Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Protokół ten pozwala na wyprowadzenie neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Komórki te umożliwią naukowcowi badanie zaburzeń u ludzi, które wpływają na współczulny układ nerwowy. Technika ta pozwala na wyprowadzenie neuronów współczulnych w warunkach spotkania podzielonego bez zasilacza z wysoką skalowalną wydajnością.

Powoduje to powstanie elektrycznie aktywnych neuronów w ciągu 20 dni. Technika ta może być stosowana w chorobach spowodowanych dysfunkcyjnym współczulnym układem nerwowym, może być również stosowana do modelowania chorób, medycyny regeneracyjnej i badań przesiewowych leków. Komórki te mogą być wykorzystywane in vitro do wprowadzania innowacji w dowolnej tkance w systemie kohodowli, na przykład do badania regulacji tkanki serca.

Gdy ludzka hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych osiągnie 80 do 90% konfluencji, należy zaobserwować duże kolonie z gładkimi, jasnymi krawędziami. W celu rozszczepienia przemyj kulturę PBS przed potraktowaniem komórek czterema mililitrami 0,25 molowego EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po dwóch minutach przepłukać płytkę 10 mililitrami pożywki E8 i przenieść odłączoną zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie przenieś 500 mikrolitrów komórek do 9,5 mililitrowej porcji świeżej pożywki E8. I umieść komórki macierzyste na nowych 100-milimetrowych szalkach pokrytych witronektyną. Na dzień przed indukcją różnicowania pokryj odpowiednią liczbę sześciu płytek dołkowych dwoma mililitrami matrycy membrany podstawnej na studzienkę.

I przechowuj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka podgrzej płytki do temperatury pokojowej i umyj gotową do podziału hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych dwa razy świeżym PBS na mycie. Po drugim myciu potraktuj komórki siedmioma mililitrami 0,5 milimolowego EDTA przez 15 minut w inkubatorze hodowli komórkowych przed aspiracją pływających ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przeniesieniem pobranych komórek do 50-mililitrowej probówki.

Dodać równą objętość PBS do probówki, aby rozcieńczyć EDTA i zebrać komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki różnicującej dnia 01 przed dodaniem odpowiedniej objętości pożywki do rozliczenia. Rozcieńczyć komórki do stężenia 1,25 razy 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy w mililitrach pożywki różnicującej na studzienkę.

Odessać cały roztwór matrycy błony podstawnej z każdej studzienki uprzednio przygotowanej płytki z sześcioma dołkami. Następnie zasiew dwa mililitry komórek do każdej studzienki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka nakarm komórki trzema mililitrami pożywki różnicującej dnia 01 na dołek.

W drugim dniu różnicowania nakarm komórki trzema mililitrami pożywki różnicującej z dnia drugiego do 10 na dołek, a następnie karm komórki co drugi dzień do 10 dnia. Aby zagregować komórki grzebienia nerwowego w sferoidy, w 10 dniu umyj komórki PBS. I dodaj dwa mililitry pożywki dysocjacyjnej do każdej studzienki.

Po 20 minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych przenieś pływające komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i doprowadź objętość zawiesiny w probówce do 50 mililitrów świeżym PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie. I ponownie zawiesić osad w wystarczającej objętości 10 do 14 dni sferoidalnego podłoża do liczenia.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do stężenia pięć razy od 10 do piątego na 500 mikrolitrów, używając pożywki sferoidalnej dnia 10 do 14. I umieść 500 mikrolitrów komórek w każdym dołku 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

Aby wywołać minimalną hodowlę sferoidów, w 11 dniu hodowli nakarm sferoidy grzebienia nerwowego dodatkowymi 500 mikrolitrami pożywki sferoidalnej z dnia 10 do 14 na studzienkę. W dniu 12 przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy po jednej stronie płytki. I ostrożnie odessaj jak najwięcej pożywki z każdej studzienki bez zasysania sferoid.

Następnie nakarm sferoidy jednym mililitrem pożywki sferoidalnej z dnia 10 do 14 na studzienkę. Aby wywołać rozszerzoną hodowlę sferoidów, w dniu 15 nakarm sferoidy 1,5 mililitra sferoidalnego podłoża dnia 10 do 14 uzupełnionego 0,5 mikromolowym kwasem retinowym na studzienkę. Następnie włóż sferoidy z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

W celu różnicowania neuronów współczulnych, w 14 lub 28 dniu przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy po jednej stronie płytki i ostrożnie zassać jak najwięcej pożywki. Nakarm komórki jednym mililitrem pożywki dla neuronów współczulnych. Aby rozbić duże skupiska sferoid na mniejsze sferoidy, dodaj nie więcej niż jeden mililitr pożywki na dołek i pipetuj sferoidy pięć do 10 razy przed rozdzieleniem.

I usuń nadmiar fibronektyny z lamininą z wcześniej przygotowanych płytek 24-dołkowych. Podzielić płytkę na jeden mililitr sferoid z każdej studzienki na 24-dołkowej płytce do hodowli sferoidalnej między czterema oddzielnymi dołkami nowej powlekanej płytki 24-dołkowej. Dodaj 250 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów współczulnych do każdej studzienki.

I umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp pożywkę w każdej studzience jednym mililitrem pożywki dla neuronów współczulnych uzupełnionej 0,125 mikromolowym kwasem retinowym i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 35 dniach nakarm neurony, ostrożnie zastępując tylko połowę istniejącej pożywki w każdej studzience świeżą pożywką.

Przed różnicowaniem ludzkie pluripotencjalne kolonie komórek macierzystych powinny być okrągłe z błyszczącymi, gładkimi krawędziami i niewielkim lub zerowym zróżnicowaniem. Komórki wyrażają marker grzebienia nerwowego Sox10 od czwartego do dziesiątego dnia. Komórki grzebienia nerwowego pojawiają się w gęstych, pociemniałych grzbietach, które są widoczne od szóstego dnia.

Te grzbiety wyrażają również Sox10. Na etapie komórek grzebienia nerwowego Sox10 koreluje ze znacznikiem powierzchni komórki CD49D, który można wykorzystać do sortowania komórek grzebienia nerwowego. Populacje posortowane i nieposortowane wytworzyły sferoidy grzebieni nerwowych w podobny sposób.

Podczas gdy ujemnie posortowane komórki nie agregują prawidłowo, nie wytwarzają okrągłych, gładkich, zdrowo wyglądających sferoid i umierają w ciągu trzech do czterech dni. Ponadto, gdy porównuje się sferoidy grzebienia nerwowego w dniu 14, ilościową PCR z odwrotną transkryptazą dla markerów grzebienia nerwowego i progenitorów nerwu współczulnego, nie można wykryć znaczących różnic między posortowanymi i nieposortowanymi komórkami. W 20 lub 35 dniu, zgodnie z odpowiednimi minimalnymi lub rozszerzonymi protokołami, neuroidy rosną w promienisty wzór z przyczepionych sferoid.

Na tym etapie ulegają ekspresji markery związane z syntezą i transportem noradrenaliny, a także Hox6 za pośrednictwem dziewięciu genów grzebienia nerwowego tułowia. Zapis elektrofizjologiczny wykrywa również aktywność neuronalną od 20 dnia. Taka aktywność może być wzmacniana lub tłumiona przez leki, które celują w autoreceptory neuronów współczulnych, dostosowując funkcjonalność zróżnicowanych neuronów.

Sam ludzki orędownik musi być zdrowy od zerowego dnia różnicowania, w przeciwnym razie eksperyment prawdopodobnie się nie powiedzie. Inhibitory lub aktywatory farmakologiczne można dodawać do neuronów, aby zrozumieć ich normalne lub patologiczne zachowanie. Metoda ta otwiera nową drogę do badania biologii i patologii współczulnej, ponieważ obecnie możliwe jest łatwe pobieranie biopsji neuronów współczulnych od ludzi.