Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Wielobarwne DNA 3D FISH umożliwia wizualizację wielu loci genomowych w zachowanych jądrach w celu niejednoznacznego zdefiniowania ich wzajemnej interakcji i lokalizacji w pojedynczej komórce, level. 3D wielobarwne DNA FISH umożliwia bezpośrednie badanie architektury jądrowej. Ogólnie rzecz biorąc, działa w połączeniu z technologiami opartymi na wychwytywaniu chromosomów, dzięki czemu technika ta jest dostępnym narzędziem do walidacji danych C w pojedynczych komórkach.

Procedurę zademonstruje Federica Marasca. Jest adiunktem w moim laboratorium. Rozpocznij od inkubacji mieszanki translacji nacięć w mieszalniku termicznym w temperaturze 16 stopni Celsjusza, zgodnie z długością wyjściowego materiału DNA.

Pod koniec inkubacji sprawdź rozmiar sond na 2,2% żelu agarozowym. Dla każdego eksperymentu DNA FISH wytrącić odpowiednią ilość sondy zgodnie z wyjściowym materiałem DNA, z którego wyprodukowano sondy, w 150 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody, 20 mikrogramach nieznakowanego DNA plemników łososia, 3,5 mikrograma specyficznego dla gatunku DNA Cot-1, trzech objętościach 100% etanolu i 1/10 objętości trzymolowego octanu sodu przez jedną godzinę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad dwa razy 500 mikrolitrami 70% etanolu. Po drugim praniu ponownie zanurz granulkę w dwóch mikrolitrach 100% formamidu i potrząsaj sondą przez 30 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza przed dodaniem równej objętości 4X soli fizjologicznej cytrynianu sodu w 20% siarczanie dekstranu. W celu utrwalenia wstępnego traktowania i przepuszczalności małych komórek z małymi jądrami i małą ilością cytoplazmy, najpierw dodaj dwa razy 10 do szóstych komórek w 200 mikrolitrach PBS bezpośrednio na szklanych szkiełkach nakrywkowych w indywidualnych dołkach 24-dołkowej płytki i pozwól komórkom osiąść przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji szybko zastąp PBS 300 mikrolitrami świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu uzupełnionego 0,1%Tween 20. Po 10 minutach umyj stałe komórki trzy razy w 300 mikrolitrach 0,05% TPBS przez pięć minut na pranie w temperaturze pokojowej. Po ostatnim praniu przepuszczaj limfocyty T za pomocą 300 mikrolitrów 0,5% TPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie potraktuj komórki 250 mikrolitrami na studzienkę koktajlu RNAzy rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PBS przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przepłukać komórki w 300 mikrolitrach PBS i dodać 300 mikrolitrów 20% glicerolu w PBS do każdego dołka z nocną inkubacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umieść szklankę na suchym lodzie na 15 do 30 sekund, aby zamrozić komórki, a następnie stopniowo rozmrażaj próbki w temperaturze pokojowej i zanurzaj je w 300 mikrolitrach 20% glicerolu w PBS przez 30 sekund. Po trzykrotnym zamrożeniu/rozmrożeniu komórek, jak właśnie pokazano, umyj próbki w 300 mikrolitrach 0,5% TPBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przemyj w 300 mikrolitrach 0,05% TPBS przez pięć minut na pranie w temperaturze pokojowej.

Po ostatnim myciu potraktuj komórki 300 mikrolitrami 0,1 normalnego kwasu solnego przez 12 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwukrotnie przepłucz w 300 mikrolitrach soli fizjologicznej cytrynianu sodu. Następnie utrwal próbki przez noc w 300 mikrolitrach 50% formamidu w 2X soli cytrynianowej sodu w temperaturze pokojowej. W celu utrwalenia, obróbki wstępnej i przepuszczalności dużych komórek z dużą ilością cytoplazmy, należy utrwalić, wstępnie potraktować i przepuszczalnie komórki podobnie jak w przypadku ludzkich pierwotnych limfocytów T i potraktować próbki 300 mikrolitrami 0,0025% pepsyny w 0,01 normalnym kwasie solnym przez kilka sekund do pięciu minut.

Obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym i zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch pięciominutowych płukań w 300 mikrolitrach 50-milimolowego chlorku magnezu, gdy tylko jądra są wolne od cytoplazmy, ale jąderka są nadal widoczne i nienaruszone. W przypadku wielokolorowego DNA 3D FISH denaturuj sondy hybrydyzacyjne w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez pięć minut i natychmiast umieść sondy na lodzie. Załaduj sondy na czyste szkiełko mikroskopowe i umieść jedno szkiełko nakrywkowe komórek na każdej kropli sondy.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem gumowym. Po całkowitym wyschnięciu cementu należy poddać próbki denaturacji na bloku grzewczym o temperaturze 75 stopni Celsjusza. Po czterech minutach uwodnić próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w metalowym pudełku unoszącym się w łaźni wodnej.

Następnego ranka zdejmij cement kauczukowy i z szkiełkami zanurzonymi w 2X soli fizjologicznej cytrynianu sodu ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe. Umieść każde szkiełko nakrywkowe w osobnych dołkach sześciodołkowej płytki zawierającej dwa mililitry świeżego cytrynianu sodu na studzienkę na dwa pięciominutowe płukania w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 90 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji krótko spłucz szkiełka nakrywkowe w dwóch mililitrach 0,2% Tween 20 w 4X soli fizjologicznej cytrynianu sodu.

W celu detekcji 3D wielokolorowego DNA FISH, przenieś szkiełka nakrywkowe do indywidualnych dołków nowej 24-dołkowej płytki i zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania w 300 mikrolitrach buforu blokującego na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 20 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji próbki należy poddać działaniu antydigoksygeniny i/lub streptawidyny o odpowiednim stężeniu rozcieńczonych w buforze blokującym przez 35 minut w ciemnej i mokrej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przenieść próbki do indywidualnych dołków na płytce sześciodołkowej i przemyć próbki trzykrotnie w dwóch mililitrach 0,2% Tween 20 i 4X soli cytrynianu sodu przez pięć minut na płukanie z wytrząsaniem przy 90 obrotach na minutę.

Po ostatnim przemyciu należy zrównoważyć próbki w dwóch mililitrach PBS przed przeniesieniem szkiełek nakrywkowych na nową 24-dołkową płytkę w celu utrwalenia po utrwaleniu w 300 mikrolitrach 2% formaldehydu w PBS na studzienkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Umyj utrwalone komórki krótko pięć razy w 300 mikrolitrach PBS, a następnie zabarwić DAPI rozcieńczonym w ilości jednego nanograma na mililitr w 300 mikrolitrach PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe jeszcze pięć razy w PBS i umieść próbki w odpowiednim podłożu mocującym.

Następnie pozyskaj obrazy 3D za pomocą mikroskopu system. 3D wielobarwne DNA FISH pozwala na współczesną wizualizację różnych loci genomowych w zachowanych jądrach 3D. W przypadku przygotowania sondy DNA, rozmiar sondy mniejszy niż 200 par zasad zapewnia udaną procedurę 3D wielokolorowego DNA FISH.

Suboptymalne sondy DNA FISH wytwarzane w wyniku translacji nacięć mogą być częściowo lub nadmiernie trawione. Nadmiernie strawione sondy spowodują niespecyficzny sygnał z powodu utraty specyficzności w hybrydyzacji i wynikającego z tego wzrostu tła. W przypadku ludzkich pierwotnych limfocytów T i małych komórek z małymi jądrami i małą ilością cytoplazmy zaleca się 12-minutową obróbkę kwasem solnym 0,1 w celu ułatwienia dostępu jąder do sond DNA i zachowania integralności jądrowej.

Cytoplazmatyczne trawienie pepsyną nie jest potrzebne do uzyskania dobrego sygnału DNA FISH w małych komórkach. Jednak w przypadku ludzkich pierwotnych mioblastów i komórek, które mają duże jądra i obfitą cytoplazmę, etap pepsynizacji ma fundamentalne znaczenie. Krótka i nieoptymalna pepsyna cytoszkieletu utrudni wejście sondy do jąder, kończąc się brakiem sygnału DNA FISH.

Jeśli jednak komórki są nadmiernie pepsynizowane, jądra nie pozostaną nienaruszone, tracąc swoją strukturę 3D. Udany wielokolorowy DNA FISH w 3D spowoduje obecność sygnału w jądrach. Sugeruję pracę ze świeżym materiałem biologicznym, testowanie sond przed wykonaniem wielokolorowego DNA FISH 3D, przygotowanie świeżych roztworów i precyzję w zakresie czasów inkubacji i temperatur.

Należy pamiętać, że formamid i HCL są substancjami niebezpiecznymi i zawsze powinny być stosowane w dygestoriach chemicznych z odpowiednimi materiałami jednorazowego użytku.