Name: Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek białek i DNA pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie właściwości biomechanicznych makrocząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Narodowej Fundacji Nauki DMS-1463234, granty National Institutes of Health HL082808 i AI133634 oraz wewnętrzne fundusze Lehigh University.

1. Przygotowanie VWF
<ol>
	<li>Zrekonstytuuj ludzki plazmatyczny VWF, aby przygotować go do reakcji znakowania. Dodaj 100 µL wody dejonizowanej (DI) do 100 µg liofilizowanego VWF, aby przygotować roztwór zapasowy VWF o stężeniu 1 mg/mL.</li>
	<li>Przeprowadź dializę roztworu zapasowego VWF w celu usunięcia nadmiaru glicyny, co zwiększy wydajność znakowania biotyną i fluorophorem.
	<ol>
		<li>Przenieś 50 µL roztworu zapasowego VWF do jednostki dializacyjnej o objętości 0,1 mL z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 10 000 i zamknij nakrętką. Pozostały roztwór zapasowy przechowuj w temperaturze -20 °C. Roztwór zapasowy VWF pozostaje stabilny do 1 roku w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przeprowadź dializę w 500 mL 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) (0,01 M fosforanu dwusodowego, 0,0018 fosforanu jednoksodowego, 0,0027 M chlorku potasu, 0,137 M chlorku sodu, pH 7,4 w 25 °C) przez 1 h w temperaturze 4 °C przy powolnym mieszaniu. Powtórz dializę przez kolejną godzinę, używając 500 mL świeżego PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij reakcję znakowania biotyną. Przygotuj 2 mM roztwór NHS-PEG4-biotyny, rozpuszczając substancję stałą w wodzie DI bezpośrednio przed reakcją. Pozostawienie NHS-PEG4-biotyny w wodzie przez dłuższy czas spowoduje hydrolizę grupy estru NHS, co obniży wydajność znakowania.
	<ol>
		<li>Dodaj 2,5 µL 2 mM NHS-PEG4-biotyny do jednostki dializacyjnej zawierającej roztwór zapasowy VWF. Przełoży się to na 20-krotną nadwyżkę molową biotyny w stosunku do monomerów VWF. Aminy pierwszorzędowe VWF zareagują z grupami estru NHS, wiążąc się kowalencyjnie z grupami PEG4-biotyny poprzez wiązania amidowe.</li>
		<li>Umieść jednostkę dializacyjną w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Zamknij jednostkę dializacyjną odpowiednią nakrętką. Zabezpiecz zespół probówka-dializator folią Parafilm. Trzymaj w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 40 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij reakcję znakowania fluorophorem. Przygotuj 2,8 mM roztwór barwnika fluorescencyjnego Alexa 488 tetrafluorofenyloestrowego (TFP-ester) (maksymalne pobudzeniemax = 498 nm, maksymalna emisjamax = 519 nm), rozpuszczając stały fluorophore w wodzie DI. Wykonaj to bezpośrednio przed reakcją, aby zapobiec hydrolizie grupy TFP-ester.
	<ol>
		<li>Dodaj 2,9 µL 2,8 mM fluorophore'u 488 do jednostki dializacyjnej. Przełoży się to na 34-krotną nadwyżkę molową fluorophore'u w stosunku do monomerów VWF. Pozostałe aminy pierwszorzędowe VWF zareagują z grupami TFP-ester, wiążąc się kowalencyjnie z fluorophore'ami poprzez wiązania amidowe.</li>
		<li>Dodaj 2,0 µL 1 M wodorowęglanu sodu (rozpuszczonego w wodzie DI) do jednostki dializacyjnej. Dostosowuje to pH reakcji do wartości bliskiej 8,0, co zwiększa wydajność reakcji TFP-esteru z aminami pierwszorzędowymi.</li>
		<li>Zabezpiecz jednostkę dializacyjną w probówce do mikrocentryfugi w taki sam sposób, jak w kroku 1.3.2. Przechowuj w ciemności, aby zapobiec fotobleachingowi, i pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 h i 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść jednostkę dializacyjną w 900 mL 1x sterylnego PBS i dializuj przez noc w temperaturze 4 °C. Uzyskasz w ten sposób około 70 µL znakowanego VWF o stężeniu 0,71 mg/mL lub 2,84 µM (stężenie monomeru).</li>
	<li>Przenieś znakowany VWF do probówki do mikrocentryfugi. Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Przechowuj w temperaturze 4 °C. Do długotrwałego przechowywania dodaj środek przeciwdrobniczy azydek sodu do stężenia końcowego 0,02% (w/v). 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.</li>
</ol>
2. Przygotowanie DNA lambda
<ol>
	<li>Przeprowadź biotinylację liniowego DNA lambda poprzez wypełnienie jego lepkich końców (miejsc cos) nukleotydami biotin-14-dCTP zgodnie ze standardowymi protokołami, powtórzonymi tutaj w kroku 2.118. Pozostałe miejsca cos wypełnij nukleotydami dATP, dTTP i dGTP.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 mM roztwory dATP, dTTP, dGTP i biotin-14-dCTP w 10-krotnym buforze reakcyjnym (500 mM chlorku sodu, 100 mM Tris-chlorowodorku, 100 mM chlorku magnezu, 10 mM ditiotreitolu, pH 7,9 w 25 °C).</li>
		<li>Przenieś 48 µL DNA lambda o stężeniu 500 ng/µL do probówki PCR i inkubuj przez 5 min w 65 °C. Miejsca cos kolistego DNA lambda rozdzielą się pod wpływem ciepła, co doprowadzi do linearyzacji cząsteczki i powstania jednoniciowych nawisów gotowych do biotinylacji. Natychmiast po tym etapie umieść próbkę na lodzie, aby zapobiec ponownemu hybrydowaniu miejsc cos.</li>
		<li>Do DNA lambda dodaj 5 µL 1 mM dATP, dTTP i dGTP oraz 4 µL 1 mM biotin-14-dCTP. Dodaj również 2,5 µL fragmentu Klenowa (3'à5' exo-) o aktywności 5 U/µL w celu katalizy syntezy DNA.</li>
		<li>Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez 1 h w 37 °C.</li>
		<li>Dodaj 1,2 µL 0,5 M EDTA. Następnie podgrzej mieszaninę reakcyjną przez 5 min w 70 °C. Spowoduje to dezaktywację fragmentu Klenowa i przerwanie reakcji biotinylacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń nadmiar nukleotydów z DNA lambda, korzystając z kolumny wirowej o pojemności 10-70 µL i progu odcięcia masy cząsteczkowej 6 000.
	<ol>
		<li>Umieść kolumnę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Wirować kolumnę wraz z probówką przy 1000 x g przez 2 min. Odrzuć filtrat zebrany w probówce.</li>
		<li>Wymień bufor kolumny na 1-krotny roztwór tego samego buforu reakcyjnego z kroku 2.1.1. W tym celu dodaj do kolumny 500 µL buforu 1x. Wirować przez 1 min przy 1000 x g. Odrzuć filtrat. Powtórz tę czynność jeszcze 2 razy, tak aby do kolumny trafiło łącznie 1500 µL.</li>
		<li>Umieść kolumnę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Ostrożnie nanieś roztwór z kroku 2.1.5 na górną warstwę kolumny. Wirować przez 4 min przy 1000 x g.</li>
		<li>Zbierz filtrat (40-70 µL) z probówki do mikrocentryfugi i przelej do probówki PCR. Zawiera on oczyszczone, biotinylowane DNA lambda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz DNA lambda fluorescencyjnym barwnikiem YOYO-1 (maksymalne wzbudzeniemax = 490 nm, maksymalna emisjamax = 509 nm) zgodnie ze standardowymi protokołami, powtórzonymi tutaj w kroku 2.3.120.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór barwnika YOYO-1 i DNA lambda z molowym stosunkiem barwnika do par zasad 1:10. Aby obliczyć stężenie par zasad DNA lambda, przyjmij, że w etapie oczyszczania nie doszło do utraty DNA. Pełnowymiarowe DNA lambda posiada 48 502 pary zasad. 
		UWAGA: Na przykład, jeśli w kroku 2.2.4 odzyskano 50 µL roztworu, należy dodać 7,4 µL barwnika YOYO-1 o stężeniu 500 µM.</li>
		<li>Podgrzewaj roztwór przez 2 h w 50 °C w ciemności, aby dopełnić reakcję.</li>
		<li>Owiń probówkę folią aluminiową i chroń przed światłem. Przechowuj w 4 °C. Roztwór jest teraz gotowy do wprowadzenia do urządzeń mikroprzepływowych. 
		UWAGA: Na tym etapie można przerwać protokół.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tworzenie form kanałów mikrofluidycznych w waflu krzemowym
<ol>
	<li>Zastosować fotolitografię w celu utworzenia kanałów mikroprzepływowych o odpowiednich wymiarach (Rysunek 2) na wzorcowym waflu krzemowym zgodnie ze standardowymi protokołami19.</li>
</ol>
4. Przygotowanie mikrofluidycznego urządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS)
<ol>
	<li>Do łódki wagowej dodać 5 części bazy elastomeru silikonowego na 1 część utwardzacza (masowo). Zawartość dokładnie mieszać przez 1 min, aby przygotować roztwór PDMS przed utwardzeniem.</li>
	<li>Umieścić matrycę z wafla krzemowego w plastikowej szalce Petriego. Wylać roztwór PDMS na wafel, tworząc warstwę o grubości 5 mm. Przykryć szalkę i pozostawić w eksykatorze pod próżnią przez 1 h w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Inkubować przykrytą szalkę Petriego w temperaturze 60 °C przez noc, aby utwardzić PDMS do postaci elastycznego ciała stałego. Proces utwardzania spowoduje uformowanie kanałów mikrofluidycznych w PDMS na styku PDMS-wafel.</li>
	<li>Za pomocą żyletki wyciąć w PDMS prostokąty o wymiarach 20 x 10 mm wokół każdego kanału mikrofluidycznego. Prostokątne bloki PDMS usunąć pęsetą.</li>
	<li>Używając tępej igły 25 G o zaostrzonych krawędziach, wykonać otwór o średnicy 0,5 mm na jednym końcu kanału, upewniając się, że otwór przechodzi całkowicie przez blok PDMS (Rycina 2). Za pomocą cienkiej igły usunąć PDMS z otworu. Powtórzyć tę czynność na drugim końcu kanału. W ten sposób powstanie wlot i wylot dla przepływu przez kanał.</li>
	<li>Oczyścić powierzchnię bloku PDMS za pomocą winylowej taśmy do pomieszczeń czystych. Przedmuchać sprężonym azotem szkiełko podstawowe nr 1 ½ o wymiarach 22 x 50 mm, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Umieścić blok PDMS stroną z kanałem do góry oraz szkiełko podstawowe w komorze urządzenia do wiązania plazmowego. Rozpocząć proces obróbki.</li>
	<li>Po zakończeniu obróbki szybko położyć blok PDMS na szkiełku podstawowym tak, aby kanał stykał się z szkiełkiem. Przyłożyć nacisk wzdłuż krawędzi bloku. Umieścić zespół szkiełko-PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 115 °C przez 15 min, aby wzmocnić trwałe wiązanie.</li>
	<li>Wprowadzić rurkę o długości 10 cm i średnicy wewnętrznej 0,25 mm do otworu wylotowego w górnej części bloku PDMS. Umożliwi to łatwy odpływ cieczy z kanału. Urządzenie jest gotowe.</li>
</ol>
5. Traktowanie powierzchni urządzenia mikrofluidycznego
<ol>
	<li>Wstrzyknij &lt;10 µL biotynilowanej albuminy surowicy bydlęcej (BSA-biotyna) w stężeniu 10 µg/mL rozpuszczonej w sterylnym 1x PBS do wlotu urządzenia mikroprzepływowego do eksperymentów z VWF. Do eksperymentów z lambda DNA wstrzyknij &lt;10 µL BSA-biotyny w stężeniu 1 mg/mL. Po wstrzyknięciu pozostaw kilka mikrolitrów BSA-biotyny w końcówce pipety i pozwól, aby końcówka pozostała osadzona we wlocie.
	<ol>
		<li>Zawsze utrzymuj kroplę wody DI wokół końcówki. Zapobiegnie to przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału. Stosuj tę technikę za każdym razem, gdy do kanału wstrzykiwany jest nowy roztwór.</li>
		<li>Pozostaw BSA-biotynę do inkubacji w urządzeniu przez 2 h. BSA zwiąże się niespecyficznie z powierzchnią szkiełka nakrywkowego (Rysunek 3A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń końcówkę pipety. Wstrzyknij do kanału &lt;10 µL roztworu blokującego z kazeiny i pozostaw do inkubacji na 30 min. Kazeina zablokuje wszelkie wolne miejsca, ograniczając niespecyficzne wiązanie biomolekuł z powierzchnią (Rysunek 3B).</li>
	<li>Usuń końcówkę i wstrzyknij do kanału &lt;10 µL streptawidyny w stężeniu 10 µg/mL rozpuszczonej w sterylnym 1x PBS w przypadku eksperymentów z VWF. Do eksperymentów z lambda DNA użyj streptawidyny w stężeniu 100 µg/mL. Inkubuj przez 10 min. Streptawidyna zwiąże się z grupami biotyny w BSA-biotynie (Rysunek 3C).</li>
	<li>Usuń końcówkę i wstrzyknij do kanału &lt;10 µL 1x roztworu detergentu (0,05% Tween 20 w PBS), aby wypłukać nadmiar streptawidyny.</li>
	<li>Usuń końcówkę i wstrzyknij &lt;10 µL albo 28,4 nM VWF rozcieńczonego w roztworze kazeiny, albo lambda DNA z kroku 2.3.3. Inkubuj VWF przez 3 min. Inkubuj lambda DNA przez 45 min (Rysunek 3D).</li>
	<li>Usuń końcówkę i wstrzyknij &lt;10 µL 5 mM wolnej biotyny rozcieńczonej w roztworze kazeiny. Wolna biotyna zablokuje nadmiarowe miejsca wiążące streptawidyny na powierzchni kanału (Rysunek 3E).</li>
</ol>
6. Wizualizacja VWF i DNA lambda pod mikroskopem fluorescencyjnym
<ol>
	<li>Przygotować 1 mL roztworu blokującego z kazeiną z dodatkiem 2,2 mM kwasu protokatechowego i 37 nM protokatechuanu-3,4-dioksygenazy (aby zminimalizować fotoblaknięcie). Napełnić strzykawkę i zamocować ją w pompie strzykawkowej. Wziąć rurkę o długości 30 cm i średnicy wewnętrznej 0,25 mm i przymocować jeden jej koniec do igły strzykawki. Przepuścić roztwór, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Drugi koniec rurki przymocować do wlotu urządzenia mikrofluidycznego. Zaleca się wykonanie tego kroku 3 minuty po etapie 5.6.</li>
	<li>Wybrać obiektyw o najwyższym powiększeniu (tj. 60-100X) w mikroskopie fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) lub mikroskopie konfokalnym. W razie potrzeby nanieść kroplę oleju imersyjnego na obiektyw. Umieścić urządzenie mikrofluidyczne na stole mikroskopu tak, aby szkiełko podstawowe przylegało do obiektywu.</li>
	<li>Uruchomić mikroskopię w polu jasnym. Dostosować ostrość tak, aby widoczne były wszelkie elementy, takie jak zanieczyszczenia i pęcherzyki powietrza. Następnie przesunąć stół w kierunku X i Y, aż krawędź kanału mikrofluidycznego stanie się widoczna i będzie przeci状態で ramy obrazu.</li>
	<li>Przełączyć na kanał 488 (FITC). Dostosować poziom Z oraz kąt TIRF w razie potrzeby, aż będzie można rozróżnić pojedyncze zielone, globularne cząsteczki. Są to cząsteczki VWF lub lambda DNA.</li>
	<li>Dostosować czas ekspozycji i intensywność lasera, aby wizualizować cząsteczki fluorescencyjne bez zbyt szybkiego ich fotoblaknięcia. Dostosować kontrast, aby cząsteczki były widoczne wyraźniej.</li>
	<li>Uruchomić przepływ z pompy strzykawkowej tak, aby roztwór blokujący z kazeiną wpływał do kanału i wypływał przez wylot. Wykonać to dokładnie 5 minut po etapie 5.6. Zatrzymywać i uruchamiać przepływ, aby obserwować zmiany w konformacji cząsteczek. Podczas stosowania przepływu używać prędkości od 5 000 do 30 000 µL/h. Powtórzyć tę czynność w różnych obszarach urządzenia mikrofluidycznego. Kontynuować ten proces, aby zlokalizować cząsteczki, które mogą się rozciągać i relaksować podczas wielokrotnych cykli zatrzymywania i uruchamiania przepływu.</li>
	<li>Zauważyć, ile czasu zajmuje cząsteczkom osiągnięcie maksymalnego rozciągnięcia i całkowite zrelaksowanie do formy globularnej. Nagrać filmy przedstawiające ciągłe zachowanie cząsteczek w przepływie ścinającym, wybierając optymalny czas ekspozycji, częstotliwość ekspozycji i czas trwania filmu, które uchwycą pełen zakres zachowań rozciągających i zminimalizują fotoblaknięcie.</li>
	<li>Zapisać filmy w formacie .AVI z paskiem skali. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.</li>
</ol>
7. Analiza obrazowa zmian konformacyjnych
<ol>
	<li>Oblicz szybkość ścinania przy ściankach (<img alt="Symbol szybkości ścinania, γ̇; diagram reologiczny; dynamika płynów; analiza naprężeń materiałowych." src="/files/ftp_upload/60784/60784sy1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Symbol 1">) przyłożoną do makrocząsteczek, wykorzystując natężenie przepływu (Q), wysokość (h) i szerokość (w) prostokątnego kanału mikrofluidycznego. W tym celu zastosuj następujące równanie: 
	<img alt="Równanie dynamiki płynów, γ̇=6Q/wh², przedstawiające szybkość ścinania, stosowane w analizie przepływu i badaniach mechanicznych." src="/files/ftp_upload/60784/60784eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"></li>
	<li>Wyznacz długość dowolnej biomolekuły przy różnych szybkościach ścinania, korzystając z dostosowanego kodu MATLAB (patrz Pliki uzupełniające). Utwórz folder o nazwie videos analysis, który zawiera następujące kody MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m oraz get_length.fig. Wewnątrz folderu videos analysis utwórz podfolder o nazwie videos i dodaj do niego pliki .AVI przeznaczone do analizy.</li>
	<li>Otwórz plik main.m w programie MATLAB 2019a i uruchom kod. W oknie poleceń, pod komunikatem Please input the data file to analyze:, wpisz nazwę pliku wideo do analizy.</li>
	<li>W otwartym graficznym interfejsie użytkownika (GUI) ustaw wartość progu (tekst w polu w prawym górnym rogu okna) na 20 i kliknij przycisk Set threshold button, aby zatwierdzić.</li>
	<li>Użyj kursora danych w górnym pasku narzędzi okna, aby wybrać dowolny piksel na pasku skali. Kliknij Start point w sekcji Scale bar po prawej stronie okna. Pozycja (x,y) wybranego piksela pojawi się po prawej stronie przycisku. Kliknij przycisk Pixel size (µm). Rozmiar piksela należy zmierzyć tylko raz dla każdego filmu.</li>
	<li>Wybierz dowolny piksel na analizowanej cząsteczce. Kliknij Start point w sekcji VWF. Po wyświetleniu pozycji wybranego piksela w polu tekstowym po prawej stronie, kliknij Left end, Right end oraz String length, aby uzyskać długość cząsteczki na obrazie. 
	UWAGA: Ten krok można wykorzystać do analizy zmian konformacyjnych dowolnej biomolekuły, mimo że kod posiada sekcję o nazwie VWF.</li>
	<li>Ponownie sprawdź lewy i prawy koniec cząsteczki. Powiększ obraz i użyj kursora danych, aby sprawdzić pozycję interesującego piksela. W razie potrzeby ręcznie wybierz piksel jako koniec i ponownie oblicz długość (w pikselach).</li>
	<li>Zapisz rozmiar piksela w µm oraz długość łańcucha w liczbie pikseli w arkuszu Excel, a następnie oblicz długość łańcucha w µm.</li>
	<li>Powtórz powyższe kroki dla każdego obrazu. Używaj przycisków Last oraz Next w prawym dolnym rogu GUI, aby przełączać się między obrazami w tym samym pliku wideo. Kliknij Close, aby zamknąć okno GUI.</li>
</ol>

<ol><li>Shaqfeh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+single-molecule+DNA+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Non-Newtonian+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of single-molecule DNA in flow.</a> Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).</li>
<li>Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-polymer+dynamics+in+steady+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-polymer dynamics in steady shear flow.</a> Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).</li>
<li>LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+individual+flexible+polymers+in+a+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow.</a> Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).</li>
<li>Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+Origin+of+the+Non-Newtonian+Viscosity+of+Semiflexible+Polymer+Solutions+in+the+Semidilute+Regime%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime.</a> ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+physics+of+von+Willebrand+factor+concatamers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Biology and physics of von Willebrand factor concatamers.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
<li>Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+unfolded+states+of+proteins+using+single-molecule+FRET+spectroscopy+and+molecular+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Siedlecki, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+human+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor.</a> Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).</li>
<li>Roiter, Y., Minko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+single+molecule+experiments+at+the+solid-liquid+interface%3A+In+situ+conformation+of+adsorbed+flexible+polyelectrolyte+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).</li>
<li>Aznauryan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+structural+and+dynamical+view+of+an+unfolded+protein+from+the+combination+of+single-molecule+FRET%2C+NMR%2C+and+SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).</li>
<li>Schuler, B., Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+studied+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding studied by single-molecule FRET.</a> Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).</li>
<li>Howorka, S., Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+analytics%3A+sensing+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanopore analytics: sensing of single molecules.</a> Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).</li>
<li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Xia, T., Li, N., Fang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Fluorescence+Imaging+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).</li>
<li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+elongation+of+von+Willebrand+factor+precedes+tension-dependent+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation.</a> Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).</li>
<li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overstretching+B-DNA%3A+The+Elastic+Response+of+Individual+Double-Stranded+and+Single-Stranded+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules.</a> Science. 271 (5250), 795-799 (1996).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-Induced+Extensional+Response+Behaviors+of+Tethered+von+Willebrand+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor.</a> Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).</li>
<li>Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+Novel+tools+for+imaging+protein%E2%80%93nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Aby uzyskać wysokiej jakości dane dotyczące zmian konformacyjnych pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano w tej metodzie, kluczowe znaczenie ma inkubacja cząsteczki przez odpowiedni czas, zminimalizowanie jej niespecyficznych interakcji z powierzchnią i ustalenie ustawień mikroskopu, które zmniejszają fotowybielanie. Zdolność cząsteczki do swobodnej zmiany konformacji jest związana z liczbą oddziaływań biotyna-streptawidyna powstałych między cząsteczką a powierzchnią. Jak wspomniano wcz...

Mechanizmy reakcji biomolekuł na bodźce środowiskowe były szeroko badane. W szczególności w środowisku przepływowym siły ścinające i wydłużające regulują zmiany konformacyjne i potencjalnie funkcję biomolekuł. Typowymi przykładami są indukowane ścinaniem rozplątywanie DNA lambda i czynnika von Willebranda (VWF). Lambda DNA została wykorzystana jako narzędzie do zrozumienia dynamiki konformacyjnej pojedynczych, elastycznych łańcuchów polimerowych oraz reologii roztworów polimerowych1,2,3,4. VWF to czujnik naturalnego przepływu, który agreguje płytki krwi w miejscach ran naczyń krwionośnych o nieprawidłowym tempie ścinania i wzorcach przepływu. Rozwikłanie VWF jest niezbędne do aktywacji wiązania płytek krwi z domeną A1 i wiązania kolagenu z domeną A3. Ponadto, rozwijanie domeny A2 wywołane wysokim ścinaniem umożliwia rozszczepienie VWF, które reguluje jego rozkład masy cząsteczkowej w krążeniu5,6. W związku z tym bezpośrednia wizualizacja tego, jak te cząsteczki zachowują się pod wpływem przepływu, może znacznie poszerzyć naszą podstawową wiedzę na temat ich biomechaniki i funkcji, co z kolei może umożliwić nowe zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne.
Typowe metodologie do charakteryzowania konformacji pojedynczych cząsteczek obejmują pęsetę optyczną/magnetyczną, mikroskopię sił atomowych (AFM) i transfer energii rezonansu Förstera (FRET)7. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek jest potężnym narzędziem do badania siły i ruchu związanych ze zmianami konformacyjnymi biomolekuł. Brakuje mu jednak możliwości mapowania ogólnych konformacji molekularnych8. AFM jest zdolny do obrazowania z wysoką rozdzielczością przestrzenną, ale ma ograniczoną rozdzielczość czasową9,10. Ponadto kontakt między końcówką a próbką może zakłócić reakcję wywołaną przepływem. Inne metody, takie jak analiza FRET i nanoporów, określają stany fałdowania i rozwijania białek pojedynczych cząsteczek na podstawie wykrywania odległości wewnątrzcząsteczkowej i objętości wykluczonych. Jednak metody te są wciąż w powijakach i ograniczone w bezpośredniej obserwacji konformacji pojedynczych cząsteczek11,12,13,14.
Z drugiej strony, bezpośrednia obserwacja makromolekuł z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną pod mikroskopią fluorescencyjną poprawiła nasze zrozumienie dynamiki pojedynczych cząsteczek w wielu procesach biologicznych15,16. Na przykład Fu i wsp. po raz pierwszy osiągnęli jednoczesną wizualizację wydłużenia VWF i wiązania receptorów płytkowych. W swojej pracy cząsteczki VWF zostały unieruchomione na powierzchni kanału mikroprzepływowego poprzez interakcje biotyna-streptawidyna i zobrazowane pod mikroskopią fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) w różnych środowiskach przepływu ścinającego17. Stosując podobną metodę jak Fu, wykazaliśmy tutaj, że konformacje VWF i lambda DNA można bezpośrednio zaobserwować zarówno w TIRF, jak i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, urządzenia mikroprzepływowe są używane do tworzenia i kontrolowania przepływu ścinającego, a biomolekuły są unieruchomione na powierzchni kanału. Po zastosowaniu różnych szybkości ścinania, konformacje tej samej cząsteczki są rejestrowane w celu zmierzenia długości rozciągnięcia, pokazanej również na Rysunek 1. Metoda ta może być szeroko stosowana do badania innych zachowań polimerów w złożonych środowiskach przepływu, zarówno w badaniach reologicznych, jak i biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do etykietowania Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Spin P-6 Kolumny żelowe</td><td>Bio-Rad</td><td>7326221</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>Stosować jako wolną biotynę w kroku 5.6</td></tr><tr><td>Biotyna-14-dCTP</td><td>AAT Bioquest</td><td>17019</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393-195</td><td>No. 1 &frac12;, 22 x 50 mm</td></tr><tr><td>dNTP Zestaw</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Boje pływakowe do mini urządzenia do dializy</td><td>Thermo Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3'&rarr; 5' egzo-)</td> <td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>Użyj do 10-krotnego buforu reakcyjnego w kroku 2.1.1 i 1-krotnego bufora reakcyjnego w kroku 2.2.2</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>N3011S</td><td></td></tr><tr><td>Mini urządzenie do dializy</td><td>Thermo Scientific</td><td>69570</td><td>10K MWCO, objętość 0,1 ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>New England BioLabs</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21330</td><td></td></tr><tr><td>Protokatechuat 3,4-dioksygenazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279</td><td></td></tr><tr><td>Kwas protokatechowy</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-205818</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych do produkcji PDMS</td><td>Firma chemiczna Dow</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85878</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>110 050</td><td>Stosować jako roztwór blokujący kazeinę w całym protokole</td></tr><tr><td>Taśma winylowa do pomieszczeń czystych</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-120-3217</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik von Willebranda, ludzkie osocze</td><td>Millipore Sigma</td><td>681300</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 Barwnik</td><td>AAT Bioquest</td><td>17580</td><td></td></tr><tr><td>Rurka o średnicy wewnętrznej 0,25 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06419-00</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 25</td><td>Thomas Scientific</td><td>JG2505X</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Zachowanie pojedynczej cząsteczki pod wpływem zakłóceń mechanicznych zostało szeroko scharakteryzowane, aby zrozumieć wiele procesów biologicznych. Jednak metody takie jak mikroskopia sił atomowych mają ograniczoną rozdzielczość czasową, podczas gdy rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) pozwala jedynie na wnioskowanie o konformacjach. Z drugiej strony mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację in situ pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym w różnych warunkach przepływu. Nasz protokół opisuje kroki w celu uchwycenia zmian konformacyjnych pojedynczych biomolekuł w różnych środowiskach przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przepływ ścinający jest wytwarzany w kanałach mikroprzepływowych i kontrolowany przez pompę strzykawkową. Jako demonstracja metody, czynnik von Willebranda (VWF) i DNA lambda są znakowane biotyną i fluoroforem, a następnie unieruchamiane na powierzchni kanału. Ich konformacje są stale monitorowane przy zmiennym przepływie ścinającym przy użyciu całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Odwracalna dynamika rozplątywania VWF jest przydatna do zrozumienia, w jaki sposób jego funkcja jest regulowana w ludzkiej krwi, podczas gdy konformacja DNA lambda oferuje wgląd w biofizykę makrocząsteczek. Protokół może być również szeroko stosowany do badania zachowania polimerów, zwłaszcza biopolimerów, w różnych warunkach przepływu oraz do badania reologii złożonych płynów.

Obserwacja dynamicznego zachowania biomolekuł, takich jak VWF i lambda DNA, jest w dużym stopniu zależna od optymalizacji ich wiązania z powierzchnią urządzenia. Inkubacja preparatów do modyfikacji powierzchni przez zalecany czas w urządzeniu mikrofluidycznym jest kluczowa dla uzyskania wiązania za pomocą zaledwie kilku punktów zakotwiczenia, co pozwala cząsteczkom na swobodne rozciąganie i rozluźnianie się pod wpływem zmiany przepływu. Jeśli białka lub DNA są związane zbyt silnie za pomocą wielu wiązań, będą rozciągać s...

Przedstawiamy protokół do unieruchamiania pojedynczych makrocząsteczek w urządzeniach mikroprzepływowych i ilościowego określania zmian w ich konformacji pod wpływem przepływu ścinającego. Protokół ten jest przydatny do charakteryzowania właściwości biomechanicznych i funkcjonalnych biomolekuł, takich jak białka i DNA, w środowisku przepływu.

Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Kwantyfikacja zmian konformacyjnych w pojedynczych biomolekułach pod wpływem przepływu ścinającego jest przydatna do zrozumienia funkcji i biofizyki makrocząsteczek, takich jak białko i DNA. Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację pojedynczych cząsteczek in situ w czasie rzeczywistym w fizjologicznych środowiskach przepływu z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Nie ma sobie równych w innych technikach, takich jak AFM.Charakteryzując siłę ścinającą, pod wpływem której białka naszego DNA ulegają globalnym zmianom konformacyjnym, można lepiej zaprojektować leki, które naśladują te właściwości biofizyczne. Protokół ten może być szeroko stosowany do badania zachowania innych polimerów, zwłaszcza biopolimerów, w różnych warunkach przepływu oraz do badania reologii złożonych płynów. Czas wykonania kroków ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.Sugerujemy wielokrotne przećwiczenie etapów obróbki powierzchni urządzenia mikroprzepływowego i mikroskopii fluorescencyjnej, aby wykonać je w efektywny sposób. Uchwycenie zmian konformacyjnych w biomolekułach jest zjawiskiem wizualnym i dynamicznym, które najlepiej oglądać na filmie. Naukowcy lepiej zrozumieją tę metodę po obejrzeniu mikroskopii białek i DNA w czasie rzeczywistym przedstawionej w tym filmie.Aby przygotować urządzenie mikroprzepływowe, dodaj pięć części bazy z elastomeru silikonowego do jednej części utwardzacza w łódce wagowej. i dokładnie mieszaj zawartość przez jedną minutę, aby uzyskać wstępnie utwardzony roztwór PDMS. Umieść główną płytkę krzemową na plastikowej szalce Petriego i wylej roztwór PDMS na płytkę, aby utworzyć pięciomilimetrową warstwę.Przykryj naczynie i pozostaw je w eksykatorze pod próżnią na godzinę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie inkubuj pokrytą szalkę Petriego w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc, aby utwardzić PDMS do elastycznego ciała stałego, co spowoduje uformowanie kanałów mikroprzepływowych w PDMS na granicy faz PDMS. Następnego dnia za pomocą brzytwy wytnij prostokąty o wymiarach 20 na 10 milimetrów wokół każdego kanału mikroprzepływowego w PDMS i usuń prostokątne bloki pęsetą.Użyj igły o rozmiarze 25 z zaostrzonymi krawędziami, aby przebić otwór o średnicy 0,5 milimetra na jednym końcu kanału, upewniając się, że otwór przechodzi całkowicie przez blok PDMS. Użyj cienkiej igły, aby wybić PDMS z otworu i powtórz proces na drugim końcu kanału. Umieść blok PDMS stroną kanałową do góry i szkiełkiem nakrywkowym w komorze spawarki plazmowej i rozpocznij obróbkę.Po zakończeniu leczenia szybko umieść blok PDMS na szkiełku nakrywkowym, tak aby kanał stykał się z szkiełkiem. Dociśnij krawędzie bloku, a następnie umieść zespół PDMS szkiełka nakrywkowego na płycie grzejnej w temperaturze 115 stopni Celsjusza na 15 minut, aby wzmocnić trwałe połączenie. Na koniec włóż 10-centymetrowy wkład.Rurka o średnicy wewnętrznej 0,25 milimetra do otworu wylotowego w górnej części bloku PDMS, aby umożliwić łatwy przepływ płynu z kanału. W przypadku eksperymentów z czynnikiem von Willebranda lub VWF wstrzyknąć do 10 mikrolitrów po 10 mikrogramów na mililitr BSA-Biotyny rozpuszczonej w sterylnym 1X PBS do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Po wstrzyknięciu należy wstrzymać kilka mikrolitrów BSA-Biotyny w końcówce pipety i pozostawić końcówkę do osadzenia we wlocie.Pozostawić BSA-Biotynę do inkubacji w urządzeniu przez dwie godziny, co spowoduje, że BSA nie zwiąże się specyficznie z powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Następnie zdejmij końcówkę pipety i wstrzyknij do kanału do 10 mikrolitrów roztworu blokującego kazeinę. Pozostaw roztwór kazeiny do inkubacji przez 30 minut, aby mógł zablokować wszelkie wolne miejsca i zmniejszyć niespecyficzne wiązanie biomolekuł z powierzchnią.Zdejmij końcówkę i wstrzyknij do 10 mikrolitrów streptawidyny w sterylnym PBS do kanału, który zwiąże się z grupami biotyny BSA-Biotyny. Następnie wstrzyknij do 10 mikrolitrów roztworu detergentu, aby zmyć nadmiar streptawidyny. Zdjąć końcówkę i wstrzyknąć VWF do roztworu kazeiny lub lambda DNA.Inkubować VWF przez trzy minuty lub lambda DNA przez 45 minut. Następnie wstrzyknij pięć milimolowych wolnych biotyn, aby zablokować nadmiar miejsc wiązania streptawidyny. Załaduj jeden mililitr roztworu blokującego kazeinę do strzykawki i zabezpiecz go w pompie strzykawkowej.Następnie przymocuj jeden koniec rurki do igły strzykawki i wlej roztwór, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Około trzy minuty po wstrzyknięciu wolnej biotyny przymocuj drugi koniec rurki do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Wybierz obiektyw o największym powiększeniu w mikroskopie TIRF lub konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym.W razie potrzeby dodaj kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu tak, aby szkiełko nakrywkowe zlicowało się z obiektywem. Rozpocznij mikroskopię w jasnym polu i dostosuj ostrość tak, aby widoczne były takie elementy, jak zanieczyszczenia i pęcherzyki.Następnie wyreguluj stolik w kierunkach X i Y, aż krawędź kanału mikroprzepływowego będzie widoczna i przetnie ramkę. Przełącz się na kanał FITC i dostosuj poziom Z i kąt TIRF zgodnie z potrzebami, aż będzie można rozróżnić poszczególne zielone cząsteczki kuliste. Dostosuj intensywność lasera i czas naświetlania, aby uwidocznić cząsteczki fluorescencyjne bez ich zbyt szybkiego fotowybielania.Następnie dostosuj kontrast, aby lepiej uwidocznić cząsteczki. Dokładnie pięć minut po wstrzyknięciu wolnej biotyny rozpocznij i zatrzymaj przepływ z pompy strzykawkowej, aby obserwować zmiany w konformacji molekularnej przy natężeniu przepływu od 5000 do 30 000 mikrolitrów na godzinę. W przypadku VWF bardzo ważne jest, aby zastosować przynajmniej niewielką ilość przepływu, taką jak 30 sekund przepływu 10 000 mikrolitrów na godzinę dokładnie pięć minut po wstrzyknięciu wolnej biotyny.Powtórz to w różnych obszarach urządzenia mikroprzepływowego i zlokalizuj cząsteczki, które mogą rozszerzać się i rozluźniać po wielu cyklach rozpoczynania i zatrzymywania przepływu. Zwróć uwagę, ile czasu potrzeba, aby cząsteczki osiągnęły maksymalną rozciągłość i całkowite rozluźnienie, i nagrywaj filmy przedstawiające ciągłe zachowanie cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego. Elastyczność cząsteczki w potwierdzaniu zmian jest często wykazywana przez jej zdolność do wydłużania się w miarę stosowania wyższych szybkości ścinania ze względu na rosnący przepływ.Krzywa wydłużenia w funkcji szybkości ścinania cząsteczki czynnika von Willebranda jest przydatna do scharakteryzowania właściwości biomechanicznych białka. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej DNA lambda podobnie wykazują zwiększoną rozciągliwość przy wyższych szybkościach ścinania po 30 sekundach i stopniowej relaksacji przez ponad dwie minuty po zatrzymaniu przepływu. Podczas pracy z VWF należy pamiętać, aby inkubować go tylko przez trzy minuty i uwalniać biotynę przez pięć minut przed rozpoczęciem przepływu.Ma to kluczowe znaczenie dla utworzenia optymalnej liczby wiązań biotyna-streptawidyna potrzebnych do odwracalnego rozplątania. Metodę tę można dostosować do wizualizacji interakcji w czasie rzeczywistym między wieloma biomolekułami i scharakteryzowania ich funkcji. Na przykład, można lepiej zrozumieć tworzenie czopów płytkowych, wizualizując VWF rozplątujący się pod wpływem wysokiego ścinania i jego wiązanie z cząsteczką adhezyjną płytek krwi GPIb-alfa za pomocą tej metody.

characterizing-single-molecule-conformational-changes-under-shear

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę charakteryzacji zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek białek i DNA pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie właściwości biomechanicznych makrocząsteczek.

Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów