Name: Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę pomiaru interakcji białkowej eIF4E-eIF4G w żywych komórkach w celu oceny wpływu leków na kompleks eIF4F. Ta technika wspiera odkrywanie nowych inhibitorów w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez główny budżet z p53lab (BMSI, A*STAR) oraz grant VIP JCO (A*STAR).

Linia komórkowa HEK293 została użyta do protokołu i została wyhodowana w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminą i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w wilgotnym środowisku.
1. Ilościowa ocena rozerwania kompleksu eIF4F za pomocą testu komplementacji eIF4E:eIF4G604-646
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i transfekcja przejściowa testu komplementacji eIF4E:eIF4G604-646
	<ol>
		<li>Do wszystkich eksperymentów używaj świeżo rozmrożonych komórek z mniej niż 20 pasażami. W dniu 1 określ liczbę komórek za pomocą standardowego licznika komórek i policz całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczenia błękitu trypana13.</li>
		<li>Wysiewaj płytki 6-dołkowe z 0,9 - 1,2 x 106 komórek HEK 293 na dołek w 2 ml standardowej pożywki wzrostowej. 
		UWAGA: Aby osiągnąć najlepszą wydajność transfekcji w obrębie linii komórkowych wskazanych powyżej, należy upewnić się, że posiane komórki zlewają się w 70-90% następnego dnia po wysiewie.</li>
		<li>Rankiem w dniu 2 należy wykonać kotransfekcję komórek z plazmidem SubA-eIF4E i eIF4G604-646-SubB za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (patrz tabela materiałów), jak opisano poniżej.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć 9 μl roztworu na bazie liposomów w probówce zawierającej 125 μl zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej (patrz tabela materiałów) przy każdej transfekcji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
			<li>Przygotować wzorcową mieszaninę DNA, rozcieńczając 3 μg każdego plazmidu w 125 μl zredukowanej pożywki surowicy dla każdej probówki do transfekcji.</li>
			<li>Dodać 12 μl odczynników wzmacniających do probówki z mieszanką główną DNA, dobrze wymieszać i natychmiast dodać mieszankę główną DNA: wzmacniacz do każdej probówki rozcieńczonych liposomów w stosunku 1:1. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodać kompleks DNA-lipid do każdej studzienki i inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rankiem 3 dnia przepłucz każdą studzienkę 1 ml PBS.</li>
		<li>Usunąć PBS i inkubować komórki w każdym dołku z 0,3 ml trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zneutralizować trypsynę, dodając 2 ml zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej zawierającej 0% FCS w każdym dołku i przenieść transfekowane komórki do probówki o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Czerwień fenolowa może zakłócać aktywność lucyferazy; W związku z tym, począwszy od tego etapu, z komórkami należy obchodzić się w pożywce bez czerwieni fenolowej.</li>
		<li>Wirować komórki przez 5 minut przy 290 x g i odessać pożywkę. Zawiesić komórki w 2 ml zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej zawierającej 0% FCS. Policz zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
		<li>Nasiona transfekowały komórki HEK 293 w 96 nieprzezroczystych płytkach o gęstości 30 000 komórek na basenik w 90 μl pożywki bez czerwieni fenolowej zawierającej 0% FCS. W celu uzyskania 3 powtórzeń technicznych w tym samym eksperymencie dla 3 różnych związków, należy zasiać 60 dołków na płytkach z komórkami z wyłączeniem dołków na krawędziach.</li>
		<li>Natychmiast po wysianiu transfekowanych komórek dodać 10 μl 10% roztworu związku DMSO (patrz krok 1.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie mieszanki
	<ol>
		<li>Przygotować 1 mM złożone roztwory podstawowe, rozpuszczając interesujący nas związek w 100% DMSO (v/v). Aby uzyskać 3 powtórzenia dla każdego miareczkowania złożonego, należy użyć 8 μl 1 mM roztworu podstawowego związku. 
		UWAGA: Objętość użytego związku podstawowego o wielkości 1 mM jest większa niż potrzebna. Ma to na celu uwzględnienie ewentualnych błędów pipetowania.</li>
		<li>Przeprowadzić 2-krotne seryjne rozcieńczenie roztworu związku podstawowego 4 μl 1 mM podstawowego roztworu do 4 μl 100% DMSO dla każdego punktu miareczkowania. 
		UWAGA: Aby uzyskać pełne miareczkowanie złożone, należy wykonać 9 seryjnych rozcieńczeń z wyjściowego zapasu w 100% DMSO. Jeśli konieczne jest przetestowanie wielu związków, należy użyć płytki 96-dołkowej i pipety wielokanałowej, aby ułatwić ten etap i późniejsze rozcieńczenia.</li>
		<li>Dodać 36 μL sterylnej wody klasy HPLC do każdego punktu 2-krotnego seryjnego rozcieńczenia, aby przygotować 40 μL 10x roztworów roboczych w 10% DMSO (v/v) (tj. 100 μM do 0,39 μM 10% serii podstawowej DMSO doprowadzi do końcowego roztworu od 10 μM do 0,039 μM, w 1% DMSO po dodaniu do komórek). Jeśli chodzi o kontrolę leczenia, należy również przygotować 10% roztwór podstawowy tylko DMSO w sterylnej wodzie klasy HPLC.</li>
		<li>Dodać 10 μl 10x roztworów roboczych do komórek na 96-dołkowej nieprzezroczystej płytce w celu uzyskania zamierzonego stężenia końcowego przy resztkowym stężeniu DMSO wynoszącym 1% (v/v) w całkowitej objętości 100 μL i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% v/v atmosferycznym CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komplementacja lucyferazy i test żywotności
	<ol>
		<li>Po 3 godzinach od narkotyzacji należy rozpocząć przygotowanie odczynnika substratowego lucyferazy, łącząc 1 objętość substratu z 19 objętościami odczynnika do rozcieńczania (patrz instrukcje producenta). 
		UWAGA: Test lucyferazy przeprowadza się przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej natychmiast dodaj 25 μl odczynnika substratowego.</li>
		<li>Potrząsaj płytką z prędkością 350 obr./min przez 50 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Oceń luminescencję za pomocą czytnika płytek. W tym celu należy ustawić czytnik lusterek na luminescencję, a filtr emisyjny na 455. Użyj wysokości pomiaru 6.5 mm przy czasie pomiaru 1 s.</li>
		<li>Aby ocenić żywotność komórek, dodać 33 μl odczynnika do oznaczania żywotności, a następnie ponownie zmierzyć luminescencję po 15 minutach w temperaturze pokojowej, używając czytnika płytek.</li>
		<li>Oceń luminescencję za pomocą czytnika płytek, ustawiając czytnik lusterek na Luminescencja, a filtr emisyjny na 600 nm. Użyj wysokości pomiaru 6.5 mm przy czasie pomiaru 1 s. 
		UWAGA: Żywotność ocenia się, mierząc wewnątrzkomórkowy poziom ATP podczas lizy komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Multipleksowanie jest w tym przypadku możliwe, ponieważ test żywotności wykorzystuje inną lucyferazy o innej długości fali emisyjnej.</li>
		<li>Użyj danych, aby określić wartości IC50 każdego związku, dopasowując dane do równania krzywej dopasowania 4 parametrów: 
		Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D 
		Wartości liczbowe D i A muszą być ograniczone w procesie dopasowywania krzywych: 
		D = wartość luminescencji na osi Y dla minimalnej asymptoty krzywej lub minimalnego teoretycznego poziomu odpowiedzi oczekiwanego w teście komplementacji eIF4E:4G. 
		A = wartość luminescencji na osi Y dla maksymalnej asymptoty krzywej lub maksymalnej odpowiedzi na poziomie teoretycznym oczekiwanej w teście komplementacji eIF4E:4G. 
		UWAGA: Wartość minimalnej odpowiedzi pochodzi z 1% leczenia kontrolnego DMSO (v/v), a wartość maksymalnej odpowiedzi pochodzi z maksymalnej odpowiedzi inhibitora mTOR o wysokim powinowactwie, który ustabilizował się bez wpływu na żywotność komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Korelacja hamowania testu eIF4E:eIF4G604-646 z rozerwaniem kompleksu eIF4F w komórkach
<ol>
	<li>Aby potwierdzić, że sygnał mierzony za pomocą testu odpowiada fizycznemu zakłóceniu interakcji eIF4E-eIF4G przez związek, komórki nasienne zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
	<li>Następnego dnia zastąpić pożywkę 1 ml zredukowanej pożywki surowicy niezawierającej czerwieni fenolowej i inkubować przez 4 godziny z interesującym związkiem. Zapewnić stężenie resztkowe DMSO na poziomie 1% (v/v) w całkowitej objętości 1 ml. 
	UWAGA: Aby łatwo umożliwić korelację z wynikiem, należy użyć stężeń związków na początku, środku i końcu zmierzonej krzywej miareczkowania testu komplementacji.</li>
	<li>Lizuj komórki i wykonaj ściąganie m7GTP w dół w celu wyizolowania kompleksów eIF4F i eIF4E: 4EBP1. Szczegółowe procedury dotyczące przeprowadzania eksperymentu z rozwijanym m7GTP można znaleźć gdzie indziej14.</li>
	<li>Wykryj poziomy białek eIF4G, eIF4E i 4EBP1 związanych z m7GTP za pomocą analizy western blot, a następnie skoreluj je z rozerwaniem kompleksu eIF4F za pomocą hamowania sygnału testu komplementacji.</li>
</ol>

<ol><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li>
<li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+translation+machinery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li>
<li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex%3A+a+critical+nexus+for+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li>
<li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis%3A+the+role+of+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E%3A+A+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li>
<li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G%3A+comparison+with+eIF4E-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li>
<li>Grüner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li>
<li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).</li>
<li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1%3A+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li>
<li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819(2013).</li>
<li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40(2019).</li>
<li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein-protein+interactions+%28PPIs%29%3A+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda opisana w tym artykule wykorzystuje test komplementacji oparty na lucyferazy do ilościowego monitorowania składania kompleksu eIF4F poprzez bezpośredni pomiar interakcji eIF4G-eIF4E w żywych komórkach. Przedstawiliśmy szczegółowe informacje na temat stosowania systemu komplementacji eIF4E-eIF4G, a także wykazaliśmy, że system jest niezwykle dokładny w pomiarze indukowanej lekiem dysocjacji interakcji eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP116. Aby ułatwić przepustowość tego testu, konfiguracja ek...

Kontrola ekspresji genów odgrywa kluczową rolę w prawidłowym wykonywaniu programów komórkowych, takich jak wzrost, proliferacja i różnicowanie. Mechanizm kontroli regulacyjnej może być wywierany zarówno na poziomie transkrypcji genów, jak i na poziomie translacji mRNA. W ciągu ostatniej dekady stało się coraz bardziej oczywiste, że kontrola translacyjna poprzez modulację procesu inicjacji, a nie późniejsze etapy wydłużania i terminacji, może precyzyjnie regulować syntezę określonych podzbiorów białek, które odgrywają szeroki zakres funkcji biologicznych.
Zwiększona translacja mRNA zaangażowanych w przeżycie, reakcje antyautofagiczne i antyapoptotyczne były związane z kilkoma nowotworami i były również przyczynowo związane z nieprawidłową aktywacją lub nadmierną ekspresją czynników inicjujących translację1.
Kompleks eIF4F jest głównym regulatorem inicjacji translacji. Wiążąc strukturę kapu na końcu 5' mRNA, eIF4F napędza początkową rekrutację mRNA-rybosom, a co za tym idzie, zwiększa wydajność translacji mRNA słabo translowanych eukariotycznych mRNAs2. Translacja mRNA związanych z rakiem za pośrednictwem eIF4F została zgłoszona w wielu modelach nowotworowych zawierających nieprawidłową aktywację szlaków RAS / MAPK lub AKT / TOR, co sugeruje, że komórki rakowe zwiększają eIF4F w celu zwiększenia własnej aktywności pronowotworowej. Przerwanie tej pętli sprzężenia zwrotnego poprzez zahamowanie tworzenia kompleksu eIF4F jest zatem bardzo obiecującą strategią terapeutyczną3,4.
Kompleks eIF4F składa się z (i) eIF4E, podjednostki wiążącej czapeczkę eIF4F, która oddziałuje ze strukturą kapu znajdującą się na 5' UTR mRNA, (ii) eIF4A, helikazy RNA i (iii) eIF4G, białka rusztowania, które oddziałuje zarówno z eIF4A, jak i eIF4E i które ostatecznie rekrutuje podjednostkę rybosomalną 40S5. Asocjacja eIF4G z eIF4E jest krokiem ograniczającym szybkość składania funkcjonalnych kompleksów eIF4F i jest ujemnie regulowana przez białka wiążące eIF4E (4EBP, elementy 1, 2 i 3))<klasa sup = "xref">6. Konkurując z wiązaniem eIF4G z eIF4E za pośrednictwem interfejsu, który składa się z kanonicznych i niekanonicznych sekwencji wiążących eIF4E7,8,9 (region obejmujący aa 604-646 na ludzkim eIF4E), 4EBP zmniejsza pulę eIF4E aktywnie zaangażowanych w translację i zapobiegających tworzeniu się kompleksów eIF4F. Wzajemne oddziaływanie tych interakcji białko-białko jest głównie regulowane przez ssaczy cel fosforylacji 4EBP za pośrednictwem rapamycyny (mTOR). Pod wpływem bodźców mitogennych mTOR bezpośrednio fosforyluje członków rodziny białek 4E-BP, zmniejszając ich związek z eIF4E, a tym samym promując interakcję eIF4E-eIF4G i tworzenie funkcjonalnych kompleksów eIF4F10.
Pomimo ogromnego wysiłku włożonego w opracowanie związków ukierunkowanych na integralność kompleksu eIF4F, brak testów mierzących bezpośrednie zakłócenie interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach ograniczył poszukiwania komórkowych aktywnych związków uderzeniowych. Zastosowaliśmy test lucyferazy oparty na analogu koelentrazyny (np. Test komplementacji oparty na Nanoluc) do monitorowania w czasie rzeczywistym stanu integralności eIF4F poprzez interakcję eIF4E-eIF4G. System białkowy komplementacji lucyferazy składa się z fragmentu białka o masie 18 kDa (SubA) i fragmentu peptydu 11 aminokwasów (SubB) zoptymalizowanego pod kątem minimalnej samoasocjacji i stabilności11. Po wyrażeniu jako produkt fuzji z ludzką domeną interakcji eIF4E na pełnej długości i domeną interakcji eIF4E z ludzkiego eiF4G1 (aa 604-646), dwa oddziałujące białka zbliżyą fragment SubA i SubB do siebie i zaindukują tworzenie substancji czynnej lucyferazy, która w obecności przepuszczalnego dla komórek substratu ostatecznie wygeneruje jasny sygnał luminescencyjny (ryc. 1). W innym miejscu informowaliśmy o budowie i walidacji systemu komplementacji eIF4E:eIF4G604-64616.
Tutaj opisujemy, jak system komplementacji eIF4E:eIF4G604-646 (dostępny na żądanie) może być zastosowany do dokładnego pomiaru zakłóceń eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP1 w żywych komórkach. Dodatkowo demonstrujemy jego użyteczność, mierząc działanie kilku inhibitorów mTOR, które są obecnie w fazie badań klinicznych jako potencjalne leki przeciwnowotworowe12. Ze względu na to, że efekty niezgodne z celem często maskują aktywność specyficzną dla leku, opisujemy również, w jaki sposób można rozszerzyć wszechstronność pomiarów systemu eIF4E:eIF4G604-646 o ortogonalne pomiary żywotności komórek, aby je uwzględnić.

<table><tbody><tr><td>Komórki 293FT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka do hodowli komórkowych 96 dołków, F-Bottom</td><td>greiner bio-one</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Miano komórek Glo 2.0</td><td>PROMEGA</td><td>G9241</td><td></td></tr><tr><td>Envision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe Finnpipette F2 12-kanałowe 30-300 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662070</td><td></td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe Finnpipette F2 12-kanałowe 5-50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4662050</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE6</td><td>PROMEGA</td><td>E2692</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI Starter Systems</td><td>PROMEGA</td><td>N2014</td><td></td></tr><tr><td>Optimem I Zredukowana surowica Mediun, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Eppendorf</td><td>nie ma zastosowania</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-Aminofenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-155S</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie montażu eif4f poprzez pomiar interakcji eif4e-eif4g w aktywnych komórkach

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Wykazano, że tworzenie kompleksu eIF4F jest kluczowym węzłem dla konwergencji szlaków sygnałowych, które często ulegają aktywacji onkogennej u ludzi. eIF4F to kompleks wiążący kapu, który bierze udział w fazie rekrutacji mRNA-rybosom podczas inicjacji translacji. W wielu komórkowych i przedklinicznych modelach nowotworów deregulacja eIF4F prowadzi do zwiększonej translacji określonych podzbiorów mRNA, które są zaangażowane w proliferację i przeżycie raka. eIF4F jest kompleksem heterotrimerycznym zbudowanym z podjednostki wiążącej czapeczkę eIF4E, helikazy eIF4A i podjednostki rusztowania eIF4G. Kluczowe znaczenie dla składania aktywnych kompleksów eIF4F ma interakcja białko-białko między białkami eIF4E i eIF4G. W tym artykule opisujemy protokół do pomiaru montażu eIF4F, który monitoruje stan interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach. Test interakcji białko-białko eIF4e:4G oparty na komórkach pozwala również na dokładną i wiarygodną ocenę zmian w integralności kompleksu eIF4F wywołanych przez leki. Przewidujemy, że metoda ta może być stosowana do weryfikacji aktywności dostępnych na rynku związków lub do dalszych badań przesiewowych nowych związków lub modalności, które skutecznie zakłócają powstawanie kompleksu eIF4F.

Aby zweryfikować czułość systemu komplementacji eIF4E:eIF4G604-646, oceniono inhibicję składania kompleksu eIF4F zapśredniczoną przez 4EBP1 przy użyciu inhibitorów mTOR. Poprzez hamowanie zależnej od kinazy mTORC1 fosforylacji białek z rodziny 4EBP, inhibicja mTOR zwiększa asocjację 4EBP1 z eIF4E, a w konsekwencji prowadzi do rozpadu kompleksu eIF4F15. Przebadano dwie klasy inhibitorów kinaz mTOR o różnym mechanizmie działania: rapalogi (np. rapamycynę),...

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Regulacja sygnalizacji kompleksu eIF4F wiąże się ze zwiększoną translacją podzbioru mRNA, który bierze udział w proliferacji i przeżyciu raka. W tym miejscu opisujemy testy interakcji białko-białko oparte na komórkach eIF4E-eIF4G, które pozwalają nam ocenić wywołane lekiem zaburzenia integralności kompleksu eIF4F w żywych komórkach. Rośnie zainteresowanie opracowywaniem metod, które skutecznie celują w granicę faza białko-białko.Wyobrażaliśmy sobie, że nasze testy PPI eIF4E-eIF4G pomogą we wspieraniu tych strategii i ich walidacji. Test ten zapewni optymalny schemat pierwotny, który pozwoli mu na optymalizację inhibitorów eIF4E-eIF4G. Prawidłowe wysiewanie komórki i wykonywanie transfekcji transferowej jest najtrudniejszym aspektem tego produktu, ponieważ może bezpośrednio odbijać się na tłumieniu systemu raportowania PPI.Po rozmrożeniu i zliczeniu komórek, wysiewaj 6-dołkowe płytki komórkami HEK 293, używając 2 mililitrów standardowego podłoża wzrostowego na dołek. Rankiem 2 dnia, dla każdej struganej transfekcji, rozcieńczyć 9 mikrolitrów roztworu na bazie liposomów w probówce zawierającej 125 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej. Podczas gdy rozcieńczone liposomy inkubują w temperaturze pokojowej przez 5 minut, przygotuj główną mieszankę DNA, rozcieńczając 3 mikrogramy każdego plazmidu w 125 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy dla każdej probówki do transfekcji.Dodaj 12 mikrolitrów odczynników wzmacniających do DNA master mix 2, a następnie dobrze wymieszaj. Natychmiast dodaj tę mieszaninę do każdej probówki rozcieńczonych liposomów w stosunku 1 do 1. Po inkubacji tego kompleksu lipidowego DNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, dodaj kompleks do każdej studzienki z 6 płytek dołkowych.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Rankiem 3 dnia spłucz każdą studzienkę 1 mililitrem PBS i dodaj 0,3 mililitra trypsyny. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut.Po inkubacji zneutralizować trypsynę, dodając 2 mililitry do każdej studzienki zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej. Przenieś transfekowane komórki do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 290x G przez 5 minut.Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 mililitrach zredukowanej pożywki surowicy. Zasiać transfekowane komórki HEK 293 w 96-dołkowych nieprzezroczystych płytkach, o gęstości 30 000 komórek na studzienkę w 90 mikrolitrach pożywki. Aby uzyskać 3 powtórzenia techniczne dla 3 różnych związków w tym samym eksperymencie, należy zasiać 60 dołków.Wyklucz studzienki na krawędziach. Natychmiast po wysianiu transfekowanych komórek dodaj 10 mikrolitrów 10% roztworu związku DMSO do każdej studzienki. Przygotuj 1 milimolowe roztwory podstawowe związków, rozpuszczając każdy interesujący Cię związek w 100% DMSO.Aby uzyskać 3 powtórzenia dla każdego miareczkowania złożonego, należy użyć 8 mikrolitrów 1 milimolowego roztworu podstawowego związku. Przeprowadzić dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego roztworu związku podstawowego w 8 dołkach 96-dołkowej płytki PCR, pipetując 4 mikrolitry 1 milimolowego materiału wyjściowego do 4 mikrolitrów 100% DMSO dla każdego punktu miareczkowania. Odrzucić nadmiar 4 mikrolitrów po ostatnim punkcie dwukrotnego seryjnego rozcieńczenia.Dodaj 36 mikrolitrów sterylnej wody klasy HPLC do każdej probówki, aby przygotować 40 mikrolitrów 10x złożonych roztworów do seryjnego rozcieńczania w 10% DMSO. Przygotuj również kontrolkę. 10% DMS tylko roztwór podstawowy w sterylnej wodzie klasy HPLC.Dodaj 10 mikrolitrów 10x roztworów roboczych do komórek w 96-dołkowej nieprzezroczystej płytce, aby uzyskać zamierzone stężenie końcowe, przy resztkowym stężeniu DMSO wynoszącym 1%Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 3 godziny. Po 3 godzinach należy rozpocząć przygotowanie odczynnika substratowego lucyferazy, łącząc 1 objętość substratu z 19 objętościami odczynnika rozcieńczającego. Użyj pipety wielokanałowej, aby natychmiast dodać 25 mikrolitrów odczynnika substratowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki z komórkami.Potrząsaj płytką na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 350 obr./min przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Aby ocenić luminescencję, umieść płytkę na czytniku płytek. Ustaw czytnik lusterek na luminescencję, a filtr emisyjny na 455.Użyj wysokości pomiaru 6,5 milimetra przy czasie pomiaru wynoszącym 1 sekundę. Aby ocenić żywotność komórek, dodaj 33 mikrolitry odczynnika do oznaczania żywotności do każdej studzienki. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej oceń luminescencję za pomocą czytnika płytek, ustawiając czytnik lustrzany na luminescencję, a filtr emisyjny na 600.Użyj wysokości pomiaru 6,5 milimetra i czasu pomiaru wynoszącego 1 sekundę. Wykorzystaj dane z czytnika płytek, aby określić wartość IC 50 dla każdego związku, dopasowując dane do krzywej równania krzywej dopasowania 4-parametrowego opisanego w manuskrypcie. Komórki HEK 293 transfekowano systemem komplementacji eIF4E-eIF4G, a następnie cofnięto i leczono inhibitorami mTOR.Gdy luminescencję oceniano 4 godziny po leczeniu, zarówno PP242, jak i rapamycyna powodowały zależne od dawki hamowanie sygnału. Ani PP242, ani rapamycyna nie spowodowały znaczącego spadku żywotności komórek, co wskazuje, że spadek luminescencji w systemie komplementacji eIF4E-eIF4G nie jest spowodowany niespecyficzną śmiercią komórki, ale raczej zakłóceniem interakcji EIF4E-4G. Analiza Western blot, przeprowadzona po eksperymencie m7GTP pull down, wykazała, że zakłócenie endogennej interakcji eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP1 koreluje ze zmierzonym sygnałem testu eIF4E-eIF4G.PP242 był silniejszym inhibitorem całkowitej fosforylacji 4EBP1 niż rapamycyna. Oba inhibitory wykazały normalny wpływ na sygnalizację mTOR, przy czym rapamycyna była bardziej aktywna wobec substratów mTORC1, a PP242 był ukierunkowany zarówno na mTORC1, jak i mTORC2. Najbardziej krytycznym aspektem tego produktu jest wysiew komórek w dniu transakcji, ponowne wysiew komórek w pożywce bez czerwieni fenolowej, ocena luminescencji testu komplementacji eIF4E-eIF4G i przeprowadzenie testu żywotności na tej samej płytce.Wtórny test żywotności można przeprowadzić w celu oceny dowolnego leku o docelowym i znanym specyficznym działaniu.

monitoring-eif4f-assembly-measuring-eif4e-eif4g-interaction-live

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Eksperymenty immunoprecypitacji SILAC stanowią potężny sposób na odkrycie nowych interakcji białko-białko. Umożliwiając dokładną względną kwantyfikację obfitości białek zarówno w próbkach kontrolnych, jak i testowych, prawdziwe interakcje można łatwo odróżnić od zanieczyszczeń eksperymentalnych, a interakcje o niskim powinowactwie zachować dzięki zastosowaniu mniej rygorystycznych warunków buforowych.

Identyfikacja partnerów interakcji białkowych w komórkach ssaków za pomocą proteomiki ilościowej SILAC-immunoprecypitacji

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Tutaj opisujemy procedurę pozwalającą na szczegółową analizę zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał fosfospecyficznych.

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli komórek ludzkich do analizy czynników inicjacji translacji, które wiążą 5' czapeczkę mRNA podczas fizjologicznych warunków tlenowych. Metoda ta wykorzystuje analog kapu m7GTP sprzężonego z agarozą i jest odpowiednia do badania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów.

Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia czasoprzestrzennej dynamiki aktywacji i fosforylacji Akt w żywych komórkach HepG2. Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii metodą Förster (FRET) jest potężnym narzędziem, które dostarcza cennych informacji na temat szlaków sygnalizacji insuliny i regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych.

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2

Poznaj metodę pomiaru interakcji białkowej eIF4E-eIF4G w żywych komórkach w celu oceny wpływu leków na kompleks eIF4F. Ta technika wspiera odkrywanie nowych inhibitorów w badaniach nad rakiem.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Przeglądaj więcej filmów