Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Kwantyfikacja zmian konformacyjnych w pojedynczych biomolekułach pod wpływem przepływu ścinającego jest przydatna do zrozumienia funkcji i biofizyki makrocząsteczek, takich jak białko i DNA. Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację pojedynczych cząsteczek in situ w czasie rzeczywistym w fizjologicznych środowiskach przepływu z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Nie ma sobie równych w innych technikach, takich jak AFM.

Charakteryzując siłę ścinającą, pod wpływem której białka naszego DNA ulegają globalnym zmianom konformacyjnym, można lepiej zaprojektować leki, które naśladują te właściwości biofizyczne. Protokół ten może być szeroko stosowany do badania zachowania innych polimerów, zwłaszcza biopolimerów, w różnych warunkach przepływu oraz do badania reologii złożonych płynów. Czas wykonania kroków ma kluczowe znaczenie dla sukcesu.

Sugerujemy wielokrotne przećwiczenie etapów obróbki powierzchni urządzenia mikroprzepływowego i mikroskopii fluorescencyjnej, aby wykonać je w efektywny sposób. Uchwycenie zmian konformacyjnych w biomolekułach jest zjawiskiem wizualnym i dynamicznym, które najlepiej oglądać na filmie. Naukowcy lepiej zrozumieją tę metodę po obejrzeniu mikroskopii białek i DNA w czasie rzeczywistym przedstawionej w tym filmie.

Aby przygotować urządzenie mikroprzepływowe, dodaj pięć części bazy z elastomeru silikonowego do jednej części utwardzacza w łódce wagowej. i dokładnie mieszaj zawartość przez jedną minutę, aby uzyskać wstępnie utwardzony roztwór PDMS. Umieść główną płytkę krzemową na plastikowej szalce Petriego i wylej roztwór PDMS na płytkę, aby utworzyć pięciomilimetrową warstwę.

Przykryj naczynie i pozostaw je w eksykatorze pod próżnią na godzinę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie inkubuj pokrytą szalkę Petriego w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc, aby utwardzić PDMS do elastycznego ciała stałego, co spowoduje uformowanie kanałów mikroprzepływowych w PDMS na granicy faz PDMS. Następnego dnia za pomocą brzytwy wytnij prostokąty o wymiarach 20 na 10 milimetrów wokół każdego kanału mikroprzepływowego w PDMS i usuń prostokątne bloki pęsetą.

Użyj igły o rozmiarze 25 z zaostrzonymi krawędziami, aby przebić otwór o średnicy 0,5 milimetra na jednym końcu kanału, upewniając się, że otwór przechodzi całkowicie przez blok PDMS. Użyj cienkiej igły, aby wybić PDMS z otworu i powtórz proces na drugim końcu kanału. Umieść blok PDMS stroną kanałową do góry i szkiełkiem nakrywkowym w komorze spawarki plazmowej i rozpocznij obróbkę.

Po zakończeniu leczenia szybko umieść blok PDMS na szkiełku nakrywkowym, tak aby kanał stykał się z szkiełkiem. Dociśnij krawędzie bloku, a następnie umieść zespół PDMS szkiełka nakrywkowego na płycie grzejnej w temperaturze 115 stopni Celsjusza na 15 minut, aby wzmocnić trwałe połączenie. Na koniec włóż 10-centymetrowy wkład.

Rurka o średnicy wewnętrznej 0,25 milimetra do otworu wylotowego w górnej części bloku PDMS, aby umożliwić łatwy przepływ płynu z kanału. W przypadku eksperymentów z czynnikiem von Willebranda lub VWF wstrzyknąć do 10 mikrolitrów po 10 mikrogramów na mililitr BSA-Biotyny rozpuszczonej w sterylnym 1X PBS do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Po wstrzyknięciu należy wstrzymać kilka mikrolitrów BSA-Biotyny w końcówce pipety i pozostawić końcówkę do osadzenia we wlocie.

Pozostawić BSA-Biotynę do inkubacji w urządzeniu przez dwie godziny, co spowoduje, że BSA nie zwiąże się specyficznie z powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Następnie zdejmij końcówkę pipety i wstrzyknij do kanału do 10 mikrolitrów roztworu blokującego kazeinę. Pozostaw roztwór kazeiny do inkubacji przez 30 minut, aby mógł zablokować wszelkie wolne miejsca i zmniejszyć niespecyficzne wiązanie biomolekuł z powierzchnią.

Zdejmij końcówkę i wstrzyknij do 10 mikrolitrów streptawidyny w sterylnym PBS do kanału, który zwiąże się z grupami biotyny BSA-Biotyny. Następnie wstrzyknij do 10 mikrolitrów roztworu detergentu, aby zmyć nadmiar streptawidyny. Zdjąć końcówkę i wstrzyknąć VWF do roztworu kazeiny lub lambda DNA.

Inkubować VWF przez trzy minuty lub lambda DNA przez 45 minut. Następnie wstrzyknij pięć milimolowych wolnych biotyn, aby zablokować nadmiar miejsc wiązania streptawidyny. Załaduj jeden mililitr roztworu blokującego kazeinę do strzykawki i zabezpiecz go w pompie strzykawkowej.

Następnie przymocuj jeden koniec rurki do igły strzykawki i wlej roztwór, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Około trzy minuty po wstrzyknięciu wolnej biotyny przymocuj drugi koniec rurki do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Wybierz obiektyw o największym powiększeniu w mikroskopie TIRF lub konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym.

W razie potrzeby dodaj kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu tak, aby szkiełko nakrywkowe zlicowało się z obiektywem. Rozpocznij mikroskopię w jasnym polu i dostosuj ostrość tak, aby widoczne były takie elementy, jak zanieczyszczenia i pęcherzyki.

Następnie wyreguluj stolik w kierunkach X i Y, aż krawędź kanału mikroprzepływowego będzie widoczna i przetnie ramkę. Przełącz się na kanał FITC i dostosuj poziom Z i kąt TIRF zgodnie z potrzebami, aż będzie można rozróżnić poszczególne zielone cząsteczki kuliste. Dostosuj intensywność lasera i czas naświetlania, aby uwidocznić cząsteczki fluorescencyjne bez ich zbyt szybkiego fotowybielania.

Następnie dostosuj kontrast, aby lepiej uwidocznić cząsteczki. Dokładnie pięć minut po wstrzyknięciu wolnej biotyny rozpocznij i zatrzymaj przepływ z pompy strzykawkowej, aby obserwować zmiany w konformacji molekularnej przy natężeniu przepływu od 5000 do 30 000 mikrolitrów na godzinę. W przypadku VWF bardzo ważne jest, aby zastosować przynajmniej niewielką ilość przepływu, taką jak 30 sekund przepływu 10 000 mikrolitrów na godzinę dokładnie pięć minut po wstrzyknięciu wolnej biotyny.

Powtórz to w różnych obszarach urządzenia mikroprzepływowego i zlokalizuj cząsteczki, które mogą rozszerzać się i rozluźniać po wielu cyklach rozpoczynania i zatrzymywania przepływu. Zwróć uwagę, ile czasu potrzeba, aby cząsteczki osiągnęły maksymalną rozciągłość i całkowite rozluźnienie, i nagrywaj filmy przedstawiające ciągłe zachowanie cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego. Elastyczność cząsteczki w potwierdzaniu zmian jest często wykazywana przez jej zdolność do wydłużania się w miarę stosowania wyższych szybkości ścinania ze względu na rosnący przepływ.

Krzywa wydłużenia w funkcji szybkości ścinania cząsteczki czynnika von Willebranda jest przydatna do scharakteryzowania właściwości biomechanicznych białka. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej DNA lambda podobnie wykazują zwiększoną rozciągliwość przy wyższych szybkościach ścinania po 30 sekundach i stopniowej relaksacji przez ponad dwie minuty po zatrzymaniu przepływu. Podczas pracy z VWF należy pamiętać, aby inkubować go tylko przez trzy minuty i uwalniać biotynę przez pięć minut przed rozpoczęciem przepływu.

Ma to kluczowe znaczenie dla utworzenia optymalnej liczby wiązań biotyna-streptawidyna potrzebnych do odwracalnego rozplątania. Metodę tę można dostosować do wizualizacji interakcji w czasie rzeczywistym między wieloma biomolekułami i scharakteryzowania ich funkcji. Na przykład, można lepiej zrozumieć tworzenie czopów płytkowych, wizualizując VWF rozplątujący się pod wpływem wysokiego ścinania i jego wiązanie z cząsteczką adhezyjną płytek krwi GPIb-alfa za pomocą tej metody.