Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala nam badać funkcję białek, takich jak białka macierzy zewnątrzkomórkowej, które są regulowane w górę na późniejszych etapach tworzenia lub dojrzewania miotuby. Metoda ta może być wykorzystana do obalenia dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach C2C12 przy użyciu określonych shRNA i odpowiednich narzędzi analitycznych do fenotypowania. Główną zaletą tej metody jest to, że wygenerowaliśmy komórki C2C12, które mogą w sposób ciągły tłumić interesujące nas geny, nawet w dojrzałych miotubach.

Najważniejszym aspektem tej procedury jest utrzymanie komórek C2C12 w stanie niezróżnicowanym, czyli przy niskiej gęstości komórek podczas rutynowej hodowli komórek. Dzień przed transfekcją wysiewaj pięć razy od 10 do czwartego C2C12 komórek na mililitr w dwóch mililitrach kompletnego DMEM na studzienkę na sześciodołkowej płytce, aby osiągnąć konfluencję od 40 do 50% po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego ranka połącz 100 mikrolitrów 25-milimolowego chlorku sodu w jednej 1,5-mililitrowej probówce reakcyjnej na kulturę z 25,5 mikrolitrami roztworu podstawowego PEI niezróżnicowanej hodowli komórkowej C2C12 na pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie połącz trzy mikrogramy plazmidowego DNA ze 100 mikrolitrami 25-milimolowego chlorku sodu na kulturę w celu pięciominutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji połączyć całą objętość każdego rozcieńczonego odczynnika PEI z każdym rozcieńczonym roztworem plazmidu z delikatnym pipetowaniem przez 25-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas inkubacji zastąpić supernatanty z kultur komórkowych C2C12 DMEM bez antybiotyków i surowicy.

Pod koniec inkubacji dodać całą objętość każdej mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki w kropelkach, ciągle przesuwając szalkę do hodowli komórkowej. Po sześciu godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp pożywkę w każdym dołku kompletnym DMEM. 24 godziny po transfekcji zastąpić cały DMEM w każdym dołku pożywką selekcyjną uzupełnioną pięcioma mikrogramami na mililitr puromycyny i zwrócić komórki do inkubatora hodowli komórkowych na 10 do 14 dni lub do momentu zaobserwowania stabilnych komórek C2C12.

Następnie rozszczep komórki C2C12 oporne na puromycynę w hodowlach o niskiej gęstości komórek w obecności pięciu mikrogramów na mililitr puromycyny i kriokonserwuj od sześciu do 10 fiolek komórek do wykorzystania w przyszłości. Aby przygotować komórki C2C12 do różnicowania, wysiewaj 1,5 razy 10 do piątych stabilnych komórek C2C12 odpornych na puromycynę w jednym mililitrze pożywki selekcyjnej na studzienkę na 12-dołkowej płytce i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż kultury będą w 95% zlewne. Aby wywołać różnicowanie, należy zastąpić pożywkę w każdym dołku DMEM bez surowicy co dwa dni po utworzeniu miorurki na odwróconym mikroskopie jasnego pola wyposażonym w kamerę.

W celu barwienia immunologicznego łańcuchów ciężkich miozyny zróżnicowanych komórek, wysiewa się pięć razy 10 do czwartych komórek C2C12 opornych na puromycynę w 500 mikrolitrach kompletnego DMEM na komorę na szkiełko ośmiodołkowe i zwraca komórki do inkubatora hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną 95% konfluencji, zastąp pożywkę selekcyjną w każdym dołku 500 mikrolitrami DMEM bez surowicy. W odpowiednich punktach czasowych eksperymentu przepłukać komórki różnicujące w każdym dołku trzykrotnie 5 mililitrami PBS na przemycie, a następnie utrwalić komórki 200 mikrolitrami 4% paraformaldehydu w PBS na studzienkę.

Po 15 minutach przemyć komórki trzykrotnie świeżym PBS na przemycie, jak właśnie wykazano, a następnie inkubować z 200 mikrolitrami 5-molowej glicyny w PBS na studzienkę przez pięć minut. Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie przed przepuszczalnością komórek 200 mikrolitrami 1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS przez 10 minut. Następnie zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał za pomocą 200 mikrolitrów 5% albuminy surowicy bydlęcej w PBS na studzienkę przez jedną godzinę, a następnie trzy przemycia w PBS.

Po ostatnim praniu oznacz komórki 200 mikrolitrami przeciwciała o ciężkim łańcuchu miozyny przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach PBS inkubować komórki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po trzech ostatnich płukaniach odessać PBS i zamontować komórki za pomocą jednej kropli podłoża montażowego uzupełnionego DAPI i szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie obserwuj każdą komorę pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiedniego zestawu filtrów. Aby ocenić skuteczność knockdown w hodowlach komórkowych za pomocą western blot, najpierw wysiewaj trzy razy 10 do piątych komórek C2C12 odpornych na puromycynę w dwóch mililitrach kompletnego DMEM na studzienkę na płytce sześciodołkowej. Po 24 godzinach przepłukać kultury PBS i zainicjować różnicowanie komórek za pomocą dwóch mililitrów DMEM bez surowicy, jak pokazano.

W celu analizy wydzielanych białek w odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych, należy zebrać jeden mililitr kondycjonowanej pożywki bez surowicy z każdej studzienki do oddzielnych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych w celu odwirowania. Po odwirowaniu przenieś jeden mililitr kondycjonowanych supernatantów pożywki do nowych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych i wytrącić białka 391 mikrolitrami kwasu trichlorooctowego w niejonowym środku powierzchniowo czynnym na probówkę. Po 30 sekundach wirowania inkubuj mieszaniny na lodzie przez 10 minut.

Pod koniec inkubacji osadzać wytrącone białka przez odwirowanie i trzykrotnie przemyć granulki białka świeżym, lodowatym acetonem i odwirować raz na przemycie. Po ostatnim praniu wysuszyć granulki na powietrzu przez trzy do czterech minut w temperaturze pokojowej przed ponownym zawieszeniem w 50 mikrolitrach buforu do próbek SDS-PAGE na probówkę. Następnie gotuj próbki przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza przed analizą western blot zgodnie ze standardowymi protokołami.

W przypadku analizy białek wewnątrzkomórkowych i błonowych, przepłucz warstwę komórkową w każdym dołku dwoma mililitrami PBS na studzienkę i użyj skrobaka do komórek, aby ostrożnie usunąć komórki w jednomililitrowych objętościach PBS. Przenieś komórki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek w celu odwirowania, a następnie trzech płukań po jednym mililitrze PBS na probówkę na płukanie przez wirowanie. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś granulki komórek w 200 mikrolitrach buforu do lizy uzupełnionego odczynnikiem koktajlowym inhibitorów proteazy bez EDTA na 30-minutową inkubację na lodzie.

Pod koniec inkubacji należy przeprowadzić ultradźwięki próbek przez 15 sekund na lodzie z ustawieniem mocy wyjściowej 10 przy częstotliwości roboczej 23 kiloherców i usunąć resztki komórek przez odwirowanie. Przenieś supernatanty do nowych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych i oznacz stężenia białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Połączyć 100 mikrogramów białka z buforem do próbek 5X SDS-PAGE w łącznej objętości 60 mikrolitrów na próbkę i gotować próbki przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Następnie przeanalizuj próbki za pomocą western blot pod kątem obecności pożądanego białka docelowego. Selekcja komórek C2C12 opornych na puromycynę może być osiągnięta w ciągu 10 do 14 dni od transfekcji dzięki skutecznej eliminacji komórek nieopornych. Zazwyczaj w tym czasie ponad 80% komórek C2C12 odłącza się od naczynia do hodowli komórkowej i jest usuwanych podczas rutynowej konserwacji komórek.

Komórki C2C12 oporne na puromycynę, wyrażające kontrolę lub ADAMTSL2 shRNA, zachowują swoją wrzecionowatą, wydłużoną morfologię komórek przy niskiej gęstości komórek, a także zdolność do różnicowania się w miotuby. Różnicowanie C2C12 po odstawieniu surowicy można monitorować za pomocą mikroskopii w jasnym polu i barwienia immunologicznego dla markera miozyny łańcucha ciężkiego miotuby. Miorurki z dodatnimi łańcuchami ciężkimi miozyny obserwuje się od trzech do pięciu dni po zainicjowaniu różnicowania i są wielojądrowe, co obserwuje się przez obecność więcej niż jednego jądra DAPI-dodatniego w granicach komórki.

Jak pokazują dane dotyczące ekspresji genów w warunkach proliferacji, skuteczność knockdown transfekcji wynosi od 40 do 60% Analizę Western blot można przeprowadzić, aby potwierdzić sukces knockdownu w lizatach komórkowych uzyskanych, na przykład, z komórek C2C12 stabilnie eksprymujących shRNA, które celują w ADAMTSL2 w porównaniu z komórkami kontrolnymi eksprymującymi shRNA. Upewnij się, że stężenie puromycyny podczas procesu selekcji jest wystarczająco wysokie, aby wyeliminować wszystkie nietransfekowane komórki C2C12, w przeciwnym razie nietransfekowane komórki mogą wyrosnąć z transfekowanych komórek. Ten test pozwala nam określić funkcję białek macierzy zewnątrzkomórkowej, które ulegają ekspresji w późniejszym etapie rozwoju mięśni, nawet jeśli są indukowane pięć lub 10 dni po różnicowaniu C2C12.

Należy pamiętać, że odczynnik do ekstrakcji RNA i beta-merkaptoetanol należy obchodzić się z kwasem wyciągowym i obchodzić się z kwasem trichlorooctowym zgodnie z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.