Name: Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj metodę wyświetlania fagowego do izolowania nowych wariantów ubikwityny modulujących ligazy E3. Technika ta umożliwia badanie interakcji białkowych i odkrywanie potencjalnych celów terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Technologia wariantu ubikwityny została opracowana w laboratorium Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto). WZ jest obecnie stypendystą CIFAR Azrieli Global Scholar w programie Humans & The Microbiome Program. Badania te zostały sfinansowane z grantów NSERC Discovery Grants przyznanych WZ (RGPIN-2019-05721).

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>PBS (bufor fosforanowy): zmieszać 50 mL 10x roztworu PBS z 450 mL wody ultrapure H2O. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).</li>
	<li>10% BSA (albumina surowicy wołowej): powoli dodać 1 g BSA do 7 mL wody ultrapure H2O i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 10 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>bufor PB (PBS uzupełniony o 1% BSA): powoli dodać 5 g BSA do 400 mL wody ultrapure H2O oraz 50 mL PBS i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>bufor PBT (PBS uzupełniony o 1% BSA i 0,05% Tween 20): powoli dodać 5 g BSA do 400 mL wody ultrapure H2O oraz 50 mL PBS i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dodać 250 µL Tween 20. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>bufor PT (PBS uzupełniony o 0,05% Tween 20): zmieszać 1 mL Tween 20 z 400 mL PBS. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 2 L. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).</li>
	<li>pożywka 2YT: dodać 16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl do 800 mL wody ultrapure H2O i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 1 L. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).</li>
	<li>płytki LB/carb: dodać 12,5 g gotowej mieszanki LB i 7,5 g agaru do 400 mL H2O. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL i sterylizować w autoklawie. Upewnić się, że agar jest całkowicie rozpuszczony, i odczekać, aż ostygnie poniżej 60 °C. Dodać 500 µL karbenicyliny o stężeniu 100 mg/mL, dobrze wymieszać i wylać na płytki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>płytki LB/tet: dodać 12,5 g gotowej mieszanki LB i 7,5 g agaru do 400 mL wody ultrapure H2O. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL i sterylizować w autoklawie. Upewnić się, że agar jest całkowicie rozpuszczony, i odczekać, aż ostygnie poniżej 60 °C. Dodać 500 µL tetracykliny o stężeniu 10 mg/mL, dobrze wymieszać i wylać na płytki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>20% PEG (glikol polietylenowy)/2,5 M NaCl: dodać 50 g PEG-8000 i 36,5 g NaCl do 200 mL wody ultrapure H2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. 
	UWAGA: Może to zająć trochę czasu; podgrzewanie może pomóc. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 250 mL. Sterylizować poprzez filtrację lub w autoklawie.</li>
	<li>0,1 M HCl: zmieszać 20 mL 1 M HCl z 180 mL wody ultrapure H2O. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).</li>
	<li>1 M Tris (pH 11,0): dodać 6,1 g bazy Tris do 40 mL wody ultrapure H2O. Dostosować pH do 11,0 za pomocą HCl i mieszać do całkowitego rozpuszczenia Tris. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 50 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).</li>
	<li>100 mg/mL (1000x) karbenicylina: dodać 2 g soli disodowej karbenicyliny do 20 mL wody ultrapure H2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>50 mg/mL (1000x) kanamycyna: dodać 1 g siarczanu kanamycyny do 20 mL wody ultrapure H2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>10 mg/mL (1000x) tetracyklina: dodać 0,2 g chlorowodorku tetracykliny do 20 mL 70% etanolu. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie białka
<ol>
	<li>Wyznacz stężenie roztworu białka docelowego w µM. Najwygodniejszym sposobem oceny stężenia białka jest pomiar absorbancji roztworu białka przy 280 nm. Jeśli stężenie jest znane w mg/mL, przelicz je na µM, korzystając z masy cząsteczkowej białka docelowego. W zależności od badanego białka można zastosować różne metody; szczegóły znajdują się w sekcji Dyskusja. 
	UWAGA: Jeśli białko jest skrócone (konkretna domena/motyw białkowy) lub posiada znacznik, należy uwzględnić te zmiany w masie cząsteczkowej podczas przeliczania z mg/mL na µM.</li>
	<li>Przygotuj trzy probówki do mikrocentryfugi z etykietami „runda 1”, „runda 2/3” oraz „runda 4/5”.
	<ol>
		<li>Oblicz objętość białka niezbędną do jego rozcieńczenia do stężenia 1 µM w 800 µL PBS i odnieś tę objętość do probówek bez dodawania PBS. 
		​UWAGA: Jeśli dostępna ilość białka docelowego jest mała, stężenie można obniżyć nawet do 0,25 µM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie do pierwszej rundy selekcji
<ol>
	<li>Przygotuj kulturę startową do namnożenia fagów wykorzystanych w drugiej rundzie selekcji.
	<ol>
		<li>Zaszczep 5 mL pożywki 2YT/tet dobrze odizolowaną kolonią Escherichia coli i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj płytkę do pierwszej rundy selekcji.
	<ol>
		<li>Rozcieńcz białko docelowe w probówce „round 1” odpowiednią ilością PBS i nanieś aliquoty po 100 µL do ośmiu dołków 96-dołkowej płytki wiążącej (tj. płytki docelowej). 
		UWAGA: Wyświetlanie fagowe (phage display) można przeprowadzić dla czterech różnych białek jednocześnie na jednej płytce, pokrywając dołki w narożnikach płytki.</li>
		<li>Opcjonalna kontrola: Jeśli białko docelowe posiada znacznik, taki jak GST lub MBP (maltose binding protein), pokryj osiem dołków w drugiej 96-dołkowej płytce wiążącej 100 µL roztworu o stężeniu 1 µM zawierającego odpowiedni znacznik epitopowy. Służy to do usunięcia niepożądanych fagów, które wiążą się nieswoiście ze znacznikiem.</li>
		<li>Wstrząsaj płytkę(i) przez noc w temperaturze 4 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pierwsza runda selekcji
<ol>
	<li>Przygotowanie materiału wejściowego do drugiej rundy.
	<ol>
		<li>Zaszczep 30 mL pożywki 2YT/tet 200 µL kultury startowej z kroku 3.1.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze 37 °C przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm, aż bakterie osiągną średnią fazę logarytmiczną (OD600 <img alt="Symbol równowagi statycznej ΣF=0, schemat ilustrujący koncepcje i obliczenia bilansu sił." src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 0,6 - 0,8). Trwa to około trzech h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie płytki z celem.
	<ol>
		<li>Usuń roztwór powlekający z płytki (lub z obu płytek, jeśli przygotowano płytkę kontrolną), odwracając ją i wstrząsając nad zlewem. Osusz delikatnie ręcznikami papierowymi.</li>
		<li>Dodaj 300 µL buforu PB do każdego powleczonego dołka.</li>
		<li>Usuń bufor PB w sposób opisany w kroku 4.2.1 i dodaj kolejne 200 µL buforu PB.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 h przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie biblioteki fagów.
	<ol>
		<li>Rozmroź bibliotekę fagów na lodzie i rozcieńcz ją w PBS do stężenia 100-krotnie przekraczającego różnorodność biblioteki. Na przykład, jeśli różnorodność biblioteki wynosi 1 x 1010, a stężenie biblioteki 1 x 1013, rozcieńcz bibliotekę tak, aby stężenie wyniosło 1 x 1012. Dla bibliotek użytych w tym protokole rozcieńcz je 10-krotnie w PBS, łącząc 1 mL biblioteki z 9 mL PBS. 
		UWAGA: Różnorodność biblioteki powinna zostać określona podczas jej tworzenia i nie można jej łatwo ocenić w inny sposób. Stężenie biblioteki można wyznaczyć, zaszczepiając komórki E. coli w średniej fazie logarytmicznej (OD600 <img alt="Symbol równowagi statycznej ΣF=0, schemat ilustrujący koncepcje i obliczenia bilansu sił." src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 0,6 - 0,8) i wysiewając na LB/carb.</li>
		<li>Dodaj 1/5 objętości PEG/NaCl. Na przykład dla 10 mL wcześniej rozcieńczonej biblioteki dodaj 2 mL PEG/NaCl.</li>
		<li>Inkubuj na lodzie przez 30 min.</li>
		<li>Wirowarkuj przy 11 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C, odlej nadsącz i ponownie wiruj przez 2 min, aby osadzić pozostały nadsącz. 
		UWAGA: Umieść probówkę w rotorze w tej samej orientacji co za pierwszym razem, aby osad pozostał w tym samym miejscu, co ułatwi jego dostrzeżenie.</li>
		<li>Delikatnie resuspenduj osad fagowy w 1 mL PBT na jedno białko. Dla czterech białek resuspenduj osad w 4 mL PBT. 
		UWAGA: Staraj się nie dotykać osadu i nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspozycja fagów na białko(a) docelowe.
	<ol>
		<li>Opcjonalna kontrola: Dodaj 100 µL biblioteki fagów do każdego powleczonego dołka na płytce kontrolnej. Inkubuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 h przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm, a następnie przenieś bibliotekę z płytki kontrolnej na płytkę z celem. Pomiń krok 4.4.2.</li>
		<li>Usuń bufor PB z płytki z celem w sposób opisany w kroku 4.2.1 i dodaj 100 µL biblioteki fagów do każdego powleczonego dołka.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 h przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucja fagów z pierwszej rundy.
	<ol>
		<li>Usuń bibliotekę fagów i przemyj powleczone dołki czterokrotnie buforem PT. Odwróć płytkę i ostrożnie stuknij o ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie krople. 
		UWAGA: Jeśli na jednej płytce powlecono wiele białek docelowych, staraj się zminimalizować przepływ wszystkich kolejnych roztworów między dołkami.</li>
		<li>Dodaj 100 µL 0,1 M HCl do każdego powleczonego dołka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm.</li>
		<li>Zneutralizuj pH, dodając 12,5 µL 1 M Tris-HCl (pH 11) do każdego powleczonego dołka.</li>
		<li>Zbierz eluowane fagi ze wszystkich 8 dołków do jednej probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mL. Podczas przenoszenia pipetuj roztwór w górę i w dół, aby go ujednolicić i odessać cały płyn z dołków.</li>
		<li>Dodaj 10% BSA do zgromadzonych eluowanych fagów do stężenia końcowego 1%. Dla typowej objętości elucji z pierwszej rundy wynoszącej 950 µL dodaj 95 µL 10% BSA. Przechowuj w temperaturze 4 °C. Jest to materiał wyjściowy z pierwszej rundy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie do kolejnych rund selekcji
<ol>
	<li>Przygotować kulturę startową do namnażania fagów wejściowych do następnej rundy selekcji zgodnie z krokiem 3.1.</li>
	<li>Pokryć płytkę dla trzeciej rundy selekcji zgodnie z krokiem 3.2, uwzględniając poniższe zmiany.
	<ol>
		<li>Pokryć tylko cztery studzienki na białko w 96-dołkowej płytce wiążącej. Użyć połowy zawartości probówek „round 2/3” lub „round 4/5” dla odpowiedniej rundy. Rozcieńczyć zawartość tych probówek w razie potrzeby, aby zapobiec sedymentacji białek z roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować fagi wejściowe do następnej rundy selekcji.
	<ol>
		<li>Użyć połowy produktu z pierwszej rundy z kroku 4.5.5 do inokulacji 3 mL komórek w średniej fazie logarytmicznej z kroku 4.1. W przypadku typowego produktu z pierwszej rundy, inokulować 500 µL produktu.</li>
		<li>Inkubować w 37 °C przez 30 min przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.</li>
		<li>Dodać faga pomocniczego M13K07 do stężenia końcowego 1 x 1010 PFU/mL.</li>
		<li>Inkubować w 37 °C przez 1 h przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.</li>
		<li>Przenieść całe 3 mL kultury do 30 mL pożywki 2YT/carb/kan. Hodować przez noc w 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.</li>
		<li>Następnego dnia przenieść kulturę do 50 mL probówki wirówkowej i wirować przy 11,000 x g przez 10 min w 4 °C, aby wytrącić komórki.</li>
		<li>Zlać nadosad z probówki do nowej probówki wirówkowej 50 mL, zmieszać z 8 mL PEG/NaCl i inkubować na lodzie przez 10 min.</li>
		<li>Wirować przy 11,000 x g przez 10 min w 4 °C, odrzucić nadosad i ponownie wirować przez 2 min. 
		UWAGA: Podczas drugiego wirowania umieścić probówkę w rotorze w tej samej orientacji co za pierwszym razem, aby osad pozostał w tym samym miejscu, co ułatwi jego zauważenie.</li>
		<li>Resuspendować osad fagowy w 800 µL PBT tak, aby był całkowicie jednorodny i nie było widocznych grudek.</li>
		<li>Przenieść roztwór fagowy do probówki do mikrowirówki 1,5 mL i wirować przy 16,200 x g przez 4 min w 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń.</li>
		<li>Przenieść nadosad do nowej probówki do mikrowirówki. Stanowi on materiał wejściowy do następnej rundy selekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalnie: Wyznaczyć miano roztworów wejściowych i wyjściowych.
	<ol>
		<li>Użyć 500 µL kultury startowej E. coli do inokulacji 5 mL 2YT/tet i inkubować w 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm, aż bakterie osiągną średnią fazę logarytmiczną (OD600 <img alt="Symbol równowagi statycznej ΣF=0, diagram ilustrujący koncepcje i obliczenia bilansu sił." src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 0,6 - 0,8). Zajmuje to około 1 h.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwory fagów wejściowych/wyjściowych do 10-3  - 10-5 w PBS i dodać 10 µL każdego rozcieńczenia do 90 µL hodowli komórek. 
		UWAGA: Używać rozcieńczonych roztworów fagów natychmiast, ponieważ fagi z czasem adsorbują się do ścianek probówki, co może prowadzić do wyników fałszywie negatywnych w transformacjach.</li>
		<li>Inkubować w 37 °C przez 20 min przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.</li>
		<li>Wysiać 5 µL na oddzielne płytki LB/carb. 
		​UWAGA: Ilość wysiewana jest zmienna i zależy od poprzednich wyników lub preferencji operatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kolejne rundy selekcji
<ol>
	<li>Wszystkie kolejne rundy przeprowadzić wraz z przygotowaniami zgodnie z krokami 3 i 4 odpowiednio, z zastrzeżeniem różnic opisanych poniżej.
	<ol>
		<li>W miejsce biblioteki jako źródła fagów należy wykorzystać materiał wejściowy otrzymany w poprzedniej rundzie. 4 studzienki na każde białko docelowe pokryć 100 µL materiału wejściowego fagów pozyskanego z poprzedniej rundy. Pozostałe ilości materiału wejściowego fagów przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Krok płukania opisany w punkcie 4.5.1 należy czynić bardziej rygorystycznym w każdej kolejnej rundzie selekcji. Runda pierwsza wymaga 4 płukań, runda druga 6 płukań, runda trzecia 8 płukań, a rundy czwarta i piąta wymagają odpowiednio 10 płukań.</li>
		<li>Należy zmniejszyć niektóre objętości w porównaniu do tych stosowanych w rundzie pierwszej, ponieważ w kolejnych rundach pokrywa się tylko cztery studzienki zamiast ośmiu. Na przykład w kroku 4.5.5 do materiału wyjściowego fagów dodaje się tylko 45 µL 10% BSA, a w kroku 5.3.1 do inokulacji komórek wykorzystuje się tylko 250 µL materiału wyjściowego fagów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przetwarzanie po selekcji i izolacja fagów
<ol>
	<li>Wyznaczyć miano roztworów wejściowych i wyjściowych dla rundy czwartej i piątej.
	<ol>
		<li>Jeśli nie wykonano tego w kroku 5.4, przeprowadzić te same czynności w celu wyznaczenia miana fagów wyjściowych z rund czwartej i piątej, dążąc do uzyskania od 30 do 300 kolonii na kilku płytkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla i izolacja fagów.
	<ol>
		<li>Do każdej probówki w 96-probówkowym stojaku do kultur mini przenieść 450 µL pożywki 2YT/carb/M13K07.</li>
		<li>Wybrać dobrze odizolowane kolonie z dowolnych płytek z kroku 7.1, aby zaszczepić każdą probówkę. 
		UWAGA: Górną połowę stojaka wykorzystać dla wyników z rundy czwartej, a dolną dla wyników z rundy piątej.</li>
		<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.</li>
		<li>Wirować przy 1,200 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść jak największą ilość supernatantu do nowego 96-probówkowego stojaka do kultur mini, nie naruszając osadu komórkowego, a stary stojak zutylizować. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Z nowego stojaka przenieść 100 µL z każdej probówki na płytkę 96-dołkową typu non-binding, w której każdym dołku znajduje się 100 µL 50% glicerolu. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C jako zapasowy stok.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Karlsson, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+PDZbody%2C+a+bivalent+binder+of+the+E6+protein+from+human+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9382(2015).</li>
<li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+SH2+domains+with+tailored+specificities+and+enhanced+affinities+for+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis.</a> Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).</li>
<li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superbinder+SH2+domains+act+as+antagonists+of+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling.</a> Science Signaling. 5 (243), (2012).</li>
<li>Wiechmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+inhibition+of+the+small+ubiquitin-like+modifier+%28SUMO%29-conjugating+enzyme+Ubc9+selectively+impairs+SUMO+chain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).</li>
<li>Ernst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+modulation+of+enzymes+in+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system.</a> Science. 339 (6119), 590-595 (2013).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+selective+inhibition+of+pathogenic+viruses+by+engineered+ubiquitin+variants%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants.</a> PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372(2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+modulation+of+HECT+E3+ligases+with+selective+ubiquitin+variant+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes.</a> Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).</li>
<li>Gabrielsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+discovery+of+inhibitors+and+activators+of+RING+and+U-box+E3+ligases+with+ubiquitin+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants.</a> Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).</li>
<li>Brown, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RING+E3+architectures+regulate+multiubiquitination+and+ubiquitin+chain+elongation+by+APC%2FC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C.</a> Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).</li>
<li>Gorelik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SCF+ubiquitin+ligases+by+engineered+ubiquitin+variants+that+target+the+Cul1+binding+site+on+the+Skp1-F-box+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).</li>
<li>Goldring, J. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+methods+to+determine+protein+concentration+prior+to+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis.</a> Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).</li>
<li>Zhang, W., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+intracellular+modulators+of+E3+ligases+and+deubiquitinases+from+phage-displayed+ubiquitin+variant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ubiquitin+Proteasome+System%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries.</a> The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).</li>
<li>Sheehan, J., Marasco, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+and+yeast+display%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Phage and yeast display.</a> Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).</li>
<li>Lowman, H. B., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent+phage+display%3A+A+method+for+selecting+variant+proteins+from+random+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries.</a> Methods. 3 (3), 205-216 (1991).</li>
<li>Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+high-affinity+binding+proteins+by+monovalent+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display.</a> Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).</li>
<li>Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+helper+phage+for+improved+monovalent+display+of+Fab+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules.</a> Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).</li>
<li>Galán, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library-based+display+technologies%3A+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Library-based display technologies: where do we stand.</a> Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+display+and+selection+of+single-chain+variable+fragments+effectively+inhibit+growth+and+progression+of+microspheres+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo.</a> Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).</li>
<li>Yamaguchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+display%3A+a+novel+screening+method+for+functional+disulfide-rich+peptides+by+solid-phase+synthesis+and+stabilization+of+mRNA-protein+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.</a> Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).</li>
<li>Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+library+size+in+cDNA+display+by+optimizing+purification+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures.</a> Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).</li>
<li>Odegrip, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIS+display%3A+In+vitro+selection+of+peptides+from+libraries+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).</li>
<li>Reiersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+antibody+display--an+in+vitro+antibody-DNA+library+selection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system.</a> Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+anti-HER2+DARPins+by+SNAP+display+reveals+stability%2Ffunction+trade-offs+in+the+selection+process%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+validation+of+intracellular+ubiquitin+variant+inhibitors+for+USP7+and+USP10%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).</li>
<li>Teyra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characterization+of+ubiquitin+variant+inhibitors+of+USP15%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15.</a> Structure. 27 (4), 590-605 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Jak wspomniano w kroku 2.1 (przygotowanie białka), do oceny stężenia białka można zastosować różne metody, a każda z nich będzie miała unikalne zalety i wady w zależności od konkretnego białka docelowego użytego do wyświetlania fagów. Źródło szczegółowych opisów i protokołów dla popularnych metod zostało podane wcześniej11.
Użycie faga zatrzymanego przez poprzednią rundę wyświetlania fagów jako danych wejściowych dla kolejnej rundy wzbogaca dobre spoiwa poprzez stopniow...

Zrozumienie szczegółów molekularnych interakcji białko-białko jest kluczowe dla nakreślenia mechanizmów transdukcji sygnału procesów biologicznych, szczególnie tych, które przyczyniają się do klinicznie ważnych chorób. W ostatnich latach wyświetlanie fagów zostało wykorzystane jako praktyczna i dostępna metoda izolowania białek/peptydów o znacznie lepszym wiązaniu z pożądanym białkiem docelowym1,2,3,4, które z kolei mogą być używane jako wewnątrzkomórkowe sondy interakcji białko-białko.
Ubikwitynacja to kaskada aktywności enzymatycznych (enzym aktywujący E1 → enzym sprzężony z E2 → ligazy E3), które kowalencyjnie sprzęgają ubikwitynę (Ub) z substratami białkowymi, aby skierować je do degradacji lub pośredniczyć w zmianach sygnalizacji komórkowej. Ponadto deubikwitynazy katalizują usuwanie ubikwityny z białek. Dlatego w komórkach występują tysiące zależnych od Ub oddziaływań białko-białko, z których zdecydowana większość rozpoznaje wspólną powierzchnię o niskim powinowactwie, ale wysokiej specyficzności, aby umożliwić słabe interakcje przez duże i zróżnicowane powierzchnie.
Ernst et al. wprowadzili mutacje do znanych regionów wiążących Ub, aby sprawdzić, czy mogą zwiększyć powinowactwo wiązania do interesującego białka, zachowując jednocześnie wysoką selektywność5. Opracowano bibliotekę kombinatoryczną zawierającą ponad 10 miliardów (7,5 x 1010) wariantów Ub (UbV) z mutacjami w pozycjach na powierzchni Ub, które pośredniczą w znanych interakcjach Ub-białko. Biblioteka ta składała się z fagów, które wyrażają białko płaszcza bakteriofaga M13 pIII połączone ze zróżnicowanymi UbV. W związku z tym poszczególne UbV mogą być wyświetlane na powierzchni faga za pośrednictwem białka płaszcza po ekspresji. Podczas procesu selekcji fagi, które wykazują UbVs ze znacznymi interakcjami wiążącymi z białkiem docelowym, zostaną zachowane i wzbogacone w kolejnych rundach wyświetlania faga, podczas gdy fagi wykazujące UbV, które słabo wiążą się z białkiem docelowym, są wypłukiwane i usuwane z puli fagów. Zatrzymane cząstki fagów zawierają fagiamid odpowiadający wyświetlanemu przez nie UbV, co pozwala na ich sekwencjonowanie i dalsze charakteryzowanie po wyizolowaniu.
Korzystając z tej strategii inżynierii białkowej, opracowano inhibitory UbV dla ludzkich deubikwitynaz5 i proteaz wirusowych6. Co ważne, wygenerowaliśmy hamujące UbV dla ludzkich ligaz E3 z rodziny HECT poprzez przejęcie miejsca wiązania E2 i aktywację UbV, które zajmują egzozyt wiążący Ub w domenie HECT7. Możemy również hamować monomeryczne E3 z rodziny RING, celując w miejsce wiązania E2 i indukować dimeryzację UbV, aby aktywować homodimeryczne RING E3s8. W przypadku wielopodjednostkowych RING E3s, UbV mogą osiągnąć hamowanie poprzez celowanie w podjednostkę RING (np. dla APC/C complex9) lub zakłócanie tworzenia kompleksu (np. dla SCF E3s10). Reasumując, UbV można wykorzystać do systematycznego badania interakcji białko-białko w systemie Ub-proteasom (UPS), dzięki czemu możemy lepiej rozszyfrować mechanizmy biochemiczne enzymów UPS oraz zidentyfikować i zwalidować funkcjonalne miejsca interwencji terapeutycznej.
Poniższy protokół opisuje, jak wykorzystać wcześniej wygenerowaną bibliotekę UbV wyświetlaną przez fagi do celowania w interesujące białko i jak wzbogacić spoiwa UbV, które oddziałują z białkiem docelowym poprzez kolejne rundy wyświetlania faga.

<table><tbody><tr><td>Axygen Mini Tube System (0,65 mL, sterylny, 96/Rack, 10 Rack/opakowanie)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-198</td><td>Hodowla wyjść fagów po wyświetleniu faga.</td></tr><tr><td>BD Difco Odwodnione podłoża hodowlane: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td>Przygotowanie płytek do miareczkowania.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V</td><td>BioShop Canada</td><td>ALB001</td><td>Składnik buforowy.</td></tr><tr><td>Sól disodowa karbenicyliny 89,0-100,5% bezwodna</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1389-5G</td><td>Hodowla komórek zakażonych fagami.</td></tr><tr><td>Kompaktowa cyfrowa wytrząsarka do mikropłytek</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-337</td><td>Wytrząsanie płytek podczas inkubacji z biblioteką fagów.</td></tr><tr><td>Corning Microplate Aluminiowa taśma uszczelniająca</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-684</td><td>Uszczelnianie zapasów glicerolu fagowego.</td></tr><tr><td>Dehydratyzowany agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>Przygotowanie płytek do miareczkowania.</td></tr><tr><td>DS-11 Spektrofotometr/fluorometr</td><td>DeNovix</td><td>DS-11 FX+</td><td>Pomiar stężenia białka.</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One CellStar 96-Well, nieobrobiona, z dnem w kształcie litery U</td><td>Fisher Scientific 7000133</td><td></td><td>Przechowywanie zapasów glicerolu fagowego.</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Elucja fagów.</td></tr><tr><td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemicznie kompetentny E. coliFisher</td> <td>Scientific</td><td>C854003</td><td>Szczep bakteryjny do infekcji fagowej.</td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1792406</td><td>Hodowla komórek pomocniczych zakażonych fagami M13K07.</td></tr><tr><td>M13KO7 pomocniczy</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>&nbsp; N0315S</td><td>Zezwalaj na pakowanie i wydzielanie fagów.</td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Wytrząsarka orbitalna</td><td>laboratoryjna Fisher Scientific</td><td>11-676-076</td><td>Hodowla komórek bakteryjnych.</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96-dołkowa mikropłytka, płaskie dno</td><td>Life Technologies</td><td>44-2404-21</td><td>Białka unieruchamiające.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10X Roztwór</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Składnik buforowy/pożywka do reprodukcji fagów.</td></tr><tr><td>Folie poliestrowe do testu ELISA i inkubacji</td><td>VWR</td><td>60941-120</td><td>Pokrywanie mikropłytek podczas inkubacji.</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000 (PEG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td>Wytrącanie fagów.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td>Wytrącanie fagów.</td></tr><tr><td>Sterylne plastikowe probówki hodowlane: Półprzezroczysty polipropylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td>Wkłady do hodowli fagów.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>Hodowla komórek E. coli OmniMax.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td>Neutralizujący eluowany roztwór fagowy.</td></tr><tr><td>Trypton w proszku</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td>Składnik pożywki do wzrostu komórek.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Komponent Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td>Buffer.</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Składnik pożywki do wzrostu komórek.</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz e3

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Ubikwityna to małe białko o masie 8,6 kDa, które jest kluczowym składnikiem układu ubikwityna-proteasom. W związku z tym może wiązać się z różnorodnym układem białek o wysokiej specyficzności, ale niskim powinowactwie. Poprzez wyświetlanie fagów, warianty ubikwityny (UbV) mogą być modyfikowane w taki sposób, aby wykazywały lepsze powinowactwo do ubikwityny typu dzikiego i zachowywały specyficzność wiązania z białkami docelowymi. Wyświetlanie fagów wykorzystuje bibliotekę fagów, w której białko płaszcza pIII nitkowatego bakteriofaga M13 (wybrane, ponieważ jest wyświetlane zewnętrznie na powierzchni faga) jest łączone z UbV. Specyficzne reszty ludzkiej ubikwityny typu dzikiego są miękkie i randomizowane (tj. Istnieje tendencja do natywnej sekwencji typu dzikiego) w celu wytworzenia UbV, dzięki czemu unika się szkodliwych zmian w konformacji białka, wprowadzając jednocześnie różnorodność niezbędną do promowania nowych interakcji z białkiem docelowym. Podczas procesu wyświetlania fagów te UbV są eksprymowane i wyświetlane na białkach płaszcza fagowego i analizowane w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania. UbV, które wykazują korzystne interakcje wiążące z białkiem docelowym, są zatrzymywane, podczas gdy słabe spoiwa są wypłukiwane i usuwane z puli bibliotecznej. Zatrzymane UbV, które są przyłączone do cząstki faga zawierającej odpowiadający jej fagimid, są eluowane, amplifikowane i zagęszczane, aby można je było przetasować z tym samym białkiem docelowym w kolejnej rundzie wyświetlania faga. Zazwyczaj wykonuje się do pięciu rund pokazu fagów, podczas których wywierana jest silna presja selekcyjna na UbV, które wiążą się słabo i/lub rozwiązle, tak że te o wyższym powinowactwie są skoncentrowane i wzbogacone. Ostatecznie UbV, które wykazują wyższą specyficzność i/lub powinowactwo do białka docelowego niż ich odpowiedniki typu dzikiego, są izolowane i mogą być charakteryzowane poprzez dalsze eksperymenty.

Wiążące białka otrzymane metodą phage display można weryfikować i analizować na wiele sposobów. Zaleca się rozpoczęcie od sekwencjonowania fagów z użyciem starterów flankujących zróżnicowaną wstawkę w bibliotece fagemidowej. Idealny eksperyment phage display wykaże wyraźną preferencję w kierunku kilku sekwencji (Rycina 1). Obecne będą również inne sekwencje, ale w mniejszej liczbie, występując raczej jako szum tła. W przedstawionym przykładzie, w którym phage display przeprowadzono pomiędzy ...

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Wyświetlanie fagów nie tylko pomaga nam badać charakterystykę wiązania klinicznie ważnych enzymów, ale także opracowywać modulatory dla tych enzymów i odpowiadających im chorób. Wyświetlanie fagów może być wykorzystywane do opracowywania nowych spoiw dla szerokiej gamy białek docelowych, a także jest łatwiejsze do wykonania niż inne konwencjonalne metody wyświetlania. Ta procedura wiązała się z wieloma powtarzającymi się czynnościami, więc kluczem jest to, aby nie używać autopilota i pozostać skoncentrowanym przez cały czas.Zacznij od zaszczepienia 30 mililitrów bulionu tetracyklinowego 2YT 200 mikrolitrami kultury nasiennej. Inkubuj go przez około trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min, aż bakterie znajdą się w fazie środkowej. Wylej roztwór powlekający z talerza do zlewu.Osusz go delikatnie ręcznikami papierowymi. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu PB do każdej powlekanej studzienki. Wylej bufor PB z talerza i osusz go na ręcznikach papierowych.Dodaj kolejne 200 mikrolitrów buforu PB do każdego powlekanego dołka płytki. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min. Rozmrozić bibliotekę fagów na lodzie, a następnie rozcieńczyć ją do 100-krotności różnorodności biblioteki w PBS.Dodać roztwór chlorku sodu glikolu polietylenowego w jednej piątej rozcieńczonej objętości biblioteki i inkubować roztwór na lodzie przez 30 minut. Następnie odwirować roztwór w temperaturze 11 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i odwirować go przez kolejne dwie minuty, aby ściągnąć pozostały supernatant i skoncentrować osad faga.Delikatnie zawiesić osad faga w jednym mililitrze buforu PBT na białko docelowe, które ma być analizowane, zwykle w sumie cztery. Dodać 100 mikrolitrów biblioteki fagów do każdej powlekanej studzienki na płytce kontrolnej. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.Wyrzuć bufor PB z płytki docelowej do zlewu i osusz talerz na ręcznikach papierowych. Przenieść wszystkie 100 mikrolitrów biblioteki fagów z płytki kontrolnej do każdego powlekanego dołka płytki docelowej. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.Następnie wyjmij bibliotekę fagów z płytki i przemyj powlekane studzienki czterokrotnie buforem PT. Odwróć talerz i postukaj w ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie krople buforu. Dodaj 100 mikrolitrów 0,1-molowego kwasu solnego do każdej pokrytej studzienki, aby wymyć.Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 300 obr./min. Następnie zneutralizuj pH, dodając 12,5 mikrolitra pH 11 jednego molowego chlorowodorku tris do każdej powlekanej studzienki. Przenieś wymyty ze wszystkich ośmiu studzienek do jednej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Pipetować w górę i w dół podczas przenoszenia, aby roztwory były jednorodne i odessać cały płyn z dołków. Dodaj 10% BSA do eluowanego faga, aby uzyskać końcowe stężenie 1% Przechowuj probówkę mikrowirówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. To jest okrągłe pierwsze wyjście.Przygotuj kulturę nasion do hodowli faga wejściowego do następnej rundy selekcji, zaszczepiając pięć mililitrów kultury nasion tetracykliny 2YT izolowaną kolonią E. coli z płytki agarowej. Inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Rozcieńczyć białko docelowe w drugiej i trzeciej probówce odpowiednią ilością PBS.Weź połowę zawartości drugiej i trzeciej rundy probówki i pokryj cztery dołki na docelowe białko w 96-dołkowej płytce wiążącej na następną rundę. Następnie użyj połowy okrągłego jednego wyjścia, aby zaszczepić trzy mililitry komórek w środkowej fazie logarytmicznej. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.Dodaj faga pomocniczego M13KO7 do końcowego stężenia 10 miliardów PFU na mililitr. Inkubuj go ponownie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Po godzinie przenieś całe trzy mililitry kultury do 30 mililitrów roztworu kanamycyny karbenicyliny 2YT.Rośnie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min. Reprezentatywne wyniki dla selekcji wariantu ubikwityny przeciwko UBE4B przedstawiono tutaj. UBV zostały uporządkowane od najwyższej do najniższej częstotliwości.Sekwencje reprezentują zróżnicowany region ubikwityny w UBV ze wszystkimi randomizowanymi resztami. Względne powinowactwo wiązania spoiw do białka docelowego typu dzikiego, zmutowanego białka docelowego, a także białek poza celem mierzy się za pomocą testów immunoenzymatycznych lub ELISA. Wszystkie absorbancje ELISA zostały znormalizowane w stosunku do 96 uśrednionych wyników ELISA BSA i 96 uśrednionych wyników ELISA GST.Ciemniejsza zieleń oznacza silniejsze wiązanie względne. GST został włączony jako kontrola niespecyficznego wiązania, ponieważ białko docelowe jest oznaczone GST. Wyniki testu ELISA przedstawiono graficznie tutaj.Oś x reprezentuje UBV, a oś y reprezentuje odpowiednią znormalizowaną absorbancję. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie wyrzucać roztworu z płytki po dodaniu kwasu solnego. Fagi są teraz zawieszone w roztworze i chcesz je zachować, aby można było wykonać kolejne analizy końcowe wzbogacania lub jedno i drugie.Zgodnie z tą procedurą należy wykonać sekwencjonowanie w celu określenia częstości UBV. Testy ELISA i IC50 można wykonać w celu określenia odpowiednio skuteczności wiązania i skuteczności hamowania, a także w celu określenia, które UBV należy dalej scharakteryzować.

using-phage-display-to-develop-ubiquitin-variant-modulators-for-e3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Opracowano prostą i skalowalną metodę oceny funkcjonalnego znaczenia wariantów missense w Ube3a, genie, którego utrata i zysk funkcji są związane zarówno z zespołem Angelmana, jak i zaburzeniem ze spektrum autyzmu.

Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę dokowania molekularnego w połączeniu z technologiami sond do przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami tradycyjnej medycyny chińskiej a celami białkowymi.

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Protokół ten opisuje metodę ubikwitynacji Streptococcus pneumoniae przy użyciu lizatu komórek ssaków lub czystego kompleksu enzymów ubikwityny, a następnie leczenie oczyszczonym kompleksem białkowym VCP/p97-UFD1-NPLOC4 w celu oceny aktywności bakteriolitycznej, umożliwiającej badanie efektorów immunologicznych zależnych od ubikwityny.

In vitro Rekonstrukcja ubikwitynacji bakteryjnej i eliminacja pośredniczona przez VCP/p97

Poznaj metodę wyświetlania fagowego do izolowania nowych wariantów ubikwityny modulujących ligazy E3. Technika ta umożliwia badanie interakcji białkowych i odkrywanie potencjalnych celów terapeutycznych.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Przeglądaj więcej filmów