Name: Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj spektroskopię sił zespołowych do badania wiązań DNA z ligandami. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę rozkładania mechanicznego struktur biologicznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca badawcza była wspierana przez National Science Foundation [CBET-1904921] i National Institutes of Health [NIH R01CA236350] dla H. M.

UWAGA: Wszystkie bufory i odczynniki chemiczne użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie mikroskopu sił ścinania
UWAGA: Mikroskop siły ścinania składa się z dwóch części: jednostki reakcyjnej (homogenizatora) oraz jednostki detekcyjnej (mikroskopu fluorescencyjnego). Powiększenie okularu wynosi 10x, a powiększenie obiektywu (powietrznego) wynosi 4x.
<ol>
	<li>Zmontuj homogenizator i mikroskop na stole montażowym. Załóż okulary ochronne i włącz mikroskop fluorescencyjny, a następnie wyreguluj homogenizator, aby upewnić się, że wiązka światła wzbudzenia o odpowiedniej długości fali (w tym przypadku użyto 488 nm) przechodzi przez środek końcówki rozdrabniającej homogenizatora.</li>
	<li>Przygotuj płaskodenną komorę reakcyjną o wysokości 5 cm i przekroju 1,5 cm2 x 1,5 cm2. Aby zminimalizować tło, upewnij się, że wybrany materiał komory nie wykazuje fluorescencji, np. szkło (niektóre tworzywa sztuczne fluorescują).</li>
	<li>Wybierz odpowiednią końcówkę rozdrabniającą homogenizatora, która zapewni pożądaną siłę ścinania. 
	UWAGA: Szybkość ścinania zależy od odległości między rotorem a statorem przy stałej prędkości obrotowej11 zgodnie z poniższym równaniem: 
	<img alt="Równanie szybkości ścinania, μπ(D/(D-d)/2)V; wzór dynamiki płynów; użytek edukacyjny." src="/files/ftp_upload/63741/63741eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie µ to lepkość dynamiczna wody w 20 °C; D to średnica wewnętrzna statora; d to średnica zewnętrzna rotora, a V to prędkość ścinania (rpm/s).</li>
	<li>Zaciśnij komorę reakcyjną na stoliku przedmiotowym mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie ustaw komorę tak, aby pomieściła końcówkę rozdrabniającą homogenizatora (Rycina 1). Upewnij się, że końcówka rozdrabniająca znajduje się nieco powyżej (~1 mm) dna komory reakcyjnej.</li>
	<li>Wyreguluj wspólnie pionową pozycję homogenizatora i komory, aby upewnić się, że ostrość mikroskopu jest ustawiona na powierzchni końcówki rozdrabniającej. Następnie dostosuj poziomą pozycję końcówki rozdrabniającej tak, aby obszar detekcji (pole widzenia) znajdował się pomiędzy rotorem a statorem (Rycina 1).</li>
	<li>Włącz kanały fluorescencji zgodnie z barwnikiem fluorescencyjnym użytym w eksperymencie.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu z szybkim ścinaniem, użyj wody zdejonizowanej (DI), aby przetestować proces przy niskiej prędkości ścinania (np. 2 000 rpm), w celu upewnienia się, że końcówka rozdrabniająca pracuje prawidłowo i nie dotyka komory reakcyjnej.</li>
</ol>
2. Rozwijanie i-motywów z ligandami i bez ligandów
<ol>
	<li>Przygotować ludzkie telomerowe DNA i-motif (Tabela materiałów) w wodzie dejonizowanej (DI), odpowiednio znakowane barwnikiem i gasicielem na dwóch końcach, zgodnie z opisem w Hu et al.11. 
	UWAGA: sekwencja zawierająca i-motif: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA do stężenia 5 µM w buforze MES 30 mM o pH 5.5 lub pH 7.4. Do roztworu DNA dodać ligand L2H2-4OTD, zsyntetyzowany według Abraham Punnoose et al.13, w zakresie stężeń 0-60 µM. Delikatnie mieszać roztwór przez 10 min w ciemności, aby umożliwić sfałdowanie struktur i-motif.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego sprawdzić i zminimalizować intensywność fluorescencji tła w komorze reakcyjnej wypełnionej dejonizowaną wodą DI, bez nakładania ścinania. Prostym sposobem na zminimalizowanie fluorescencji tła jest przemycie komory reakcyjnej wodą DI. Wartość fluorescencji tła musi zostać odjęta podczas późniejszej analizy danych. 
	UWAGA: Od tego momentu należy unikać światła rozproszonego.</li>
	<li>Ustawić parametry kamery CCD za pomocą oprogramowania. Zalecane parametry są następujące: czas ekspozycji = 0.5 s, czułość CCD = 1600 oraz czas rejestracji = 20 min.</li>
	<li>Za pomocą długiej pipety wprowadzić roztwór DNA do pustej i czystej komory reakcyjnej. Przykryć komorę reakcyjną czarnym pudełkiem. Następnie uruchomić homogenizator, aby przeprowadzić ścinanie z wybraną szybkością ścinania w zakresie od 9 724 s−1 do 97 245 s−1 (wybranej za pomocą oprogramowania homogenizatora) przez 20 min, przy włączonej kamerze CCD w celu rejestracji danych.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu wyjąć komorę i przemyć ją wodą DI.</li>
</ol>
3. Reakcja klik wyzwalana siłą ścinania
<ol>
	<li>Przygotować i-motif DNA w wodziey destylowanej (DI). Inkubować 10 µM i-motif DNA w 300 µL buforu Tris 30 mM (pH 7,4) uzupełnionego o 150 µM CuCl oraz 300 µM kwasu askorbinowego przez 10 min w celu sfałdowania struktur i-motif (wszystkie stężenia są stężeniami końcowymi w roztworze). 
	UWAGA: CuCl jest katalizatorem reakcji click. Kwas askorbinowy zapobiega utlenianiu miedzi (I).</li>
	<li>Przefiltrować roztwór za pomocą urządzenia do ultrafiltracji przy sile odśrodkowej 14 300 x g. Po każdej filtracji uzupełnić objętość roztworu do ok. 500 µL za pomocą buforu Tris 30 mM (pH 7,4) uzupełnionego o 300 µM kwasu askorbinowego.</li>
	<li>Powtórzyć filtrację 3 razy.</li>
	<li>Zebrać pozostały roztwór i doprowadzić do końcowej objętości 300 µL, dodając Tris 30 mM (pH 7,4) uzupełniony o 300 µM kwasu askorbinowego wraz z 20 µM Calfluor 488 azide, 20 µM HPG oraz 10 µM TBTA. Po dodaniu odczynników przenieść roztwór do ciemni. 
	UWAGA: Po tym kroku należy unikać ekspozycji na światło.</li>
	<li>Przed eksperymentami z przeciąganiem sprawdzić i zminimalizować intensywność fluorescencji tła w komorze reakcyjnej wypełnionej wodą DI za pomocą mikroskopu. Prostym sposobem na zminimalizowanie fluorescencji tła jest przemycie komory reakcyjnej wodą DI.</li>
	<li>Wprowadzić roztwór DNA do pustej komory reakcyjnej za pomocą długiej pipety, a następnie rozpocząć przeciąganie homogenizatorem przy szybkości ścinania 63 209 s−1 przez 20 min przy włączonej kamerze CCD.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu wyjąć komorę i przemyć ją wodą DI.</li>
</ol>

<ol><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+Optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li>
<li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+strong+is+a+covalent+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li>
<li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li>
<li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026(2016).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li>
<li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility%3A+Force-induced+collagen+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li>
<li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li>
<li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells%3A+go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li>
<li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li>
<li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li>
<li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li>
<li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li>
<li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół opisany w tym manuskrypcie pozwala na badanie w czasie rzeczywistym rozwijania się zestawu struktur biomolekularnych za pomocą siły ścinającej. Przedstawione wyniki podkreślają, że struktury i-motif DNA mogą być rozwijane za pomocą siły ścinającej. Rozwinięcie i-motifu związanego z ligandem i reakcje kliknięcia wywołane siłą ścinającą były dowodami koncepcji dla tej metody spektroskopii sił zespołowych.
Rysunek 1 przedstawia konfigurację instrumentu. Końc...

W spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek1 (SMFS), właściwości mechaniczne poszczególnych struktur molekularnych zostały zbadane za pomocą zaawansowanych instrumentów, takich jak mikroskop sił atomowych, pęseta optyczna i pęseta magnetyczna2,3,4. Ograniczony przez ten sam wymóg kierunkowości cząsteczek w układach generujących/wykrywających siłę lub małe pole widzenia w pęsetach magnetycznych i miniaturowym mikroskopie siły wirówki (MCF)5,6,7,8, tylko ograniczona liczba cząsteczek może być badana jednocześnie za pomocą SMFS. Niska przepustowość SMFS uniemożliwia jego szerokie zastosowanie w dziedzinie rozpoznawania molekularnego, co wymaga zaangażowania dużego zestawu cząsteczek.
Przepływ ścinający stanowi potencjalne rozwiązanie do przyłożenia sił do ogromnego zestawu molekuł9. W przypadku przepływu cieczy wewnątrz kanału, im bliżej powierzchni kanału, tym wolniejsze natężenie przepływu10. Taki gradient prędkości przepływu powoduje naprężenie ścinające, które jest równoległe do powierzchni granicznej. Gdy cząsteczka jest umieszczana w tym przepływie ścinającym, cząsteczka zmienia orientację tak, że jej długa oś wyrównuje się z kierunkiem przepływu, ponieważ siła tnąca jest przykładana do długiej osi11. W wyniku tej reorientacji oczekuje się, że wszystkie cząsteczki tego samego typu (rozmiar i długość uchwytów) ustawią się w tym samym kierunku, doświadczając tej samej siły ścinającej.
Ta praca opisuje protokół użycia takiego przepływu ścinającego do wywierania siły ścinającej na masywny zestaw struktur molekularnych, czego przykładem jest motyw DNA i. W tym protokole generowany jest przepływ ścinający między wirnikiem a stojanem w końcówce homogenizatora. Niniejsze badanie wykazało, że pofałdowana struktura i-motif DNA może być rozwijana przez szybkość ścinania 9724-97245 s−1. Poza tym stwierdzono stałą dysocjacji wynoszącą 36 μM między ligandem L2H2-4OTD a i-motif. Wartość ta jest zgodna z wartością 31 μM zmierzoną za pomocą testu przesunięcia żelu12. Co więcej, obecna technika jest wykorzystywana do rozwijania motywu dwuteowego, który może wystawić chelatowaną miedź (I) w celu katalizowania reakcji kliknięcia. Protokół ten pozwala zatem na rozwinięcie dużego zestawu struktur i-motif za pomocą tanich instrumentów w rozsądnym czasie (krótszym niż 30 minut). Biorąc pod uwagę, że technika siły ścinającej drastycznie zwiększa przepustowość spektroskopii sił, nazywamy tę technikę zespołową spektroskopią sił (EFS). Protokół ten ma na celu dostarczenie wytycznych eksperymentalnych ułatwiających zastosowanie tego EFS opartego na sile ścinającej.

<table><tbody><tr><td>3K MWCO</td><td>Amicon Millipore Sigma</td><td>ufc900324</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>VWR</td><td>VWRC0143-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calfluor 488 azydek</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>1369-1</td><td></td></tr><tr><td>CuCl</td><td>Thermo&nbsp;</td><td></td><td></td>ACRO270525000</tr><tr><td>Końcówka dyspersyjna</td><td>Szwajcaria</td><td>PT-DA07/2EC-B101</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy DNA</td><td></td> IDT <td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik</td><td>IDT</td><td>/5Cy5</td><td></td></tr>/<tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Janpan</td><td>Nikon TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Szwajcaria</td><td>PT 3100D</td><td></td></tr><tr><td>HPG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>CS-295271</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26760.295</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>VWR</td><td>VWRCE169-500G</td><td></td></tr><tr><td>Quencher</td><td>IDT</td><td>/3IAbRQSp/</td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>T2993</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>VWRCE133-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Techniki jednocząsteczkowe oparte na zasadach fluorescencji i mechanochemii zapewniają najwyższą czułość w wykrywaniu biologicznym. Jednak ze względu na brak możliwości wysokiej przepustowości zastosowanie tych technik jest ograniczone w biofizyce. Spektroskopia sił zespołowych (EFS) wykazała wysoką przepustowość w badaniu ogromnego zestawu struktur molekularnych poprzez przekształcenie badań mechanochemicznych pojedynczych cząsteczek w badania zespołów molekularnych. W tym protokole drugorzędowe struktury DNA (i-motify) zostały rozwinięte w przepływie ścinającym między wirnikiem a stojanem końcówki homogenizatora z szybkością ścinania do 77796/s. Wykazano wpływ natężenia przepływu i wielkości cząsteczek na siły ścinające doświadczane przez i-motif. Technika EFS ujawniła również powinowactwo wiązania między i-motifami DNA a ligandami. Ponadto zademonstrowaliśmy reakcję chemiczną kliknięcia, która może być wywołana przez siłę ścinającą (tj. chemia mechano-klik). Wyniki te określają skuteczność wykorzystania siły ścinającej do kontrolowania konformacji struktur molekularnych.

Rysunek 1 przedstawia mechaniczne rozwijanie i detekcję w czasie rzeczywistym zespołów cząsteczek w EFS. Na Rysunku 1B zaobserwowano, że intensywność fluorescencji DNA i-motywu wzrastała wraz z prędkością ścinania w zakresie od 9 724 s−1 do 97 245 s−1 w buforze MES o pH 5,5. Jako kontrolę przeprowadzono badanie, w którym intensywność fluorescencji nie wzrosła podczas ścinania tego samego DNA i-motywu z prędkością 63 209 s<...

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Protokół ten zapewnia technikę o wysokiej przepustowości do badania międzycząsteczkowego wiązania między DNA a ligandami. Technika ta wykazała wysoką przepustowość w badaniu ogromnego zestawu struktur biomolekularnych. Odbywa się to poprzez przekształcanie mechanicznych właściwości chemicznych poszczególnych cząsteczek w właściwości zespołów molekularnych.Myślę, że jest to bardzo krok naprzód w eksperymencie, ale jest kilka krytycznych kroków. Na przykład wyrównanie mikroskopu, homogenizatora i rurki reakcyjnej. Te trzy rzeczy powinny być idealnie wyrównane, aby dokładnie śledzić zmianę fluorescencji.Zacznij od złożenia homogenizatora i mikroskopu na stole montażowym. Po założeniu gogli włącz mikroskop fluorescencyjny, a następnie wyreguluj homogenizator, aby upewnić się, że wiązka światła wzbudzającego przechodzi przez środek końcówki dyspergującej homogenizatora. Następnie przygotuj komorę reakcyjną z płaskim dnem o wysokości pięciu centymetrów i przekroju 1,5 na 1,5 centymetra kwadratowego, upewniając się, że wybrany materiał komory nie fluoryzuje w celu zmniejszenia tła.Następnie zacisnąć komorę reakcyjną na stoliku próbki mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie wyregulować komorę tak, aby utrzymywała końcówkę dyspergującą homogenizatora, upewniając się, że końcówka znajduje się nieco powyżej dolnej powierzchni komory reakcyjnej. Następnie wyreguluj pionowe położenie homogenizatora i komory, aby upewnić się, że ostrość mikroskopu znajduje się na powierzchni końcówki dyspergującej. Następnie wyreguluj poziome położenie końcówki dyspergującej, aby upewnić się, że obszar wykrywania jest ustawiony między wirnikiem a staterem.Włącz kanały fluorescencyjne, zgodnie z barwnikiem fluorescencyjnym użytym w eksperymencie. Przed eksperymentem ze ścinaniem z dużą prędkością użyto wody dejonizowanej do przetestowania ścinania przy niskiej prędkości ścinania. Najpierw przygotuj ludzki telomerowy motyw dwuteowy znakowany barwnikiem i wygaszaczem na jego dwóch końcach odpowiednio w wodzie dejonizowanej, jak opisano w manuskrypcie.Następnie rozcieńczyć DNA do pięciu mikromoli w 30-milimolowym buforze MES o pH 5,5 lub pH 7,4. Do roztworu DNA dodać ligand L2H24OTD" w zakresie stężeń od zera do 60 mikromolów i delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut, aby złożyć struktury i-motif bez światła. Sprawdź i zminimalizuj intensywność fluorescencji tła w komorze reakcyjnej wypełnionej wodą dejonizowaną za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego bez ścinania.Następnie ustaw parametry kamery CCD za pomocą oprogramowania z czasem naświetlania 0,5 sekundy, czułością CCD 1 600 i czasem nagrywania równym 20 minut. Za pomocą długiej pipety dodaj roztwór DNA do pustej i czystej komory reakcyjnej i przykryj komorę reakcyjną czarną skrzynką. Następnie uruchom homogenizator, aby wykonać ścinanie z wybraną szybkością ścinania w zakresie od 9 724 na sekundę do 97 245 na sekundę przez 20 minut, przy włączonej kamerze CCD w celu zarejestrowania danych.Po eksperymencie wyjmij komorę i umyj ją wodą dejonizowaną. Przygotuj i-motif DNA i wodę dejonizowaną. Następnie inkubuj 10 mikromolowych i-motif DNA i 300 mikrolitrów 30-milimolowego buforu tris uzupełnionego 150 mikromolowym chlorkiem miedzi i 300 mikromolowym kwasem askorbinowym przez 10 minut, aby złożyć struktury i-motif.Następnie ultra przefiltrować roztwór za pomocą urządzenia do ultrafiltracji przy sile odśrodkowej 14, 300 razy G. Uzupełnić roztwór do około 500 mikrolitrów 30 milimolowymi tris uzupełnionymi 300 mikromolowym kwasem askorbinowym po każdej filtracji. Po zebraniu pozostałego roztworu uzyskać końcową objętość 300 mikrolitrów, dodając 30 milimolowych trisów uzupełnionych 300 mikromolowym kwasem askorbinowym wraz z 20 mikromolowymi azydami CalFluor 488, 20 mikromolowymi HPG i 10 mikromolowymi TBTA. Po dodaniu odczynników przenieś roztwór do ciemnego pomieszczenia.Następnie przed eksperymentami ścinania należy sprawdzić i zminimalizować intensywność fluorescencji tła komory reakcyjnej wypełnionej wodą dejonizowaną. Następnie dodaj roztwór DNA do pustej komory reakcyjnej za pomocą długiej pipety, a następnie rozpocznij ścinanie homogenizatora z szybkością ścinania 63,209 na sekundę przez 20 minut przy włączonej kamerze CCD. Po eksperymencie wyjmij komorę i umyj ją wodą dejonizowaną.Zaobserwowano, że intensywność fluorescencji DNA z motywem dwubiegunowym wzrasta z samą szybkością od 9 724 na sekundę do 97 245 na sekundę w buforze MES o pH 5,5. Jednak intensywność fluorescencji nie zwiększała się, gdy ten sam DNA z motywem dwuteowym był ścinany z szybkością 63 209 na sekundę, ponieważ nie fałduje się przy pH 7,4 w buforze MES. Oceniono wiązanie ligandu z cząsteczkami i-motifu DNA poddanych czystemu przepływowi, co wykazało, że przyrost intensywności fluorescencji stawał się mniej oczywisty wraz ze wzrostem stężenia ligandów.Stała dysocjacji została określona dla interakcji między ligandem a i-motif i stwierdzono, że wynosi 34 mikromole. Miedziany chelatowany i-motif został rozłożony z szybkością ścinania 63,209 na sekundę, a uwolniony miedziany motyw wywołał fluorogenną reakcję kliknięcia, co z czasem spowodowało wzrost intensywności fluorescencji. Po pierwsze, upewnij się, że obszar wykrywania jest ustawiony między wirnikiem a staterem.Po drugie, sprawdź i zminimalizuj tło fluorescencji. I na koniec upewnij się, że przefiltrowałeś reakcję przed wykonaniem reakcji na kliknięcie. Ta metoda otwiera bramę do badania wytrzymałości mechanicznej, składania i rozkładania wszystkich rodzajów polimerów.Mogą to być inne struktury DNA, białka lub inne polimery i ich interakcja z innymi rodzajami cząsteczek. Jak wspomniano, przy użyciu tego podejścia można zbadać kilka innych makrocząsteczek.

ensemble-force-spectroscopy-by-shear-forces

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszym przedstawiamy przewodnik krok po kroku, prezentujący przeznaczenie, zasadę działania oraz reprezentatywne wyniki uzyskiwane za pomocą nowatorskiego spektrometru siły grawitacyjnej.

Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru siły oddziaływań między dobrze zdefiniowaną powierzchnią nieorganiczną a peptydami lub aminokwasami za pomocą pomiarów spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Informacje uzyskane z pomiaru są ważne dla lepszego zrozumienia interakcji peptyd-materiał nieorganiczny.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Poznaj spektroskopię sił zespołowych do badania wiązań DNA z ligandami. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę rozkładania mechanicznego struktur biologicznych w czasie rzeczywistym.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Przeglądaj więcej filmów