Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster

Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.

Drosophila stanowi doskonały model do badania genetycznych podstaw wrażliwości na alkohol, ponieważ można precyzyjnie określić ilościowo wrażliwość na alkohol w kontrolowanym tle genetycznym i warunkach środowiskowych. Aktualne metody pomiaru wrażliwości na alkohol w grupach testowych muszek Drosophila. Przedstawiamy prostą, tanią i wysokoprzepustową metodę oceny wrażliwości na alkohol u dużej liczby pojedynczych much.

Różnice we wrażliwości na alkohol u Drosophila można przełożyć na podobne fenotypy u ludzi, ponieważ muchy dzielą około 75% swoich genów z ludzkimi ortologami. Opracowany przez nas test może być również stosowany do pomiaru wpływu ostrej toksyczności substancji lotnych na inne owady, w tym inne gatunki much lub wektory chorób. Zacznij od stworzenia kartonowego szablonu 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.

Obrysuj wokół płytki i wytnij wyznaczony obszar. Następnie użyj kartonowego szablonu, aby stworzyć kawałek małej siatki przeciw owadom wielkości talerza. Umieść małą linię gorącego kleju na obwodzie 24-dołkowej płytki hodowlanej i przymocuj siatkę sitową na wierzchu studzienek.

Następnie użyj gorącego pistoletu do klejenia, aby przymocować drewniany patyczek rzemieślniczy do trzech stron płytki hodowlanej. Przygotuj tyle płytek, ile zmieści się w komorze filmowej. Aby stworzyć komorę filmową, wytnij otwór wielkości obiektywu kamery wideo po jednej stronie styropianowego pudełka i dodatkowe nacięcie na rozmiar podkładki oświetleniowej po przeciwnej stronie.

Włóż podkładkę oświetleniową do szczeliny i umieść kamerę w otworze obiektywu nad podkładką oświetleniową. Umieść wszystkie materiały testowe w kontrolowanym środowisku, najlepiej w komorze behawioralnej o wilgotności około 30%, temperaturze 25 stopni Celsjusza, równomiernym przepływie powietrza i poziomie hałasu poniżej 65 decybeli. Użyj wcześniej wykonanego kartonowego szablonu, aby wyciąć dwa kawałki gazy.

Następnie odpipetuj jeden mililitr 100% etanolu przez siatkę sitową do każdej studzienki. Osusz siatkę i połóż na wierzchu dwa kawałki gazy. Wytnij mały kawałek cienkiej, elastycznej, plastikowej deski do krojenia, używając kartonowego szablonu jako prowadnicy do powiększenia obszaru o jeden do dwóch centymetrów na jednym z krótszych boków.

Po przecięciu upewnij się, że plastik nadal mieści się między trzema drewnianymi patyczkami rzemieślniczymi na aparacie testowym, ale zwisa z jednego końca. Przygotuj aspirator zgodnie ze wskazówkami rękopisu i użyj go do przeniesienia jednej muchy na dołek do 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej, przykrywając wszelkie studzienki wcześniej zasysanymi muchami elastycznym tworzywem sztucznym. Zapisać położenie studzienki i wszelkie istotne informacje o genotypie lub fenotypie każdej muchy.

Trzymać elastyczny plastik równo z górną częścią płytki do hodowli komórkowej zawierającej muchy i odwrócić płytkę na wierzch zmodyfikowanej płytki do hodowli komórkowej z etanolem. Użyj patyczków rzemieślniczych, aby wyrównać odwróconą płytkę hodowli komórkowej, upewniając się, że każda studzienka z etanolem jest wyrównana z każdą studzienką zawierającą muchę. Upewnij się, że podkładka oświetleniowa świeci z pełną jasnością i rozpocznij nagrywanie za pomocą kamery wideo.

Wystaw muchy na działanie etanolu, ostrożnie usuwając plastik między dwiema płytami, uważając, aby nie usunąć gazy. Gdy podejrzewa się, że wszystkie muchy straciły kontrolę nad postawą, mocno postukaj w środek płytki. Jeśli wystąpi ruch, kontynuuj nagrywanie, stukając co jedną do dwóch minut, aż nie nastąpi żaden ruch.

Zakończ nagrywanie, gdy nie ma ruchu. Aby odzyskać muchy, należy zdjąć górną płytkę z aparatury testowej i zassać poszczególne muchy do wybranych pojemników. Wymieniać etanol na zmodyfikowanych płytkach do hodowli komórkowych co najmniej raz na godzinę, aby utrzymać stałą ekspozycję na etanol przez cały czas trwania testu, i powtórzyć eksperyment dla tylu próbek, ile jest pożądane.

Obejrzyj nagranie wideo, aby określić czas sedacji muchy, który definiuje się jako moment, w którym mucha traci kontrolę nad postawą i zdolność lokomotoryczną. Aby zapewnić dokładność, obejrzyj film w odwrotnej kolejności i nagraj czas, w którym mucha zaczyna się poruszać. Ta metoda może być wykorzystana do wygenerowania danych na temat dużej liczby much w ciągu 10 minut.

Dwie 24-dołkowe płytki użyto do jednoczesnego pomiaru czasu sedacji etanolem dla 48 pojedynczych muszek z dwóch linii DGRP o różnej wrażliwości na alkohol. Duże rozmiary próbek zwiększają dokładność i zmniejszają błąd związany ze zmiennością środowiska. RAL_555 muchy były mniej czułe niż muchy RAL-177.

Samce i samice RAL_177 nie wykazywały efektu dymorfizmu płciowego, podczas gdy samice linii RAL_555 były mniej wrażliwe na ekspozycję na etanol niż samce. Podczas prób stosowania tego protokołu ważne jest, aby precyzyjnie wykonać aspirację much i odwrócenie płytki hodowli komórkowej, aby osiągnąć pożądany rezultat. Ponieważ zdolność do oceny pojedynczych much pozwala uniknąć zakłóceń spowodowanych interakcjami grupowymi, test ten zwiększa użyteczność modelu Drosophila w wysokoprzepustowych badaniach nad ostrymi skutkami ekspozycji na alkohol.