Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Wyświetlanie fagów nie tylko pomaga nam badać charakterystykę wiązania klinicznie ważnych enzymów, ale także opracowywać modulatory dla tych enzymów i odpowiadających im chorób. Wyświetlanie fagów może być wykorzystywane do opracowywania nowych spoiw dla szerokiej gamy białek docelowych, a także jest łatwiejsze do wykonania niż inne konwencjonalne metody wyświetlania. Ta procedura wiązała się z wieloma powtarzającymi się czynnościami, więc kluczem jest to, aby nie używać autopilota i pozostać skoncentrowanym przez cały czas.

Zacznij od zaszczepienia 30 mililitrów bulionu tetracyklinowego 2YT 200 mikrolitrami kultury nasiennej. Inkubuj go przez około trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min, aż bakterie znajdą się w fazie środkowej. Wylej roztwór powlekający z talerza do zlewu.

Osusz go delikatnie ręcznikami papierowymi. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu PB do każdej powlekanej studzienki. Wylej bufor PB z talerza i osusz go na ręcznikach papierowych.

Dodaj kolejne 200 mikrolitrów buforu PB do każdego powlekanego dołka płytki. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min. Rozmrozić bibliotekę fagów na lodzie, a następnie rozcieńczyć ją do 100-krotności różnorodności biblioteki w PBS.

Dodać roztwór chlorku sodu glikolu polietylenowego w jednej piątej rozcieńczonej objętości biblioteki i inkubować roztwór na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować roztwór w temperaturze 11 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i odwirować go przez kolejne dwie minuty, aby ściągnąć pozostały supernatant i skoncentrować osad faga.

Delikatnie zawiesić osad faga w jednym mililitrze buforu PBT na białko docelowe, które ma być analizowane, zwykle w sumie cztery. Dodać 100 mikrolitrów biblioteki fagów do każdej powlekanej studzienki na płytce kontrolnej. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.

Wyrzuć bufor PB z płytki docelowej do zlewu i osusz talerz na ręcznikach papierowych. Przenieść wszystkie 100 mikrolitrów biblioteki fagów z płytki kontrolnej do każdego powlekanego dołka płytki docelowej. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.

Następnie wyjmij bibliotekę fagów z płytki i przemyj powlekane studzienki czterokrotnie buforem PT. Odwróć talerz i postukaj w ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie krople buforu. Dodaj 100 mikrolitrów 0,1-molowego kwasu solnego do każdej pokrytej studzienki, aby wymyć.

Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 300 obr./min. Następnie zneutralizuj pH, dodając 12,5 mikrolitra pH 11 jednego molowego chlorowodorku tris do każdej powlekanej studzienki. Przenieś wymyty ze wszystkich ośmiu studzienek do jednej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Pipetować w górę i w dół podczas przenoszenia, aby roztwory były jednorodne i odessać cały płyn z dołków. Dodaj 10% BSA do eluowanego faga, aby uzyskać końcowe stężenie 1% Przechowuj probówkę mikrowirówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. To jest okrągłe pierwsze wyjście.

Przygotuj kulturę nasion do hodowli faga wejściowego do następnej rundy selekcji, zaszczepiając pięć mililitrów kultury nasion tetracykliny 2YT izolowaną kolonią E. coli z płytki agarowej. Inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Rozcieńczyć białko docelowe w drugiej i trzeciej probówce odpowiednią ilością PBS.

Weź połowę zawartości drugiej i trzeciej rundy probówki i pokryj cztery dołki na docelowe białko w 96-dołkowej płytce wiążącej na następną rundę. Następnie użyj połowy okrągłego jednego wyjścia, aby zaszczepić trzy mililitry komórek w środkowej fazie logarytmicznej. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.

Dodaj faga pomocniczego M13KO7 do końcowego stężenia 10 miliardów PFU na mililitr. Inkubuj go ponownie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Po godzinie przenieś całe trzy mililitry kultury do 30 mililitrów roztworu kanamycyny karbenicyliny 2YT.

Rośnie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Reprezentatywne wyniki dla selekcji wariantu ubikwityny przeciwko UBE4B przedstawiono tutaj. UBV zostały uporządkowane od najwyższej do najniższej częstotliwości.

Sekwencje reprezentują zróżnicowany region ubikwityny w UBV ze wszystkimi randomizowanymi resztami. Względne powinowactwo wiązania spoiw do białka docelowego typu dzikiego, zmutowanego białka docelowego, a także białek poza celem mierzy się za pomocą testów immunoenzymatycznych lub ELISA. Wszystkie absorbancje ELISA zostały znormalizowane w stosunku do 96 uśrednionych wyników ELISA BSA i 96 uśrednionych wyników ELISA GST.

Ciemniejsza zieleń oznacza silniejsze wiązanie względne. GST został włączony jako kontrola niespecyficznego wiązania, ponieważ białko docelowe jest oznaczone GST. Wyniki testu ELISA przedstawiono graficznie tutaj.

Oś x reprezentuje UBV, a oś y reprezentuje odpowiednią znormalizowaną absorbancję. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie wyrzucać roztworu z płytki po dodaniu kwasu solnego. Fagi są teraz zawieszone w roztworze i chcesz je zachować, aby można było wykonać kolejne analizy końcowe wzbogacania lub jedno i drugie.

Zgodnie z tą procedurą należy wykonać sekwencjonowanie w celu określenia częstości UBV. Testy ELISA i IC50 można wykonać w celu określenia odpowiednio skuteczności wiązania i skuteczności hamowania, a także w celu określenia, które UBV należy dalej scharakteryzować.