Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy
24 stycznia 2025
Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.
Jesteśmy zaangażowani w badanie mechanizmu fuzji błon wewnątrzkomórkowych. W tym protokole dążymy do uświadomienia sobie dynamiki konformacyjnej białka fuzyjnego błony retikulum endoplazmatycznego atlastyny podczas cyklu hydrolizy GTP za pomocą smFRET. Atlastyna może występować jako monomer lub dimer w cyklu hydrolizy GTP.
W eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami trudno jest znaleźć odpowiednie strategie znakowania i immobilizacji białek, a poniżej przedstawiono dynamikę konformacyjną atlastyny w całym cyklu hydrolizy GTP. W porównaniu z masowym FRET, smFRET może dokładnie monitorować konformacje białek w różnych stanach obciążenia nukleotydami, zapewniając w ten sposób bezpośredni wgląd w zachowanie cząsteczek modulatora. Użyliśmy smFRET, aby w pełni rozwiązać cykl hydrolizy GTP atlastyny podczas różnych strategii pozycji.
Wierzymy, że nasze odkrycia przyczynią się do zwiększenia dynamiki konformacyjnej w badaniu białek hydrolizy GTP i dostarczą nowych interpretacji rzadkich procesów biologicznych. Aby oczyścić powierzchnię szkiełka nakrywkowego, użyj pęsety, aby zebrać osiem szkiełek nakrywkowych i umieść je w słoiku do barwienia. Dodaj 50 mililitrów acetonu, aby przykryć szkiełka nakrywkowe i umieść słoik do barwienia w myjce ultradźwiękowej na 30 minut.
Szkiełka nakrywkowe należy trzykrotnie spłukać wodą podwójnie destylowaną i umyć metanolem w myjce ultradźwiękowej. Następnie dodaj roztwór piranii do słoika do barwienia i podgrzewaj go w czajniku do kąpieli wodnej w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po schłodzeniu słoika do temperatury pokojowej spłucz szkiełka nakrywkowe sześć razy wodą podwójnie destylowaną.
Dodaj roztwór mettlenku sodu do słoika do barwienia i umieść go w myjce ultradźwiękowej na 15 minut. Po spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą, dodaj podwójnie destylowaną wodę do słoika do barwienia i umieść ją w myjce ultradźwiękowej na 15 minut. Zacisnąć szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia i osuszyć je azotem.
Przełóż wysuszone szkiełka nakrywkowe do innego słoika do barwienia i piecz słoik w suszarce w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie schłodzić słoik do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodaj 47,5 mililitra metanolu, 2,5 mililitra kwasu octowego i 0,5 mililitra trietoksysilanu do zlewki i równomiernie wymieszaj.
Przenieś mieszaninę do słoika do barwienia i inkubuj przez 10 minut. Spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą w słoiku do barwienia i sonikuj przez pięć minut. Po spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą i wysuszeniu ich azotem, jak pokazano, umieść szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów.
Rozpuścić SVA-mPEG i SVA-mPEG-Biotyna w roztworze o wysokiej zawartości soli w stosunku 1:100. Upuść przygotowaną mieszankę na szkiełko nakrywkowe i przykryj je innym szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełka nakrywkowe w odpowiedniej wilgotności przez dwie godziny lub przez noc.
Po modyfikacji oddziel szkiełka nakrywkowe, spłucz je wodą dejonizowaną i wysusz suszarką azotem. Ostrożnie umieść zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe w 50-mililitrowej tubce. Po oczyszczeniu domeny GTPazy białka dynaminopodobnego atlastyny lub ATL ulegającego ekspresji w komórkach Rosetta E. coli, zmień bufor białkowy na bufor biotynylacji białek za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego.
W przypadku biotynylacji białek wymieszaj po 100 mikrolitrów 100-milimolowego ATP, 100-milimolowego octanu magnezu i 500-mikromolowej D-biotyny, 10 mikrolitrów 100-mikromolowej ligazy biotyny BirA i 50-mikromolowej białka do końcowej objętości jednego mililitra. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń wolną D-biotynę za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej.
Inkubować 20 mikrolitrów biotynylowanego białka z 20 mikrolitrami 15-mikromolowej streptawidyny przez 20 minut na lodzie. Wykryj skuteczność biotynylacji białek za pomocą SDS-PAGE. Rozpuść fluorofory LD555 i LD655 w dimetylosulfotlenku do końcowego stężenia pięciu milimolów.
Aby przygotować bufor do etykietowania, wymieszaj 25 milimolowych HEPES, 150 milimolowych chlorków potasu i pięć milimolowych chlorków magnezu. Zmień bufor białkowy na bufor znakujący za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego. W przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET należy zmieszać ATL1cyto-TK z LD555 i LD655 w stosunku 1:1,2:1,2 do końcowej objętości 100 mikrolitrów.
Inkubuj mieszaninę przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku międzycząsteczkowych testów smFRET inkubować ATL1cyto-K z LD555 i biotynylowany ATL1cyto-K z LD655 przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować komorę do immobilizacji białek, ostrożnie przyklej zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe i szkiełko mikroskopowe za pomocą dostosowanej taśmy dwustronnej.
Zainstaluj węże i końcówki, aby utworzyć komorę mikroprzepływową z sześcioma kanałami. W celu naniesienia poprawek mapowych dodaj 10 mikrolitrów 10% cząstek polistyrenu na szkiełko mikroskopowe i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem, wybierz pole view zawierające cząstki polistyrenu i nagraj wideo w trybie jasnego pola.
Użyj niestandardowego skryptu, aby wyrównać środkowe położenie tej samej cząstki polistyrenu zarówno w kanale dawcy, jak i akceptora. Zapisz plik mapy jako plik TXT. W przypadku międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET zmieszaj LD555 znakowaną ATL1cyto-K z LD655 znakowaną ATL1cyto-K-biotyną w stosunku jeden do jednego o końcowym stężeniu jednego milimola GTP-gamma-S.
Inkubuj mieszaninę na lodzie przez godzinę, aby dimeryzować białka. Wymieszaj LD555 znakowaną ATL1cyto-T z LD655 znakowaną ATL1cyto-K-biotyną w stosunku jeden do jednego z jednym milimolem GTP-gamma-S do międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET ATL1cyto-T i ATL1cyto-K. Inkubować mieszaninę na lodzie przez godzinę, aby uzyskać dimeryzowane białka.
Następnie, w przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET, inkubować LD555 i LD655 znakowane ATL1cyto-TK z jednym milimolem GDP na lodzie przez jedną godzinę. W przypadku eksperymentów międzycząsteczkowych inkubować 10 mikrogramów na mililitr streptawidyny przez 10 minut, aby unieruchomić białka. W przypadku testów wewnątrzcząsteczkowych dodaj 10 mikrogramów na mililitr biotynylowanego przeciwciała anty-He i inkubuj przez 10 minut w celu unieruchomienia białek.
Po inkubacji dodaj rozcieńczony dimer ATL1 do białka w kanale i pozwól mu unieruchomić się przez 10 minut. Przepłukać kanał dwukrotnie buforem inkubacyjnym. Dodaj kwas benzoesowy i PCD do kanału w końcowym stężeniu 2,5 milimola.
Wybierz laser o długości fali 532 nm jako źródło światła wzbudzenia. Ustaw kamerę EMCCD tak, aby rejestrowała dane w odstępie między klatkami wynoszącym 30 milisekund. Zapisz nagrane filmy w 16-bitowym formacie TIFF.
Po pozyskaniu danych wyodrębnij ścieżki FRET z nagranych filmów. Wybierz i zapisz ścieżki FRET w formacie TXT. Wyodrębnij dane z plików TXT i oblicz wartości FRET za pomocą domowych skryptów w MATLAB.
Dopasuj dane smFRET według GaussAmp w Origin, aby uzyskać histogram rozkładu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca naukowa bada dynamikę konformacyjną białka fuzji błony retikulum endoplazmatycznego atlastyny podczas cyklu hydrolizy GTP, wykorzystując pojedynczo-cząsteczkową rezonansową transfer energii (smFRET). Badanie podkreśla wyzwania związane z znakowaniem i immobilizacją białek w eksperymentach na pojedynczych cząsteczkach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuroscience
- Cell Biology
- Biophysics
Tło
- Białka superfamilii dynaminy są kluczowe dla fuzji błon.
- Atlastyna może występować w formie monomerowej lub dimerycznej podczas hydrolizy GTP.
- Pojedynczo-cząsteczkowy FRET dostarcza informacji na temat konformacji białek.
- Zrozumienie dynamiki atlastyny jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów fuzji błon.
Cel badania
- Zbadanie zmian konformacyjnych atlastyny podczas hydrolizy GTP.
- Wykorzystanie smFRET do monitorowania dynamiki białek w różnych stanach obciążenia nukleotydem.
- Rozwiązanie wyzwań związanych ze znakowaniem i immobilizacją białek w badaniach na pojedynczych cząsteczkach.
Wykorzystane metody
- Technika pojedynczo-cząsteczkowego FRET (smFRET).
- Strategie eksperymentalne dotyczące znakowania białek.
- Techniki immobilizacji do eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach.
- Analiza dynamiki cyklu hydrolizy GTP.
Główne wyniki
- smFRET skutecznie monitoruje konformacje atlastyny.
- Różne stany obciążenia nukleotydem wpływają na dynamikę atlastyny.
- Wyzwania związane ze znakowaniem i immobilizacją zostały rozwiązane.
- Uzyskano wgląd w cykl hydrolizy GTP atlastyny.
Wnioski
- smFRET jest potężnym narzędziem do badania dynamiki białek.
- Zrozumienie zmian konformacyjnych atlastyny pomaga w zrozumieniu mechanizmów fuzji błon.
- Przyszłe badania mogą bazować na tych wynikach, aby zbadać inne białka podobne do dynaminy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-molecule FRET (smFRET) imaging of atlastin provides direct, quantitative insight into the conformational dynamics underlying GTPase-driven membrane fusion, a process relevant to neurodegenerative disease mechanisms. This approach enables high-resolution interrogation of mechanochemical protein function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. The method's precision in monitoring nucleotide-dependent conformational states positions it as a reusable capability for biopharma discovery pipelines focused on membrane fusion and GTPase biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of conformational transitions in disease-relevant GTPases.
- Supports mechanistic de-risking by linking nucleotide state to structural dynamics.
- Facilitates functional target validation through real-time single-molecule analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage of membrane fusion targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule assays for quantitative conformational readouts.
- Enables reproducible measurement of protein dynamics under defined nucleotide states.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators or inhibitors.
- Provides a platform for scalable, high-content mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns conformational biomarkers with disease-relevant mechanistic endpoints.
- Ensures continuity from molecular discovery to preclinical validation of GTPase function.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative mechanistic evidence.
- Supports translational research into rare neurodegenerative disorders linked to atlastin dysfunction.
Pipeline & Workflow Integration
smFRET imaging of atlastin integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and translational research, enabling iterative hypothesis testing and functional validation.
- Discovery Biology: Provides quantitative evidence for conformational changes during GTP hydrolysis, clarifying mechanistic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET outputs for comparative analysis of nucleotide states and modulators.
- Analytics: Generates high-content single-molecule data for statistical comparison of protein conformations.
- Translational Research: Links molecular dynamics to disease-relevant phenotypes in neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform for studying other mechanochemical proteins beyond atlastin.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-molecule assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane fusion and GTPase-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence and protein biochemistry.
- Demands specialized instrumentation such as TIRF microscopy and EMCCD cameras.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of labeling and immobilization protocols.
- Adaptation to other mechanochemical proteins may require optimization of labeling strategies.
- Throughput and data analysis depend on robust computational infrastructure and custom scripts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Preparation and Modification of Coverslips for Protein Immobilization in Chambers
4:12
Protein Biotinylation and Fluorophore Labeling for Single-Molecule Frster Resonance Energy Transfer (smFRET) Assays
6:41
Single-Molecule FRET Imaging and Data Analysis for GTP Hydrolysis Cycle of Atlastin
