Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster
20 kwietnia 2020
Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.
Drosophila stanowi doskonały model do badania genetycznych podstaw wrażliwości na alkohol, ponieważ można precyzyjnie określić ilościowo wrażliwość na alkohol w kontrolowanym tle genetycznym i warunkach środowiskowych. Aktualne metody pomiaru wrażliwości na alkohol w grupach testowych muszek Drosophila. Przedstawiamy prostą, tanią i wysokoprzepustową metodę oceny wrażliwości na alkohol u dużej liczby pojedynczych much.
Różnice we wrażliwości na alkohol u Drosophila można przełożyć na podobne fenotypy u ludzi, ponieważ muchy dzielą około 75% swoich genów z ludzkimi ortologami. Opracowany przez nas test może być również stosowany do pomiaru wpływu ostrej toksyczności substancji lotnych na inne owady, w tym inne gatunki much lub wektory chorób. Zacznij od stworzenia kartonowego szablonu 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
Obrysuj wokół płytki i wytnij wyznaczony obszar. Następnie użyj kartonowego szablonu, aby stworzyć kawałek małej siatki przeciw owadom wielkości talerza. Umieść małą linię gorącego kleju na obwodzie 24-dołkowej płytki hodowlanej i przymocuj siatkę sitową na wierzchu studzienek.
Następnie użyj gorącego pistoletu do klejenia, aby przymocować drewniany patyczek rzemieślniczy do trzech stron płytki hodowlanej. Przygotuj tyle płytek, ile zmieści się w komorze filmowej. Aby stworzyć komorę filmową, wytnij otwór wielkości obiektywu kamery wideo po jednej stronie styropianowego pudełka i dodatkowe nacięcie na rozmiar podkładki oświetleniowej po przeciwnej stronie.
Włóż podkładkę oświetleniową do szczeliny i umieść kamerę w otworze obiektywu nad podkładką oświetleniową. Umieść wszystkie materiały testowe w kontrolowanym środowisku, najlepiej w komorze behawioralnej o wilgotności około 30%, temperaturze 25 stopni Celsjusza, równomiernym przepływie powietrza i poziomie hałasu poniżej 65 decybeli. Użyj wcześniej wykonanego kartonowego szablonu, aby wyciąć dwa kawałki gazy.
Następnie odpipetuj jeden mililitr 100% etanolu przez siatkę sitową do każdej studzienki. Osusz siatkę i połóż na wierzchu dwa kawałki gazy. Wytnij mały kawałek cienkiej, elastycznej, plastikowej deski do krojenia, używając kartonowego szablonu jako prowadnicy do powiększenia obszaru o jeden do dwóch centymetrów na jednym z krótszych boków.
Po przecięciu upewnij się, że plastik nadal mieści się między trzema drewnianymi patyczkami rzemieślniczymi na aparacie testowym, ale zwisa z jednego końca. Przygotuj aspirator zgodnie ze wskazówkami rękopisu i użyj go do przeniesienia jednej muchy na dołek do 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej, przykrywając wszelkie studzienki wcześniej zasysanymi muchami elastycznym tworzywem sztucznym. Zapisać położenie studzienki i wszelkie istotne informacje o genotypie lub fenotypie każdej muchy.
Trzymać elastyczny plastik równo z górną częścią płytki do hodowli komórkowej zawierającej muchy i odwrócić płytkę na wierzch zmodyfikowanej płytki do hodowli komórkowej z etanolem. Użyj patyczków rzemieślniczych, aby wyrównać odwróconą płytkę hodowli komórkowej, upewniając się, że każda studzienka z etanolem jest wyrównana z każdą studzienką zawierającą muchę. Upewnij się, że podkładka oświetleniowa świeci z pełną jasnością i rozpocznij nagrywanie za pomocą kamery wideo.
Wystaw muchy na działanie etanolu, ostrożnie usuwając plastik między dwiema płytami, uważając, aby nie usunąć gazy. Gdy podejrzewa się, że wszystkie muchy straciły kontrolę nad postawą, mocno postukaj w środek płytki. Jeśli wystąpi ruch, kontynuuj nagrywanie, stukając co jedną do dwóch minut, aż nie nastąpi żaden ruch.
Zakończ nagrywanie, gdy nie ma ruchu. Aby odzyskać muchy, należy zdjąć górną płytkę z aparatury testowej i zassać poszczególne muchy do wybranych pojemników. Wymieniać etanol na zmodyfikowanych płytkach do hodowli komórkowych co najmniej raz na godzinę, aby utrzymać stałą ekspozycję na etanol przez cały czas trwania testu, i powtórzyć eksperyment dla tylu próbek, ile jest pożądane.
Obejrzyj nagranie wideo, aby określić czas sedacji muchy, który definiuje się jako moment, w którym mucha traci kontrolę nad postawą i zdolność lokomotoryczną. Aby zapewnić dokładność, obejrzyj film w odwrotnej kolejności i nagraj czas, w którym mucha zaczyna się poruszać. Ta metoda może być wykorzystana do wygenerowania danych na temat dużej liczby much w ciągu 10 minut.
Dwie 24-dołkowe płytki użyto do jednoczesnego pomiaru czasu sedacji etanolem dla 48 pojedynczych muszek z dwóch linii DGRP o różnej wrażliwości na alkohol. Duże rozmiary próbek zwiększają dokładność i zmniejszają błąd związany ze zmiennością środowiska. RAL_555 muchy były mniej czułe niż muchy RAL-177.
Samce i samice RAL_177 nie wykazywały efektu dymorfizmu płciowego, podczas gdy samice linii RAL_555 były mniej wrażliwe na ekspozycję na etanol niż samce. Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby precyzyjnie wykonać aspirację much i odwrócenie płytki hodowli komórkowej, aby osiągnąć pożądany rezultat. Ponieważ zdolność do oceny pojedynczych much pozwala uniknąć zakłóceń spowodowanych interakcjami grupowymi, test ten zwiększa użyteczność modelu Drosophila w wysokoprzepustowych badaniach nad ostrymi skutkami ekspozycji na alkohol.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia prosty i kosztowo efektywny test wysokoprzepustowy służący do oceny wrażliwości na sedację alkoholem u poszczególnych much Drosophila. Metoda ta pozwala na precyzyjną kwantyfikację wrażliwości na alkohol w kontrolowanych warunkach, co zwiększa użyteczność Drosophila jako modelu do badania czynników genetycznych związanych z wrażliwością na alkohol.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Genetyka
Wprowadzenie
- Muszka owocówka (Drosophila) jest cennym organizmem modelowym do badania wrażliwości na alkohol ze względu na podobieństwa genetyczne do ludzi.
- Obecne metody zazwyczaj oceniają grupy much, co może maskować różnice indywidualne.
- Nowy test pozwala na ocenę pojedynczych much, co redukuje wpływ czynników zakłócających wynikających z interakcji grupowych.
- Zrozumienie wrażliwości na alkohol u Drosophila może dostarczyć wiedzy na temat podobnych fenotypów u ludzi.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowej metody pomiaru wrażliwości na sedację alkoholem u poszczególnych osobników Drosophila.
- Umożliwienie analizy dużych prób w celu zwiększenia dokładności wyników.
- Zbadanie podłoży genetycznych wrażliwości na alkohol z wykorzystaniem różnych linii Drosophila.
Zastosowane metody
- Wykonanie tekturowego szablonu dla 24-dołkowej płytki hodowlanej.
- Wykorzystanie siatki przeciw owadom oraz kleju na gorąco do przygotowania układu testowego.
- Kontrolowane warunki środowiskowe podczas testów, w tym wilgotność i temperatura.
- Rejestracja zachowania much w odpowiedzi na ekspozycję na etanol w celu określenia czasu sedacji.
Główne wyniki
- Test pozwolił na pomyślne pomiar czasy sedacji etanolem dla 48 poszczególnych much z dwóch różnych linii DGRP.
- Muchy z linii RAL_555 wykazały mniejszą wrażliwość na etanol w porównaniu do much z linii RAL-177.
- W linii RAL_177 nie zaobserwowano efektów dymorfizmu płciowego, natomiast samice z linii RAL_555 były mniej wrażliwe niż samce.
- Metoda ta umożliwia szybkie gromadzenie danych dla dużych grup much.
Wnioski
- Analiza ta zwiększa możliwość badania wrażliwości na alkohol u Drosophila przy wysokiej przepustowości.
- Zapewnia ona niezawodny sposób oceny indywidualnych różnic w wrażliwości na alkohol.
- Otrzymane wyniki przyczyniają się do zrozumienia czynników genetycznych wpływających na wrażliwość na alkohol.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe ilościowe oznaczanie sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster umożliwia precyzyjną analizę genetyczną wrażliwości na alkohol w ściśle kontrolowanych warunkach. Ten skalowalny test wspiera wczesną walidację celów orazB ograniczanie ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do fenotypów neurobehawioralnych istotnych dla ludzkiej reakcji na alkohol. Przepustowość i powtarzalność tej metody pozycjonują ją jako podstawowe narzędzie do selekcji portfela badań oraz odkryć opartych na hipotezach w dziedzinie neurogenetyki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie determinantów genetycznych leżących u podstaw wrażliwości na alkohol w kontrolowanym systemie modelowym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolowanie relacji genotyp-fenotyp na poziomie pojedynczych osobników.
- Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych poprzez modelowanie konserwowanych odpowiedzi behawioralnych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, powtarzalne testy behawioralne do późniejszego przesiewu związków lub badań nad perturbacjami genetycznymi.
- Standaryzuje ilościowy pomiar czasu sedacji, co zapewnia wysoką powtarzalność testu.
- Umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe gromadzenie danych w celu wiarygodnej oceny fenotypu w dużych kohortach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność z behawioralnymi punktami końcowymi istotnymi dla choroby w celu eksploracji translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych do przedklinicznej walidacji związków neuroaktywnych lub interwencji.
- Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację odpowiedzi na poziomie poszczególnych osobników, co wspiera postęp skorygowany o ryzyko.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta integruje się z wczesnym etapem przejścia od odkrycia do identyfikacji wiodących cząsteczek, umożliwiając weryfikację hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego przed wyborem modelu przedklinicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych i wyjaśnianie szlaków sygnałowych dla genów odpowiedzialnych za wrażliwość na alkohol.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników czasu sedacji, zapewniając gotowość i skalowalność testu.
- Analityka: Zapewnia precyzyjne pomiary oparte na obrazach wideo do statystycznego porównywania genotypów i warunków.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne z fenotypami behawioralnymi istotnymi dla eksploracji przedklinicznej.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptowalną platformę do testowania związków lotnych w różnych modelach owadziego.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandaryzowane, skalowalne i powtarzalne fenotypowanie behawioralne.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywną alokację zasobów na wczesnym etapie odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów genetycznych i punktów końcowych fenotypowych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie genetyki behawioralnej oraz fenotypowania opartego na analizie wideo.
- Wymaga kontrolowanych komór środowiskowych oraz infrastruktury do rejestracji wideo.
- Wymaga standaryzacji protokołów gromadzenia i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda może być dostosowana do innych modeli owadów i ekspozycji na substancje lotne poprzez modyfikację protokołu.
- Precyzja w obchodzeniu się z muszkami oraz wyrównanie płytek są krytyczne dla wiarygodności testu.
