Name: Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj protokół różnicowania neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach bez karmienia. Ta metoda umożliwia generowanie elektrycznie aktywnych neuronów w ciągu 20 dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Heidi Ulrichs za krytyczne przeczytanie i zredagowanie rękopisu.

<ol><li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia%3A+History%2C+genotype%2C+phenotype+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li>
<li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li>
<li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+denervation+predicts+PD+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals.</a> Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).</li>
<li>Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+renal+sympathetic+denervation%3A+2013+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond.</a> Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).</li>
<li>Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Anatomy%2C+Physiology%2C+and+Pharmacology+of+the+Autonomic+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System.</a> Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+NM+%22The+Neural+Crest%22">The Neural Crest</a>. , Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Simões-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+neural+crest+development+and+evolution+from+genomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis.</a> Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).</li>
<li>Labosky, P. A., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winged+helix+transcription+factor+Hfh2+is+expressed+in+neural+crest+and+spinal+cord+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).</li>
<li>Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+Promotes+the+Expansion+of+Dorsal+Neural+Progenitors+in+Spinal+Cord+by+Inhibiting+Neuronal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation.</a> Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).</li>
<li>Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP%2C+Wnt+and+FGF+signals+are+integrated+through+evolutionarily+conserved+enhancers+to+achieve+robust+expression+of+Pax3+and+Zic+genes+at+the+zebrafish+neural+plate+border%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border.</a> Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).</li>
<li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth%2C+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li>
<li>Guillemot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+achaete-scute+homolog+1+is+required+for+the+early+development+of+olfactory+and+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons.</a> Cell. 75 (3), 463-476 (1993).</li>
<li>Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeobox+gene+Phox2b+is+essential+for+the+development+of+autonomic+neural+crest+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives.</a> Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).</li>
<li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insm1+%28IA-1%29+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrainor%2C+P+%22Neural+Crest+Cells%3A+Evolution%2C+Development+and+Disease%22">Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+perspectives+on+differentiation+of+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons.</a> Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).</li>
<li>Zeltner, N., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+disease+modeling%3A+current+hurdles+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise.</a> Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).</li>
<li>Oh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Coupling+with+Cardiac+Muscle+Promotes+Maturation+of+hPSC-Derived+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).</li>
<li>Frith, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+axial+progenitors+generate+trunk+neural+crest+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).</li>
<li>Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Methods+to+Differentiate+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).</li>
<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li>
<li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+systems+in+stress%3A+structural+and+molecular+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Review%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li>
<li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling%2C+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Autonomic+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li>
<li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Neurophotonics%3B+Neural+Imaging+and+Sensing%3B+and+Optogenetics+and+Optical+Manipulation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niedawno opublikowaliśmy dwa przeglądy, z których jeden omawia zastosowanie symN pochodzących z hPSC do modelowania choroby31 , a także dogłębne porównanie dostępnych protokołów różnicowania22. Dlatego tutaj skupiamy się na rozwiązywaniu problemów z obecnym protokołem, aby pomóc zainteresowanemu badaczowi odnieść sukces w tworzeniu symN. Podczas całego procesu różnicowania, w celu uzyskania spójnych danych, a także zdrowych zróżnicowanych komórek, zanieczyszczenie na wszyst...

Postganglioniczne neurony współczulne (symNs) należą do autonomicznego układu nerwowego (ANS) i pełnią wiele ważnych ról w reagowaniu i regulowaniu homeostazy ciała niezależnie od świadomości. Na przykład stres stymuluje symN i wywołuje reakcję walki lub ucieczki, która prowadzi do wzrostu częstości akcji serca, ciśnienia krwi i pocenia się. SymN są dotknięte wieloma zaburzeniami u ludzi z powodu genetyki, toksyczności/urazu lub jako towarzysze innych chorób. Przykładem neuropatii genetycznej jest zaburzenie rodzinne w dzieciństwie (FD), w którym ciężka dysregulacja symN powoduje kryzys dysautonomiczny, objawiający się poceniem się, plamami na skórze, atakami wymiotów, nadciśnieniem i lękiem1. Przykładem toksyczności jest chemioterapia, która według doniesień ma toksyczne skutki uboczne na neurony autonomiczne2. Wiadomo, że autonomiczne odnerwienie i nadunerwienie mogą prowadzić do chorób takich jak choroba Parkinsona lub nadciśnieniowa choroba nerek lub im towarzyszyć3,4. W związku z tym możliwość prowadzenia badań i zrozumienia mechanizmów biologii symN i defektów w kontekście choroby jest korzystna dla poszukiwania nowych i skutecznych metod leczenia.
Anatomia 
Obwodowy układ nerwowy rozgałęzia się na podziały czuciowe i autonomiczne. Nerwy doprowadzające czuciowego układu nerwowego są odpowiedzialne za odczuwanie bólu i dotyku, podczas gdy ANS jest odpowiedzialny za przekazywanie informacji ze wszystkich narządów do mózgu. ANS dzieli się na jelitowy układ nerwowy, unerwienie przewodu pokarmowego, przywspółczulny układ nerwowy, który jest ważny dla relaksacji, oraz współczulny układ nerwowy (SNS), który jest ważny dla aktywacji/regulacji narządów. SNS adaptuje system dwuneuronowy5. Przedzwojowe współczulne aksony nerwowe w rdzeniu kręgowym najpierw rzutują do zwojów współczulnych, gdzie znajdują się zazwojowe ciała komórek symN. Neurony te następnie wysyłają długie projekcje, aby unerwić tkanki docelowe każdego narządu w ciele. Sygnały przekazywane przez neurony przedzwojowe są cholinergiczne, podczas gdy objawy pozwojowe są adrenergiczne, a zatem wyrażają noradrenalinę (NE) jako główny neuroprzekaźnik. Istnieje kilka godnych uwagi wyjątków od neuronów zazwojowych, współczulnych, które są cholinergiczne, w tym te unerwiające naczynia krwionośne. Neurony zazwojowe adrenergiczne wyrażają enzymy hydroksylazę tyrozyny (TH), dekarboksylazę L-aminokwasów aromatycznych (AAAD), dopaminę β-hydroksylazę (DBH) i oksydazę monoaminową (MAO-A), wszystkie odpowiedzialne za wytwarzanie i metabolizowanie NE. Ponadto wykazują ekspresję transporterów i/lub receptorów recyklingu NE: receptora α-adrenergicznego (ADRA2), receptora β-adrenergicznego (ADR2B), transportera noradrenaliny (NET1) i pęcherzykowego transportera monoamin (VMAT1/2).
Rozwój 
Podczas rozwoju embrionalnego symN pochodzą z grzebienia nerwowego (NC), który wyłania się między cewą nerwową a nakładającą się ektodermą6 i może różnicować się w wiele linii komórkowych, w tym melanocyty, osteoblasty, adipocyty, glej, neurony jelitowe, neurony czuciowe i neurony autonomiczne7. Komórki grzebienia nerwowego (NCC) są komórkami silnie migrującymi, które pokonują kilka tras przez zarodek. Na tym wczesnym etapie rozwoju NC komórki wyrażają markery SNAIL1/2, FOXD3 i SOX108,9,10,11. Trasa migracji wraz z przyjętym przez nie położeniem osiowym określa podtyp NC, w który będą się rozwijać. Te podtypy NC można rozróżnić na podstawie specyficznej ekspresji genu HOX: NCC czaszkowe nie wyrażają genów HOX, NCC nerwu błędnego wyrażają HOX 1-5, NCC tułowia wyrażają HOX 6-9, a NCC krzyżowe wyrażają HOX 10-1112. Wśród nich NCC tułowia są uznawane za główne źródło symN. Prekursory SymN wyrażają czynnik transkrypcyjny MASH1/ASCL113, który promuje ekspresję PHOX2B14 i INSM115. Rodzina czynników transkrypcyjnych GATA ulega ekspresji podczas późnego rozwoju współczulnego. GATA2 i GATA3 są wyrażane w symN, co z kolei aktywuje DBH16. Czynnik transkrypcyjny HAND2 jest również ważny dla ekspresji i utrzymania DBH i TH17.
HPSC (np. embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) są potężnym narzędziem18 do podsumowania paradygmatów rozwojowych i generowania symN, które mogą być następnie wykorzystane do modelowania chorób różnych zaburzeń u ludzi. W związku z tym, podczas generowania symN z hPSC, kluczowe znaczenie ma przestrzeganie wytycznych rozwojowych i ocena ekspresji odpowiednich markerów w procesie różnicowania.
Poprzedni protokół symN 
Kilka grup badawczych wcześniej zgłosiło generowanie symN z hPSCs19,20,21. Bezpośrednie porównanie tych protokołów ze sobą i z naszymi zostało niedawno przejrzane22. W 201623 opublikowaliśmy protokół różnicowania do generowania autonomicznych neuronów o charakterze symN (Rysunek 1A). W protokole tym wykorzystano pożywkę opartą na KSR, która była wykorzystywana zarówno do utrzymywania niezróżnicowanych hPSC, jak i różnicowania komórek. Ponadto hPSC utrzymywano na mysich fibroblastach embrionalnych (komórkach żywiciela MEF). Zastosowaliśmy ten protokół i PSC od pacjentów z FD do modelowania zaburzenia23. W 2019 roku opisaliśmy bardziej szczegółową wersję tego starszego protokołu24. Podsumowując, los neuronalny został wywołany przez podwójne hamowanie SMAD25 w celu zablokowania sygnalizacji TGF-β i BMP w ciągu pierwszych 2 dni. Aktywacja WNT za pomocą CHIR99021 promowała neuronalne komórki progenitorowe, aby stały się komórkami NC. W dniu 11 komórki zostały posortowane według FACS dla populacji CD49D+ lub SOX10+26,23, co dało około 40% wydajności generowania NC. W związku z tym konieczne było sortowanie, aby zapewnić wydajność i czystość dla kolejnych etapów różnicowania. NCC utrzymywano i amplifikowano jako sferoidy z połączonym traktowaniem FGF2 i CHIR. Po 4 dniach sferoidy NC utrzymania zostały posiane i podano BDNF, GDNF i NGF, aby zakończyć dojrzewanie symN. Chociaż te symN wyrażały silne markery symN, takie jak ASCL1, TH, DBH i PHOX2A, markery bardziej dojrzałych symN, w tym ekspresja nikotynowego receptora acetylocholiny (CHRNA3 / CHRNB4) i transportera pęcherzyków (VMAT1 / 2), były niskie nawet po 70 dniach różnicowania. Geny HOX w tym protokole nie zostały formalnie przebadane, a właściwości dojrzałych neuronów, w tym aktywność elektrofizjologiczna komórek, nie zostały zweryfikowane.
Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do generowania symN (Rysunek 1B). HPSC są utrzymywane w warunkach wolnych od podajnika, na szalkach pokrytych witronektyną (VTN), przy użyciu pożywki Essential 8 (E8) 27. Wzór podłoża różnicującego był modyfikowany na każdym etapie, zwiększając w ten sposób odsetek populacji NC28. Dojrzewanie symN można przeprowadzić na posortowanych lub niesortowanych masowych populacjach NCC CD49D+/SOX10+. Oba wykazują wysoki poziom ekspresji markera symN do 30 dnia. Co więcej, symN generowane za pomocą tego protokołu reagują na zapis elektrofizjologiczny oraz na leczenie związkami aktywującymi i hamującymi symN.

<table><tbody><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowe probówki do hodowli tkankowych</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki o bardzo niskim mocowaniu</td> Inkubator kultur tkankowych <td>Corning</td><td>07 200 601 i 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>5% CO2/20% O2</td><td>Thermo Fisher/Life Technologie</td><td>Heracell VIOS 160i</td> 50 ml stożkowe probówki do hodowli <td></td></tr><tr><td>tkankowych</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovation Technologie komórkowe</td><td>AT104500</td><td>Roztwór do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-AP2a</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie</td></tr> <tr><td>1:400Przeciwciało anty-Ascl1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556604</td><td>Gospodarz: mysz IgG1; Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD49D</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>Gospodarz: Mysz IgG1; 5 &mu; l / milion komórek w 100 &mu; l objętość</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-CD49D (izotyp)</td><td>BioLegend</td><td>400125</td><td>Gospodarz: mysz IgG1; 5 &mu; l / milion komórek w 100 &mu; l objętość</td></tr><tr><td>barwnika DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-DBH</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>Gospodarz: Kurczak; Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-HOXC9</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-NET1</td><td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PRPH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-377093/H0112</td><td>Gospodarz: Mysz IgG2a; Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SOX10</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365692</td><td>Gospodarz: Mysz IgG1; Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TH</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101-150</td><td>Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>Stężenie w magazynie: 100 mM</td></tr><tr><td>suplement B27</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>Stężenie w magazynie: 50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td>Stężenie zapasów: 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>Stężenie zapasów: 6 mM</td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Hrabina II</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>57021& 5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R& D Systems</td><td>4423</td><td>Stężenie w magazynie: 6 mM</td></tr><tr><td>Kriofiolka</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Stężenie w magazynie: 100 mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>Stężenie w magazynie: 1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>Stężenie w magazynie: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6 średni</td><td>gibco</td><td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8 średni</td><td>gibco</td><td>A15169-01</td><td>Stężenie w magazynie: 1x</td></tr><tr><td>suplement E8</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>Stężenie w magazynie: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>Stężenie w magazynie: 0,5 M</td></tr><tr><td>Płytki elektrofizjologiczne (AXION cytoview MEA96)</td><td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX (do FACS)</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ (do sortowania)</td><td></td></tr><tr><td>Rurki FACS (niebieska nasadka filtra)</td><td>Lampy</td> FACS <td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>(biała nasadka)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>Stężenie zapasów: 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>Matryca błony podstawnej; Stężenie magazynowe: 100x</td></tr><tr><td>hPSC</td><td>Thomson i wsp., (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Oh i wsp. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka fibronektyna (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654</td><td>Stężenie zapasowe: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081</td><td>Stężenie magazynowe: 200 mM</td></tr><tr><td>zbiornik LN</td><td>Niestandardowe systemy biogenne</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik MEA</td><td>Axion BioSystems</td><td>Maestro Pro</td><td></td></tr><tr><td>Mouse laminin I (LM)</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>Stężenie magazynowe: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>suplement N2</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Stężenie magazynowe: 100x</td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>gibco</td><td>21103-049</td><td>Stężenie magazynowe: 1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01</td><td>Stężenie magazynowe: 25 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>Stężenie magazynowe: 1x</td></tr><tr><td>bromowodorek poli-L-ornityny (PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>Stężenie podstawowe: 15 mg / ml</td></tr><tr><td>Primocin (antybiotyki)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>Stężenie magazynowe: 50 mg / ml</td></tr><tr><td>maszyna qPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB/CF</td><td>Stężenie w magazynie: 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Stężenie magazynowe: 1 mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R& D Systems</td><td>1614</td><td>Stężenie magazynowe: 10 mM</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Corning</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN)</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>A14700</td><td>Stężenie magazynowe: 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>VWR/Corning</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>Koncentracja magazynowa: 10 mM</td></tr></tbody></table>

skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stały się potężnym narzędziem do modelowania chorób i badania rozwoju ludzkiego embrionalnego in vitro. Wcześniej przedstawiliśmy protokół różnicowania do wyprowadzania autonomicznych neuronów o charakterze współczulnym, który został zastosowany u pacjentów z neuropatią autonomiczną. Jednak protokół został zbudowany w oparciu o wymianę surowicy nokautującej (KSR) i warunki hodowli opartej na karmieniu, a aby zapewnić wysoką wydajność różnicowania, konieczne było sortowanie komórek. Czynniki te powodują dużą zmienność, wysoki koszt i niską odtwarzalność. Co więcej, dojrzałe właściwości współczulne, w tym aktywność elektryczna, nie zostały zweryfikowane. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół, w którym hodowla i różnicowanie PSC są przeprowadzane w warunkach hodowli bez karmnika i zdefiniowanych chemicznie. Zidentyfikowano markery genetyczne identyfikujące grzebień nerwowy tułowia. Dalsze różnicowanie w pozazwojowe neurony współczulne uzyskuje się po 20 dniach bez konieczności sortowania komórek. Zapis elektrofizjologiczny dodatkowo pokazuje funkcjonalną tożsamość neuronu. Wyzwalanie wykryte przez nasze zróżnicowane neurony może być wzmocnione przez nikotynę i stłumione przez antagonistę receptora adrenergicznego propranolol. Pośrednie współczulne neuronalne komórki progenitorowe w tym protokole mogą być utrzymywane jako sferoidy nerwowe przez okres do 2 tygodni, co pozwala na ekspansję kultur. Podsumowując, nasz zaktualizowany protokół różnicowania neuronów współczulnych wykazuje wysoką wydajność różnicowania, lepszą odtwarzalność, większą elastyczność i lepsze dojrzewanie neuronów w porównaniu z poprzednią wersją. Protokół ten dostarczy naukowcom komórek niezbędnych do badania ludzkich zaburzeń, które wpływają na autonomiczny układ nerwowy.

W niniejszym protokole przedstawiamy instrukcje dotyczące generowania symN z hPSC. Warunki hodowli zaprezentowane w tej pracy zostały udoskonalone w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu23,24 (Rysunek 1A>) i zmienione na warunki wolne od komórek karmionek oraz chemicznie zdefiniowane (Rysunek 1B). Przedstawiono dwie opcje: jedną, w której symN są tworzone w ciągu 20 dni, oraz drugą, w której NCC...

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Protokół ten pozwala na wyprowadzenie neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Komórki te umożliwią naukowcowi badanie zaburzeń u ludzi, które wpływają na współczulny układ nerwowy. Technika ta pozwala na wyprowadzenie neuronów współczulnych w warunkach spotkania podzielonego bez zasilacza z wysoką skalowalną wydajnością.Powoduje to powstanie elektrycznie aktywnych neuronów w ciągu 20 dni. Technika ta może być stosowana w chorobach spowodowanych dysfunkcyjnym współczulnym układem nerwowym, może być również stosowana do modelowania chorób, medycyny regeneracyjnej i badań przesiewowych leków. Komórki te mogą być wykorzystywane in vitro do wprowadzania innowacji w dowolnej tkance w systemie kohodowli, na przykład do badania regulacji tkanki serca.Gdy ludzka hodowla pluripotencjalnych komórek macierzystych osiągnie 80 do 90% konfluencji, należy zaobserwować duże kolonie z gładkimi, jasnymi krawędziami. W celu rozszczepienia przemyj kulturę PBS przed potraktowaniem komórek czterema mililitrami 0,25 molowego EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po dwóch minutach przepłukać płytkę 10 mililitrami pożywki E8 i przenieść odłączoną zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki.Następnie przenieś 500 mikrolitrów komórek do 9,5 mililitrowej porcji świeżej pożywki E8. I umieść komórki macierzyste na nowych 100-milimetrowych szalkach pokrytych witronektyną. Na dzień przed indukcją różnicowania pokryj odpowiednią liczbę sześciu płytek dołkowych dwoma mililitrami matrycy membrany podstawnej na studzienkę.I przechowuj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka podgrzej płytki do temperatury pokojowej i umyj gotową do podziału hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych dwa razy świeżym PBS na mycie. Po drugim myciu potraktuj komórki siedmioma mililitrami 0,5 milimolowego EDTA przez 15 minut w inkubatorze hodowli komórkowych przed aspiracją pływających ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przeniesieniem pobranych komórek do 50-mililitrowej probówki.Dodać równą objętość PBS do probówki, aby rozcieńczyć EDTA i zebrać komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki różnicującej dnia 01 przed dodaniem odpowiedniej objętości pożywki do rozliczenia. Rozcieńczyć komórki do stężenia 1,25 razy 10 do piątej komórki na centymetr kwadratowy w mililitrach pożywki różnicującej na studzienkę.Odessać cały roztwór matrycy błony podstawnej z każdej studzienki uprzednio przygotowanej płytki z sześcioma dołkami. Następnie zasiew dwa mililitry komórek do każdej studzienki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka nakarm komórki trzema mililitrami pożywki różnicującej dnia 01 na dołek.W drugim dniu różnicowania nakarm komórki trzema mililitrami pożywki różnicującej z dnia drugiego do 10 na dołek, a następnie karm komórki co drugi dzień do 10 dnia. Aby zagregować komórki grzebienia nerwowego w sferoidy, w 10 dniu umyj komórki PBS. I dodaj dwa mililitry pożywki dysocjacyjnej do każdej studzienki.Po 20 minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych przenieś pływające komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i doprowadź objętość zawiesiny w probówce do 50 mililitrów świeżym PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie. I ponownie zawiesić osad w wystarczającej objętości 10 do 14 dni sferoidalnego podłoża do liczenia.Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do stężenia pięć razy od 10 do piątego na 500 mikrolitrów, używając pożywki sferoidalnej dnia 10 do 14. I umieść 500 mikrolitrów komórek w każdym dołku 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.Aby wywołać minimalną hodowlę sferoidów, w 11 dniu hodowli nakarm sferoidy grzebienia nerwowego dodatkowymi 500 mikrolitrami pożywki sferoidalnej z dnia 10 do 14 na studzienkę. W dniu 12 przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy po jednej stronie płytki. I ostrożnie odessaj jak najwięcej pożywki z każdej studzienki bez zasysania sferoid.Następnie nakarm sferoidy jednym mililitrem pożywki sferoidalnej z dnia 10 do 14 na studzienkę. Aby wywołać rozszerzoną hodowlę sferoidów, w dniu 15 nakarm sferoidy 1,5 mililitra sferoidalnego podłoża dnia 10 do 14 uzupełnionego 0,5 mikromolowym kwasem retinowym na studzienkę. Następnie włóż sferoidy z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.W celu różnicowania neuronów współczulnych, w 14 lub 28 dniu przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy po jednej stronie płytki i ostrożnie zassać jak najwięcej pożywki. Nakarm komórki jednym mililitrem pożywki dla neuronów współczulnych. Aby rozbić duże skupiska sferoid na mniejsze sferoidy, dodaj nie więcej niż jeden mililitr pożywki na dołek i pipetuj sferoidy pięć do 10 razy przed rozdzieleniem.I usuń nadmiar fibronektyny z lamininą z wcześniej przygotowanych płytek 24-dołkowych. Podzielić płytkę na jeden mililitr sferoid z każdej studzienki na 24-dołkowej płytce do hodowli sferoidalnej między czterema oddzielnymi dołkami nowej powlekanej płytki 24-dołkowej. Dodaj 250 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów współczulnych do każdej studzienki.I umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp pożywkę w każdej studzience jednym mililitrem pożywki dla neuronów współczulnych uzupełnionej 0,125 mikromolowym kwasem retinowym i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 35 dniach nakarm neurony, ostrożnie zastępując tylko połowę istniejącej pożywki w każdej studzience świeżą pożywką.Przed różnicowaniem ludzkie pluripotencjalne kolonie komórek macierzystych powinny być okrągłe z błyszczącymi, gładkimi krawędziami i niewielkim lub zerowym zróżnicowaniem. Komórki wyrażają marker grzebienia nerwowego Sox10 od czwartego do dziesiątego dnia. Komórki grzebienia nerwowego pojawiają się w gęstych, pociemniałych grzbietach, które są widoczne od szóstego dnia.Te grzbiety wyrażają również Sox10. Na etapie komórek grzebienia nerwowego Sox10 koreluje ze znacznikiem powierzchni komórki CD49D, który można wykorzystać do sortowania komórek grzebienia nerwowego. Populacje posortowane i nieposortowane wytworzyły sferoidy grzebieni nerwowych w podobny sposób.Podczas gdy ujemnie posortowane komórki nie agregują prawidłowo, nie wytwarzają okrągłych, gładkich, zdrowo wyglądających sferoid i umierają w ciągu trzech do czterech dni. Ponadto, gdy porównuje się sferoidy grzebienia nerwowego w dniu 14, ilościową PCR z odwrotną transkryptazą dla markerów grzebienia nerwowego i progenitorów nerwu współczulnego, nie można wykryć znaczących różnic między posortowanymi i nieposortowanymi komórkami. W 20 lub 35 dniu, zgodnie z odpowiednimi minimalnymi lub rozszerzonymi protokołami, neuroidy rosną w promienisty wzór z przyczepionych sferoid.Na tym etapie ulegają ekspresji markery związane z syntezą i transportem noradrenaliny, a także Hox6 za pośrednictwem dziewięciu genów grzebienia nerwowego tułowia. Zapis elektrofizjologiczny wykrywa również aktywność neuronalną od 20 dnia. Taka aktywność może być wzmacniana lub tłumiona przez leki, które celują w autoreceptory neuronów współczulnych, dostosowując funkcjonalność zróżnicowanych neuronów.Sam ludzki orędownik musi być zdrowy od zerowego dnia różnicowania, w przeciwnym razie eksperyment prawdopodobnie się nie powiedzie. Inhibitory lub aktywatory farmakologiczne można dodawać do neuronów, aby zrozumieć ich normalne lub patologiczne zachowanie. Metoda ta otwiera nową drogę do badania biologii i patologii współczulnej, ponieważ obecnie możliwe jest łatwe pobieranie biopsji neuronów współczulnych od ludzi.

efficient-differentiation-postganglionic-sympathetic-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film demonstruje metodę in vitro do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w komórki grzebienia nerwowego (NCC) na podporze macierzy błony podstawnej za pomocą pożywki różnicującej. NCC są następnie dysocjowane i formowane w sferoidy za pomocą innego ośrodka różnicującego. Wreszcie sferoidy są przekształcane w pozazwojowe neurony współczulne za pomocą współczulnego ośrodka neuronowego.

Generowanie zazwojowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film pokazuje generowanie nerwowych komórek progenitorowych z nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe za pomocą neuronalnej pożywki różnicującej. Podczas gdy różnicowanie jest indukowane w komórkach nietransgenicznych za pomocą małych cząsteczek, transgeniczne hPSC są różnicowane przez dodanie antybiotyku, który indukuje promotor dla czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla...

Różnicowanie nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Ten film pokazuje proces różnicowania ludzkich iPSC w neurony ruchowe. Uzasadnienie obejmuje wykorzystanie iPSC, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji określonych czynników transkrypcyjnych. Po wyhodowaniu w pożywce zawierającej doksycyklinę, antybiotyk ten wyzwala ekspresję czynników transkrypcyjnych, promując w ten sposób różnicowanie iPSC w komórki progenitorowe neuronów ruchowych. Ostatecznie przodkowie są hodowani w pożywce neuronalnej, aby uzyskać dojrzałe i...

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne neurony ruchowe

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Wywodzenie linii jelitowego układu nerwowego (ENS) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowi skalowalne źródło komórek do badania rozwoju i chorób ENS oraz do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół in vitro do wyprowadzania neuronów jelitowych z hPSC przy użyciu chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli.

Różnicowanie linii jelitowego układu nerwowego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj protokół różnicowania neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach bez karmienia. Ta metoda umożliwia generowanie elektrycznie aktywnych neuronów w ciągu 20 dni.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Przeglądaj więcej filmów