Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek

Kłębuszkowe zapalenie nerek powoduje patologiczne uszkodzenie kłębuszków nerkowych ze znaczną śmiercią komórek i uwalnianiem zewnątrzkomórkowego DNA. Protokół ten umożliwia wizualizację zewnątrzkomórkowego DNA w miejscu uwolnienia podczas urazu patologicznego. Zaletą tej techniki jest to, że mierzy zewnątrzkomórkowe DNA ze śmierci komórki w nerce.

W przeciwieństwie do surowicy lub moczu, pomiar zewnątrzkomórkowego DNA jest zastępczym markerem uszkodzenia patologicznego. Znaczenie tej metody polega na tym, że zarówno zewnątrzkomórkowe barwienie DNA, jak i analiza obrazu są łatwo przenoszone na inne choroby autoimmunologiczne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów i toczeń. Metoda ta wymaga podstawowej wiedzy z zakresu histologii nerek.

Aby umożliwić dokładne wykrycie zewnątrzkomórkowego DNA kłębuszkowego, badacz musi być w stanie prawidłowo zidentyfikować kłębuszki nerkowe. W przypadku barwienia zewnątrzkomórkowego DNA należy najpierw podgrzać próbki w stojaku na szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie zanurzyć szkiełka w dwóch 40-minutowych zmianach rozpuszczalnika w dygestorium. Po drugim zanurzeniu należy ponownie nawodnić próbki dwa razy w 100% etanolu i jeden raz w 70% etanolu przez pięć minut na zabieg.

Po ostatnim zabiegu za pomocą szczypiec umieść szkiełka we wrzącym roztworze do pobierania antygenu w szybkowarze na wysokich obrotach przez 10 minut. Po zdemaskowaniu epitopów antygenu przenieś szybkowar z ognia do zlewu i natychmiast przelej pokrywę zimną wodą z kranu. Pozostawić szkiełka do zrównoważenia przez 20 minut w roztworze do pobierania antygenu, a następnie przemyć próbki dwukrotnie w 0,01 molowym PBS na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut na przemycie.

Po drugim myciu użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół próbek tkanki nerkowej i zablokuj wszelkie niespecyficzne barwienia 60 mikrolitrami 10% surowicy kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji ostrożnie zastąp roztwór blokujący 60 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w komorze wilgotnościowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj szkiełka na wytrząsarce orbitalnej w PBS przez dwie minuty na mycie, a następnie dodaj 60 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem do każdego szkiełka na 40-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji umyć szkiełka w PBS, jak pokazano, a następnie poddać działaniu 0,3% czerni Sudan w 70% etanolu, aby stłumić potencjalną autofluorescencję wywołaną formaliną. Po 30 minutach umyj szkiełka w wodzie z kranu, aby usunąć wszelkie osady i zanurz szkiełka w PBS na 10 minut, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się czarnego osadu Sudanu. Pod koniec inkubacji zamontuj szkiełka na konfokalnych szklanych szkiełkach nakrywkowych za pomocą trzech 60 mikrolitrów kropli roztworu montażowego uzupełnionego DAPI i uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.

Pozostaw szkiełka do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem do czasu zobrazowania za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Pamiętaj, aby uszczelnić szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas obrazowania i oczyścić szkiełka nakrywkowe z etanolu, aby zwiększyć rozdzielczość obrazowania.

Po zobrazowaniu 20 kłębuszków nerkowych na slajd otwórz możliwą do trenowania wtyczkę Weka Segmentation w ImageJ i upuść pierwszy obraz na pasku narzędzi ImageJ. Kliknij kanały obrazu, koloru i podziału. Pojawi się obraz przedstawiający pierwotne barwienie przeciwciałami.

Aby utworzyć scalony plik z pojedynczymi obrazami, kliknij opcję Kolor i Scal kanały. Pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o przypisanie koloru do każdego kanału. Zaznacz pola Utwórz kompozyt i zachowaj obrazy źródłowe, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się scalony obraz kompozytowy.

Korzystając z podstawowego barwienia przeciwciałami jako przewodnika, narysuj obszar zainteresowania wokół kępki kłębuszków nerkowych. Aby wykonać rozmycie gaussowskie na pojedynczym niebieskim obrazie DAPI, kliknij opcję proces, filtry i rozmycie gaussowskie. Ustaw rozmycie od jednego do dwóch.

Obraz stanie się nieco rozmyty, ale jądra będą wydawały się gładkie, tło zostanie zmiękczone. Następnie kliknij wtyczki, segmentację i trenowaną segmentację Weka i użyj narzędzia wolnej ręki, aby prześledzić nienaruszone jądra. Po dodaniu wszystkich interesujących jąder w polu dodaj klasę pierwszą, użyj narzędzia linii, aby wyznaczyć obszary tła do pola klasy drugiej.

Kliknij utwórz nową klasę i użyj narzędzia linii, aby obrysować pozajądrowe DNA barwione DAPI. Kliknij klasyfikator trenowania i uzyskaj prawdopodobieństwo. Przełącz mysz, aby uzyskać czarno-biały obraz wszystkich komponentów z zaznaczonym na biało obiektem zaznaczenia.

Aby zduplikować ten obraz, kliknij obraz i powiel. Pod obrazem dostosuj i próg. Użyj przycisku myszy, aby dostosować próg, aż zaobserwowane zostanie tylko zewnątrzkomórkowe DNA.

Po progowaniu kliknij pozycję proces, binarny i utwórz binarny, a następnie skopiuj wcześniej wygenerowany obszar kłębuszków nerkowych. Naciśnij Control Shift E, aby wybrać opcję edycja, zaznaczenia i przywracanie, aby przywrócić zaznaczenie. Aby zmierzyć tylko zewnątrzkomórkowe cząstki DNA w kłębuszku nerkowym, kliknij Analizuj cząstki i OK. Zostanie wygenerowany arkusz wyników pokazujący liczbę cząstek, powierzchnię, średnią liczbę pikseli i procent kłębuszków nerkowych zawierających zewnątrzkomórkowe DNA.

Aby zapisać klasyfikator jako zewnątrzkomórkowy klasyfikator DNA, kliknij Zapisz klasyfikator i zapisz dane. Aby ponownie zastosować model do kolejnych obrazów, powtórz początkowe przetwarzanie obrazu, jak pokazano, przed wybraniem klasyfikatora obciążenia i zapisanego pliku klasyfikatora. Pojawi się menu dziennika i uruchomi model.

Po uruchomieniu modelu kliknij przycisk Załaduj dane i wybierz plik extracellularDNA.arff. Następnie kliknij utwórz wynik. Jeśli wynikowy obraz nie zdołał pobrać wszystkich jąder, tła lub zewnątrzkomórkowego DNA, kliknij przycisk Klasyfikator ponownego trenowania i w razie potrzeby dodaj więcej klasyfikatorów.

Tutaj pokazane są obrazy jednokanałowe pokazujące reprezentatywne barwienie DNA i beta aktyny. Połączenie tych dwóch obrazów pozwala na narysowanie obszaru zainteresowania wokół obszaru kłębuszków nerkowych w celu pomiaru zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkach nerkowych myszy przy użyciu trenowalnej segmentacji Weka, jak pokazano. Model ten można zastosować do identyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w próbkach z biopsji nerki od pacjenta kontrolnego lub porównania z biopsją nerki od pacjenta z zapaleniem naczyń związanym z mielooperoksydazą ANCA.

Ponadto program ten można przełożyć na inne barwienia w próbkach tkanek nerkowych, na przykład na barwienie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili i odkładanie się zewnątrzkomórkowej mieloperoksydazy w zapaleniu naczyń związanym z ANCA. Co ważne, nie obserwuje się istotnych różnic, gdy te same dane są analizowane przez wielu użytkowników. Najważniejszym etapem analizy jest dostarczenie wystarczającej liczby przykładów tła, jąder i zewnątrzkomórkowego DNA z kłębuszkami nerkowymi jako klasyfikatorami, z których można się uczyć w programie segmentacji Weka.

Ta metoda jest łatwa do przeniesienia. Na przykład, dalsza analiza różnych typów śmierci komórek może być badana poprzez barwienie pod kątem specyficznych przeciwciał przeciwko markerom apoptozy lub martwicy. Nasza technika może być stosowana w innych procesach zapalnych, takich jak ocena ekspresji TLR w autoimmunologicznej chorobie nerek lub ekspresji zewnątrzkomórkowej mieloperoksydazy w biopsjach ludzkich nerek.