, liczba płytek krwi i leukocytów jest jednak drastycznie zmniejszona w grupie pętli lateksowej, a liczba wolnych hemoglobiny dramatycznie wzrasta, co wskazuje na bardzo słabą biokompatybilność lateksu.

Podczas gdy wszystkie testowane urządzenia naczyniowe indukują zwiększoną aktywację układu krzepnięcia i składnika komplementarnego. Pętle PVC powlekane heparyną wykazują tendencję do obniżania poziomów obu rodzajów aktywacji w porównaniu z pętlami z PVC pokrytymi polimerem. Pętle lateksowe wykazują najwyższe poziomy elastazy TNF IL-6 i PMN, co podkreśla silną aktywację leukocytów przez lateks.

CD41-dodatnie płytki krwi odzyskane z probówek lateksowych wykazują niezwykle wysoką medianę intensywności fluorescencji dla CD62P, podczas gdy zintegrowana ekspresja jest drastycznie zmniejszona na granulocytach i limfocytach. Co ciekawe, poziomy integralne są wyższe w monocytach z rurek lateksowych, co sugeruje interakcje płytek krwi aktywowane przez monocyty. Rzeczywiście, barwienie agregatów płytek krwi monocytów ujawnia zwiększoną tendencję do agregacji w pętlach lateksowych i stentowych.

Pomimo zmniejszonej częstości występowania monocytów w pętlach lateksowych. Aby uniknąć wewnętrznej aktywacji składników krwi, ważne jest, aby zapewnić prawidłowe zamknięcie pętli i ostrożne obchodzenie się z krwią. Tak więc, postępując zgodnie z tą procedurą, można przeanalizować interakcję między białkami allogenicznymi lub TRUCKs a składnikami krwi, które są wykorzystywane w stanach zapalnych lub badaniach farmaceutycznych.