Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek
18 czerwca 2020
Zewnątrzkomórkowe DNA (ecDNA) uwalniane podczas śmierci komórki jest prozapalne i przyczynia się do stanu zapalnego. Pomiar ecDNA w miejscu urazu może określić skuteczność leczenia w narządzie docelowym. Protokół ten opisuje wykorzystanie narzędzia uczenia maszynowego do automatyzacji pomiaru ecDNA w tkance nerkowej.
Kłębuszkowe zapalenie nerek powoduje patologiczne uszkodzenie kłębuszków nerkowych ze znaczną śmiercią komórek i uwalnianiem zewnątrzkomórkowego DNA. Protokół ten umożliwia wizualizację zewnątrzkomórkowego DNA w miejscu uwolnienia podczas urazu patologicznego. Zaletą tej techniki jest to, że mierzy zewnątrzkomórkowe DNA ze śmierci komórki w nerce.
W przeciwieństwie do surowicy lub moczu, pomiar zewnątrzkomórkowego DNA jest zastępczym markerem uszkodzenia patologicznego. Znaczenie tej metody polega na tym, że zarówno zewnątrzkomórkowe barwienie DNA, jak i analiza obrazu są łatwo przenoszone na inne choroby autoimmunologiczne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów i toczeń. Metoda ta wymaga podstawowej wiedzy z zakresu histologii nerek.
Aby umożliwić dokładne wykrycie zewnątrzkomórkowego DNA kłębuszkowego, badacz musi być w stanie prawidłowo zidentyfikować kłębuszki nerkowe. W przypadku barwienia zewnątrzkomórkowego DNA należy najpierw podgrzać próbki w stojaku na szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie zanurzyć szkiełka w dwóch 40-minutowych zmianach rozpuszczalnika w dygestorium. Po drugim zanurzeniu należy ponownie nawodnić próbki dwa razy w 100% etanolu i jeden raz w 70% etanolu przez pięć minut na zabieg.
Po ostatnim zabiegu za pomocą szczypiec umieść szkiełka we wrzącym roztworze do pobierania antygenu w szybkowarze na wysokich obrotach przez 10 minut. Po zdemaskowaniu epitopów antygenu przenieś szybkowar z ognia do zlewu i natychmiast przelej pokrywę zimną wodą z kranu. Pozostawić szkiełka do zrównoważenia przez 20 minut w roztworze do pobierania antygenu, a następnie przemyć próbki dwukrotnie w 0,01 molowym PBS na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut na przemycie.
Po drugim myciu użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół próbek tkanki nerkowej i zablokuj wszelkie niespecyficzne barwienia 60 mikrolitrami 10% surowicy kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji ostrożnie zastąp roztwór blokujący 60 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w komorze wilgotnościowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj szkiełka na wytrząsarce orbitalnej w PBS przez dwie minuty na mycie, a następnie dodaj 60 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem do każdego szkiełka na 40-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji umyć szkiełka w PBS, jak pokazano, a następnie poddać działaniu 0,3% czerni Sudan w 70% etanolu, aby stłumić potencjalną autofluorescencję wywołaną formaliną. Po 30 minutach umyj szkiełka w wodzie z kranu, aby usunąć wszelkie osady i zanurz szkiełka w PBS na 10 minut, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się czarnego osadu Sudanu. Pod koniec inkubacji zamontuj szkiełka na konfokalnych szklanych szkiełkach nakrywkowych za pomocą trzech 60 mikrolitrów kropli roztworu montażowego uzupełnionego DAPI i uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.
Pozostaw szkiełka do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem do czasu zobrazowania za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Pamiętaj, aby uszczelnić szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas obrazowania i oczyścić szkiełka nakrywkowe z etanolu, aby zwiększyć rozdzielczość obrazowania.
Po zobrazowaniu 20 kłębuszków nerkowych na slajd otwórz możliwą do trenowania wtyczkę Weka Segmentation w ImageJ i upuść pierwszy obraz na pasku narzędzi ImageJ. Kliknij kanały obrazu, koloru i podziału. Pojawi się obraz przedstawiający pierwotne barwienie przeciwciałami.
Aby utworzyć scalony plik z pojedynczymi obrazami, kliknij opcję Kolor i Scal kanały. Pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o przypisanie koloru do każdego kanału. Zaznacz pola Utwórz kompozyt i zachowaj obrazy źródłowe, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się scalony obraz kompozytowy.
Korzystając z podstawowego barwienia przeciwciałami jako przewodnika, narysuj obszar zainteresowania wokół kępki kłębuszków nerkowych. Aby wykonać rozmycie gaussowskie na pojedynczym niebieskim obrazie DAPI, kliknij opcję proces, filtry i rozmycie gaussowskie. Ustaw rozmycie od jednego do dwóch.
Obraz stanie się nieco rozmyty, ale jądra będą wydawały się gładkie, tło zostanie zmiękczone. Następnie kliknij wtyczki, segmentację i trenowaną segmentację Weka i użyj narzędzia wolnej ręki, aby prześledzić nienaruszone jądra. Po dodaniu wszystkich interesujących jąder w polu dodaj klasę pierwszą, użyj narzędzia linii, aby wyznaczyć obszary tła do pola klasy drugiej.
Kliknij utwórz nową klasę i użyj narzędzia linii, aby obrysować pozajądrowe DNA barwione DAPI. Kliknij klasyfikator trenowania i uzyskaj prawdopodobieństwo. Przełącz mysz, aby uzyskać czarno-biały obraz wszystkich komponentów z zaznaczonym na biało obiektem zaznaczenia.
Aby zduplikować ten obraz, kliknij obraz i powiel. Pod obrazem dostosuj i próg. Użyj przycisku myszy, aby dostosować próg, aż zaobserwowane zostanie tylko zewnątrzkomórkowe DNA.
Po progowaniu kliknij pozycję proces, binarny i utwórz binarny, a następnie skopiuj wcześniej wygenerowany obszar kłębuszków nerkowych. Naciśnij Control Shift E, aby wybrać opcję edycja, zaznaczenia i przywracanie, aby przywrócić zaznaczenie. Aby zmierzyć tylko zewnątrzkomórkowe cząstki DNA w kłębuszku nerkowym, kliknij Analizuj cząstki i OK. Zostanie wygenerowany arkusz wyników pokazujący liczbę cząstek, powierzchnię, średnią liczbę pikseli i procent kłębuszków nerkowych zawierających zewnątrzkomórkowe DNA.
Aby zapisać klasyfikator jako zewnątrzkomórkowy klasyfikator DNA, kliknij Zapisz klasyfikator i zapisz dane. Aby ponownie zastosować model do kolejnych obrazów, powtórz początkowe przetwarzanie obrazu, jak pokazano, przed wybraniem klasyfikatora obciążenia i zapisanego pliku klasyfikatora. Pojawi się menu dziennika i uruchomi model.
Po uruchomieniu modelu kliknij przycisk Załaduj dane i wybierz plik extracellularDNA.arff. Następnie kliknij utwórz wynik. Jeśli wynikowy obraz nie zdołał pobrać wszystkich jąder, tła lub zewnątrzkomórkowego DNA, kliknij przycisk Klasyfikator ponownego trenowania i w razie potrzeby dodaj więcej klasyfikatorów.
Tutaj pokazane są obrazy jednokanałowe pokazujące reprezentatywne barwienie DNA i beta aktyny. Połączenie tych dwóch obrazów pozwala na narysowanie obszaru zainteresowania wokół obszaru kłębuszków nerkowych w celu pomiaru zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkach nerkowych myszy przy użyciu trenowalnej segmentacji Weka, jak pokazano. Model ten można zastosować do identyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w próbkach z biopsji nerki od pacjenta kontrolnego lub porównania z biopsją nerki od pacjenta z zapaleniem naczyń związanym z mielooperoksydazą ANCA.
Ponadto program ten można przełożyć na inne barwienia w próbkach tkanek nerkowych, na przykład na barwienie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili i odkładanie się zewnątrzkomórkowej mieloperoksydazy w zapaleniu naczyń związanym z ANCA. Co ważne, nie obserwuje się istotnych różnic, gdy te same dane są analizowane przez wielu użytkowników. Najważniejszym etapem analizy jest dostarczenie wystarczającej liczby przykładów tła, jąder i zewnątrzkomórkowego DNA z kłębuszkami nerkowymi jako klasyfikatorami, z których można się uczyć w programie segmentacji Weka.
Ta metoda jest łatwa do przeniesienia. Na przykład, dalsza analiza różnych typów śmierci komórek może być badana poprzez barwienie pod kątem specyficznych przeciwciał przeciwko markerom apoptozy lub martwicy. Nasza technika może być stosowana w innych procesach zapalnych, takich jak ocena ekspresji TLR w autoimmunologicznej chorobie nerek lub ekspresji zewnątrzkomórkowej mieloperoksydazy w biopsjach ludzkich nerek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół umożliwia wizualizacje pozakomórkowego DNA (ecDNA) uwalnianego podczas śmierci komórek w tkankach nerkowych, co jest kluczowe dla zrozumienia patologicznego uszkodzenia kłębuszków nerkowych. Metoda ta pozwala na pomiar ecDNA jako surogatowego wskaźnika uszkodzenia nerek, dostarczając informacji na temat skuteczności terapii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Patologia
Tło
- Kłębuszkowe zapalenie nerek prowadzi do znacznej śmierci komórek i uwalniania ecDNA.
- ecDNA ma działanie prozapalne i przyczynia się do stanu zapalnego.
- Pomiar ecDNA może wskazywać na skuteczność leczenia.
- Ta technika może być zastosowana do innych chorób autoimmunologicznych.
Cel badania
- Wizualizacja ecDNA w miejscu uwolnienia podczas uszkodzenia nerki.
- Ustawienie ecDNA jako wskaźnika patologicznego uszkodzenia.
- Dostarczenie metody, która może być przystosowana do innych warunków.
Stosowane metody
- Wizualizacja ecDNA w tkance nerkowej.
- Analiza obrazów do ilościowego określenia ecDNA.
- Wymagana podstawowa wiedza na temat histologii nerek.
- Zastosowanie narzędzi uczenia maszynowego do automatyzacji.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja ecDNA w tkance nerkowej.
- Wykazana korelacja między poziomem ecDNA a uszkodzeniem nerki.
- Metoda jest przenośna na inne choroby autoimmunologiczne.
- Dostarcza niezawodnego surogatowego wskaźnika do oceny uszkodzenia.
Wnioski
- Pomiar ecDNA jest cennym narzędziem do zrozumienia patologii nerek.
- Technika ta może poprawić monitorowanie terapeutyczne.
- Możliwość szerszych zastosowań w badaniach nad chorobami autoimmunologicznymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables objective, automated quantification of extracellular DNA (ecDNA) in formalin-fixed paraffin-embedded kidney tissue, addressing a critical gap in measuring cell death directly at the site of pathological injury. By leveraging trainable Weka segmentation for image analysis, the method reduces manual annotation burden and provides reproducible, quantitative readouts that support mechanistic de-risking in autoimmune disease models. The approach enhances target validation confidence by linking ecDNA release to specific cell death pathways (apoptosis, necrosis, NETs) in glomerulonephritis, offering translational relevance for biomarker development and preclinical efficacy assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying ecDNA as a direct readout of glomerular cell death in disease models.
- Operational Value: Supports functional target validation by distinguishing ecDNA levels between healthy and diseased tissue, clarifying mechanism of action.
- Predictive Value: Generates quantitative data to assess target engagement and biological de-risking in preclinical vasculitis models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs (particle count, area, percentage glomeruli positive) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Demonstrates no significant inter-user variability when sufficient training examples are provided, supporting assay robustness.
- Scalability: Trained classifier can be applied to subsequent images, enabling batch processing and reducing manual intervention in large-scale studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a consistent ecDNA measurement approach across murine models and human FFPE biopsies.
- Biomarker Alignment: ecDNA serves as a disease-relevant surrogate marker for renal injury, aligning with pathophysiological processes in ANCA-associated vasculitis.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective comparison of ecDNA levels across treatment groups to inform go/no-go criteria in therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, enabling standardized assay deployment in screening, and providing quantitative analytics for translational decision-making.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by linking ecDNA release to specific cell death mechanisms (e.g., NETosis, apoptosis) in glomerulonephritis models.
- Screening: Generates standardized, quantitative image-based readouts that support assay reproducibility and compound effect evaluation.
- Analytics: Delivers measurable outputs (ecDNA particle area, count, glomerular occupancy) that allow comparative analysis between experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity from murine GN models to human kidney biopsy analysis via conserved ecDNA detection in FFPE tissue.
- Enterprise Reuse: Trainable Weka classifier is a reusable asset adaptable to other organs and stains (e.g., NETs, ecMPO) beyond initial ecDNA application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing objective, spatially resolved ecDNA quantification in the target organ.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through machine learning–driven segmentation, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by delivering quantitative, mechanism-linked biomarkers for preclinical vasculitis programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on ecDNA modulation efficacy in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in kidney histology to accurately identify glomeruli and define regions of interest.
- Depends on confocal imaging infrastructure and ImageJ with trainable Weka segmentation plugin for analysis.
- Necessitates standardization of staining, antigen retrieval, and autofluorescence quenching steps across laboratories.
- Requires sufficient training data (background, nuclei, ecDNA examples) to build a robust classifier for reliable segmentation.
- Limited to 2D image analysis; z-stack or 3D ecDNA quantification would require additional validation.
