Name: Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj technikę 3D multicolor DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych. Ta metoda umożliwia wizualizację wielu loci genomowych na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za pomoc techniczną ze strony INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Mediolan, Włochy), w szczególności C. Cordiglieri, za pomoc podczas pozyskiwania wielokolorowych obrazów 3D DNA FISH. Prace te zostały wsparte następującymi grantami dla B.B.: EPIGEN Italian flagship program, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) oraz Giovani Ricercatori, włoskie Ministerstwo Zdrowia (GR-2011-02349383). Praca ta została wsparta następującym grantem dla F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

1. Procedury przygotowania sondy DNA i znakowania z tłumaczeniem nicków
<ol>
	<li>Oczyścić i oczyścić sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC), plazmidy lub produkty PCR za pomocą specjalnych zestawów (tabela materiałów), ponownie zawiesić w ddH2O, sprawdzić elektroforezą na żelu agarozowym i określić ilościowo.</li>
	<li>Przeprowadzić translację nacięcia na 1,5−2 μg DNA z kroku 1.1 w końcowej objętości 50 μl, mieszając wszystkie odczynniki w probówce o niskim poziomie wiązania DNA o 0,5 ml zgodnie z tabelą 1. 
	UWAGA: Bezpośrednio oznakowane sondy mogą poprawić stosunek sygnału do szumu. Zestawy do produkcji pośrednio i bezpośrednio znakowanych sond z różnymi fluorochromami Alexa metodą translacji nicków są dostępne na rynku.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę translacji nacięć w mieszalniku termicznym w temperaturze 16 °C przez czas zależny od długości wyjściowego materiału DNA: 45 minut w przypadku produktów PCR (pula produktów PCR po 2 000 pz każdy) i do 4 godzin w przypadku DNA BAC i plazmidów.</li>
	<li>Sprawdź rozmiar sond wytworzonych w kroku 1.3 za pomocą elektroforezy na 2,2% żelu agarozowym. 
	UWAGA: Optymalny rozmiar sondy to <200 pz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Jeśli DNA nie jest wystarczająco strawione, dodać 5 U polimerazy DNA I i 0,05 U DNazy I do reakcji i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze 16 °C, a następnie ponownie sprawdzić. Zatrzymać reakcję za pomocą 0,5 mM EDTA (stężenie końcowe). Przechowuj sondy w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdego eksperymentu DNA FISH wytrącić następujące ilości sond w zależności od wyjściowego materiału DNA, z którego produkowane są sondy: 200 ng z produktów PCR z translacją nicka, 100 ng z BAC z translacją nicka lub 300 ng z plazmidu z translacją nicka. Dodać ddH2O do 150 μl, 20 μg nieznakowanego DNA plemników łososia, 3,5 μg specyficznego dla gatunku DNA Cot-1, 3 objętości 100% EtOH i 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2. Wytrącać się w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Przemyć granulkę dwukrotnie 70% EtOH.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2 μl 100% formamidu o pH 7,0, wstrząsać w temperaturze 40 °C przez 30 minut (może to potrwać do kilku godzin), a następnie dodać równą objętość 4x cytrynian soli fizjologicznej (SSC)/20% siarczanu dekstranu.
	<ol>
		<li>Przygotować 20x SSC, mieszając 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu w końcowej objętości 1 lH2O. Autoklaw, przefiltrować i przygotować podwielokrotności. 
		UWAGA: W przypadku wielokolorowych DNA FISH różne sondy mogą być wytrącane razem, z wyjątkiem sond, które mogą wyżarzać się ze sobą. W tych szczególnych przypadkach należy traktować je oddzielnie, wytrącić i ponownie zawiesić sondy, dzieląc odczynniki wymienione w krokach 1.5−1.7 w odniesieniu do liczby sond. Połączyć próbki dopiero po ponownym zawieszeniu w formamidzie. Jeśli używane są szkiełka nakrywkowe o średnicy większej niż 10 mm lub mniejszej niż 10 mm, należy zwiększyć / zmniejszyć objętość odczynników użytych w krokach 1,5−1,7 proporcjonalnie do rozmiaru szkiełka. Sondy hybrydyzacyjne mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez długi czas (do dwóch miesięcy).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrwalanie komórek, obróbka wstępna i przepuszczalność
UWAGA: Przejścia przepuszczalności i deproteinizacji są kluczowymi krokami. Czas reakcji i stężenie odczynników silnie zależą od typu komórki, obfitości cytoplazmy i morfologii jądra.
<ol>
	<li>Utrwalanie komórek, obróbka wstępna i przepuszczalność ludzkich pierwotnych limfocytów T 
	UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla małych komórek, z małymi jądrami i małą ilością cytoplazmy.
	<ol>
		<li>Stosować szkiełka nakryte szklane (10 mm, grubość nr 1,5H).</li>
		<li>Umyj szklankę z ddH2O, a następnie z 70% EtOH i pozostaw do wyschnięcia. Użyj jednej szklanki na każdy dołek z 24-dołkowej płytki.</li>
		<li>Dodaj 200 μl 0,1% poli-L-lizyny (w/v) (tabela materiałów) bezpośrednio na szkło, aby utworzyć kroplę. Zwróć uwagę, ponieważ kropla musi pozostać na szklanej powierzchni bez dotykania studzienki przez 2-5 minut. Ostrożnie wylej kroplę i pozostaw szklankę do wyschnięcia na 30 minut.</li>
		<li>Wykonaj krok 2.1.3 jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Umieścić 200 μl komórek zawiesinowych (2 x 106/ml, zawiesina PBS pierwotnych limfocytów T ex vivo) bezpośrednio na szkle, pozostawić komórki do wysiewu w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.</li>
		<li>Szybko usuń kroplę. Dodać świeżo przygotowany 4% PFA (przygotowany w PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7,0, przefiltrowany) przez 10 minut i utrwalić wysiane komórki w temperaturze RT.</li>
		<li>Umyć trzykrotnie po 5 minut 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) w temperaturze RT. Filtrować 0,5% TPBS przez 10 minut w temperaturze RT.</li>
		<li>Przeprowadzić leczenie RNazą, dodając 2,5 μl koktajlu RNazy (tabela materiałów) do 250 μl PBS/studzienkę na 24-dołkowej płytce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wypłukać w PBS, dodać 20% glicerolu/PBS i inkubować przez noc (ON) w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Ten krok może trwać od 1 godziny do ON. Szkiełka można przechowywać w 20% glicerolu/PBS w temperaturze 4 °C do 7 dni.</li>
		<li>Zamrozić na suchym lodzie (15−30 s), stopniowo rozmrażać w temperaturze pokojowej i moczyć w 20% glicerolu/PBS. Powtórz krok 2.1.9 jeszcze trzy razy.</li>
		<li>Prać w 0,5% TPBS przez 5 min w RT. Prać w 0,05% TPBS, dwa razy przez 5 min w RT. Inkubować w 0,1 N HCl przez 12 min w RT. Płukać w 2x SSC.</li>
		<li>Inkubować w 50% formamidzie o pH 7,0/2x SSC ON w RT. 
		UWAGA: Czas inkubacji można zoptymalizować i ostatecznie skrócić. Preparaty można przechowywać w 50% formamidzie/2x SSC przez kilka dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie komórek, obróbka wstępna i przepuszczalność ludzkich mioblastów pierwotnych 
	UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla dużych komórek z dużą ilością cytoplazmy.
	<ol>
		<li>Hoduj ludzkie pierwotne mioblasty bezpośrednio na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach w pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM), 20% płodowa surowica bydlęca (FBS), 25 ng/ml czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), 10 ng/ml naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), 10 μg/ml insuliny ludzkiej, 1x glutamina, 1x penicylina/streptomycyna) przez co najmniej 24 godziny (osiągając 50−70% konfluencji). 
UWAGA: Aby ułatwić przyczepność, żelatynę lub kolagen lub poli-L-lizynę można użyć do pokrycia szkiełka nakrywkowego przed siewem.</li>
		<li>Przepłukać komórki w 2−3 zmianach PBS. Dodaj świeżo przygotowane 4% PFA i utrwalaj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Prać trzy razy po 3 minuty w 0,01% TPBS w RT. Przepuszczalnie w 0,5% TPBS przez 10 min w RT.</li>
		<li>Przeprowadzić leczenie RNazą, dodając 2,5 μl koktajlu RNazy (tabela materiałów) do 250 μl PBS/studzienkę na 24-dołkowej płytce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wypłukać w PBS, dodać 20% glicerolu/PBS i inkubować w temperaturze RT. 
		UWAGA: Ten krok może trwać od 1 godziny do ON. Szkiełka można przechowywać w 20% glicerolu/PBS w temperaturze 4 °C do 7 dni.</li>
		<li>Zamrozić na suchym lodzie (15−30 s), stopniowo rozmrażać w temperaturze pokojowej i moczyć w 20% glicerolu/PBS. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
		<li>Umyj trzy razy po 10 minut w PBS. Inkubować w 0,1 N HCl przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płukać w 2x SSC.</li>
		<li>Inkubować w 50% formamidzie o pH 7,0/2x SSC ON w RT. 
		UWAGA: Czas inkubacji można zoptymalizować i ostatecznie skrócić. Preparaty można przechowywać w 50% formamidzie/2x SSC przez kilka dni.</li>
		<li>Preparaty równowagowe (utrzymywane w 50% formamidzie/2x SSC) w 2x SSC przez 2 min. Następnie równoważ w PBS przez 3 minuty.</li>
		<li>Stosuj 0,01 N HCl/0,0025% pepsyny przez kilka sekund do 5 minut, w zależności od typu komórki. Na tym etapie obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym i zatrzymaj reakcję (krok 2.2.11), gdy tylko jądra zostaną wolne od cytoplazmy, zachowując nienaruszoną ich strukturę (np. jąderka są nadal widoczne i nienaruszone).</li>
		<li>Dezaktywować pepsynę, przemywając ją dwukrotnie przez 5 minut w 50 mM MgCl2/PBS.</li>
		<li>Postfix w 1% PFA/PBS przez 1 min. Myć przez 5 min w PBS. Umyć dwa razy po 5 minut w 2x SSC, a następnie dodać 50% formamidu/2x SSC przez co najmniej 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 3D wielokolorowa hybrydyzacja DNA FISH
<ol>
	<li>Denaturować sondy w temperaturze 80 °C przez 5 minut, a następnie szybko umieścić na lodzie.</li>
	<li>Załaduj sondy hybrydyzacyjne na czyste szkiełko mikroskopowe. Odwróć szkiełko nakrywkowe z komórkami do góry nogami na kropli sond hybrydyzacyjnych.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe cementem gumowym. Pozostaw cement kauczukowy do całkowitego wyschnięcia. Następnie umieść szkiełka na bloku grzewczym i denaturuj w temperaturze 75 °C przez 4 min. 
	UWAGA: Czas denaturacji i temperaturę denaturacji można zwiększyć do 80 °C.</li>
	<li>Hybrydyzować w temperaturze 37 °C ON w metalowym pudełku unoszącym się w łaźni wodnej. 
	UWAGA: Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, temperatura hybrydyzacji może wzrosnąć do 42 °C.</li>
	<li>Odkleić cement kauczukowy, zanurzyć szkiełka w 2x SCC, zdjąć szklane szkiełko nakrywkowe i przenieść je do 2x SSC w płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Przemyć w 2x SSC trzy razy przez 5 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 90 obr./min w wytrząsarce inkubatora. Przemyć w 0,1x SSC trzy razy przez 5 minut w temperaturze 60 °C, wstrząsając z prędkością 90 obr./min w wytrząsarce inkubatora. Spłucz krótko w 4x SSC/0,2% TWEEN 20.</li>
</ol>
4. 3D wielobarwne wykrywanie DNA FISH
UWAGA: Dla sond bezpośrednio oznaczonych, pomiń kroki 4.1 i 4.2.
<ol>
	<li>Blokować 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 20 minut w temperaturze 37 °C na 24-dołkowej płytce, wstrząsając z prędkością 20 obr./min w wytrząsarce inkubatora.</li>
	<li>Inkubować z odpowiednim stężeniem antydigoksygeniny (1:150) i/lub streptawidyny (1:1 000) (tabela materiałów) rozcieńczonych w 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA przez 35 minut w ciemnej i mokrej komorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyć w 4x SSC/0,2% TWEEN 20 trzy razy po 5 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 90 obr./min na 6-dołkowej płytce w inkubatorze.</li>
	<li>Równowaga w PBS i post-fix w 2% formaldehydzie/PBS przez 2 minuty w temperaturze pokojowej na płytce 24-dołkowej. 
	UWAGA: Sondy znakowane bezpośrednio nie wymagają mocowania po utrwaleniu.</li>
	<li>Umyć 5x krótko w PBS. Barwieć 1 ng/ml DAPI (4,6-diamidyn-2-fenyloindol)/PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć 5x krótko w PBS. Zamontuj za pomocą roztworu zapobiegającego blaknięciu (tabela materiałów).</li>
</ol>
5. 3D wielobarwna mikroskopia i analiza DNA FISH
<ol>
	<li>Pozyskiwanie obrazów 3D za pomocą systemu mikroskopowego. 
	UWAGA: W tym przypadku używany jest mikroskop szerokokątny o odległości osiowej 0,2−0,25 μm między kolejnymi sekcjami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Analizuj stosy obrazów 3D za pomocą różnych programów i narzędzi (tutaj, NuCLεD lub Nuclear Contacts Locator w 3D). 
	UWAGA: Narzędzie NuCLεD zostało opracowane w celu automatycznej analizy wielokolorowego DNA FISH 3D w stosach z-obrazów komórek fluorescencyjnych. NuCLεD rekonstruuje jądra ze stosów obrazów komórkowych w 3D, a także wykrywa i lokalizuje fluorescencyjne plamki 3D. Mierzy względne położenie plamek w jądrze (np. odległość od środka ciężkości jąder i/lub obrzeża jąder) oraz maksymalny promień dla każdego jądra i odległości między plamkami. Użyte narzędzie i algorytm są w pełni opisane w Cortesi et al.16.</li>
	<li>Przeanalizuj dane (np. odległości 3D między określonymi loci genomowymi a centroidem jądrowym i częstotliwościami kontaktów) uzyskane przez NuCLεD. 
	UWAGA: W przypadku odległości 3D między określonymi loci genomowymi a centroidem jądrowym, należy znormalizować odległości na maksymalnym promieniu dla każdego jądra i przedstawić te dane jako rozkłady częstości znormalizowanych odległości od centroidu jądrowego. W przypadku badań oddziaływań dalekiego zasięgu przyjmuje się, że częstości kontaktu mieszczą się w zakresie 10−20%21 z progową odległością, która może się różnić i może wynosić około 2 μm35.
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić analizę statystyczną, przeanalizuj około 100 jąder na replikę biologiczną. Przedstaw odległości 3D między określonymi loci genomowymi jako skumulowane rozkłady częstości odległości, które są poniżej wybranego progu między odległościami i użyj testu t, aby ocenić znaczenie różnic w rozkładach. Oblicz również procent jąder dodatnich dla oddziaływań, które są poniżej wybranego progu odległości między odległościami, i użyj dokładnego testu Fishera, aby ocenić znaczenie różnic w procentach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772(2016).</li>
<li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li>
<li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+genome+organization+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li>
<li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+genome+architecture%3A+players+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li>
<li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li>
<li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li>
<li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47(2015).</li>
<li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li>
<li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly%28ADP-ribose%29-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li>
<li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+TADs%3A+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li>
<li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li>
<li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773(2014).</li>
<li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints%3B+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, Pt 2 64-72 (2015).</li>
<li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li>
<li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+tissue+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li>
<li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR%2FCas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li>
<li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li>
<li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , Chapter 4, Unit 4 15(2013).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li>
<li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li>
<li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+morphologies%3A+their+diversity+and+functional+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li>
<li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147(2015).</li>
<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li>
<li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584(2018).</li>
<li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li>
<li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li>
<li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging%2C+contact+maps%2C+and+integrative+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872(2018).</li>
<li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecna metoda opisuje krok po kroku protokół do wykonywania 3D wielokolorowego DNA FISH na szerokiej gamie ludzkich komórek pierwotnych. Chociaż DNA FISH jest technologią znajdującą się w szerokim zastosowaniu, wielobarwne 3D DNA FISH na zachowanych jądrach interfazowych 3D jest nadal trudne do wykonania w wielu laboratoriach, głównie ze względu na charakterystykę użytych próbek23,24.
Translacja nacięć sondy jest podstawowym krokiem do...

Wyższe eukarionty muszą systematycznie kondensować i kompaktować ogromną ilość informacji genetycznej w maleńkiej przestrzeni 3D jądra1,2,3,4. Dziś wiemy, że genom jest przestrzennie uporządkowany w przedziałach i topologicznie powiązanych domenach5 i że wiele poziomów fałdowania DNA generuje kontakty między różnymi regionami genomu, które mogą obejmować tworzenie pętli chromatyny6,7. Dynamiczna pętla chromatyny 3D może wpływać na wiele różnych procesów biologicznych, takich jak transkrypcja8,9, różnicowanie i rozwój10,11, naprawa DNA12,13, podczas gdy jego perturbacje są związane z różnymi chorobami14,15,16 i wady rozwojowe15,17,18.
Opracowano wiele podejść do badania organizacji genomu 3D. Technologie oparte na wychwytywaniu konformacji chromosomów (technologie C, 3C, 4C, 5C, Hi-C i pochodne) zostały opracowane w celu badania organizacji genomu w komórkach stałych3,4,19,20. Takie podejścia opierają się na zdolności do uchwycenia częstotliwości kontaktu między loci genomu w fizycznej bliskości. Technologie C, w zależności od ich złożoności, wychwytują globalną organizację genomu 3D i topologię jądrową populacji komórek3,4,19,20. Niemniej jednak, interakcje 3D są dynamiczne w czasie i przestrzeni, bardzo zmienne między poszczególnymi komórkami składającymi się z interakcji multipleksowych i są bardzo heterogeniczne21,22.
3D wielokolorowa fluorescencyjna fluorescencyjna DNA hybrydyzacja in situ (FISH) to technika, która pozwala na wizualizację specyficznych loci genomowych na poziomie pojedynczej komórki, umożliwiając bezpośrednie badanie architektury jądrowej 3D w sposób komplementarny do technologii C. Jest to technologia stosowana obecnie do jednoznacznej walidacji wyników C-scores. Wielokolorowe DNA 3D FISH wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie sondy uzupełniające genomowe loci będące przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie różnych fluoroforów i odpowiedniego sprzętu mikroskopowego pozwala na współczesną wizualizację wielu celów w przestrzeni jądrowej23,24. W ostatnich latach FISH został połączony z postępem technologicznym w mikroskopii w celu uzyskania wizualizacji struktur o drobnej skali w wysokiej rozdzielczości25,26 lub z podejściami CRISPR-Cas do wizualizacji kwasów nukleinowych w obrazowaniu na żywo27,28. Pomimo szerokiego zastosowania, podejście 3D multicolor DNA FISH jest nadal uważane za trudne w wielu laboratoriach, ponieważ używany materiał biologiczny musi zostać dostosowany.
Tutaj oferujemy kompleksowy protokół dla 3D wielokolorowego DNA FISH (od przygotowania komórki/sondy do analizy danych) mający zastosowanie do szerokiego zakresu ludzkich komórek pierwotnych, umożliwiając wizualizację wielu loci genomowych i zachowanie struktury 3D jąder. Aby badać architekturę jądrową, musi zostać zachowana trójwymiarowa struktura jąder. Z tego powodu, w przeciwieństwie do innych istniejących protokołów29,30,31, unikamy stosowania gradientu alkoholowego i przechowywania szkiełek nakrywkowych w alkoholu, które mogą wpływać na strukturę chromatyny32. Metoda jest zaadaptowana z zachowanych protokołów 3D DNA FISH 24,33 do zastosowania do szerokiej gamy ludzkich komórek pierwotnych, zarówno izolowanych ex vivo, jak i hodowanych in vitro. Istnieją parametry przenikania i deproteinizacji dla różnych morfologii jądra i cech cytologicznych (np. różne stopnie zagęszczenia jądra, obfitość cytoszkieletu)34. Parametry te są często ogólnie opisane w innych protokołach24,33, bez wyraźnego rozróżnienia procedury w różnych typach komórek. Ponadto opracowaliśmy specjalne narzędzie o nazwie NuCLεD (nuclear contacts locator in 3D)16, dostarczające zasad analizy danych, które poprawią bliskość 3D między różnymi loci i ich topologiczną dystrybucję jądrową w przestrzeni jądrowej w zautomatyzowany sposób.

<table><tbody><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Digoxigenina 488</td><td>DBA</td><td>DI7488</td><td></td></tr><tr><td>b-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna 11 d-UTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0081</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Coverlsips</td><td>Marienfeld</td><td>117500</td><td></td></tr><tr><td>CY3 d-UTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4,6-diamidyn-2-fenyloindol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Kwasy dezoksyrybonukleinowe jednoniciowe z jąder łososia</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu (proszek)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-203917A</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin 11 d-UTP</td><td>Roche</td><td>11093088910</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21969-035 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>polimerazy DNA I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18010-017</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (C-G-A-T)</td><td>Euroclone</td><td>BL0423A/C/G</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>FBS Hyclon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30109</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma</td><td>F8775-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024 100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15279-001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Human Sigma</td><td>I9278-5 mL</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>NaAc (octan sodu, pH 5,2, 3 M)</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pennycylina/Streptawidyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070-063 100 ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsyny</td><td>Biorad</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>PhasePrep Zestaw DNA BAC</td><td>Sigma</td><td>NA0100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Szybka ekstrakcja żelu i Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K220001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Szybki zestaw do miniprzygotowania plazmidu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K210010</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl RNAza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2288</td><td></td></tr><tr>Prowadnice <td>Bostik</td><td></td><td></td>z<td>gumowo-cementu</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-0114</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian Tri-Sodu</td><td>Sigma</td><td>1110379026</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250mL</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

wielokolorowe narzędzie 3d dna fish do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

Głównym pytaniem w biologii komórki jest organizacja genomu w przestrzeni jądrowej i jak architektura chromatyny może wpływać na procesy takie jak ekspresja genów, tożsamość komórki i różnicowanie. Wiele podejść opracowanych do badania architektury 3D genomu można podzielić na dwie uzupełniające się kategorie: technologie oparte na konformacji chromosomów (technologie C) i obrazowanie. Podczas gdy pierwsza z nich opiera się na uchwyceniu konformacji chromosomów i interakcji proksymalnego DNA w populacji stałych komórek, druga, oparta na fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (FISH) na jądrach zakonserwowanych w 3D, umożliwia współczesną wizualizację wielu loci na poziomie jednej komórki (wielokolorowej), badając ich interakcje i rozmieszczenie w jądrze (3D multicolor DNA FISH). Technika 3D wielokolorowego DNA FISH ma ograniczenie polegające na wizualizacji tylko kilku z góry określonych loci, co nie pozwala na kompleksową analizę architektury jądrowej. Jednak biorąc pod uwagę solidność wyników, wielokolorowe DNA 3D FISH w połączeniu z mikroskopią 3D i rekonstrukcją obrazu jest możliwą metodą walidacji wyników opartych na technologii C oraz jednoznacznego badania położenia i organizacji określonych loci na poziomie pojedynczej komórki. Tutaj proponujemy krok po kroku metodę 3D wielokolorowego DNA FISH, odpowiednią dla szerokiej gamy ludzkich komórek pierwotnych i omawiamy wszystkie praktyczne działania, kluczowe kroki, pojęcia obrazowania 3D i analizę danych potrzebnych do uzyskania udanego i pouczającego wielokolorowego DNA 3D FISH w różnych kontekstach biologicznych.

Opisana w niniejszym artykule metoda wielokolorowej hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) DNA w 3D umożliwia jednoczesną wizualizację różnych loci genomowych w utrwalonych jądrach komórkowych w 3D (Rysunek 1B). Protokół ten pozwala na pomiar odległości między allelami oraz różnymi loci genomowymi w celu oceny ich bliskości przestrzennej, a także określenia ich położenia w obrębie jądra (np. odległości loci od centroidu lub peryferii jąder)16. I...

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

Wielobarwne DNA 3D FISH umożliwia wizualizację wielu loci genomowych w zachowanych jądrach w celu niejednoznacznego zdefiniowania ich wzajemnej interakcji i lokalizacji w pojedynczej komórce, level. 3D wielobarwne DNA FISH umożliwia bezpośrednie badanie architektury jądrowej. Ogólnie rzecz biorąc, działa w połączeniu z technologiami opartymi na wychwytywaniu chromosomów, dzięki czemu technika ta jest dostępnym narzędziem do walidacji danych C w pojedynczych komórkach.Procedurę zademonstruje Federica Marasca. Jest adiunktem w moim laboratorium. Rozpocznij od inkubacji mieszanki translacji nacięć w mieszalniku termicznym w temperaturze 16 stopni Celsjusza, zgodnie z długością wyjściowego materiału DNA.Pod koniec inkubacji sprawdź rozmiar sond na 2,2% żelu agarozowym. Dla każdego eksperymentu DNA FISH wytrącić odpowiednią ilość sondy zgodnie z wyjściowym materiałem DNA, z którego wyprodukowano sondy, w 150 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody, 20 mikrogramach nieznakowanego DNA plemników łososia, 3,5 mikrograma specyficznego dla gatunku DNA Cot-1, trzech objętościach 100% etanolu i 1/10 objętości trzymolowego octanu sodu przez jedną godzinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad dwa razy 500 mikrolitrami 70% etanolu. Po drugim praniu ponownie zanurz granulkę w dwóch mikrolitrach 100% formamidu i potrząsaj sondą przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza przed dodaniem równej objętości 4X soli fizjologicznej cytrynianu sodu w 20% siarczanie dekstranu. W celu utrwalenia wstępnego traktowania i przepuszczalności małych komórek z małymi jądrami i małą ilością cytoplazmy, najpierw dodaj dwa razy 10 do szóstych komórek w 200 mikrolitrach PBS bezpośrednio na szklanych szkiełkach nakrywkowych w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki i pozwól komórkom osiąść przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji szybko zastąp PBS 300 mikrolitrami świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu uzupełnionego 0,1%Tween 20. Po 10 minutach umyj stałe komórki trzy razy w 300 mikrolitrach 0,05% TPBS przez pięć minut na pranie w temperaturze pokojowej. Po ostatnim praniu przepuszczaj limfocyty T za pomocą 300 mikrolitrów 0,5% TPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie potraktuj komórki 250 mikrolitrami na studzienkę koktajlu RNAzy rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PBS przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przepłukać komórki w 300 mikrolitrach PBS i dodać 300 mikrolitrów 20% glicerolu w PBS do każdego dołka z nocną inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść szklankę na suchym lodzie na 15 do 30 sekund, aby zamrozić komórki, a następnie stopniowo rozmrażaj próbki w temperaturze pokojowej i zanurzaj je w 300 mikrolitrach 20% glicerolu w PBS przez 30 sekund. Po trzykrotnym zamrożeniu/rozmrożeniu komórek, jak właśnie pokazano, umyj próbki w 300 mikrolitrach 0,5% TPBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przemyj w 300 mikrolitrach 0,05% TPBS przez pięć minut na pranie w temperaturze pokojowej.Po ostatnim myciu potraktuj komórki 300 mikrolitrami 0,1 normalnego kwasu solnego przez 12 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przepłucz w 300 mikrolitrach soli fizjologicznej cytrynianu sodu. Następnie utrwal próbki przez noc w 300 mikrolitrach 50% formamidu w 2X soli cytrynianowej sodu w temperaturze pokojowej. W celu utrwalenia, obróbki wstępnej i przepuszczalności dużych komórek z dużą ilością cytoplazmy, należy utrwalić, wstępnie potraktować i przepuszczalnie komórki podobnie jak w przypadku ludzkich pierwotnych limfocytów T i potraktować próbki 300 mikrolitrami 0,0025% pepsyny w 0,01 normalnym kwasie solnym przez kilka sekund do pięciu minut.Obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym i zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch pięciominutowych płukań w 300 mikrolitrach 50-milimolowego chlorku magnezu, gdy tylko jądra są wolne od cytoplazmy, ale jąderka są nadal widoczne i nienaruszone. W przypadku wielokolorowego DNA 3D FISH denaturuj sondy hybrydyzacyjne w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut i natychmiast umieść sondy na lodzie. Załaduj sondy na czyste szkiełko mikroskopowe i umieść jedno szkiełko nakrywkowe komórek na każdej kropli sondy.Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem gumowym. Po całkowitym wyschnięciu cementu należy poddać próbki denaturacji na bloku grzewczym o temperaturze 75 stopni Celsjusza. Po czterech minutach uwodnić próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w metalowym pudełku unoszącym się w łaźni wodnej.Następnego ranka zdejmij cement kauczukowy i z szkiełkami zanurzonymi w 2X soli fizjologicznej cytrynianu sodu ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe. Umieść każde szkiełko nakrywkowe w osobnych dołkach sześciodołkowej płytki zawierającej dwa mililitry świeżego cytrynianu sodu na studzienkę na dwa pięciominutowe płukania w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 90 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji krótko spłucz szkiełka nakrywkowe w dwóch mililitrach 0,2% Tween 20 w 4X soli fizjologicznej cytrynianu sodu.W celu detekcji 3D wielokolorowego DNA FISH, przenieś szkiełka nakrywkowe do indywidualnych dołków nowej 24-dołkowej płytki i zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania w 300 mikrolitrach buforu blokującego na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 20 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji próbki należy poddać działaniu antydigoksygeniny i/lub streptawidyny o odpowiednim stężeniu rozcieńczonych w buforze blokującym przez 35 minut w ciemnej i mokrej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przenieść próbki do indywidualnych dołków na płytce sześciodołkowej i przemyć próbki trzykrotnie w dwóch mililitrach 0,2% Tween 20 i 4X soli cytrynianu sodu przez pięć minut na płukanie z wytrząsaniem przy 90 obrotach na minutę.Po ostatnim przemyciu należy zrównoważyć próbki w dwóch mililitrach PBS przed przeniesieniem szkiełek nakrywkowych na nową 24-dołkową płytkę w celu utrwalenia po utrwaleniu w 300 mikrolitrach 2% formaldehydu w PBS na studzienkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Umyj utrwalone komórki krótko pięć razy w 300 mikrolitrach PBS, a następnie zabarwić DAPI rozcieńczonym w ilości jednego nanograma na mililitr w 300 mikrolitrach PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe jeszcze pięć razy w PBS i umieść próbki w odpowiednim podłożu mocującym.Następnie pozyskaj obrazy 3D za pomocą mikroskopu system. 3D wielobarwne DNA FISH pozwala na współczesną wizualizację różnych loci genomowych w zachowanych jądrach 3D. W przypadku przygotowania sondy DNA, rozmiar sondy mniejszy niż 200 par zasad zapewnia udaną procedurę 3D wielokolorowego DNA FISH.Suboptymalne sondy DNA FISH wytwarzane w wyniku translacji nacięć mogą być częściowo lub nadmiernie trawione. Nadmiernie strawione sondy spowodują niespecyficzny sygnał z powodu utraty specyficzności w hybrydyzacji i wynikającego z tego wzrostu tła. W przypadku ludzkich pierwotnych limfocytów T i małych komórek z małymi jądrami i małą ilością cytoplazmy zaleca się 12-minutową obróbkę kwasem solnym 0,1 w celu ułatwienia dostępu jąder do sond DNA i zachowania integralności jądrowej.Cytoplazmatyczne trawienie pepsyną nie jest potrzebne do uzyskania dobrego sygnału DNA FISH w małych komórkach. Jednak w przypadku ludzkich pierwotnych mioblastów i komórek, które mają duże jądra i obfitą cytoplazmę, etap pepsynizacji ma fundamentalne znaczenie. Krótka i nieoptymalna pepsyna cytoszkieletu utrudni wejście sondy do jąder, kończąc się brakiem sygnału DNA FISH.Jeśli jednak komórki są nadmiernie pepsynizowane, jądra nie pozostaną nienaruszone, tracąc swoją strukturę 3D. Udany wielokolorowy DNA FISH w 3D spowoduje obecność sygnału w jądrach. Sugeruję pracę ze świeżym materiałem biologicznym, testowanie sond przed wykonaniem wielokolorowego DNA FISH 3D, przygotowanie świeżych roztworów i precyzję w zakresie czasów inkubacji i temperatur.Należy pamiętać, że formamid i HCL są substancjami niebezpiecznymi i zawsze powinny być stosowane w dygestoriach chemicznych z odpowiednimi materiałami jednorazowego użytku.

3d-multicolor-dna-fish-tool-to-study-nuclear-architecture-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Izolacja i charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi pacjentów z rakiem jest rodzajem nieinwazyjnej płynnej biopsji i wiąże się z nawrotem choroby i progresją choroby. Ten film opisuje technikę fluorescencji-hybrydyzacji DNA in situ (DNA FISH) na CTC uchwyconych na przewodzie medycznym w celu zbadania konkretnego genu będącego przedmiotem zainteresowania.

3D DNA RYBY: technika lokalizacji określonego genu na chromosomie

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego wykrywania modyfikacji histonów przez immunofluorescencję i sekwencje DNA przez DNA FISH, a następnie mikroskopię 3D i analizy (3D immuno-DNA FISH).

Połączona immunofluorescencja i DNA FISH na zakonserwowanych w 3D jądrach interfazowych w celu zbadania zmian w organizacji jądrowej 3D

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Ta metoda opisuje protokół immunofluorescencji i proces kwantyfikacji do oceny dystrybucji białek z różnymi wzorcami organizacji jądra w ludzkich limfocytach T. Protokół ten zapewnia wskazówki krok po kroku, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na wykonaniu półautomatycznej analizy na Fidżi, a kończąc na obsłudze danych przez notebook Google Colab.

Wszechstronne narzędzie do analizy dynamicznych zmian w ciałach jądrowych w różnych typach komórek

Poznaj technikę 3D multicolor DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych. Ta metoda umożliwia wizualizację wielu loci genomowych na poziomie pojedynczych komórek.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów