Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach
May 1st, 2020
Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.
Regulacja sygnalizacji kompleksu eIF4F wiąże się ze zwiększoną translacją podzbioru mRNA, który bierze udział w proliferacji i przeżyciu raka. W tym miejscu opisujemy testy interakcji białko-białko oparte na komórkach eIF4E-eIF4G, które pozwalają nam ocenić wywołane lekiem zaburzenia integralności kompleksu eIF4F w żywych komórkach. Rośnie zainteresowanie opracowywaniem metod, które skutecznie celują w granicę faza białko-białko.
Wyobrażaliśmy sobie, że nasze testy PPI eIF4E-eIF4G pomogą we wspieraniu tych strategii i ich walidacji. Test ten zapewni optymalny schemat pierwotny, który pozwoli mu na optymalizację inhibitorów eIF4E-eIF4G. Prawidłowe wysiewanie komórki i wykonywanie transfekcji transferowej jest najtrudniejszym aspektem tego produktu, ponieważ może bezpośrednio odbijać się na tłumieniu systemu raportowania PPI.
Po rozmrożeniu i zliczeniu komórek, wysiewaj 6-dołkowe płytki komórkami HEK 293, używając 2 mililitrów standardowego podłoża wzrostowego na dołek. Rankiem 2 dnia, dla każdej struganej transfekcji, rozcieńczyć 9 mikrolitrów roztworu na bazie liposomów w probówce zawierającej 125 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej. Podczas gdy rozcieńczone liposomy inkubują w temperaturze pokojowej przez 5 minut, przygotuj główną mieszankę DNA, rozcieńczając 3 mikrogramy każdego plazmidu w 125 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy dla każdej probówki do transfekcji.
Dodaj 12 mikrolitrów odczynników wzmacniających do DNA master mix 2, a następnie dobrze wymieszaj. Natychmiast dodaj tę mieszaninę do każdej probówki rozcieńczonych liposomów w stosunku 1 do 1. Po inkubacji tego kompleksu lipidowego DNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, dodaj kompleks do każdej studzienki z 6 płytek dołkowych.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Rankiem 3 dnia spłucz każdą studzienkę 1 mililitrem PBS i dodaj 0,3 mililitra trypsyny. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut.
Po inkubacji zneutralizować trypsynę, dodając 2 mililitry do każdej studzienki zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej. Przenieś transfekowane komórki do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 290x G przez 5 minut.
Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 mililitrach zredukowanej pożywki surowicy. Zasiać transfekowane komórki HEK 293 w 96-dołkowych nieprzezroczystych płytkach, o gęstości 30 000 komórek na studzienkę w 90 mikrolitrach pożywki. Aby uzyskać 3 powtórzenia techniczne dla 3 różnych związków w tym samym eksperymencie, należy zasiać 60 dołków.
Wyklucz studzienki na krawędziach. Natychmiast po wysianiu transfekowanych komórek dodaj 10 mikrolitrów 10% roztworu związku DMSO do każdej studzienki. Przygotuj 1 milimolowe roztwory podstawowe związków, rozpuszczając każdy interesujący Cię związek w 100% DMSO.
Aby uzyskać 3 powtórzenia dla każdego miareczkowania złożonego, należy użyć 8 mikrolitrów 1 milimolowego roztworu podstawowego związku. Przeprowadzić dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego roztworu związku podstawowego w 8 dołkach 96-dołkowej płytki PCR, pipetując 4 mikrolitry 1 milimolowego materiału wyjściowego do 4 mikrolitrów 100% DMSO dla każdego punktu miareczkowania. Odrzucić nadmiar 4 mikrolitrów po ostatnim punkcie dwukrotnego seryjnego rozcieńczenia.
Dodaj 36 mikrolitrów sterylnej wody klasy HPLC do każdej probówki, aby przygotować 40 mikrolitrów 10x złożonych roztworów do seryjnego rozcieńczania w 10% DMSO. Przygotuj również kontrolkę. 10% DMS tylko roztwór podstawowy w sterylnej wodzie klasy HPLC.
Dodaj 10 mikrolitrów 10x roztworów roboczych do komórek w 96-dołkowej nieprzezroczystej płytce, aby uzyskać zamierzone stężenie końcowe, przy resztkowym stężeniu DMSO wynoszącym 1%Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 3 godziny. Po 3 godzinach należy rozpocząć przygotowanie odczynnika substratowego lucyferazy, łącząc 1 objętość substratu z 19 objętościami odczynnika rozcieńczającego. Użyj pipety wielokanałowej, aby natychmiast dodać 25 mikrolitrów odczynnika substratowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki z komórkami.
Potrząsaj płytką na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 350 obr./min przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Aby ocenić luminescencję, umieść płytkę na czytniku płytek. Ustaw czytnik lusterek na luminescencję, a filtr emisyjny na 455.
Użyj wysokości pomiaru 6,5 milimetra przy czasie pomiaru wynoszącym 1 sekundę. Aby ocenić żywotność komórek, dodaj 33 mikrolitry odczynnika do oznaczania żywotności do każdej studzienki. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej oceń luminescencję za pomocą czytnika płytek, ustawiając czytnik lustrzany na luminescencję, a filtr emisyjny na 600.
Użyj wysokości pomiaru 6,5 milimetra i czasu pomiaru wynoszącego 1 sekundę. Wykorzystaj dane z czytnika płytek, aby określić wartość IC 50 dla każdego związku, dopasowując dane do krzywej równania krzywej dopasowania 4-parametrowego opisanego w manuskrypcie. Komórki HEK 293 transfekowano systemem komplementacji eIF4E-eIF4G, a następnie cofnięto i leczono inhibitorami mTOR.
Gdy luminescencję oceniano 4 godziny po leczeniu, zarówno PP242, jak i rapamycyna powodowały zależne od dawki hamowanie sygnału. Ani PP242, ani rapamycyna nie spowodowały znaczącego spadku żywotności komórek, co wskazuje, że spadek luminescencji w systemie komplementacji eIF4E-eIF4G nie jest spowodowany niespecyficzną śmiercią komórki, ale raczej zakłóceniem interakcji EIF4E-4G. Analiza Western blot, przeprowadzona po eksperymencie m7GTP pull down, wykazała, że zakłócenie endogennej interakcji eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP1 koreluje ze zmierzonym sygnałem testu eIF4E-eIF4G.
PP242 był silniejszym inhibitorem całkowitej fosforylacji 4EBP1 niż rapamycyna. Oba inhibitory wykazały normalny wpływ na sygnalizację mTOR, przy czym rapamycyna była bardziej aktywna wobec substratów mTORC1, a PP242 był ukierunkowany zarówno na mTORC1, jak i mTORC2. Najbardziej krytycznym aspektem tego produktu jest wysiew komórek w dniu transakcji, ponowne wysiew komórek w pożywce bez czerwieni fenolowej, ocena luminescencji testu komplementacji eIF4E-eIF4G i przeprowadzenie testu żywotności na tej samej płytce.
Wtórny test żywotności można przeprowadzić w celu oceny dowolnego leku o docelowym i znanym specyficznym działaniu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, ułatwiając ocenę zakłóceń indukowanych lekami w dynamice kompleksu eIF4F. Test ma na celu wspieranie rozwoju inhibitorów ukierunkowanych na tę interakcję białko-białko.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Interakcje białko-białko
- Badania nad rakiem
Tło
- Kompleks eIF4F jest kluczowy dla regulacji translacji mRNA.
- Jego sygnalizacja jest związana z proliferacją i przeżyciem komórek rakowych.
- Ukierunkowane na interfejsy białko-białko jest rosnącym obszarem zainteresowania.
- Ocena interakcji eIF4E-eIF4G może pomóc w odkrywaniu leków.
Cel badania
- Opracowanie testu opartego na komórkach dla interakcji eIF4E-eIF4G.
- Ocena wpływu leków na integralność kompleksu eIF4F.
- Zapewnienie ram dla optymalizacji inhibitorów eIF4E-eIF4G.
Zastosowane metody
- Techniki siewu komórek i transferu transfekcji.
- Testy interakcji białko-białko w żywych komórkach.
- Ocena zakłóceń indukowanych lekami.
- Optymalizacja warunków testu dla niezawodnych wyników.
Główne wyniki
- Test skutecznie mierzy interakcje eIF4E-eIF4G.
- Leczenie lekami może zmienić dynamikę kompleksu eIF4F.
- Wyzwania w obsłudze komórek mogą wpływać na wyniki testu.
- Metoda wspiera walidację potencjalnych inhibitorów.
Wnioski
- Test eIF4E-eIF4G jest cennym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Umożliwia ocenę wpływu leków na interakcje białek.
- To podejście może ułatwić rozwój ukierunkowanych terapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Monitoring eIF4F assembly via eIF4E-eIF4G interaction provides a live-cell readout of a key oncogenic signaling node, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking of translation initiation inhibitors. This assay supports predictive confidence in compound screening by linking target engagement to functional disruption of cancer-relevant mRNA translation, informing portfolio decisions in oncology drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the eIF4E-eIF4G protein-protein interaction as a functional readout of eIF4F complex assembly in live cells.
- Operational Value: Enables assessment of drug-induced perturbations in target engagement without relying on cell death confounders.
- Strategic Value: Supports target validation by correlating compound effects with known pathway inhibitors like PP242 and rapamycin.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative luminescence-based readout amenable to dose-response profiling and IC50 determination.
- Operational Value: Compatible with 96-well format and dual-readout design (target engagement and viability) for assay robustness.
- Strategic Value: Enables primary screening and lead optimization of eIF4E-eIF4G disruptors in a physiologically relevant cellular context.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures target modulation in a disease-relevant system where eIF4F dysregulation drives oncogenic translation.
- Operational Value: Demonstrates correlation with biochemical validation (e.g., 4EBP1-mediated disruption via m7GTP pull-down), supporting translational continuity.
- Strategic Value: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing specific target effects from cytotoxic artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling quantitative lead optimization prior to preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of the eIF4F node and pathway clarification in oncogenic signaling contexts.
- Screening: Enables reproducible, quantitative compound evaluation with built-in viability counterscreening.
- Analytics: Generates dose-response data and IC50 values via 4-parameter curve fitting for compound prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical validity through correlation with orthogonal validation of eIF4E-eIF4G disruption.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing PPI-targeted modalities across oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation and reduces mechanistic ambiguity in PPI-directed screening.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable readouts with internal viability controls to ensure data quality.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by isolating specific target effects from cytotoxic confounders.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of eIF4E-eIF4G inhibitors based on target engagement and functional relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell transfection and protein-protein interaction assay design.
- Dependent on luminescence detection infrastructure and orbital shaking for signal development.
- Necessitates standardization of cell seeding density and transfection efficiency across wells.
- Involves optimization of compound dilution series in DMSO to maintain consistent solvent exposure.
- Limited by the need for careful cell handling to avoid artifacts in PPI reporting, particularly during transfer and re-seeding steps.
