Name: Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Naucz się stabilnego knockdownu genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii mioblastów C2C12 przy użyciu shRNA. Ta metoda umożliwia badanie funkcji białek ECM podczas różnicowania mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.H. jest wspierany przez National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant numer AR070748) oraz fundusze zalążkowe z Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine w Mt. Sinai.

<ol><li>Tanzer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Science%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Orthopaedic+Association%22%5BJournal%5D)">Current concepts of extracellular matrix.</a> Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).</li>
<li>Hubmacher, D., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+the+extracellular+matrix%3A+novel+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The biology of the extracellular matrix: novel insights.</a> Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).</li>
<li>Sakai, L. Y., Keene, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillin+protein+pleiotropy%3A+Acromelic+dysplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias.</a> Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).</li>
<li>Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+The+driving+force+of+mammalian+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases.</a> Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).</li>
<li>Le Goff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTSL2+mutations+in+geleophysic+dysplasia+demonstrate+a+role+for+ADAMTS-like+proteins+in+TGF-beta+bioavailability+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation.</a> Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).</li>
<li>Dubail, J., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+ADAMTS+proteases+and+ADAMTS-like+proteins+from+mammalian+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics.</a> Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).</li>
<li>Koo, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAMTS-like+2+%28ADAMTSL2%29+is+a+secreted+glycoprotein+that+is+widely+expressed+during+mouse+embryogenesis+and+is+regulated+during+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis.</a> Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).</li>
<li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+serum+origin+on+tissue+engineered+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).</li>
<li>Bajaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+differentiation+of+C2C12+skeletal+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts.</a> Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).</li>
<li>Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Muscle+Stem+Cell+Niche+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease.</a> Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).</li>
<li>Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culturing%2C+and+Differentiation+of+Primary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice.</a> Bio-protocol. 7 (9), 2248(2017).</li>
<li>Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keep+Your+Friends+Close%3A+Cell-Cell+Contact+and+Skeletal+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298(2017).</li>
<li>Lawson, M. A., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+myoblasts+in+serum-free+media%3A+effects+of+modified+media+are+cell+line-specific%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific.</a> Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).</li>
<li>Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+serum-free+differentiation+conditions+for+C2C12+myoblast+cells+assessed+as+to+active+tension+generation+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).</li>
<li>Cheng, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+that+promote+primary+human+skeletal+myoblast+culture+and+muscle+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).</li>
<li>Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+produces+myogenesis+in+C2C12+myoblasts+by+induction+of+NF-kappaB+and+downregulation+of+AP-1+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities.</a> Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).</li>
<li>Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection+of+cultured+mouse+muscle+cells%3A+a+direct+comparison+of+Lipofectamine+and+DOSPER%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER.</a> Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).</li>
<li>Balcı, B., Dinçer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+mouse-derived+C2C12+myoblasts+using+a+matrigel+basement+membrane+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix.</a> Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).</li>
<li>Xia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+chemokine-like+factor+2+promotes+the+proliferation+and+survival+of+C2C12+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).</li>
<li>Tapia, O., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Nuclear+Lamina+Proteins+in+Myoblast+Differentiation+by+Functional+Complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).</li>
<li>Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transfection+efficiency+of+nonviral+gene+transfer+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents.</a> Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).</li>
<li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+in+vitro+gene+delivery+via+regulation+of+cellular+endocytosis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).</li>
<li>Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransfer+in+differentiated+myotubes%3A+a+novel%2C+efficient+procedure+for+functional+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer.</a> Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).</li>
<li>Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+potent+RNA+interference+in+terminally+differentiated+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).</li>
<li>Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+cultured+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of cultured myotubes.</a> Science's STKE. 2003 (192), 11(2003).</li>
<li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+Regulates+Skeletal+Muscle+Oxidative+Metabolism+Cooperatively+with+Alternative+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano tutaj protokół stabilnego knockdown białek ECM w mioblastach C2C12 oraz analizy fenotypowej różnicowania mioblastów C2C12 w miotuby. O wyniku eksperymentu decyduje kilka czynników, które należy dokładnie rozważyć. Utrzymanie komórek C2C12 w fazie proliferacji jest kluczowym krokiem do utrzymania komórek C2C12 w stanie prekursorowym mioblastów. Zachowanie zdolności komórek C2C12 do konsekwentnego różnicowania się w miotubki zależy od i) liczby pasaży komórek, ii) gęstości hodowanych komórek podczas rutynowej konse...

Białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zapewniają strukturalne wsparcie dla wszystkich tkanek, pośredniczą w komunikacji między komórkami i decydują o losie komórki. Tworzenie i dynamiczna przebudowa ECM ma zatem kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy tkanek i narządów1,2. Patologiczne warianty w kilku genach kodujących białka ECM powodują zaburzenia układu mięśniowo-szkieletowego o fenotypach od dystrofii mięśniowych do budowy rzekomej muśluzy3,4. Na przykład warianty patogenne w ADAMTSL2 powodować niezwykle rzadkie zaburzenie układu mięśniowo-szkieletowego dysplazję geleofizyjną, która objawia się budową pseudomięśniową, tj. pozornym wzrostem masy mięśni szkieletowych5. Wraz z danymi dotyczącymi ekspresji genów u myszy i ludzi sugeruje to rolę ADAMTSL2 w rozwoju mięśni szkieletowych lub homeostazie6,7.
Protokół, który tutaj opisujemy, został opracowany w celu zbadania mechanizmu, za pomocą którego ADAMTSL2 moduluje rozwój mięśni szkieletowych i/lub homeostazę w warunkach hodowli komórkowej. Stabilnie zniszczyliśmy ADAMTSL2 w mysiej linii komórkowej mioblastów C2C12. Mioblasty C2C12 i ich różnicowanie się w miotubki to dobrze opisany i szeroko stosowany model hodowli komórkowej do różnicowania mięśni szkieletowych i bioinżynierii mięśni szkieletowych8,9. Komórki C2C12 przechodzą przez wyraźne etapy różnicowania po odstawieniu surowicy, co powoduje tworzenie się wielojądrowych miotub po 3-10 dniach w hodowli. Te etapy różnicowania można niezawodnie monitorować, mierząc poziomy mRNA różnych genów markerowych, takich jak MyoD, miogenina lub miozyna łańcucha ciężkiego (MyHC). Jedną z zalet generowania stabilnych knockdownów genów w komórkach C2C12 jest to, że geny, które ulegają ekspresji na późniejszych etapach różnicowania C2C12, mogą być skuteczniej ukierunkowane, w porównaniu z przejściowym knockdownem osiąganym przez RNA o małych interferujących (si), który zwykle trwa przez 5-7 dni po transfekcji i zależy od wydajności transfekcji. Drugą zaletą opisanego tutaj protokołu jest stosunkowo szybkie generowanie partii komórek knockdown C2C12 przy użyciu selekcji puromycyny. Alternatywne rozwiązania, takie jak nokaut genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 lub izolacja pierwotnych prekursorów komórek mięśni szkieletowych od myszy ludzkich lub myszy z niedoborem genu docelowego, są technicznie trudniejsze lub wymagają dostępności biopsji mięśni pacjenta lub myszy z niedoborem genu docelowego. Jednak, podobnie jak w przypadku innych podejść opartych na hodowlach komórkowych, istnieją ograniczenia w stosowaniu komórek C2C12 jako modelu różnicowania komórek mięśni szkieletowych, takie jak dwuwymiarowy (2D) charakter hodowli komórkowej i brak mikrośrodowiska in vivo, które ma kluczowe znaczenie dla utrzymania niezróżnicowanych komórek prekursorowych mięśni szkieletowych10.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Chemical</td><td>191784</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countesse II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Odczynnik</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4205987</td><td></td></tr><tr><td>Komórki C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemical</td><td>183172</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMSO Fisher Bioreagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (stopień amplifikacji)</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>VWR Life Sciences</td><td>19C2656013</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszom (IRDYE 800CW)</td> <td>Li-Cor</td><td>C90130-02</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciwko myszom (rodamina-czerwień)</td> <td>Jackson Immune Research</td><td>133389</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (wytrząsarka)</td><td>Denville Scientific Corporation</td><td>1704N205BC105</td><td></td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Amresco, VWR Life Sciences</td><td>2707C122</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji plazmidu Midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Myosin 4 (łańcuch ciężki miozyny)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6503-82</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe</td><td>Invitrogen</td><td>2086310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Life Sciences</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>niejonowy środek powierzchniowo czynny/detergent</td><td>VWR Life Sciences</td><td>18D1856500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>MP</td><td>199983</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna Antybiotyki</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petridish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polipropylenowe</td><td>Fisherbrand</td><td>149569C</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowych</td><td>Roche</td><td>33576300</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>PCR (Real Time)</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4359284</td><td></td></tr><tr><td>reakcji </td><td>probówki Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transcription Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Thermo Scientific</td><td>TK274910</td><td></td></tr><tr><td>plazmid kontrolny sh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07201820MN</td><td></td></tr><tr><td>sh 3086 plazmid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092578</td><td></td></tr><tr><td>sh 972 plazmid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>TRCN0000092579</tr><tr><td>sh 1977 plazmid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092582</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr (Nanodrop)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One C</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Reagent Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>743566</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Acros Organics</td><td>30145369</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Ambion</td><td></td><td></td>254707</tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1421</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 0,25%</td> <td>Gibco-Life Technology Corporation</td><td>2085459</td><td></td></tr><tr><td>Woda (poddana działaniu DEPC i wolna od nukleaz)</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>186163</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do blottingu</td><td>Western Biorad</td><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1422</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów c2c12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)rna

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są kluczowe dla rozwoju mięśni szkieletowych i homeostazy. Stabilny knockdown genów kodujących białka ECM w mioblastach C2C12 może być zastosowany do badania roli tych białek w rozwoju mięśni szkieletowych. W tym miejscu opisujemy protokół zubożenia białka ECM ADAMTSL2 jako przykład, przy użyciu RNA o małych spinkach do włosów (sh) w komórkach C2C12. Po transfekcji plazmidów shRNA, stabilne komórki zostały wyselekcjonowane partiami przy użyciu puromycyny. Dalej opisujemy utrzymanie tych linii komórkowych i analizę fenotypową poprzez ekspresję mRNA, ekspresję białka i różnicowanie C2C12. Zaletami tej metody są stosunkowo szybkie generowanie stabilnych komórek knockdown C2C12 oraz niezawodne różnicowanie komórek C2C12 w wielojądrowe miotubki po wyczerpaniu surowicy w pożywce do hodowli komórkowej. Różnicowanie komórek C2C12 można monitorować za pomocą mikroskopii jasnego pola i pomiaru poziomów ekspresji kanonicznych genów markerowych, takich jak MyoD, miogenina lub łańcuch ciężki miozyny (MyHC), wskazujących na postęp różnicowania mioblastów C2C12 w miotubach. W przeciwieństwie do przejściowego knockdownu genów z małymi interferującymi (si) RNA, geny, które ulegają ekspresji później podczas różnicowania C2C12 lub podczas dojrzewania miotuby, mogą być skuteczniej ukierunkowane poprzez generowanie komórek C2C12, które stabilnie wyrażają shRNA. Ograniczeniami metody są zmienność skuteczności knockdownu, w zależności od konkretnego shRNA, które można przezwyciężyć za pomocą strategii nokautu genów opartych na CRISPR/Cas9, a także potencjalne skutki shRNA poza celem, które należy wziąć pod uwagę.

Selekcję linii C2C12 opornej na puromycynę można przeprowadzić w ciągu 10−14 dni po transfekcji dzięki wydajnej eliminacji komórek niewrażliwych, tj. nietransfekowanych (Rysunek 1B). Zazwyczaj ponad 80% komórek odkleja się od naczynia hodowlanego i są one usuwane podczas rutynowej pielęgnacji hodowli. Komórki C2C12 oporne na puromycynę, wykazujące ekspresję kontrolnego (scrambled) shRNA, zachowują wrzecionowaty, wydłużony kształt morfologiczny przy niskiej gęstości komórek o...

Dostarczamy protokół do stabilnego niszczenia genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w mioblastach C2C12 za pomocą małego spinki do włosów (sh) RNA. Na przykładzie ADAMTSL2 opisujemy metody walidacji skuteczności knockdown na poziomie mRNA, białka i komórki podczas różnicowania mioblastów C2C12 do miotub.

Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala nam badać funkcję białek, takich jak białka macierzy zewnątrzkomórkowej, które są regulowane w górę na późniejszych etapach tworzenia lub dojrzewania miotuby. Metoda ta może być wykorzystana do obalenia dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach C2C12 przy użyciu określonych shRNA i odpowiednich narzędzi analitycznych do fenotypowania. Główną zaletą tej metody jest to, że wygenerowaliśmy komórki C2C12, które mogą w sposób ciągły tłumić interesujące nas geny, nawet w dojrzałych miotubach.Najważniejszym aspektem tej procedury jest utrzymanie komórek C2C12 w stanie niezróżnicowanym, czyli przy niskiej gęstości komórek podczas rutynowej hodowli komórek. Dzień przed transfekcją wysiewaj pięć razy od 10 do czwartego C2C12 komórek na mililitr w dwóch mililitrach kompletnego DMEM na studzienkę na sześciodołkowej płytce, aby osiągnąć konfluencję od 40 do 50% po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego ranka połącz 100 mikrolitrów 25-milimolowego chlorku sodu w jednej 1,5-mililitrowej probówce reakcyjnej na kulturę z 25,5 mikrolitrami roztworu podstawowego PEI niezróżnicowanej hodowli komórkowej C2C12 na pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie połącz trzy mikrogramy plazmidowego DNA ze 100 mikrolitrami 25-milimolowego chlorku sodu na kulturę w celu pięciominutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji połączyć całą objętość każdego rozcieńczonego odczynnika PEI z każdym rozcieńczonym roztworem plazmidu z delikatnym pipetowaniem przez 25-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas inkubacji zastąpić supernatanty z kultur komórkowych C2C12 DMEM bez antybiotyków i surowicy.Pod koniec inkubacji dodać całą objętość każdej mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki w kropelkach, ciągle przesuwając szalkę do hodowli komórkowej. Po sześciu godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp pożywkę w każdym dołku kompletnym DMEM. 24 godziny po transfekcji zastąpić cały DMEM w każdym dołku pożywką selekcyjną uzupełnioną pięcioma mikrogramami na mililitr puromycyny i zwrócić komórki do inkubatora hodowli komórkowych na 10 do 14 dni lub do momentu zaobserwowania stabilnych komórek C2C12.Następnie rozszczep komórki C2C12 oporne na puromycynę w hodowlach o niskiej gęstości komórek w obecności pięciu mikrogramów na mililitr puromycyny i kriokonserwuj od sześciu do 10 fiolek komórek do wykorzystania w przyszłości. Aby przygotować komórki C2C12 do różnicowania, wysiewaj 1,5 razy 10 do piątych stabilnych komórek C2C12 odpornych na puromycynę w jednym mililitrze pożywki selekcyjnej na studzienkę na 12-dołkowej płytce i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż kultury będą w 95% zlewne. Aby wywołać różnicowanie, należy zastąpić pożywkę w każdym dołku DMEM bez surowicy co dwa dni po utworzeniu miorurki na odwróconym mikroskopie jasnego pola wyposażonym w kamerę.W celu barwienia immunologicznego łańcuchów ciężkich miozyny zróżnicowanych komórek, wysiewa się pięć razy 10 do czwartych komórek C2C12 opornych na puromycynę w 500 mikrolitrach kompletnego DMEM na komorę na szkiełko ośmiodołkowe i zwraca komórki do inkubatora hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną 95% konfluencji, zastąp pożywkę selekcyjną w każdym dołku 500 mikrolitrami DMEM bez surowicy. W odpowiednich punktach czasowych eksperymentu przepłukać komórki różnicujące w każdym dołku trzykrotnie 5 mililitrami PBS na przemycie, a następnie utrwalić komórki 200 mikrolitrami 4% paraformaldehydu w PBS na studzienkę.Po 15 minutach przemyć komórki trzykrotnie świeżym PBS na przemycie, jak właśnie wykazano, a następnie inkubować z 200 mikrolitrami 5-molowej glicyny w PBS na studzienkę przez pięć minut. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie przed przepuszczalnością komórek 200 mikrolitrami 1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS przez 10 minut. Następnie zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał za pomocą 200 mikrolitrów 5% albuminy surowicy bydlęcej w PBS na studzienkę przez jedną godzinę, a następnie trzy przemycia w PBS.Po ostatnim praniu oznacz komórki 200 mikrolitrami przeciwciała o ciężkim łańcuchu miozyny przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach PBS inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po trzech ostatnich płukaniach odessać PBS i zamontować komórki za pomocą jednej kropli podłoża montażowego uzupełnionego DAPI i szkiełkiem nakrywkowym.Następnie obserwuj każdą komorę pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiedniego zestawu filtrów. Aby ocenić skuteczność knockdown w hodowlach komórkowych za pomocą western blot, najpierw wysiewaj trzy razy 10 do piątych komórek C2C12 odpornych na puromycynę w dwóch mililitrach kompletnego DMEM na studzienkę na płytce sześciodołkowej. Po 24 godzinach przepłukać kultury PBS i zainicjować różnicowanie komórek za pomocą dwóch mililitrów DMEM bez surowicy, jak pokazano.W celu analizy wydzielanych białek w odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych, należy zebrać jeden mililitr kondycjonowanej pożywki bez surowicy z każdej studzienki do oddzielnych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych w celu odwirowania. Po odwirowaniu przenieś jeden mililitr kondycjonowanych supernatantów pożywki do nowych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych i wytrącić białka 391 mikrolitrami kwasu trichlorooctowego w niejonowym środku powierzchniowo czynnym na probówkę. Po 30 sekundach wirowania inkubuj mieszaniny na lodzie przez 10 minut.Pod koniec inkubacji osadzać wytrącone białka przez odwirowanie i trzykrotnie przemyć granulki białka świeżym, lodowatym acetonem i odwirować raz na przemycie. Po ostatnim praniu wysuszyć granulki na powietrzu przez trzy do czterech minut w temperaturze pokojowej przed ponownym zawieszeniem w 50 mikrolitrach buforu do próbek SDS-PAGE na probówkę. Następnie gotuj próbki przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza przed analizą western blot zgodnie ze standardowymi protokołami.W przypadku analizy białek wewnątrzkomórkowych i błonowych, przepłucz warstwę komórkową w każdym dołku dwoma mililitrami PBS na studzienkę i użyj skrobaka do komórek, aby ostrożnie usunąć komórki w jednomililitrowych objętościach PBS. Przenieś komórki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek w celu odwirowania, a następnie trzech płukań po jednym mililitrze PBS na probówkę na płukanie przez wirowanie. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś granulki komórek w 200 mikrolitrach buforu do lizy uzupełnionego odczynnikiem koktajlowym inhibitorów proteazy bez EDTA na 30-minutową inkubację na lodzie.Pod koniec inkubacji należy przeprowadzić ultradźwięki próbek przez 15 sekund na lodzie z ustawieniem mocy wyjściowej 10 przy częstotliwości roboczej 23 kiloherców i usunąć resztki komórek przez odwirowanie. Przenieś supernatanty do nowych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych i oznacz stężenia białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Połączyć 100 mikrogramów białka z buforem do próbek 5X SDS-PAGE w łącznej objętości 60 mikrolitrów na próbkę i gotować próbki przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Następnie przeanalizuj próbki za pomocą western blot pod kątem obecności pożądanego białka docelowego. Selekcja komórek C2C12 opornych na puromycynę może być osiągnięta w ciągu 10 do 14 dni od transfekcji dzięki skutecznej eliminacji komórek nieopornych. Zazwyczaj w tym czasie ponad 80% komórek C2C12 odłącza się od naczynia do hodowli komórkowej i jest usuwanych podczas rutynowej konserwacji komórek.Komórki C2C12 oporne na puromycynę, wyrażające kontrolę lub ADAMTSL2 shRNA, zachowują swoją wrzecionowatą, wydłużoną morfologię komórek przy niskiej gęstości komórek, a także zdolność do różnicowania się w miotuby. Różnicowanie C2C12 po odstawieniu surowicy można monitorować za pomocą mikroskopii w jasnym polu i barwienia immunologicznego dla markera miozyny łańcucha ciężkiego miotuby. Miorurki z dodatnimi łańcuchami ciężkimi miozyny obserwuje się od trzech do pięciu dni po zainicjowaniu różnicowania i są wielojądrowe, co obserwuje się przez obecność więcej niż jednego jądra DAPI-dodatniego w granicach komórki.Jak pokazują dane dotyczące ekspresji genów w warunkach proliferacji, skuteczność knockdown transfekcji wynosi od 40 do 60% Analizę Western blot można przeprowadzić, aby potwierdzić sukces knockdownu w lizatach komórkowych uzyskanych, na przykład, z komórek C2C12 stabilnie eksprymujących shRNA, które celują w ADAMTSL2 w porównaniu z komórkami kontrolnymi eksprymującymi shRNA. Upewnij się, że stężenie puromycyny podczas procesu selekcji jest wystarczająco wysokie, aby wyeliminować wszystkie nietransfekowane komórki C2C12, w przeciwnym razie nietransfekowane komórki mogą wyrosnąć z transfekowanych komórek. Ten test pozwala nam określić funkcję białek macierzy zewnątrzkomórkowej, które ulegają ekspresji w późniejszym etapie rozwoju mięśni, nawet jeśli są indukowane pięć lub 10 dni po różnicowaniu C2C12.Należy pamiętać, że odczynnik do ekstrakcji RNA i beta-merkaptoetanol należy obchodzić się z kwasem wyciągowym i obchodzić się z kwasem trichlorooctowym zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.

stable-knockdown-genes-encoding-extracellular-matrix-proteins-c2c12

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zmierzono wkład czynnika przebudowy chromatyny ACF w indukowaną przez E4orf4 śmierć komórek. Protokół obejmuje selekcję klonów komórkowych, w których traktowanie doksycykliną indukuje warunkowy knockdown podjednostek ACF: Acf1 i SNF2h, oraz zastosowanie testu z DAPI do pomiaru indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek w indukowalnych liniach komórkowych.

Przygotowanie linii komórkowych do warunkowego wyciszenia ekspresji genu i pomiar efektów wyciszenia w odniesieniu do indukowanej przez E4orf4 śmierci komórek

W tym filmie demonstrujemy metodę przeprowadzania transdukcji wektorów lentiwirusowych shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown w unieśmiertelnionych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (iHSPC).

Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Szybki i prosty sposób na wygenerowanie ludzkich linii komórkowych z indukowalną i odwracalną nadekspresją cDNA lub nokautem za pośrednictwem shRNA interesującego genu. Metoda ta umożliwia naukowcom wiarygodne i wysoce powtarzalne manipulowanie liniami komórkowymi, które są trudne do zmiany za pomocą przejściowych metod transfekcji lub konwencjonalnych strategii knockdown/knockout.

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

Wyciszanie genów przez siRNA stanowi wygodną strategię eksperymentalną do analizy funkcji biologicznych zależnych od BRCA2 z natychmiastowymi implikacjami dla lepszego zrozumienia biologii raka. Przedstawiono metodę skutecznego wyciszania BRCA2 wraz z eksperymentalną procedurą wykrywania i ilościowego określania zmian w ekspresji białka BRCA2 poprzez immunoblotting w ludzkich liniach komórkowych.

Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich

W tym protokole przedstawiamy procedury tworzenia modeli mioblastów dystrofii 1 dyotonii, w tym zoptymalizowane utrzymanie komórek C2C12, transfekcję/transdukcję genów i różnicowanie miocytów.

Modelowanie dystrofii miotonicznej 1 w komórkach mioblastów C2C12

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

Opisujemy metodę in vivo do badania funkcjonalnej utraty określonego genu w komórkach satelitarnych za pomocą kombinacji uszkodzenia mięśni szkieletowych za pośrednictwem kardiotoksyny i wstrzyknięcia samodostarczającego siRNA.

Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

W obecnym badaniu, wyrażenie dwóch dalszych komponentów sygnalizacyjnych szlaku PINK, cytoprotekcyjnej kalcyneuryny i proapoptotycznego CHOP, za pomocą specyficznych shRNA. W przeciwny sposób modulują one podatność pierwotnych neuronów korowych na atrofię neurytów po indukcji stresu retikulum endoplazmatycznego.

Modulacja molekularna przez specyficzne shRNA dostarczane przez lentiwirusa w neuronach zestresowanych retikulum endoplazmatycznym

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Protokół opisuje, jak generować nokautujące mioblasty za pomocą CRISPR/Cas9, zaczynając od projektowania przewodników RNA, aż po klonowanie komórkowe i charakterystykę klonów nokautujących.

Rozwój nokautujących linii komórkowych mięśni przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Naucz się stabilnego knockdownu genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii mioblastów C2C12 przy użyciu shRNA. Ta metoda umożliwia badanie funkcji białek ECM podczas różnicowania mięśni.

Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA (Wideo) | JoVE Journal

Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA

Przeglądaj więcej filmów