Name: Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj wielowymiarowy system kokultury do modelowania raka płaskonabłonkowego płuca z wykorzystaniem komórek TUM622 i fibroblastów CAF. Ta metoda pozwala badać plastyczność fenotypową oraz interakcje nowotworowo-stromalne w kontekście 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Magali Guffroy, Johnowi Kreegerowi i Stephani Bisulco z grupy Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker za wsparcie w zakresie patologii/histologii oraz Michaelowi Arensmanowi za krytyczną recenzję manuskryptu. Dziękujemy również Programowi Podoktoranckiemu firmy Pfizer oraz grupie badawczo-rozwojowej ds. onkologii, a w szczególności Robertowi Abrahamowi, Puja Sapra, Karen Widbin i Jennifer Tejeda za wsparcie programu.

1. Pasażowanie i hodowla komórek TUM622 i CAF w hodowlach 2D
<ol>
	<li>Pasażowanie i hodowla komórek TUM622
	<ol>
		<li>Ciepła pożywka hodowlana 3D i odczynniki do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) dla komórek TUM622 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Pasaż komórek TUM622 przy 80% zbiegu w kolbach 2D. Zwykle dzieje się to 1 tydzień po pasażu.</li>
		<li>Wyrzucić starą pożywkę z kolby T75 i przemyć raz 6 ml buforu HEPES. Należy unikać pipetowania bezpośrednio na komórki.</li>
		<li>Odessać bufor HEPES. Dodaj 4 ml trypsyny/EDTA (0,25 mg/ml, patrz tabela materiałów) w celu szybkiego spłukania i wyrzuć trypsynę/EDTA.</li>
		<li>Dodać 2 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Wyjąć kolby z inkubatora i postukać w kolby, aby poluzować komórki bez tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie zwrócić kolby do inkubatora na dodatkowe 5 minut 
		UWAGA: Długotrwała ekspozycja na trypsynę nieodwracalnie uszkodzi komórki i zmieni ich fenotyp, dlatego zaleca się ograniczenie czasu ekspozycji komórek na trypsynę.</li>
		<li>Upewnij się, że komórki odłączyły się i zdysocjowały pod mikroskopem świetlnym (4x lub 10x). Dodać 4 ml buforu neutralizacyjnego (bufor TNS) (patrz informacje o odczynniku do subkultur w Tabeli materiałów), a następnie 10 ml pożywki 3D (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej zdysocjować komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę przez sitko o pojemności 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Nasiona 0,8 x 106 komórek/kolba T75 w 20 ml pożywki hodowlanej 3D (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Karm komórki co drugi dzień, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie i hodowla CAF
	<ol>
		<li>Przejście CAF, gdy komórki osiągają zbieg. Zwykle dzieje się to po 5 dniach hodowli z podziału 1:2.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę CAF za pomocą pożywki podstawowej RPMI z 20% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% L-glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.</li>
		<li>W kolbie T75 przepłukać CAF solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodać 2 ml trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Obserwować pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórki uległy dysocjacji w kolbie (4x lub 10x). Jeśli nie, przedłuż inkubację o kolejne 2-3 minuty.</li>
		<li>Gdy komórki odłączą się i zdysocjują, dodaj 10 ml pożywki hodowlanej 3D, aby zneutralizować trypsynę/EDTA i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dalej dysocjować CAF.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki 3D (patrz tabela materiałów) i umieścić w dwóch nowych kolbach T75.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Posiewanie komórek TUM622 w macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli 3D
<ol>
	<li>Dzień przed eksperymentem rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. Plastikowe pipety (2 ml) i końcówki schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc. 
	UWAGA: Nie wszystkie partie macierzy błony podstawnej mają taką samą zdolność do wspierania wzrostu 3D komórek TUM622. Dlatego konieczne jest nabycie i przetestowanie wielu partii macierzy błony podstawnej w celu zidentyfikowania tych, które wspierają silne tworzenie acini. Zwykle wymaga to wyższego stężenia białka (16-18 mg/ml) w matrycy.</li>
	<li>W dniu eksperymentu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C należy umieścić ciepłą pożywkę hodowlaną 3D, bufor HEPES, trypsynę/EDTA i bufor neutralizujący trypsynę (TNS). Bezpośrednio przed założeniem kultury wyjmij rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodówki i umieść fiolkę na lodzie.</li>
	<li>Schłodzić płytki do hodowli tkankowych na metalowej platformie chłodzącej umieszczonej na lodzie. Umieść probówki wirówkowe na metalowym stojaku chłodzącym na lodzie.</li>
	<li>Korzystając z komórek TUM622 uzyskanych w kroku 1.1.7, oblicz żądaną liczbę komórek potrzebnych do posiewu. Zazwyczaj potrzeba 15 000-30 0000 komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Niższa gęstość jest bardziej odpowiednia do obrazowania i kwantyfikacji, podczas gdy wyższa gęstość jest preferowana podczas pobierania komórek do ekstrakcji RNA lub western blot.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do schłodzonej probówki wirówkowej (każda probówka zawiera komórki do trzykrotnego posiania) i odwirować w temperaturze 300 x g w wirówce kubełkowej do zawieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant pipetą zasysającą przymocowaną do niefiltrowanej końcówki (20 μl), pozostawiając około 100 μl pożywki w probówce (jako wskazówkę należy użyć oznaczeń na probówce).</li>
	<li>Delikatnie postukaj w bok rurki, aby usunąć i oddzielić granulkę przed powrotem do stojaka chłodzącego.</li>
	<li>Używając wstępnie schłodzonych pipet o pojemności 2 ml, delikatnie wymieszaj matrycę, pipetując kilka razy w górę i w dół, utrzymując fiolkę w kontakcie z lodem. Pipetować z równą i umiarkowaną prędkością, aby podczas tej procedury do matrycy nie zostały wprowadzone pęcherzyki.</li>
	<li>Przenieść odpowiednią objętość matrycy do każdej probówki wirówkowej. W przypadku posiewu trzykrotnego na płytce 24-dołkowej dodaj 1,1 ml macierzy membrany podstawnej do każdej probówki.</li>
	<li>Używając wstępnie schłodzonych końcówek, odpipetuj matrycę w każdej probówce w górę i w dół około 10 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek.</li>
	<li>Przenieść 310 μl zawiesiny komórek/matryc do każdego dołka wstępnie schłodzonej płytki 24-dołkowej. Pipetę umieszcza się pod kątem 90° do powierzchni płytki, a zawiesinę dodaje się do środka studzienki. Zawieszenie powinno się rozłożyć i przykryć całą studnię bez konieczności przechylania płyty.</li>
	<li>Aby ułatwić dalszą analizę immunofluorescencyjną, umieść zawiesinę komórki/matrycy równolegle w szkiełkach z 2-dołkową komorą. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek/matryc do środka studzienki z 2-dołkowym szkiełkiem komorowym (patrz Tabela materiałów). Dzięki temu matryca może tworzyć strukturę przypominającą kopułę o znacznie mniejszej objętości.</li>
	<li>Włożyć płytkę i komorę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy. Zbadaj płytkę/szkiełko pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w matrycy (4x lub 10x).</li>
	<li>Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki 3D do każdego dołka i 1,5 ml pożywki 3D do każdego dołka szkiełka komorowego, a następnie włóż je z powrotem do inkubatora.</li>
</ol>
3. 3D Kokulturacja komórek TUM622 i CAF w macierzy zewnątrzkomórkowej
<ol>
	<li>Przygotować zawiesiny komórkowe TUM622 i CAF zgodnie z sekcją 2.</li>
	<li>Policz gęstość komórek CAF, pobierając 10 μl zawiesiny komórek i mieszając ją z 10 μl błękitu trypanowego.</li>
	<li>Dodać 10 μl mieszaniny do każdej z dwóch komór na hememytometrze, aby policzyć i obliczyć gęstość komórek. 
	UWAGA: CAF mają nieregularne kształty i mogą nie być dokładnie zliczane na automatycznym liczniku komórek.</li>
	<li>Współosadzanie komórek TUM622 i CAF w macierzy błony podstawnej
	<ol>
		<li>Na podstawie informacji o gęstości komórek oblicz żądaną liczbę komórek używanych do powlekania. CAF są wysiewane w stosunku 2:1 komórek TUM622. Na przykład dla 30 000 wysianych komórek TUM622 60 000 CAF jest osadzonych.</li>
		<li>Przenieś odpowiednią objętość TUM622 oraz zawiesinę komórek CAFs do tej samej probówki wirówkowej i postępuj zgodnie z krokami 2.5-2.11 w celu posiewu na płytki 24-dołkowe. W celu immunofluorescencji przenieś 60 μl mieszaniny TUM622/CAFs do szkiełek komorowych, jak opisano w kroku 2.12).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla TUM622 z nałożonymi CAF w macierzy błony podstawnej (patrz tabela materiałów)
	<ol>
		<li>Skonfiguruj monokulturę TUM622 zgodnie z krokami 2.5-2.13.</li>
		<li>Przenieś dwukrotność liczby zawiesiny CAF (w porównaniu z liczbą wysianych komórek TUM622) do probówki wirówkowej i wiruj przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić CAF w 1 ml pożywki hodowlanej 3D.</li>
		<li>Przenieś 1 ml zawiesiny CAFs do studzienki zawierającej osadzone komórki TUM622.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zbieranie TUM622 Acini do ekstrakcji RNA/białka i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Przygotować poprzedniego dnia bufor do przemywania i bufor do pobierania komórek zgodnie z protokołem zestawu do pobierania komórek 3D i schłodzić przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Trzymaj płytki w chłodziarce płytowej, a inne odczynniki na lodzie przed rozpoczęciem procesu ekstrakcji.</li>
	<li>Odessać pożywkę z dołków hodowlanych 3D bez dotykania matrycy i delikatnie przemyć studzienkę 3 razy 1 ml buforu do mycia.</li>
	<li>Odessać końcowe płukanie i dodać 1 ml buforu do zbierania komórek do każdej studzienki.</li>
	<li>Użyj końcówki pipety p1000, aby zeskrobać matrycę z każdej studzienki.</li>
	<li>Pipetuj w górę i w dół, aby jeszcze bardziej zdysocjować matrycę.</li>
	<li>Przenieść 1 ml mieszanki do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj kolejny 1 ml bufora do zbioru do tej samej studzienki.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.5-4.7 i przenieś całą mieszaninę tego samego dołka do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Zakryj probówki i kołysz w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Napełnić każdą probówkę lodowatym PBS do 10 ml, a następnie odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant bez dotykania osadu. Supernatant powinien zawierać fragmenty matrycy, ale wszystkie sferoidy powinny być zebrane na dnie probówki.</li>
	<li>Dodaj lodowaty PBS do drugiego prania. Odwróć rurkę kilka razy, aby oddzielić osad. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Podczas wirowania przygotuj bufor do lizy do zbierania białka i RNA.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i dodać bufor do lizy do dalszego przetwarzania w celu zebrania białka lub RNA. Alternatywnie, komórki mogą być ponownie zawieszone w celu analizy przepływu/sortowania FACS lub szeregowego przejścia.</li>
</ol>
5. Immunofluorescencja TUM622 Acini
<ol>
	<li>Przygotować bufor immunofluorescencyjny (bufor IF: PBS z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), 0,2% Triton X-100 i 0,05% Tween-20), pierwotny bufor blokujący (bufor IF z 10% surowicą kozą), wtórny bufor blokujący (pierwotny bufor blokujący z 20 μg/ml koziego anty-mysiego F(ab')2)</li>
	<li>Odessać pożywkę z szkiełek 2-dołkowych, spłukać raz PBS i ustawić szkiełko na chłodziarce z metalową płytką na lodzie. Szkiełko komory powinno pozostać na chłodnicy z metalową płytą do końca protokołu.</li>
	<li>Dodaj wstępnie schłodzony 4% PFA, aby utrwalić acini i inkubować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Usuń 4% PFA i umyj trzy razy po 2 ml wstępnie schłodzonego PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc na bujaku.</li>
	<li>Odessać PBS i przepuszczać 1,5 ml 0,5% Triton X-100 w PBS (wstępnie schłodzony) przez 20 minut. Pod koniec tej procedury struktura przypominająca kopułę stanie się luźna.</li>
	<li>Delikatnie zassać bufor przepuszczalności ze szkiełka komory, aby uniknąć utraty próbki. Osiąga się to poprzez dodanie cienkiej końcówki (20 μl) do pipety zasysającej i dociśnięcie końcówki w kierunku rogu komory.</li>
	<li>Umyj trzy razy 2 ml wstępnie schłodzonego PBS przez 5 minut, delikatnie kołysząc na bujaku.</li>
	<li>Zablokować próbkę za pomocą podstawowego buforu blokującego na lodzie na 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń główny bufor blokujący i dodaj dodatkowy bufor blokujący i blok na 30 minut.</li>
	<li>Dodać przeciwciała pierwszorzędowe do pierwszorzędowego buforu blokującego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Stężenie stosowanych tutaj przeciwciał powinno być wyższe niż normalnie stosowane do barwienia komórek w hodowli 2D. Większość pierwszorzędowych przeciwciał użytych w tym badaniu rozcieńcza się w stosunku 1:100 (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć próbkę 3 razy 2 ml zimnego buforu IF. 
	UWAGA: Próbki mogą być luźne, należy zachować szczególną ostrożność podczas zasysania.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w przeciwciałach drugorzędowych rozcieńczonych w pierwszorzędowym buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Preferowane przeciwciała drugorzędowe powinny być silnie adsorbowane krzyżowo, aby zmniejszyć barwienie tła. Większość przeciwciał drugorzędowych użytych w tym badaniu rozcieńcza się w rozcieńczeniu 1:200.</li>
	<li>Usunąć przeciwciała drugorzędowe i przemyć próbkę 3 razy 2 ml zimnego buforu IF. 
	UWAGA: Próbki mogą być luźne, należy zachować szczególną ostrożność podczas zasysania.</li>
	<li>Dodaj PBS z DAPI (rozcieńczenie 1:1,000) podczas ostatniego prania, aby zabarwić jądro. Wykonaj kolejne 2 prania w PBS.</li>
	<li>Zobrazuj próbki pod mikroskopem konfokalnym w ciągu 3 dni. 
	UWAGA: Ze względu na rozmiar organoidów i ograniczenia w odległości roboczej obiektywu, próbki są zwykle obrazowane w powiększeniu 10x lub 20x.</li>
</ol>
6. Przygotowanie próbek kultur 3D do badań immunohistochemicznych
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z szkiełek z 2-dołkową komorą i raz spłukać PBS.</li>
	<li>Utrwal kultury 3D w 4% PFA w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Usunąć 4% PFA, otoczyć kultury 2,5 ml żelu do próbek histologicznych (patrz tabela materiałów) i umieścić szkiełko w temperaturze 4 °C do zestalenia się przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieś próbki otoczone żelem do próbek histologicznych do kaset tkankowych i przetwarzaj je w automatycznym procesorze próbek tkanek przez noc.</li>
	<li>Zanurz próbki w wosku parafinowym i przygotuj do podziału12.</li>
</ol>
7. 3D Test cytotoksyczności dla badania przesiewowego związków (przykład dla jednej płytki 96-dołkowej)
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy umieścić 96-dołkową płytkę na chłodziarce płytkowej, zbiornik o pojemności 25 ml na chłodziarce zbiornikowej i stożkowe probówki o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Przygotować zawiesiny macierzy komórkowej komórek TUM622 we wstępnie schłodzonej stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, dodając do komórek odpowiednią objętość macierzy błony podstawnej. Pożądana gęstość komórek TUM622 wynosi 10 000 komórek na 70-75 μl macierzy błony podstawnej. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby umożliwić równomierne wymieszanie komórek w matrycy.</li>
	<li>Przesunąć płytę z chłodnicą płytową i zbiornik z chłodnicą zbiornika z dala od lodu na suchą powierzchnię, aby uniknąć kontaktu matrycy membrany podstawnej z lodem podczas przenoszenia.</li>
	<li>Przenieś mieszaninę komórek matrycowych do zbiornika chłodzącego bez tworzenia pęcherzyków.</li>
	<li>Za pomocą mechanicznej pipety wielokanałowej (10-300 μl) przenieś 70-75 μl komórek mieszankowych do każdego odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut, aby matryca błony podstawnej zestaliła się.</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki we wszystkich rzędach i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Rozpocznij dawkowanie mieszanki następnego dnia lub później, w zależności od celu eksperymentu.</li>
	<li>Sferoidy mogą być ponownie podawane i dozowane co 2-3 dni przez okres do 10 dni, usuwając zużyte podłoża za pomocą 8- lub 12-dołkowego kolektora próżniowego i zastępując je świeżymi pożywkami z pożądanymi związkami lub bez.</li>
	<li>Liczbę sferoid TUM622 można określić ilościowo za pomocą imagera 3D zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+of+squamous+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers.</a> Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Extracellular+Matrix%2C+Scaffolds%2C+and+Signaling%3A+Tissue+Architecture+Regulates+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).</li>
<li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).</li>
<li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+differentiate+to+3D+glandular+acini+on+basement+membrane+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).</li>
<li>Godugu, C., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlgiMatrix-Based+3D+Cell+Culture+System+as+an+In+Vitro+Tumor+Model%3A+An+Important+Tool+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research.</a> Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511(2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+suppress+SOX2-induced+dysplasia+in+a+lung+squamous+cancer+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).</li>
<li>Damelin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+a+cellular+hierarchy+in+lung+cancer+reveals+an+oncofetal+antigen+expressed+on+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells.</a> Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).</li>
<li>Sapra, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tumor+regression+induced+by+an+antibody-drug+conjugate+that+targets+5T4%2C+an+oncofetal+antigen+expressed+on+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989(2008).</li>
</ol>

Autorami są pracownicy i akcjonariusze firmy Pfizer Inc.

Guzy to niejednorodne tkanki złożone z komórek rakowych współistniejących obok komórek zrębu, takich jak fibroblasty związane z rakiem, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe w ECM. Razem te różnorodne składniki komunikują się ze sobą i wpływają na mikrośrodowisko guza, odgrywając aktywną rolę w napędzaniu nowotworzenia, procesu, który obejmuje postępujące zmiany w architekturze guza. Idealnie byłoby, gdyby model rozwoju nowotworu in vitro był w stanie uchwycić dynamiczne zmiany w architekturze tkanek obserwowane w l...

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Rak płaskonabłonkowy płuca (LUSC), który jest drugim najczęstszym typem niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) i stanowi około 30% wszystkich nowotworów płuc, jest często diagnozowany w zaawansowanych stadiach i ma złe rokowanie1. Możliwości leczenia pacjentów z LUSC są główną niezaspokojoną potrzebą, którą można poprawić dzięki lepszemu zrozumieniu podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych, które napędzają nowotworzenie LUSC.
Podobnie jak w przypadku większości nowotworów u ludzi, patogeneza LUSC charakteryzuje się zaburzeniem nienaruszonej, dobrze uporządkowanej architektury tkanki nabłonkowej2. Podczas tego procesu dochodzi do utraty prawidłowej polaryzacji komórek wierzchołkowo-podstawnych, kontaktów komórka-komórka i komórka-macierz, co pozwala na niekontrolowany wzrost i inwazyjne zachowanie komórek nowotworowych. Obecnie powszechnie uznaje się, że złośliwe cechy komórek nowotworowych nie mogą objawiać się bez istotnej interakcji między komórkami rakowymi a ich lokalnym mikrośrodowiskiem nowotworowym (TME)3. Kluczowe składniki TME, w tym macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), fibroblasty związane z rakiem (CAF), a także komórki śródbłonka i infiltrujące komórki odpornościowe, aktywnie kształtują TME i napędzają proces nowotworowy4. Niemniej jednak nasza obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób komórki nowotworowe i te kluczowe składniki TME oddziałują na siebie, napędzając zmiany w architekturze tkanek podczas progresji LUC, jest bardzo ograniczona.
Trójwymiarowa (3D) hodowla jest ważnym narzędziem do badania biologicznej aktywności wewnętrznych i zewnętrznych zmian w komórkach regulujących zmiany architektoniczne tkanek zarówno w normalnych, jak i chorych tkankach5. 3D kultury zapewniają odpowiedni kontekst strukturalny i funkcjonalny, którego zwykle brakuje w tradycyjnych kulturach dwuwymiarowych (2D). Dodane wymiary takich systemów bardziej naśladują tkanki in vivo w wielu aspektach fizjologii komórki i zachowań komórkowych, w tym proliferacji, różnicowania, migracji, ekspresji białek i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne. W ostatnich latach wysiłki różnych laboratoriów doprowadziły do opracowania modeli 3D in vitro zarówno dla normalnego płuca, jak i NSCLC6,7,8. Jednak model raka płaskonabłonkowego płuca, który mógłby podsumować zarówno dynamiczne zmiany architektoniczne tkanek podczas nowotworzenia, jak i uwzględnić kluczowe składniki zrębu, był niedostępny.
Tutaj opisujemy metody tworzenia nowatorskiego systemu kokultury 3-wymiarowej (3D) przy użyciu pierwotnych komórek LUSC pochodzących z PDX (określanych jako TUM622) i CAFów9,10. Zarówno TUM622, jak i CAF pochodzą od pacjenta z NSCLC ze słabo zróżnicowanymi nowotworami10. Po osadzeniu jako pojedyncze komórki w ECM, rzadka subpopulacja komórek TUM622 ma zdolność tworzenia organoidów o strukturach podobnych do worków, które wykazują prawidłową polaryzację komórek wierzchołkowo-podstawnych. Te struktury podobne do worków są hiperplastyczne, wykazują niejednorodną ekspresję markerów podobnych do macierzystych i różnicujących podobnych do pierwotnego guza, pozostając nieinwazyjnymi, a tym samym naśladują najwcześniejszy etap rozwoju LUC. Co ważne, wykazaliśmy, że architektura tkankowa struktur podobnych do worków może zostać zmieniona poprzez hamowanie wewnętrznych szlaków sygnałowych komórek za pomocą inhibitorów małocząsteczkowych lub dodanie kluczowych składników w ECM, takich jak CAF, z których ten ostatni zwiększa tworzenie acini i dodatkowo prowokuje acini do inwazyjności, gdy znajdują się w bliskiej odległości. Łącznie dane te sugerują, że ten system kohodowli 3D organoidów LUSC stanowi cenną platformę do badania dynamicznej wzajemności między komórkami LUSC a TME i może być zaadaptowany do monitorowania odpowiedzi komórek LUSC na leczenie farmakologiczne11.

<table><tbody><tr><td>Pożywka do wzrostu nabłonka oskrzeli</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>BEGM</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40um</td><td>ThermoFisher</td><td>352340</td><td>Do przepuszczania komórek TUM622</td></tr><tr><td>Rozszczepione przeciwciało kaspazy 3</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9661 (RRID: AB_2341188)</td><td>Rabbit</td></tr><tr><td>CoolRack CFT30</td><td>Biocision</td><td>BCS-138</td><td>Do hodowli 3D</td></tr><tr><td>CoolSink XT96F</td><td>Biocision</td><td>BCS-536</td><td>Do hodowli 3D</td></tr><tr><td>Zestaw do zbierania komórek Cultrex 3D</td><td>Bio-Techne</td><td>3448-020-K</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex (preferowany do kohodowli)</td> <td>Bio-Techne</td><td>3443-005-01</td><td>Do hodowli 3D</td></tr><tr><td>Przeciwciało CXCR4</td><td>Abcam</td><td>Ab124824 (RRID: AB_10975635)</td> <td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>E-kadheryny</td> królika <td>BD Biosciences</td><td>610182 (RRID: AB_397581)</td> <td>Mysz</td></tr><tr><td>GelCount</td><td>Oxford Optronix</td><td></td><td>Do liczenia i pomiarów przeciwciał Acini</td></tr><tr><td>GM130</td><td>BD Biosciences</td><td>610822 (RRID: AB_398141)</td><td></td></tr> <tr><td>Mouse Goat Serum</td><td>Vector</td><td>Labs S1000 (RRID: AB_2336615)</td> <td>Do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Do CAFs</td></tr><tr><td>Żel do próbek histologicznych</td><td>Richard Allan Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Dla immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Integryna alfa 6 przeciwciało</td><td>Millipore Sigma</td><td>Mab1378 (RRID: AB_2128317)</td> <td>Szczurze</td></tr><tr><td>przeciwciało inwolukrynowe</td><td>Abcam Ab68</td><td>(RRID: AB_305656)</td> <td>Mysie</td></tr><tr><td>przeciwciało Ki67</td><td>Abcam Ab15580</td><td>(RRID: AB_443209)</td> <td>Rabbit</td></tr><tr><td>Lab-Tec II z komorą # 1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego</td><td>Nalge Nunc International</td><td>155379 (2)</td><td>Dla kultury 3D</td></tr><tr><td>Lab-Tec II komorowy #1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego</td><td>Nalge Nunc International</td><td>155409 (8)</td><td>Do hodowli 3D</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Dla CAFów</td></tr><tr><td>Matrigel (preferowany do monohodowli)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Do hodowli 3D</td></tr><tr><td>przeciwciało p63</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>13109 (SRRID:AB_2637091)</td><td>Kojec dla królików</td></tr><tr><td>/ paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Dla odczynników do subkultur CAFs</td></tr><tr><td>ReagentPack</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Do dysocjacji komórek TUM622</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Do CAFów</td></tr><tr><td>Przeciwciało Sox2</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3579 (RRID: AB_2195767)</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Do dysocjacji CAF</td></tr><tr><td>Vi-Cell</td><td>Bechman Coulter</td><td></td><td>Automatyczny licznik komórek</td></tr><tr><td>Przeciwciało wimentyny</td><td>Abcam</td><td>Ab92547 (RRID: AB_10562134)</td> Technologia sygnalizacji komórkowej <td>przeciwciała przeciwko</td></tr> <tr><td>beta-kateninie</td><td>królika</td><td>2677s (RRID: AB_1030943)</td> <td>Mysz</td></tr></tbody></table>

wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Interakcje guz-zręb odgrywają kluczową rolę w rozwoju raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC). Jednak zrozumienie, w jaki sposób te dynamiczne interakcje przyczyniają się do zmian w architekturze tkanek obserwowanych podczas nowotworzenia, pozostaje trudne ze względu na brak odpowiednich modeli. W tym protokole opisujemy generowanie modelu kokultury 3D przy użyciu pierwotnej hodowli komórkowej LUSC znanej jako TUM622. Komórki TUM622 zostały stworzone z ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta LUSC (PDX) i mają unikalną właściwość tworzenia struktur podobnych do worków po wysianiu w macierzy błony podstawnej. Pokazujemy, że TUM622 acini w kokulturze 3D podsumowują kluczowe cechy architektury tkankowej podczas progresji LUSC, a także dynamiczne interakcje między komórkami LUSC a składnikami mikrośrodowiska guza (TME), w tym macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Dalej dostosowujemy nasz główny protokół hodowli 3D, aby pokazać, w jaki sposób ten system może być wykorzystany do różnych dalszych analiz. Ogólnie rzecz biorąc, ten model organoidowy tworzy biologicznie bogatą i elastyczną platformę, która umożliwia uzyskanie wglądu w wewnętrzne i zewnętrzne mechanizmy komórki, które sprzyjają zakłócaniu architektury nabłonka podczas progresji raka i pomogą w poszukiwaniu nowych celów terapeutycznych i markerów diagnostycznych.

Komórki TUM622 i CAF w hodowli 2D 
Rysunek 1 przedstawia typową morfologię komórek TUM622 oraz CAF w hodowli 2D. Komórki TUM622 są zaokrąglone z dużymi jądrami, natomiast CAF są płaskie i wydłużone. Komórki TUM622 mogą osiągnąć 80%-90% konfluencji w hodowli. Dalsza proliferacja prowadzi do powstania większej liczby, lecz mniejszych komórek zagregowanych w koloniach, które nie stykają się bezpośrednio. Z kolei CAF preferują wzrost przy wyżs...

System modelowy in vitro został opracowany w celu uchwycenia zmian architektonicznych tkanek podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) w trójwymiarowej (3D) kohodowli z fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Ten system organoidów stanowi unikalną platformę do badania ról różnych zmian wewnętrznych i zewnętrznych komórek nowotworowych, które modulują fenotyp guza.

Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Nasz system hodowli rejestruje plastyczność fenotypową komórek raka płaskonabłonkowego płuc w odpowiedzi na interakcje guza-zrębu oraz sposób, w jaki te interakcje regulują morfologię guza podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc. Główną zaletą naszego systemu jest jego zdolność do modelowania biologii komórek płaskonabłonkowych płuc w kontekście 3D przy jednoczesnym zachowaniu plastyczności komórek nowotworowych. Ta kokultura 3D zapewnia unikalny system do badania interakcji komórek nowotwor-zręb i może być dostosowany do monitorowania odpowiedzi komórek raka płaskonabłonkowego płuc i fibroblastów związanych z rakiem na leczenie farmakologiczne.Na początek rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Ostudzić dwumililitrowe plastikowe pipety i końcówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia podgrzej odczynniki używane do dysocjacji komórek TUM622, buforu HEPES, trypsyny/EDTA i buforu neutralizującego trypsynę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wyjmij rozmrożoną matrycę błony podstawnej z lodówki i umieść fiolkę na lodzie. Schłodzić płytki do hodowli tkankowych na metalowej chłodziarce platformowej umieszczonej na lodzie. Umieść probówki wirówkowe na metalowym stojaku chłodzącym na lodzie.Oblicz ilość potrzebnych komórek na podstawie liczby dołków i stężenia komórek w każdym dołku, który ma być przygotowany. Przenieś zawiesinę komórek TUM622 do schłodzonej probówki wirówkowej i wiruj z prędkością 300 g w wiszącej wirówce kubełkowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą pipety zasysającej przymocowanej do niefiltrowanej końcówki, ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 200 mikrolitrów pożywki w probówce.Delikatnie postukaj w bok rurki, aby usunąć i oddzielić granulkę, a następnie włóż ją z powrotem do stojaka chłodzącego. Używając dwumililitrowych, wstępnie schłodzonych pipet, delikatnie wymieszaj matrycę z lodem, pipetując kilka razy w górę iw dół. Pipetować z równą i umiarkowaną prędkością, aby podczas tej procedury do matrycy nie zostały wprowadzone pęcherzyki.Przenieś 1,1 mililitra matrycy do każdej probówki wirówkowej. Używając wstępnie schłodzonych końcówek, odpipetuj matrycę w każdej probówce w górę i w dół około 10 razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek. Przenieść 310 mikrolitrów zawiesiny matrycy komórkowej do każdego dołka wstępnie schłodzonej 24-dołkowej płytki.Umieść pipetę pod kątem 90 stopni do powierzchni płytki i dodaj zawiesinę do środka dołka. Zawiesina rozprzestrzenia się i zakrywa całą studnię. Aby ułatwić dalszą analizę immunofluorescencyjną, przenieś 60 mikrolitrów zawiesiny matrycy komórkowej do środka studzienki szkiełka dwudołkowego.Dzięki temu matryca może tworzyć strukturę przypominającą kopułę o znacznie mniejszej objętości. Włożyć płytkę i komorę z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy. Następnie zbadaj płytkę i wsuń pod mikroskop świetlny, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są równomiernie rozmieszczone w matrycy.Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki 3D do każdego dołka płytki i 1,5 mililitra pożywki hodowlanej 3D do każdej studzienki szkiełka komorowego, a następnie włóż je z powrotem do inkubatora. Po przygotowaniu zawiesin komórkowych TUM622 i CAF, jak opisano wcześniej, policz gęstość komórek CAF, mieszając 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego. Dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny do każdej z dwóch komór na hemocytometrze, aby policzyć i obliczyć gęstość komórek.Aby współosadzić komórki TUM622 i CAF w macierzy błony podstawnej, najpierw oblicz żądaną liczbę komórek używanych do posiewu na podstawie informacji o gęstości komórek. CAF są wysiewane w stosunku 2:1 komórek TUM622. Przenieś obliczoną objętość TUM622s oraz zawiesinę komórek CAF do tej samej probówki wirówkowej.Odkręć i zassaj całe medium. Zawiesić w macierzy membrany podstawnej i płytce 310 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki płytki 24-dołkowej. W celu immunofluorescencji przenieś 60 mikrolitrów mieszanin TUM622 i CAF do szkiełek komorowych, jak opisano wcześniej.Aby przeprowadzić kokulturację TUM622 z nałożonymi CAF w macierzy błony podstawnej, najpierw ustaw monokulturę TUM622, jak opisano wcześniej, przenieś podwójną liczbę zawiesiny CAF do probówki wirówkowej i wiruj z prędkością 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić CAF w pożywce hodowlanej, przenieść dwukrotną liczbę komórek CAF, które zostały ponownie zawieszone w pożywce hodowlanej, do każdej z studzienek zawierających osadzone komórki TUM622. Typowe komórki TUM622 w hodowli 2D są zaokrąglone dużymi jądrami, podczas gdy CAF są płaskie i wydłużone.Wysiane w hodowli 3D, pojedyncze komórki TUM622 były zdolne do tworzenia organoidów o morfologii podobnej do acinarów po osadzeniu. Między piątym a siódmym dniem w strukturach przypominających worki pojawiło się światło, które następnie pozostało puste. Każdy acinus, złożony z monowarstwy komórek otaczających puste światło, wykazywał prawidłową wierzchołkową polaryzację podstawową, podobną do nabłonka płuc in vivo.Te podobne do worków struktury były hiperplastyczne i rosły do 24 dni przed całkowitym rozpadem macierzy zewnątrzkomórkowej. W kokulturach TUM622-CAF, zarówno nakładających, jak i współosadzających, obecność CAF znacznie zwiększyła liczbę i rozmiar powstałych sferoid. Co ciekawe, kiedy TUM622 acini zbliżyły się do CAF, spowodowały, że acini stały się inwazyjne i migrowały w kierunku CAF, tworząc struktury przypominające łzy.Aby zapewnić solidne tworzenie struktur podobnych do worków, kluczowe znaczenie ma utrzymanie macierzy błony podstawnej w postaci płynnej podczas całego procesu osadzania komórek. Organoidy TUM622 mogą być wykorzystywane do różnych analiz dalszych, w tym między innymi do immunofluorescencji, immunohistochemii, cytometrii przepływowej, ekstrakcji RNA i białek, a także mogą być modyfikowane pod kątem badań przesiewowych leków. Korzystając z tego systemu jako platformy, można zbadać, w jaki sposób zmiany wewnętrzne i zewnętrzne komórek nowotworowych w mikrośrodowisku guza mogą wpływać na architekturę nabłonka guza i powstawanie raka.

multidimensional-coculture-system-to-model-lung-squamous-carcinoma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę hodowli 3D komórek raka płuc w celu zbadania interakcji komórka-matryca. W protokole przeprowadzimy hodowlę 3D komórek raka płuc TUM622 w celu zbadania jego potencjału tworzenia organoidów in vitro.

Trójwymiarowa hodowla komórek raka płuc: metoda badania interakcji komórka-macierz

Ten film opisuje dwa systemy modelowe invitro do uchwycenia zmian w architekturze tkanek podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc w trójwymiarowej (3D) kohodowli z fibroblastami związanymi z rakiem. System ten stanowi unikalną platformę do badania roli zmian wewnętrznych i zewnętrznych, które wpływają na fenotyp guza.

Kokultura 3D komórek raka płuc z CAF: system modelowy in vitro do badania progresji guza

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) model raka płuc oparty na biologicznym rusztowaniu kolagenowym do badania wrażliwości na terapie ukierunkowane na niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC). Pokazujemy różne techniki odczytu w celu określenia wskaźnika proliferacji, apoptozy i stanu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT). Zebrane dane są integrowane z modelem in silico w celu przewidywania wrażliwości leków.

Połączony model tkankowy 3D guza płuca wykonany in vitro/in silico do przewidywania skuteczności leków w określonych tłach mutacyjnych

Tutaj prezentujemy protokół dla modelu raka płuc ex vivo, który naśladuje etapy progresji guza i pomaga wyizolować guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe i zmiany przerzutowe.

Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

To badanie przedstawia ortotopowy model niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) oparty na wewnątrzpłucnej inokulacji wielokomórkowych sferoid fluorescencyjnych komórek A549-iRFP. Model podsumowuje kliniczne stadia niedrobnokomórkowego raka płuca i reaguje na cisplatynę, zgodnie z dynamicznym monitorowaniem in vivo fluorescencji na długich falach.

Budowa ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu niedrobnokomórkowego raka płuca naśladującego postęp choroby i predykcję działania leków

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj wielowymiarowy system kokultury do modelowania raka płaskonabłonkowego płuca z wykorzystaniem komórek TUM622 i fibroblastów CAF. Ta metoda pozwala badać plastyczność fenotypową oraz interakcje nowotworowo-stromalne w kontekście 3D.

Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Przeglądaj więcej filmów