Name: Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę smFRET do badania dynamiki konformacyjnej atlastyny podczas cyklu hydrolizy GTP. Technika ta umożliwia precyzyjną obserwację zmian konformacyjnych białka błonowego ER.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

X.B. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32371287), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (63223043 i 63233053) oraz Projekt Szkolenia Talentów na Uniwersytecie Nankai (035-BB042112). Y.L. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (12022409 i T2221001) oraz Kluczowy Program Badawczy Nauk Granicznych CAS (ZDBS-LY-SLH015). L.M. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32271274 i 31770812).

Monitoring GTPase Atlastin in Different Nucleotide Loading States

<ol><li>Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins.</a> Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).</li>
<li>Kalia, R., Frost, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+and+cut%3A+Allosteric+motion+and+membrane+fission+by+dynamin+superfamily+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins.</a> Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).</li>
<li>Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamin superfamily.</a> Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).</li>
<li>Bryce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastin-3+is+a+constitutive+ER+membrane+fusion+catalyst%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst.</a> J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).</li>
<li>Crosby, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+human+atlastin+fusion+activity+reveals+autoinhibition+by+the+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus.</a> J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+dynamin-like+GTPases+involved+in+the+generation+of+the+tubular+er+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network.</a> Cell. 138 (3), 549-561 (2009).</li>
<li>Jang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atlastins+are+sufficient+to+drive+the+fusion+of+liposomes+with+a+physiological+lipid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition.</a> J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin-1+regulates+morphology+and+function+of+endoplasmic+reticulum+in+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites.</a> Nat Commun. 10 (1), 568(2019).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+gtpase+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin.</a> Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).</li>
<li>Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlastin+GTPases+are+required+for+Golgi+apparatus+and+er+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis.</a> Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).</li>
<li>Faust, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+C-terminal+tail+is+an+amphipathic+helix+that+perturbs+the+bilayer+structure+during+endoplasmic+reticulum+homotypic+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion.</a> J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).</li>
<li>Liu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+interaction+of+the+c+terminus+and+association+of+the+transmembrane+segments+facilitate+atlastin-mediated+homotypic+endoplasmic+reticulum+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).</li>
<li>Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+the+GTPase+atlastin+requires+a+conserved+c-terminal+cytoplasmic+tail+and+dimerization+through+the+middle+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).</li>
<li>Bian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+atlastin+GTpase+provide+insight+into+homotypic+fusion+of+endoplasmic+reticulum+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).</li>
<li>Byrnes, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+conformational+switching+and+GTP+loading+of+the+large+g+protein+atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin.</a> EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).</li>
<li>Byrnes, L. J., Sondermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+nucleotide-dependent+dimerization+of+the+large+g+protein+atlastin-1%2Fspg3a%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).</li>
<li>Morin-Leisk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intramolecular+salt+bridge+drives+the+soluble+domain+of+gtp-bound+atlastin+into+the+postfusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation.</a> J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).</li>
<li>Pendin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+packing+of+a+three-helix+bundle+is+required+for+atlastin-mediated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).</li>
<li>Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crossover+conformational+shift+of+the+GTPase+atlastin+provides+the+energy+driving+ER+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion.</a> J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+yeast+dynamin-like+GTPase+sey1p+provide+insight+into+homotypic+er+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion.</a> J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).</li>
<li>Rizo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release.</a> Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).</li>
<li>Gao, S., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion%3A+The+machineries+in+and+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion: The machineries in and out.</a> Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).</li>
<li>Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypervariable+region+of+atlastin-1+is+a+site+for+intrinsic+and+extrinsic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation.</a> J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).</li>
<li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR-mediated+beta-arrestin+activation+deconvoluted+with+single-molecule+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision.</a> Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+translocation+underlying+chromatin+remodelling+by+snf2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2.</a> Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+dynamin-like+MXA+revealed+by+single-molecule+fret%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret.</a> Nat Commun. 8, 15744(2017).</li>
<li>Shi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+mechanism+of+atlastin-mediated+homotypic+membrane+fusion+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level.</a> Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).</li>
<li>Guelly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+high-throughput+sequencing+identifies+mutations+in+atlastin-1+as+a+cause+of+hereditary+sensory+neuropathy+type+i%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i.</a> Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).</li>
<li>Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+CRISPR%2FCas9+induced+atlastin+pathological+mutations+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila.</a> Front Neurosci. 14, 547746(2020).</li>
<li>Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+network+formation+and+membrane+fusion+by+atlastin1%2Fspg3a+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+newly+identified+GTPase+gene+cause+autosomal+dominant+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia.</a> Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Technologia FRET opiera się na transferze energii pomiędzy dwoma barwnikami fluorescencyjnymi (donorem i akceptorem). W przypadku ich zbliżenia do siebie (zwykle 1-10 nm) wzbudzony donor przekazuje swoją energię do akceptora, co skutkuje spadkiem intensywności fluorescencji donora i wzrostem intensywności fluorescencji akceptora.
W eksperymentach smFRET cząsteczki są rozcieńczane do bardzo niskich stężeń i unieruchamiane na szkiełkach, a sygnały FRET poszczególnych cząsteczek są wykrywane za p...

W komórkach eukariotycznych białka nadrodziny dynamin pośredniczą w przebudowie błon biologicznych, w tym kanalikach błonowych, rozszczepieniu i fuzji1,2,3. Mutacje w tych białkach prowadzą do różnych chorób ludzkich, takich jak choroby neurodegeneracyjne. Członkowie nadrodziny dynamin zazwyczaj zawierają domenę GTPazy, domenę środkową składającą się z wiązek spiralnych, motyw wiązania błony i domenę efektorową GTPazy (GED). Jedną z takich dynaminopodobnych GTPazy jest atlastyna (ATL), która katalizuje homotypową fuzję błonową retikulum endoplazmatycznego (ER) w celu utworzenia sieci4,5,6,7,8,9,10. U ssaków występują trzy ATL (ATL1-3). Cząsteczka ATL składa się z N-końcowego regionu cytozolowego (cyto ATL), w tym domeny GTPazy i centralnej domeny o trzech helikach (3HB), po której następują dwa regiony transbłonowe, ale brakuje typowego GED. Alternatywnie, ATL zawiera ogon C-końcowy, który odgrywa kluczową rolę w fuzji membranowej11,12,13.
Stwierdzono, że efektywna fuzja membranowa opiera się na zależnym od hydrolizy GTP przegrupowaniu domeny w ATLcyto14,15,16,17,18,19,20. Jednak w porównaniu z kompleksem SNARE, który wykorzystuje energię fałdowania ze zmian konformacyjnych do napędzania heterotypowej fuzji błonowej21, homotypowy proces fuzji błonowej, w którym pośredniczy ATL i inne specyficzne dla fuzji białka podobne do dynaminy22 pozostaje nieuchwytny. Trzy struktury krystaliczne ludzkiegocyto ATL1 zostały określone w różnych warunkach obciążenia nukleotydami14,15,16,23. W strukturach te dwa 3HB w dimerze są skierowane w różnych kierunkach, ale nadal brakuje kompleksowego modelu wyjaśniającego, w jaki sposób dynamika konformacyjnacyto ATL i jego aktywność GTPazy są sprzężone.
W poprzednim modelu, monomeryczne cząsteczki ATL tworzą dimery na różnych błonach w sposób zależny od GTP, aby napędzać fuzję błonową. W tym miejscu opisano trzy strategie zastosowania jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu Förstera (smFRET) do bezpośredniej obserwacji i dokładnego wykrywania zachowania poszczególnych cząsteczekcyto ATL1. smFRET to potężna technika szeroko wykorzystywana do badania dynamiki konformacyjnej i interakcji poszczególnych biomolekuł w czasie rzeczywistym, takich jak aktywacja β-aresztyny za pośrednictwem GPCR24, przebudowa chromatyny przez Snf225 oraz rearanżacje domen białka podobnego do dynaminy MxA w połączeniu z cyklami hydrolizy GTP26. Ponieważ smFRET może skutecznie wykrywać zmiany odległości tylko od ~3 nm do ~8 nm, zarówno międzycząsteczkowe, jak i wewnątrzcząsteczkowe eksperymenty smFRET są wymagane do kompleksowej analizy konformacjicyto ATL1 dla każdego stanu obciążenia nukleotydami. Wygenerowano trzy konstruktycyto ATL1 ze wszystkimi natywnymi cysteinami podstawionymi alaninami i K400 (ATL1 cyto-K) lub parą T51 / K400 (ATL1 cyto-TK) zmutowaną do cysteiny w celu znakowania fluoroforu. Strategie unieruchamianiacyto dimeru lub monomeru ATL1 w komorze mikroprzepływowej pokrytej streptawidyną (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) dla międzycząsteczkowych lub wewnątrzcząsteczkowych eksperymentów smFRET są pokazane w <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B-D. Metoda ta dostarcza więcej szczegółów na temat dynamiki konformacyjnej białek podobnych do dynaminy na każdym etapie hydrolizy GTP27.

<table><tbody><tr><td>Filtry odśrodkowe 10 K Amicon</td><td></td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>45 Ti rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>532-nm</td><td>laser Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>640-nm</td><td>laser Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 K MWCO spinowe kolumny odsalające</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa adenozyno-5-trifosforanu (ATP)</td><td>Roche</td><td>11140965001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas benzoesowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242381</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td>170-124</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało anty He</td><td>Przeciwciała Bioss</td><td>Bs-0287R-bio</td><td></td></tr><tr><td>d-biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>IX897</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa 5&prime;-difosforanu guanozyny (GDP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; G7127</td><td></td></tr><tr><td>5'-O-[gamma-tio]trifosforan guanozyny (GTP&gamma; S)</td><td>Roche</td><td>10220647001</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze numerycznej</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon, 100x, NDA 1.49, zanurzenie w oleju</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.net/ij/</td></tr> <tr><td>Isopropyl-&Beta;-D-tiogalaktozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LD555-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne</td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy potas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat octanu magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Natick, MA</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu</td><td>Fisherbrand</td><td>18834</td><td>&nbsp;( 24 mm i razy; 60 mm)</td></tr> <tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td></td><td></td><td>Indywidualne, (75 mm & razy; 26 mm & razy; 1 mm) z 6 parami otworów przelotowych o średnicy 1,2 mm</td></tr><tr><td>mPEG-SVA-5000</td><td>Laysan Bio</td><td>170-106</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17531802</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> Origin <td>https://www.originlab.com/</td></tr> <tr><td>Cząstki polistyrenu</td><td>QDSphere</td><td>AG1265</td><td></td></tr><tr><td>Protokatechuat 3,4-dioksygenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610492</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Wzrost (10/300 GL)</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop TIRF</td><td>Nikon</td><td>Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Thermo</td><td>75259</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie pojedynczych cząsteczek fret do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny gtpazy podobnej do dynaminy

Single-Molecule FRET Imaging for Observing the Conformational Dynamics of Dynamin-Like GTPase Atlastin

Rotacja ciała sztywnego w centralnej domenie trójhelisowej (3HB) względem domeny GTPazy atlastyny białka podobnego do dynaminy (ATL) jest kluczowym czynnikiem powodującym homotypową fuzję błonową w retikulum endoplazmatycznym (ER). Zakłócenia w tym procesie są związane z dziedziczną paraplegią spastyczną (HSP), zaburzeniem neurodegeneracyjnym. Badania strukturalne i biochemiczne sugerują, że zmiany konformacyjne w ATL są związane z hydrolizą GTP, ale wizualizacja tej dynamiki konformacyjnej w czasie rzeczywistym podczas cyklu hydrolizy GTP pozostaje wyzwaniem. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy mechaniczne stojące za funkcją ATL, wykorzystano jednocząsteczkowy transfer energii rezonansu Förstera (smFRET). Zastosowano trzy specyficzne strategie w celu unieruchomienia N-końcowego regionu cytozolowego ludzkiego ATL1 (ATL1cyto) w komorze mikroprzepływowej pokrytej streptawidyną, ułatwiając zastosowanie wewnątrzcząsteczkowego i międzycząsteczkowego obrazowania smFRET. Umożliwiło to precyzyjne monitorowanie konformacji białek w różnych stanach obciążenia nukleotydami, zapewniając bezpośredni wgląd w indywidualne zachowania molekularne. Metoda ta może być również stosowana do badania innych białek mechanochemicznych.

Eksperymenty smFRET przeprowadzono na mikroskopie TIRF, rejestrując intensywność fluorescencji fluoroforów co 30 ms. Reprezentatywne obrazy cząsteczek ATL1cyto znakowanych LD555 (donor) i/lub LD655 (akceptor) w obecności lub przy braku różnych nukleotydów przedstawiono na Rysunku 2A-C. Zarejestrowano intensywności fluorescencji dwóch fluoroforów na pojedynczych cząsteczkach i wyekstrahowano setki trajektorii FRET wykazujących typowe cechy pojedync...

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

The rigid-body rotation of the three-helical middle domain (3HB) relative to the GTPase domain of dynamin-like protein atlastin (ATL) is a crucial driver ...

Jesteśmy zaangażowani w badanie mechanizmu fuzji błon wewnątrzkomórkowych. W tym protokole dążymy do uświadomienia sobie dynamiki konformacyjnej białka fuzyjnego błony retikulum endoplazmatycznego atlastyny podczas cyklu hydrolizy GTP za pomocą smFRET. Atlastyna może występować jako monomer lub dimer w cyklu hydrolizy GTP.W eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami trudno jest znaleźć odpowiednie strategie znakowania i immobilizacji białek, a poniżej przedstawiono dynamikę konformacyjną atlastyny w całym cyklu hydrolizy GTP. W porównaniu z masowym FRET, smFRET może dokładnie monitorować konformacje białek w różnych stanach obciążenia nukleotydami, zapewniając w ten sposób bezpośredni wgląd w zachowanie cząsteczek modulatora. Użyliśmy smFRET, aby w pełni rozwiązać cykl hydrolizy GTP atlastyny podczas różnych strategii pozycji.Wierzymy, że nasze odkrycia przyczynią się do zwiększenia dynamiki konformacyjnej w badaniu białek hydrolizy GTP i dostarczą nowych interpretacji rzadkich procesów biologicznych. Aby oczyścić powierzchnię szkiełka nakrywkowego, użyj pęsety, aby zebrać osiem szkiełek nakrywkowych i umieść je w słoiku do barwienia. Dodaj 50 mililitrów acetonu, aby przykryć szkie

single-molecule-fret-imaging-for-observing-conformational-dynamics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Zgłaszamy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, aby bezpośrednio zobrazować i określić ilościowo ruch fluorescencyjnie znakowanej, w pełni zrekonstytuowanej helikazy Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) na liniowych cząsteczkach DNA utrzymywanych w miejscu w pułapce optycznej.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę smFRET do badania dynamiki konformacyjnej atlastyny podczas cyklu hydrolizy GTP. Technika ta umożliwia precyzyjną obserwację zmian konformacyjnych białka błonowego ER.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Przeglądaj więcej filmów