Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Protokół ten zapewnia technikę o wysokiej przepustowości do badania międzycząsteczkowego wiązania między DNA a ligandami. Technika ta wykazała wysoką przepustowość w badaniu ogromnego zestawu struktur biomolekularnych. Odbywa się to poprzez przekształcanie mechanicznych właściwości chemicznych poszczególnych cząsteczek w właściwości zespołów molekularnych.

Myślę, że jest to bardzo krok naprzód w eksperymencie, ale jest kilka krytycznych kroków. Na przykład wyrównanie mikroskopu, homogenizatora i rurki reakcyjnej. Te trzy rzeczy powinny być idealnie wyrównane, aby dokładnie śledzić zmianę fluorescencji.

Zacznij od złożenia homogenizatora i mikroskopu na stole montażowym. Po założeniu gogli włącz mikroskop fluorescencyjny, a następnie wyreguluj homogenizator, aby upewnić się, że wiązka światła wzbudzającego przechodzi przez środek końcówki dyspergującej homogenizatora. Następnie przygotuj komorę reakcyjną z płaskim dnem o wysokości pięciu centymetrów i przekroju 1,5 na 1,5 centymetra kwadratowego, upewniając się, że wybrany materiał komory nie fluoryzuje w celu zmniejszenia tła.

Następnie zacisnąć komorę reakcyjną na stoliku próbki mikroskopu fluorescencyjnego, a następnie wyregulować komorę tak, aby utrzymywała końcówkę dyspergującą homogenizatora, upewniając się, że końcówka znajduje się nieco powyżej dolnej powierzchni komory reakcyjnej. Następnie wyreguluj pionowe położenie homogenizatora i komory, aby upewnić się, że ostrość mikroskopu znajduje się na powierzchni końcówki dyspergującej. Następnie wyreguluj poziome położenie końcówki dyspergującej, aby upewnić się, że obszar wykrywania jest ustawiony między wirnikiem a staterem.

Włącz kanały fluorescencyjne, zgodnie z barwnikiem fluorescencyjnym użytym w eksperymencie. Przed eksperymentem ze ścinaniem z dużą prędkością użyto wody dejonizowanej do przetestowania ścinania przy niskiej prędkości ścinania. Najpierw przygotuj ludzki telomerowy motyw dwuteowy znakowany barwnikiem i wygaszaczem na jego dwóch końcach odpowiednio w wodzie dejonizowanej, jak opisano w manuskrypcie.

Następnie rozcieńczyć DNA do pięciu mikromoli w 30-milimolowym buforze MES o pH 5,5 lub pH 7,4. Do roztworu DNA dodać ligand L2H24OTD" w zakresie stężeń od zera do 60 mikromolów i delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut, aby złożyć struktury i-motif bez światła. Sprawdź i zminimalizuj intensywność fluorescencji tła w komorze reakcyjnej wypełnionej wodą dejonizowaną za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego bez ścinania.

Następnie ustaw parametry kamery CCD za pomocą oprogramowania z czasem naświetlania 0,5 sekundy, czułością CCD 1 600 i czasem nagrywania równym 20 minut. Za pomocą długiej pipety dodaj roztwór DNA do pustej i czystej komory reakcyjnej i przykryj komorę reakcyjną czarną skrzynką. Następnie uruchom homogenizator, aby wykonać ścinanie z wybraną szybkością ścinania w zakresie od 9 724 na sekundę do 97 245 na sekundę przez 20 minut, przy włączonej kamerze CCD w celu zarejestrowania danych.

Po eksperymencie wyjmij komorę i umyj ją wodą dejonizowaną. Przygotuj i-motif DNA i wodę dejonizowaną. Następnie inkubuj 10 mikromolowych i-motif DNA i 300 mikrolitrów 30-milimolowego buforu tris uzupełnionego 150 mikromolowym chlorkiem miedzi i 300 mikromolowym kwasem askorbinowym przez 10 minut, aby złożyć struktury i-motif.

Następnie ultra przefiltrować roztwór za pomocą urządzenia do ultrafiltracji przy sile odśrodkowej 14, 300 razy G. Uzupełnić roztwór do około 500 mikrolitrów 30 milimolowymi tris uzupełnionymi 300 mikromolowym kwasem askorbinowym po każdej filtracji. Po zebraniu pozostałego roztworu uzyskać końcową objętość 300 mikrolitrów, dodając 30 milimolowych trisów uzupełnionych 300 mikromolowym kwasem askorbinowym wraz z 20 mikromolowymi azydami CalFluor 488, 20 mikromolowymi HPG i 10 mikromolowymi TBTA. Po dodaniu odczynników przenieś roztwór do ciemnego pomieszczenia.

Następnie przed eksperymentami ścinania należy sprawdzić i zminimalizować intensywność fluorescencji tła komory reakcyjnej wypełnionej wodą dejonizowaną. Następnie dodaj roztwór DNA do pustej komory reakcyjnej za pomocą długiej pipety, a następnie rozpocznij ścinanie homogenizatora z szybkością ścinania 63,209 na sekundę przez 20 minut przy włączonej kamerze CCD. Po eksperymencie wyjmij komorę i umyj ją wodą dejonizowaną.

Zaobserwowano, że intensywność fluorescencji DNA z motywem dwubiegunowym wzrasta z samą szybkością od 9 724 na sekundę do 97 245 na sekundę w buforze MES o pH 5,5. Jednak intensywność fluorescencji nie zwiększała się, gdy ten sam DNA z motywem dwuteowym był ścinany z szybkością 63 209 na sekundę, ponieważ nie fałduje się przy pH 7,4 w buforze MES. Oceniono wiązanie ligandu z cząsteczkami i-motifu DNA poddanych czystemu przepływowi, co wykazało, że przyrost intensywności fluorescencji stawał się mniej oczywisty wraz ze wzrostem stężenia ligandów.

Stała dysocjacji została określona dla interakcji między ligandem a i-motif i stwierdzono, że wynosi 34 mikromole. Miedziany chelatowany i-motif został rozłożony z szybkością ścinania 63,209 na sekundę, a uwolniony miedziany motyw wywołał fluorogenną reakcję kliknięcia, co z czasem spowodowało wzrost intensywności fluorescencji. Po pierwsze, upewnij się, że obszar wykrywania jest ustawiony między wirnikiem a staterem.

Po drugie, sprawdź i zminimalizuj tło fluorescencji. I na koniec upewnij się, że przefiltrowałeś reakcję przed wykonaniem reakcji na kliknięcie. Ta metoda otwiera bramę do badania wytrzymałości mechanicznej, składania i rozkładania wszystkich rodzajów polimerów.

Mogą to być inne struktury DNA, białka lub inne polimery i ich interakcja z innymi rodzajami cząsteczek. Jak wspomniano, przy użyciu tego podejścia można zbadać kilka innych makrocząsteczek.