Rozszyfrowywanie strukturalnych skutków aktywacji mutacji somatycznych EGFR za pomocą symulacji dynamiki molekularnej

Symulacja dynamiki molekularnej to technika obliczeniowa, która może być wykorzystana do badania ruchów molekularnych i może ujawnić zmiany konformacyjne kluczowe dla zrozumienia funkcji biochemicznych i komórkowych. Badanie zakresu ruchów dynamicznych dostępnych dla makrocząsteczki jest trudne. Wykorzystanie wyników symulacji dynamiki molekularnej w połączeniu z danymi eksperymentalnymi pozwala na ocenę ich znaczenia funkcjonalnego.

Za pomocą symulacji dynamiki molekularnej pokażemy, jak mutacje obserwowane u pacjentów z rakiem wpływają na potwierdzenia celowania w EGFR i wiązanie ligandów. Aby przygotować strukturę naszej kinazy apo aktywnego typu dzikiego, otwórz program do wizualizacji Kymera, a następnie w menu pliku kliknij pobierz według ID.Wybierz bazę danych Banku Danych Białek i określ kod Banku Danych Białek 2GS2. Aby zbudować brakujące elementy konstrukcyjne 2GS2, należy pozyskać te segmenty z innych struktur EGFR.

Aby skonstruować delecję ELREA od pięciu reszt glutaminianu 746 do alaniny 750 w EGFR, kliknij ulubione, sekwencję i pokaż sekwencję, aby otworzyć sekwencję 2GS2 typu dzikiego. W wyświetlonym oknie sekwencji kliknij edytuj i dodaj sekwencję, aby wybrać sekwencję formatu FASTA ze mutantem usuwania. W oknie linii trasowania wybierz strukturę i model lub homologię.

W wyskakującym okienku określ strukturę złożoną 2GS2 jako szablon i sekwencję mutanta jako zapytanie, które ma być modelowane, a następnie wybierz zmutowany model z wynikowych modeli na podstawie wyniku zDOPE i oględzin. Aby przygotować strukturę nieaktywnej kinazy EGFR typu dzikiego, otwórz strukturę Banku Danych Białek 2GS7 i dodaj brakujące segmenty z innych struktur EGFR, modelując zmutowaną formę delecji, jak pokazano. Aby przygotować aktywną strukturę kinazy EGFR typu dzikiego związaną z ATP, należy użyć struktury Banku Danych Białkowych 2ITX jako struktury podstawowej, budując brakujące segmenty przy użyciu innych struktur EGFR i modelując formę mutanta delecji za pomocą modelera, jak pokazano.

Aby skonstruować asymetryczną strukturę dimerów EGFR typu dzikiego, otwórz 2GS2 w Kymera i kliknij narzędzia, strukturę wyższego rzędu i komórkę elementarną, aby przekształcić strukturę w zespół biologiczny, który zawiera kinazy aktywatora i odbiornika w układzie asymetrycznym. Wybierz strukturę 2GS2 i wprowadź utwórz kopie, a następnie wybierz i zapisz pojedynczy asymetryczny dimer z wielu kopii dimeru wynikających z operacji symetrii. Aby zbudować mutanta waliny alaniny 702, wybierz narzędzia, edycję struktury i rotamery, aby zastąpić alaninę 702 waliną.

Otwórz struktury w Maestro i kliknij przycisk kreatora przygotowania białek, a następnie wybierz dodaj atomy wodoru i uzupełnij brakujące atomy łańcucha bocznego, a następnie kliknij przetwarzanie wstępne. Aby określić stany protonacji reszt jonizowalnych przy pH 7,0, kliknij przycisk uściślaj i użyj PROPKA, aby zoptymalizować orientację reszt asparaginy, glutaminy i histaminy do wiązania wodorowego, a następnie zminimalizować strukturę. Aby skonfigurować system symulacji, otwórz program LEAP i zaimportuj pole siłowe Amber FF14SB oraz cząsteczki wody TIP3P.

W przypadku systemów powiązanych z ATP zaimportuj parametry ATP i załaduj strukturę. Roztworuj strukturę w oktaedrycznym pudełku z wyraźnymi cząsteczkami wody TIP3P, które rozciągają się na 10 angstremów we wszystkich kierunkach od atomów powierzchniowych białka. Sprawdź system pasów i dodaj niezbędne jony, aby go zneutralizować.

Aby odpowiednio modelować układy biomolekularne, dodaj dodatkowe atomy sodu i chlorku do pola symulacji, aby doprowadzić stężenie soli w systemie do 0,15 mola, a następnie wygeneruj i zapisz pliki topologii i współrzędnych systemu, które posłużą jako dane wejściowe dla późniejszej symulacji produkcji. Korzystając z Bursztynu, początkowo zminimalizuj energię systemu symulacji, aby obejść wszelkie niekorzystne konfiguracje. W pliku wejściowym minimalizacji dostosuj maksymalną zmienną cyklu dla całkowitego cyklu minimalizacji oraz liczbę cykli, aby wskazać liczbę cykli dla algorytmu najbardziej stromego spadania.

Użyj zmiennej masy utwierdzenia, aby przyłożyć siłę utwierdzenia do atomów substancji rozpuszczonej określonych przez parametr maski utwierdzenia. Przeprowadź minimalizację w wielu krokach, stopniowo zmniejszając ograniczenie zastosowane do atomów substancji rozpuszczonej z 25 do 0 kilokalorii na kwadrat angstrema molowego, a następnie użyj polecenia, aby uruchomić minimalizację. Podgrzej system przez 100 pikosekund od 0 do 300 kelwinów i użyj poleceń, aby ustawić ograniczenie 10 kilokalorii molowych na kwadrat angstrema na atomach substancji rozpuszczonej.

Następnie użyj polecenia, aby przeprowadzić ogrzewanie. Zrównoważ układ przez 900 pikosekund w izotermicznym zespole izobarycznym i ustaw granicę odległości dziewięciu angstremów dla oddziaływań elektrostatycznych dalekiego zasięgu, stopniowo obniżaj ograniczenie atomu substancji rozpuszczonej do 0,1 kilokalorii na kwadrat angstrema molowego i zakończ równowagę nieograniczoną symulacją pięciu nanosekund. Uruchom wyrównanie za pomocą polecenia, jak wskazano.

Dostosuj tekst, aby umożliwić przeprowadzanie symulacji produkcji przez 100 nanosekund z zapisywaniem konformacji co 10 pikosekund, a następnie uruchom symulację za pomocą polecenia, jak wskazano. Aby zobrazować próbkę konformacji podczas symulacji kinazy EGFR typu dzikiego i zmutowanego, otwórz pliki topologii Bursztyn i odpowiadające im pliki trajektorii w Visual Molecular Dynamics. Korzystając z wygodnych reprezentacji struktury drugorzędowej, przeanalizuj ogólną dynamikę strukturalną białek na podstawie zarejestrowanej trajektorii.

Następnie przyjrzyj się specyficznym interakcjom między atomami i pozostałościami będącymi przedmiotem zainteresowania, takimi jak katalitycznie niezbędny mostek solny lizyny 745-glutaminianu 762. Alternatywnie można zapisać wiele konformacji pobranych podczas symulacji w formacie Banku Danych Białkowych i otworzyć je w systemie Kymera. Użyj opcji matchmaker, aby nałożyć struktury na początkową lub środkową strukturę i wyświetlić strukturę mediany w bryle, a resztę wyrównanych struktur w wyblakłej bieli, aby umożliwić wizualizację zarejestrowanych ruchów strukturalnych z większą przejrzystością.

Aby przeanalizować globalną stabilność EGFR typu dzikiego i zmutowanego oraz zbadać elastyczność różnych jednostek strukturalnych, należy zaimportować typologię Amber i odpowiadające jej pliki trajektorii. W pliku wejściowym odchylenia średniokwadratowego wskaż atomy szkieletu początkowej struktury jako odniesienie do dopasowania pierwiastka średniokwadratowego. W pliku wejściowym fluktuacji średniej kwadratowej należy wskazać atomy C-alfa struktury początkowej jako odniesienie do dopasowania pierwiastka średniokwadratowego.

Następnie uruchom analizę za pomocą programu CPPTRAJ i wykreśl dane wyjściowe. Alternatywnie, aby wyrównać zespoły konformacyjne i pokolorować każdą resztę na podstawie odchylenia średniej kwadratowej pierwiastka atomu C-alfa, otwórz konformacje w Kymera i wyrównaj je z opcją matchmakera. Wybierz narzędzia, opis i renderuj według atrybutu.

Zaznacz reszty zespołów konformacyjnych i ustaw odchylenie średniej kwadratowej pierwiastka C-alfa jako atrybuty, a następnie kliknij przycisk OK. Ślad łańcucha konformacji będzie pokolorowany na niebiesko, biało lub czerwono, odzwierciedlając odpowiednio obszary wysokiej, średniej i niskiej stabilności strukturalnej. Aby przeanalizować interakcje wiązań wodorowych między ATP a EGFR typu dzikiego i delecyjnego, przygotuj skrypt CPPTRAJ do wykonania tego zadania. Określić analizę dla międzycząsteczkowych wiązań wodorowych tylko ze zmienną nointramolową i zdefiniować wiązanie wodorowe o odległości akceptora donora mniejszej lub równej 3,5 angstrema i kącie wiązania większym lub równym 135 stopni.

Aby ocenić oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe, na przykład między katalitycznie ważnymi resztami lizyny i glutaminianu, należy określić lizynę jako donor wodoru i glutaminian jako reszty akceptorowe i uruchomić skrypt zgodnie ze wskazaniami, aby umożliwić analizę wyniku. Aby obliczyć wolne energie wiązania między ATP a EGFR typu dzikiego i delecyjnego, przygotuj pliki banku danych białek receptora liganda w fazie gazowej i kompleksu receptora liganda w programie LEAP i ustaw ATP jako ligand, a EGFR jako receptor. Ustaw uogólnioną wartość radiową born na M Bond I2. Następnie wygeneruj pliki topologii bursztynowej i współrzędnych dla plików banku danych białek w fazie gazowej.

Podobnie, aby obliczyć swobodne energie wiązania między kinazami aktywatora i odbiornika EGFR typu dzikiego i alaniny 702 waliny, określ kinazę odbiorczą jako ligand, a kinazę aktywatora jako receptor i zapisz odpowiednią topologię i pliki współrzędnych. Przygotuj plik wejściowy z uogólnioną powierzchnią biologiczną mechaniki molekularnej i ustaw wartość IGB na dwa, a saltcon na 0,1. Następnie za pomocą mmpbsa.

py dostępny w Amber, wprowadź polecenie zgodnie ze wskazaniami, aby wykonać obliczenia energii wiązania i przeanalizować dane wyjściowe. Podczas tej reprezentatywnej 100-nanosekundowej symulacji mutant alaniny 702 waliny wykazał zwiększoną stabilność konformacyjną segmentu B przybłony, prawdopodobnie z powodu ściślejszych oddziaływań hydrofobowych w porównaniu z EGFR typu dzikiego. Mutant waliny alaniny 702 wykazywał również niższą energię swobodną wiązania między kinazami aktywatora i odbiornika w porównaniu z EGFR typu dzikiego, co stanowi korzystniejsze oddziaływania dimerowe, które utrzymują aktywną konformację kinazy EGFR.

Symulacja mutacji delecyjnej skutkowała niższymi fluktuacjami atomu C-alfa kluczowej funkcjonalnie helisy alfa C-helisy w porównaniu z EGFR typu dzikiego, wydłużając czas stanu aktywnego EGFR. Mutacja delecyjna spowodowała również częste tworzenie wiązań wodorowych między polarnymi atomami lizyny 745 i glutaminianu 762 w łańcuchu bocznym, co jest kluczową interakcją dla aktywności enzymatycznej EGFR w porównaniu z EGFR typu dzikiego. Ponadto liczba wiązań wodorowych między ATP i EGFR była większa dla mutanta delecji niż dla EGFR typu dzikiego.

Mutacja delecyjna spowodowała również ruch do wewnątrz nieaktywnej helisy alfa C-helisy EGFR, co jest zmianą strukturalną oczekiwaną podczas przejścia do stanu aktywnego. W przeciwieństwie do tego, alfa C-helisa nieaktywnego EGFR typu dzikiego zachowała swoją początkową konformację. Aby ocenić wpływ mutacji, kluczowe znaczenie ma wybór odpowiednich stanów konformacyjnych struktur oraz odpowiednie przygotowanie i zrównoważenie tych struktur.

Ważne jest, aby połączyć symulacje dynamiki molekularnej z badaniami eksperymentalnymi, ponieważ synergia między tymi technikami korzystnie wpływa na interpretację wyników i może dostarczyć informacji do dodatkowych eksperymentów w laboratorium mokrym.