Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Regulacja sygnalizacji kompleksu eIF4F wiąże się ze zwiększoną translacją podzbioru mRNA, który bierze udział w proliferacji i przeżyciu raka. W tym miejscu opisujemy testy interakcji białko-białko oparte na komórkach eIF4E-eIF4G, które pozwalają nam ocenić wywołane lekiem zaburzenia integralności kompleksu eIF4F w żywych komórkach. Rośnie zainteresowanie opracowywaniem metod, które skutecznie celują w granicę faza białko-białko.

Wyobrażaliśmy sobie, że nasze testy PPI eIF4E-eIF4G pomogą we wspieraniu tych strategii i ich walidacji. Test ten zapewni optymalny schemat pierwotny, który pozwoli mu na optymalizację inhibitorów eIF4E-eIF4G. Prawidłowe wysiewanie komórki i wykonywanie transfekcji transferowej jest najtrudniejszym aspektem tego produktu, ponieważ może bezpośrednio odbijać się na tłumieniu systemu raportowania PPI.

Po rozmrożeniu i zliczeniu komórek, wysiewaj 6-dołkowe płytki komórkami HEK 293, używając 2 mililitrów standardowego podłoża wzrostowego na dołek. Rankiem 2 dnia, dla każdej struganej transfekcji, rozcieńczyć 9 mikrolitrów roztworu na bazie liposomów w probówce zawierającej 125 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej. Podczas gdy rozcieńczone liposomy inkubują w temperaturze pokojowej przez 5 minut, przygotuj główną mieszankę DNA, rozcieńczając 3 mikrogramy każdego plazmidu w 125 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy dla każdej probówki do transfekcji.

Dodaj 12 mikrolitrów odczynników wzmacniających do DNA master mix 2, a następnie dobrze wymieszaj. Natychmiast dodaj tę mieszaninę do każdej probówki rozcieńczonych liposomów w stosunku 1 do 1. Po inkubacji tego kompleksu lipidowego DNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, dodaj kompleks do każdej studzienki z 6 płytek dołkowych.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Rankiem 3 dnia spłucz każdą studzienkę 1 mililitrem PBS i dodaj 0,3 mililitra trypsyny. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut.

Po inkubacji zneutralizować trypsynę, dodając 2 mililitry do każdej studzienki zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej. Przenieś transfekowane komórki do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 290x G przez 5 minut.

Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 mililitrach zredukowanej pożywki surowicy. Zasiać transfekowane komórki HEK 293 w 96-dołkowych nieprzezroczystych płytkach, o gęstości 30 000 komórek na studzienkę w 90 mikrolitrach pożywki. Aby uzyskać 3 powtórzenia techniczne dla 3 różnych związków w tym samym eksperymencie, należy zasiać 60 dołków.

Wyklucz studzienki na krawędziach. Natychmiast po wysianiu transfekowanych komórek dodaj 10 mikrolitrów 10% roztworu związku DMSO do każdej studzienki. Przygotuj 1 milimolowe roztwory podstawowe związków, rozpuszczając każdy interesujący Cię związek w 100% DMSO.

Aby uzyskać 3 powtórzenia dla każdego miareczkowania złożonego, należy użyć 8 mikrolitrów 1 milimolowego roztworu podstawowego związku. Przeprowadzić dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego roztworu związku podstawowego w 8 dołkach 96-dołkowej płytki PCR, pipetując 4 mikrolitry 1 milimolowego materiału wyjściowego do 4 mikrolitrów 100% DMSO dla każdego punktu miareczkowania. Odrzucić nadmiar 4 mikrolitrów po ostatnim punkcie dwukrotnego seryjnego rozcieńczenia.

Dodaj 36 mikrolitrów sterylnej wody klasy HPLC do każdej probówki, aby przygotować 40 mikrolitrów 10x złożonych roztworów do seryjnego rozcieńczania w 10% DMSO. Przygotuj również kontrolkę. 10% DMS tylko roztwór podstawowy w sterylnej wodzie klasy HPLC.

Dodaj 10 mikrolitrów 10x roztworów roboczych do komórek w 96-dołkowej nieprzezroczystej płytce, aby uzyskać zamierzone stężenie końcowe, przy resztkowym stężeniu DMSO wynoszącym 1%Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 3 godziny. Po 3 godzinach należy rozpocząć przygotowanie odczynnika substratowego lucyferazy, łącząc 1 objętość substratu z 19 objętościami odczynnika rozcieńczającego. Użyj pipety wielokanałowej, aby natychmiast dodać 25 mikrolitrów odczynnika substratowego do każdego dołka 96-dołkowej płytki z komórkami.

Potrząsaj płytką na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 350 obr./min przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Aby ocenić luminescencję, umieść płytkę na czytniku płytek. Ustaw czytnik lusterek na luminescencję, a filtr emisyjny na 455.

Użyj wysokości pomiaru 6,5 milimetra przy czasie pomiaru wynoszącym 1 sekundę. Aby ocenić żywotność komórek, dodaj 33 mikrolitry odczynnika do oznaczania żywotności do każdej studzienki. Po 15 minutach w temperaturze pokojowej oceń luminescencję za pomocą czytnika płytek, ustawiając czytnik lustrzany na luminescencję, a filtr emisyjny na 600.

Użyj wysokości pomiaru 6,5 milimetra i czasu pomiaru wynoszącego 1 sekundę. Wykorzystaj dane z czytnika płytek, aby określić wartość IC 50 dla każdego związku, dopasowując dane do krzywej równania krzywej dopasowania 4-parametrowego opisanego w manuskrypcie. Komórki HEK 293 transfekowano systemem komplementacji eIF4E-eIF4G, a następnie cofnięto i leczono inhibitorami mTOR.

Gdy luminescencję oceniano 4 godziny po leczeniu, zarówno PP242, jak i rapamycyna powodowały zależne od dawki hamowanie sygnału. Ani PP242, ani rapamycyna nie spowodowały znaczącego spadku żywotności komórek, co wskazuje, że spadek luminescencji w systemie komplementacji eIF4E-eIF4G nie jest spowodowany niespecyficzną śmiercią komórki, ale raczej zakłóceniem interakcji EIF4E-4G. Analiza Western blot, przeprowadzona po eksperymencie m7GTP pull down, wykazała, że zakłócenie endogennej interakcji eIF4E-eIF4G za pośrednictwem 4EBP1 koreluje ze zmierzonym sygnałem testu eIF4E-eIF4G.

PP242 był silniejszym inhibitorem całkowitej fosforylacji 4EBP1 niż rapamycyna. Oba inhibitory wykazały normalny wpływ na sygnalizację mTOR, przy czym rapamycyna była bardziej aktywna wobec substratów mTORC1, a PP242 był ukierunkowany zarówno na mTORC1, jak i mTORC2. Najbardziej krytycznym aspektem tego produktu jest wysiew komórek w dniu transakcji, ponowne wysiew komórek w pożywce bez czerwieni fenolowej, ocena luminescencji testu komplementacji eIF4E-eIF4G i przeprowadzenie testu żywotności na tej samej płytce.

Wtórny test żywotności można przeprowadzić w celu oceny dowolnego leku o docelowym i znanym specyficznym działaniu.