Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Nasz system hodowli rejestruje plastyczność fenotypową komórek raka płaskonabłonkowego płuc w odpowiedzi na interakcje guza-zrębu oraz sposób, w jaki te interakcje regulują morfologię guza podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc. Główną zaletą naszego systemu jest jego zdolność do modelowania biologii komórek płaskonabłonkowych płuc w kontekście 3D przy jednoczesnym zachowaniu plastyczności komórek nowotworowych. Ta kokultura 3D zapewnia unikalny system do badania interakcji komórek nowotwor-zręb i może być dostosowany do monitorowania odpowiedzi komórek raka płaskonabłonkowego płuc i fibroblastów związanych z rakiem na leczenie farmakologiczne.

Na początek rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Ostudzić dwumililitrowe plastikowe pipety i końcówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia podgrzej odczynniki używane do dysocjacji komórek TUM622, buforu HEPES, trypsyny/EDTA i buforu neutralizującego trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wyjmij rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodówki i umieść fiolkę na lodzie. Schłodzić płytki do hodowli tkankowych na metalowej chłodziarce platformowej umieszczonej na lodzie. Umieść probówki wirówkowe na metalowym stojaku chłodzącym na lodzie.

Oblicz ilość potrzebnych komórek na podstawie liczby dołków i stężenia komórek w każdym dołku, który ma być przygotowany. Przenieś zawiesinę komórek TUM622 do schłodzonej probówki wirówkowej i wiruj z prędkością 300 g w wiszącej wirówce kubełkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą pipety zasysającej przymocowanej do niefiltrowanej końcówki, ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 200 mikrolitrów pożywki w probówce.

Delikatnie postukaj w bok rurki, aby usunąć i oddzielić granulkę, a następnie włóż ją z powrotem do stojaka chłodzącego. Używając dwumililitrowych, wstępnie schłodzonych pipet, delikatnie wymieszaj matrycę z lodem, pipetując kilka razy w górę iw dół. Pipetować z równą i umiarkowaną prędkością, aby podczas tej procedury do matrycy nie zostały wprowadzone pęcherzyki.

Przenieś 1,1 mililitra matrycy do każdej probówki wirówkowej. Używając wstępnie schłodzonych końcówek, odpipetuj matrycę w każdej probówce w górę i w dół około 10 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek. Przenieść 310 mikrolitrów zawiesiny matrycy komórkowej do każdego dołka wstępnie schłodzonej 24-dołkowej płytki.

Umieść pipetę pod kątem 90 stopni do powierzchni płytki i dodaj zawiesinę do środka dołka. Zawiesina rozprzestrzenia się i zakrywa całą studnię. Aby ułatwić dalszą analizę immunofluorescencyjną, przenieś 60 mikrolitrów zawiesiny matrycy komórkowej do środka studzienki szkiełka dwudołkowego.

Dzięki temu matryca może tworzyć strukturę przypominającą kopułę o znacznie mniejszej objętości. Włożyć płytkę i komorę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy. Następnie zbadaj płytkę i wsuń pod mikroskop świetlny, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w matrycy.

Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki 3D do każdego dołka płytki i 1,5 mililitra pożywki hodowlanej 3D do każdej studzienki szkiełka komorowego, a następnie włóż je z powrotem do inkubatora. Po przygotowaniu zawiesin komórkowych TUM622 i CAF, jak opisano wcześniej, policz gęstość komórek CAF, mieszając 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego. Dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny do każdej z dwóch komór na hemocytometrze, aby policzyć i obliczyć gęstość komórek.

Aby współosadzić komórki TUM622 i CAF w macierzy błony podstawnej, najpierw oblicz żądaną liczbę komórek używanych do posiewu na podstawie informacji o gęstości komórek. CAF są wysiewane w stosunku 2:1 komórek TUM622. Przenieś obliczoną objętość TUM622s oraz zawiesinę komórek CAF do tej samej probówki wirówkowej.

Odkręć i zassaj całe medium. Zawiesić w macierzy membrany podstawnej i płytce 310 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki płytki 24-dołkowej. W celu immunofluorescencji przenieś 60 mikrolitrów mieszanin TUM622 i CAF do szkiełek komorowych, jak opisano wcześniej.

Aby przeprowadzić kokulturację TUM622 z nałożonymi CAF w macierzy błony podstawnej, najpierw ustaw monokulturę TUM622, jak opisano wcześniej, przenieś podwójną liczbę zawiesiny CAF do probówki wirówkowej i wiruj z prędkością 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić CAF w pożywce hodowlanej, przenieść dwukrotną liczbę komórek CAF, które zostały ponownie zawieszone w pożywce hodowlanej, do każdej z studzienek zawierających osadzone komórki TUM622. Typowe komórki TUM622 w hodowli 2D są zaokrąglone dużymi jądrami, podczas gdy CAF są płaskie i wydłużone.

Wysiane w hodowli 3D, pojedyncze komórki TUM622 były zdolne do tworzenia organoidów o morfologii podobnej do acinarów po osadzeniu. Między piątym a siódmym dniem w strukturach przypominających worki pojawiło się światło, które następnie pozostało puste. Każdy acinus, złożony z monowarstwy komórek otaczających puste światło, wykazywał prawidłową wierzchołkową polaryzację podstawową, podobną do nabłonka płuc in vivo.

Te podobne do worków struktury były hiperplastyczne i rosły do 24 dni przed całkowitym rozpadem macierzy zewnątrzkomórkowej. W kokulturach TUM622-CAF, zarówno nakładających, jak i współosadzających, obecność CAF znacznie zwiększyła liczbę i rozmiar powstałych sferoid. Co ciekawe, kiedy TUM622 acini zbliżyły się do CAF, spowodowały, że acini stały się inwazyjne i migrowały w kierunku CAF, tworząc struktury przypominające łzy.

Aby zapewnić solidne tworzenie struktur podobnych do worków, kluczowe znaczenie ma utrzymanie macierzy błony podstawnej w postaci płynnej podczas całego procesu osadzania komórek. Organoidy TUM622 mogą być wykorzystywane do różnych analiz dalszych, w tym między innymi do immunofluorescencji, immunohistochemii, cytometrii przepływowej, ekstrakcji RNA i białek, a także mogą być modyfikowane pod kątem badań przesiewowych leków. Korzystając z tego systemu jako platformy, można zbadać, w jaki sposób zmiany wewnętrzne i zewnętrzne komórek nowotworowych w mikrośrodowisku guza mogą wpływać na architekturę nabłonka guza i powstawanie raka.