Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Jesteśmy zaangażowani w badanie mechanizmu fuzji błon wewnątrzkomórkowych. W tym protokole dążymy do uświadomienia sobie dynamiki konformacyjnej białka fuzyjnego błony retikulum endoplazmatycznego atlastyny podczas cyklu hydrolizy GTP za pomocą smFRET. Atlastyna może występować jako monomer lub dimer w cyklu hydrolizy GTP.

W eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami trudno jest znaleźć odpowiednie strategie znakowania i immobilizacji białek, a poniżej przedstawiono dynamikę konformacyjną atlastyny w całym cyklu hydrolizy GTP. W porównaniu z masowym FRET, smFRET może dokładnie monitorować konformacje białek w różnych stanach obciążenia nukleotydami, zapewniając w ten sposób bezpośredni wgląd w zachowanie cząsteczek modulatora. Użyliśmy smFRET, aby w pełni rozwiązać cykl hydrolizy GTP atlastyny podczas różnych strategii pozycji.

Wierzymy, że nasze odkrycia przyczynią się do zwiększenia dynamiki konformacyjnej w badaniu białek hydrolizy GTP i dostarczą nowych interpretacji rzadkich procesów biologicznych. Aby oczyścić powierzchnię szkiełka nakrywkowego, użyj pęsety, aby zebrać osiem szkiełek nakrywkowych i umieść je w słoiku do barwienia. Dodaj 50 mililitrów acetonu, aby przykryć szkiełka nakrywkowe i umieść słoik do barwienia w myjce ultradźwiękowej na 30 minut.

Szkiełka nakrywkowe należy trzykrotnie spłukać wodą podwójnie destylowaną i umyć metanolem w myjce ultradźwiękowej. Następnie dodaj roztwór piranii do słoika do barwienia i podgrzewaj go w czajniku do kąpieli wodnej w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po schłodzeniu słoika do temperatury pokojowej spłucz szkiełka nakrywkowe sześć razy wodą podwójnie destylowaną.

Dodaj roztwór mettlenku sodu do słoika do barwienia i umieść go w myjce ultradźwiękowej na 15 minut. Po spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą, dodaj podwójnie destylowaną wodę do słoika do barwienia i umieść ją w myjce ultradźwiękowej na 15 minut. Zacisnąć szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia i osuszyć je azotem.

Przełóż wysuszone szkiełka nakrywkowe do innego słoika do barwienia i piecz słoik w suszarce w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie schłodzić słoik do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodaj 47,5 mililitra metanolu, 2,5 mililitra kwasu octowego i 0,5 mililitra trietoksysilanu do zlewki i równomiernie wymieszaj.

Przenieś mieszaninę do słoika do barwienia i inkubuj przez 10 minut. Spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą w słoiku do barwienia i sonikuj przez pięć minut. Po spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą i wysuszeniu ich azotem, jak pokazano, umieść szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów.

Rozpuścić SVA-mPEG i SVA-mPEG-Biotyna w roztworze o wysokiej zawartości soli w stosunku 1:100. Upuść przygotowaną mieszankę na szkiełko nakrywkowe i przykryj je innym szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełka nakrywkowe w odpowiedniej wilgotności przez dwie godziny lub przez noc.

Po modyfikacji oddziel szkiełka nakrywkowe, spłucz je wodą dejonizowaną i wysusz suszarką azotem. Ostrożnie umieść zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe w 50-mililitrowej tubce. Po oczyszczeniu domeny GTPazy białka dynaminopodobnego atlastyny lub ATL ulegającego ekspresji w komórkach Rosetta E. coli, zmień bufor białkowy na bufor biotynylacji białek za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego.

W przypadku biotynylacji białek wymieszaj po 100 mikrolitrów 100-milimolowego ATP, 100-milimolowego octanu magnezu i 500-mikromolowej D-biotyny, 10 mikrolitrów 100-mikromolowej ligazy biotyny BirA i 50-mikromolowej białka do końcowej objętości jednego mililitra. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń wolną D-biotynę za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej.

Inkubować 20 mikrolitrów biotynylowanego białka z 20 mikrolitrami 15-mikromolowej streptawidyny przez 20 minut na lodzie. Wykryj skuteczność biotynylacji białek za pomocą SDS-PAGE. Rozpuść fluorofory LD555 i LD655 w dimetylosulfotlenku do końcowego stężenia pięciu milimolów.

Aby przygotować bufor do etykietowania, wymieszaj 25 milimolowych HEPES, 150 milimolowych chlorków potasu i pięć milimolowych chlorków magnezu. Zmień bufor białkowy na bufor znakujący za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego. W przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET należy zmieszać ATL1cyto-TK z LD555 i LD655 w stosunku 1:1,2:1,2 do końcowej objętości 100 mikrolitrów.

Inkubuj mieszaninę przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku międzycząsteczkowych testów smFRET inkubować ATL1cyto-K z LD555 i biotynylowany ATL1cyto-K z LD655 przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować komorę do immobilizacji białek, ostrożnie przyklej zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe i szkiełko mikroskopowe za pomocą dostosowanej taśmy dwustronnej.

Zainstaluj węże i końcówki, aby utworzyć komorę mikroprzepływową z sześcioma kanałami. W celu naniesienia poprawek mapowych dodaj 10 mikrolitrów 10% cząstek polistyrenu na szkiełko mikroskopowe i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem, wybierz pole view zawierające cząstki polistyrenu i nagraj wideo w trybie jasnego pola.

Użyj niestandardowego skryptu, aby wyrównać środkowe położenie tej samej cząstki polistyrenu zarówno w kanale dawcy, jak i akceptora. Zapisz plik mapy jako plik TXT. W przypadku międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET zmieszaj LD555 znakowaną ATL1cyto-K z LD655 znakowaną ATL1cyto-K-biotyną w stosunku jeden do jednego o końcowym stężeniu jednego milimola GTP-gamma-S.

Inkubuj mieszaninę na lodzie przez godzinę, aby dimeryzować białka. Wymieszaj LD555 znakowaną ATL1cyto-T z LD655 znakowaną ATL1cyto-K-biotyną w stosunku jeden do jednego z jednym milimolem GTP-gamma-S do międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET ATL1cyto-T i ATL1cyto-K. Inkubować mieszaninę na lodzie przez godzinę, aby uzyskać dimeryzowane białka.

Następnie, w przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET, inkubować LD555 i LD655 znakowane ATL1cyto-TK z jednym milimolem GDP na lodzie przez jedną godzinę. W przypadku eksperymentów międzycząsteczkowych inkubować 10 mikrogramów na mililitr streptawidyny przez 10 minut, aby unieruchomić białka. W przypadku testów wewnątrzcząsteczkowych dodaj 10 mikrogramów na mililitr biotynylowanego przeciwciała anty-He i inkubuj przez 10 minut w celu unieruchomienia białek.

Po inkubacji dodaj rozcieńczony dimer ATL1 do białka w kanale i pozwól mu unieruchomić się przez 10 minut. Przepłukać kanał dwukrotnie buforem inkubacyjnym. Dodaj kwas benzoesowy i PCD do kanału w końcowym stężeniu 2,5 milimola.

Wybierz laser o długości fali 532 nm jako źródło światła wzbudzenia. Ustaw kamerę EMCCD tak, aby rejestrowała dane w odstępie między klatkami wynoszącym 30 milisekund. Zapisz nagrane filmy w 16-bitowym formacie TIFF.

Po pozyskaniu danych wyodrębnij ścieżki FRET z nagranych filmów. Wybierz i zapisz ścieżki FRET w formacie TXT. Wyodrębnij dane z plików TXT i oblicz wartości FRET za pomocą domowych skryptów w MATLAB.

Dopasuj dane smFRET według GaussAmp w Origin, aby uzyskać histogram rozkładu.