Name: Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek. Ta metoda umożliwia wizualizację ecDNA jako markera uszkodzenia nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy Monash Micro Imaging za korzystanie z pionowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Nikon C1 oraz platformy Monash Histology do przetwarzania tkanki nerkowej.

<ol><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li>
<li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%3A+the+significance+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li>
<li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+way+to+die%3A+apoptosis%2C+necrosis+and+reactive+oxygen+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li>
<li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li>
<li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4%2B+cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li>
<li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA+in+natural+environments%3A+features%2C+relevance+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li>
<li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412(2018).</li>
<li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li>
<li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trainable+Weka+Segmentation%3A+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li>
<li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+a+Trap%3F+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423(2019).</li>
<li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+%26+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li>
<li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation%2C+endothelial+damage%2C+and+autoimmune+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li>
<li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li>
</ol>

Nic do ujawnienia.

Istnieje wiele protokołów, które mierzą markery prozapalne w surowicy i moczu zarówno pacjentów, jak i mysich modeli kłębuszkowego zapalenia nerek. Opisany protokół umożliwia analizę produktów śmierci komórki (ecDNA, NET i ecMPO) bezpośrednio w obrębie kłębuszków nerkowych. Najważniejszymi krokami w tym protokole jest przygotowanie tkanek i obrazowanie. Głównym elementem ograniczającym stosowanie metody barwienia fluorescencyjnego do analizy jest autofluorescencja tkanek. Tkanka parafinowa utrwalona w formalinie podlega ...

Zapalenie naczyń związane z przeciwciałami cytoplazmatycznymi przeciwko mieloperoksydazie (MPO-AAV) jest chorobą autoimmunologiczną, która powoduje niewydolność nerek z powodu patologicznego uszkodzenia kłębuszków nerkowych ze znaczną śmiercią komórki i uwolnieniem kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA)1,2. DNA może aktywować układ odpornościowy, działając jako sygnał zagrożenia. W normalnych, zdrowych warunkach lokalizacja jądrowa DNA zapewnia ochronę przed narażeniem na działanie układu odpornościowego. Własne DNA, które jest uwalniane zewnątrzkomórkowo podczas procesów patogennych lub autoimmunizacji, jest postrzegane przez układ odpornościowy jako silne białko molekularne związane z uszkodzeniem prozapalnym (DAMP)3. Pozakomórkowe DNA (ecDNA) jest uwalniane z umierających komórek poprzez kilka odrębnych mechanizmów, które są regulowane przez odrębne szlaki biochemiczne, takie jak apoptoza, nekroptoza, tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), nekroza lub pyroptoza4,5,6,7,8.
Opisujemy tutaj metody barwienia i pomiaru ecDNA uwolnionego z umierających komórek w odcinkach nerek z zatopioną w formalinie parafinie (FFPE) z eksperymentalnych biopsji anty-MPO GN i nerek od pacjentów z MPO-AAV9,10. Istnieje wiele metod wykrywania krążącego dwuniciowego DNA (dsDNA) i kompleksów DNA zarówno z surowicy, jak i moczu oraz z testów in vitro11,12. Metody te, choć dokładne w określaniu ilości ecDNA, nie określają, gdzie ecDNA jest uwalniane anatomicznie. Istnieją metody, które opisują specyficzny pomiar ecDNA, takie jak tunel dla apoptozy i pomiar szczątków komórkowych13,14. Nie ma metody, która opisywałaby pomiar ecDNA wynikającego ze wszystkich form śmierci komórki w nerkach FFPE, w których dochodzi do patologicznego uszkodzenia. Jest to ważne w celu ustalenia, czy eksperymentalne terapie terapeutyczne usuwają ecDNA z miejsc patologicznego uszkodzenia w rzeczywistym narządzie docelowym.
Akwizycja wielu obrazów z próbek nerek tworzy dużą ilość danych, które są zwykle analizowane przez jednego użytkownika. Jest to pracochłonne, czasochłonne i może być przedmiotem niewiarygodnej odtwarzalności przez innych użytkowników ze względu na stronniczość użytkownika. Trainable Weka segmentation to wtyczka oprogramowania typu open source dla ImageJ, która wykorzystuje najnowocześniejsze narzędzia bioinformatyczne do klasyfikowania pikseli za pomocą algorytmów uczenia maszynowego15,16. Ta metoda jest "możliwa do wytrenowania", dzięki czemu uczy się na podstawie klasyfikacji segmentów pikseli użytkownika i stosuje nową wyuczoną klasyfikację do innych obrazów. Metoda ta opiera się na typowych narzędziach analitycznych w programie ImageJ, które są używane do "klasyfikowania" każdego piksela w segmencie jako należącego do określonej "klasy". Gdy program nauczy się "klasyfikatorów", można ich użyć do identyfikacji innych podobnych sklasyfikowanych segmentów na tym samym obrazie. Model ten jest następnie zapisywany i stosowany do innych zestawów obrazów w ramach tego samego eksperymentu.
Obecne przeszkody w określaniu ecDNA in situ w skrawkach nerek to endogenna autofluorescencja wynikająca z utrwalenia w formalinie oraz pracochłonna analiza obrazów. Opisujemy tutaj jak wygasić ową autofluorescencję, wykryć ecDNA, oraz wykorzystać nadzorowane uczenie maszynowe do wysokoprzepustowego pomiaru ecDNA. Wcześniej opublikowaliśmy pomiar NET i zewnątrzkomórkowego MPO (ecMPO) za pomocą makra w ImageJ, teraz demonstrujemy półautomatyzację tych metod przy użyciu nadzorowanego uczenia maszynowego1. Demonstrujemy zdolność adaptacyjną narzędzia uczenia maszynowego w celu sklasyfikowania alternatywnej plamy dla NET i ecMPO w tym samym obrazie. Te opisane tutaj metody barwienia do wykrywania ecDNA, NET i ecMPO można przełożyć na inne narządy stałe i choroby, w których ecDNA, NETS i ecMPO odgrywają rolę w utrwalaniu chorób, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i toczeń17,18.

<table><tbody><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td> 5<td>% i 1% roztwory składa się z PBS, może być wytwarzana luzem i zamrażana - wyrzucana po rozmrożeniu.</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw koziej IgG (H+L) z kurczaka wchłaniane krzyżowo, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21468</td><td>Wiruj w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko myszym przeciwciałom IgG (H+L) z kurczaka, Alex Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-121468</td><td>Wiruj w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał</td></tr><tr><td>Kurczak anty królik IgG (H+L) Przeciwciało wchłaniane krzyżowo Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21441</td><td>Wirować w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał</td></tr><tr><td>Surowice skrywkowe z kurczaka</td><td>SIGMA</td><td>C5405</td><td>Wykonane z 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x60 mm</td><td>Azerscientific</td><td>ES0107222</td><td>#1.5 Nie jest to standardowa grubość - przeznaczona do stosowania w mikroskopii</td></tr> <tr><td>konfokalnejEDTA 10mM</td><td>SIGMA</td><td>E6758</td><td>Dodaj TRIS i EDTA razem w wodzie destylowanej i pH do 9, w celu odzyskania antygenu, można uzupełnić w 10x roztworze</td></tr><tr><td>Etanol 30%, 70% i 100%</td> <td>Chem Supply</td><td>UN1170</td><td>Dostarczany jako 100% niedenaturowany etanol - rozcieńczony do 30% i 70% przy użyciu wody destylowanej</td></tr><tr><td>Formaldehyd, 4% (10% neutralna buforowana formalina)</td> <td>TRAJAN</td><td>NBF-500</td><td>Nerkę umieszcza się w 5 ml probówce zawierającej 3 ml formaliny na 16 godzin w temperaturze pokojowej, formalinę należy stosować w dygestorii</td></tr><tr><td>Szklane szkiełka histologiczne - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0mm</td><td>TRAJAN</td><td>J3800AM4</td><td>Niezbędne jest stosowanie dodatnio naładowanych szkiełek powlekanych. Nie zalecamy stosowania poli-L-lizyny do powlekania szkiełek, ponieważ tkanka przemieszcza się ze szkiełek podczas etapu pobierania antygenu</td></tr><tr><td>Kozioł przeciwciało przeciwko człowiekowi / myszy MPO</td><td>R& D</td><td>AF3667</td><td>Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu</td></tr><tr><td>Histosol</td><td>Clini Pure</td><td>CPL HISTOSOL 08</td><td>Używany schludny, w pojemnikach do barwienia o pojemności 200 ml, do stosowania w dygestoriach</td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>VECTOR Labs</td><td>H-400</td><td>Służy do rysowania okręgu wokół tkanki nerkowej</td></tr><tr><td>Mysz anty człowiek/mysz Peptydyloarginaza 4 (PAD4)</td><td>ABCAM</td><td>ab128086</td><td>Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu</td></tr><tr><td>Konfokalna skaningowa głowica laserowa Nikon C1 przymocowana do odwróconego mikroskopu Nikon Ti-E</td><td>Coherent Scientific</td><td></td><td>Aliquot i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>SIGMA</td><td>P38135</td><td>0,01 M PB / 0,09% NaCl Uzupełnij 5L na raz</td></tr><tr><td>Szybkowar 6L Tefal secure 5 Neo ze stali nierdzewnej</td><td>Tefal</td><td>GSA-P2530738</td><td>Zakupiony w lokalnym sklepie z artykułami gospodarstwa domowego</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36962</td><td>Nałóż krople bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe</td></tr><tr><td>Królik anty ludzkie/mysie przeciwciało beta aktyny</td><td>ABCAM</td><td>ab8227</td><td>Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu</td></tr><tr><td>Królik przeciwciało przeciwko człowiekowi / myszy H3Cit</td><td>ABCAM</td><td>ab5103</td><td>Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przybyciu</td></tr><tr><td>Stojak do barwienia 24 szkiełka</td><td>ProScitech</td><td>H4465</td><td>Wybrany stojak do barwienia musi być w stanie wytrzymać gotowanie pod ciśnieniem i inkubację w piekarniku o temperaturze 60 stopni</td></tr><tr><td>Sudan Black B</td><td>SIGMA</td><td>199664</td><td>0,3% Dodać 3g do butelki 1L w 70% etanolu, przefiltrować i chronić przed światłem stabilnym przez 6 miesięcy w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Tris 10mM</td><td>SIGMA</td><td>T4661</td><td>Dodaj TRIS i EDTA razem w wodzie destylowanej i pH do 9, do pobierania antygenu, może być sporządzony w 10x roztworze</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Trajan</td><td>XL005/20</td><td>Musi być używany w dygestoriach</td></tr></tbody></table>

nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego dna w kłębuszkowym zapaleniu nerek

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Śmierć komórek kłębuszków nerkowych jest patologiczną cechą zapalenia naczyń krwionośnych związanego z przeciwciałami cytoplazmatycznymi przeciwko neutrofilom (MPO-AAV). Zewnątrzkomórkowy kwas dezoksyrybonukleinowy (ecDNA) jest uwalniany podczas różnych form śmierci komórki, w tym apoptozy, martwicy, nekroptozy, zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i piroptozy. Pomiar tej śmierci komórki jest czasochłonny i wymaga kilku różnych biomarkerów do identyfikacji różnych biochemicznych form śmierci komórki. Pomiar ecDNA jest zwykle przeprowadzany w surowicy i moczu jako substytut uszkodzenia nerek, a nie w rzeczywistym narządzie docelowym, w którym dochodzi do patologicznego urazu. Obecna trudność w badaniu ecDNA w nerkach polega na braku metod dla tkanki zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE), zarówno eksperymentalnie, jak i w archiwalnych biopsjach ludzkich nerek. Protokół ten zawiera podsumowanie kroków wymaganych do barwienia ecDNA w tkance FFPE (zarówno ludzkiej, jak i mysjej), wygaszania autofluorescencji i pomiaru ecDNA w powstałych obrazach za pomocą narzędzia uczenia maszynowego z publicznie dostępnej wtyczki ImageJ o otwartym kodzie źródłowym, którą można trenować w segmentacji Weka. Możliwa do wytrenowania segmentacja Weka jest stosowana do ecDNA w kłębuszkach nerkowych, gdzie program uczy się klasyfikować ecDNA. Ten klasyfikator jest stosowany do kolejnych pozyskanych obrazów nerek, zmniejszając potrzebę ręcznego dodawania adnotacji do każdego pojedynczego obrazu. Zdolność adaptacyjna możliwej do wytrenowania segmentacji Weka została dodatkowo wykazana w tkance nerkowej z eksperymentalnego mysiego kłębuszkowego zapalenia nerek (GN) przeciwko MPO, w celu identyfikacji NET i ecMPO, powszechnych patologicznych czynników przyczyniających się do anty-MPO GN. Metoda ta zapewnia obiektywną analizę ecDNA w tkance nerkowej, która wyraźnie pokazuje skuteczność, z jaką trenowalny program segmentacji Weka może odróżnić ecDNA od zdrowej, normalnej tkanki nerkowej od chorej tkanki nerkowej. Protokół ten można łatwo dostosować do identyfikacji ecDNA, NET i ecMPO w innych narządach.

Obrazy te przedstawiają wiele etapów niezbędnych do pomyślnego wykorzystania trenowalnej segmentacji Weka w celu zminimalizowania pracochłonnych pomiarów manualnych ecDNA w fluorescencyjnie barwionej tkance nerek FFPE myszy z indukowanym GN przeciwko MPO. Etapy te zostały podsumowane na Rysunku 1 oraz Rysunku 2 za pomocą obrazów pobranych bezpośrednio z programu segmentacji Weka, co obrazuje każdy krok w procesie analizy. Wyniki ...

Zewnątrzkomórkowe DNA (ecDNA) uwalniane podczas śmierci komórki jest prozapalne i przyczynia się do stanu zapalnego. Pomiar ecDNA w miejscu urazu może określić skuteczność leczenia w narządzie docelowym. Protokół ten opisuje wykorzystanie narzędzia uczenia maszynowego do automatyzacji pomiaru ecDNA w tkance nerkowej.

Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Kłębuszkowe zapalenie nerek powoduje patologiczne uszkodzenie kłębuszków nerkowych ze znaczną śmiercią komórek i uwalnianiem zewnątrzkomórkowego DNA. Protokół ten umożliwia wizualizację zewnątrzkomórkowego DNA w miejscu uwolnienia podczas urazu patologicznego. Zaletą tej techniki jest to, że mierzy zewnątrzkomórkowe DNA ze śmierci komórki w nerce.W przeciwieństwie do surowicy lub moczu, pomiar zewnątrzkomórkowego DNA jest zastępczym markerem uszkodzenia patologicznego. Znaczenie tej metody polega na tym, że zarówno zewnątrzkomórkowe barwienie DNA, jak i analiza obrazu są łatwo przenoszone na inne choroby autoimmunologiczne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów i toczeń. Metoda ta wymaga podstawowej wiedzy z zakresu histologii nerek.Aby umożliwić dokładne wykrycie zewnątrzkomórkowego DNA kłębuszkowego, badacz musi być w stanie prawidłowo zidentyfikować kłębuszki nerkowe. W przypadku barwienia zewnątrzkomórkowego DNA należy najpierw podgrzać próbki w stojaku na szkiełka w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie zanurzyć szkiełka w dwóch 40-minutowych zmianach rozpuszczalnika w dygestorium. Po drugim zanurzeniu należy ponownie nawodnić próbki dwa razy w 100% etanolu i jeden raz w 70% etanolu przez pięć minut na zabieg.Po ostatnim zabiegu za pomocą szczypiec umieść szkiełka we wrzącym roztworze do pobierania antygenu w szybkowarze na wysokich obrotach przez 10 minut. Po zdemaskowaniu epitopów antygenu przenieś szybkowar z ognia do zlewu i natychmiast przelej pokrywę zimną wodą z kranu. Pozostawić szkiełka do zrównoważenia przez 20 minut w roztworze do pobierania antygenu, a następnie przemyć próbki dwukrotnie w 0,01 molowym PBS na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut na przemycie.Po drugim myciu użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół próbek tkanki nerkowej i zablokuj wszelkie niespecyficzne barwienia 60 mikrolitrami 10% surowicy kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji ostrożnie zastąp roztwór blokujący 60 mikrolitrami podstawowego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania w komorze wilgotnościowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj szkiełka na wytrząsarce orbitalnej w PBS przez dwie minuty na mycie, a następnie dodaj 60 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem do każdego szkiełka na 40-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji umyć szkiełka w PBS, jak pokazano, a następnie poddać działaniu 0,3% czerni Sudan w 70% etanolu, aby stłumić potencjalną autofluorescencję wywołaną formaliną. Po 30 minutach umyj szkiełka w wodzie z kranu, aby usunąć wszelkie osady i zanurz szkiełka w PBS na 10 minut, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się czarnego osadu Sudanu. Pod koniec inkubacji zamontuj szkiełka na konfokalnych szklanych szkiełkach nakrywkowych za pomocą trzech 60 mikrolitrów kropli roztworu montażowego uzupełnionego DAPI i uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci.Pozostaw szkiełka do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem do czasu zobrazowania za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Pamiętaj, aby uszczelnić szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas obrazowania i oczyścić szkiełka nakrywkowe z etanolu, aby zwiększyć rozdzielczość obrazowania.Po zobrazowaniu 20 kłębuszków nerkowych na slajd otwórz możliwą do trenowania wtyczkę Weka Segmentation w ImageJ i upuść pierwszy obraz na pasku narzędzi ImageJ. Kliknij kanały obrazu, koloru i podziału. Pojawi się obraz przedstawiający pierwotne barwienie przeciwciałami.Aby utworzyć scalony plik z pojedynczymi obrazami, kliknij opcję Kolor i Scal kanały. Pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o przypisanie koloru do każdego kanału. Zaznacz pola Utwórz kompozyt i zachowaj obrazy źródłowe, a następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się scalony obraz kompozytowy.Korzystając z podstawowego barwienia przeciwciałami jako przewodnika, narysuj obszar zainteresowania wokół kępki kłębuszków nerkowych. Aby wykonać rozmycie gaussowskie na pojedynczym niebieskim obrazie DAPI, kliknij opcję proces, filtry i rozmycie gaussowskie. Ustaw rozmycie od jednego do dwóch.Obraz stanie się nieco rozmyty, ale jądra będą wydawały się gładkie, tło zostanie zmiękczone. Następnie kliknij wtyczki, segmentację i trenowaną segmentację Weka i użyj narzędzia wolnej ręki, aby prześledzić nienaruszone jądra. Po dodaniu wszystkich interesujących jąder w polu dodaj klasę pierwszą, użyj narzędzia linii, aby wyznaczyć obszary tła do pola klasy drugiej.Kliknij utwórz nową klasę i użyj narzędzia linii, aby obrysować pozajądrowe DNA barwione DAPI. Kliknij klasyfikator trenowania i uzyskaj prawdopodobieństwo. Przełącz mysz, aby uzyskać czarno-biały obraz wszystkich komponentów z zaznaczonym na biało obiektem zaznaczenia.Aby zduplikować ten obraz, kliknij obraz i powiel. Pod obrazem dostosuj i próg. Użyj przycisku myszy, aby dostosować próg, aż zaobserwowane zostanie tylko zewnątrzkomórkowe DNA.Po progowaniu kliknij pozycję proces, binarny i utwórz binarny, a następnie skopiuj wcześniej wygenerowany obszar kłębuszków nerkowych. Naciśnij Control Shift E, aby wybrać opcję edycja, zaznaczenia i przywracanie, aby przywrócić zaznaczenie. Aby zmierzyć tylko zewnątrzkomórkowe cząstki DNA w kłębuszku nerkowym, kliknij Analizuj cząstki i OK. Zostanie wygenerowany arkusz wyników pokazujący liczbę cząstek, powierzchnię, średnią liczbę pikseli i procent kłębuszków nerkowych zawierających zewnątrzkomórkowe DNA.Aby zapisać klasyfikator jako zewnątrzkomórkowy klasyfikator DNA, kliknij Zapisz klasyfikator i zapisz dane. Aby ponownie zastosować model do kolejnych obrazów, powtórz początkowe przetwarzanie obrazu, jak pokazano, przed wybraniem klasyfikatora obciążenia i zapisanego pliku klasyfikatora. Pojawi się menu dziennika i uruchomi model.Po uruchomieniu modelu kliknij przycisk Załaduj dane i wybierz plik extracellularDNA.arff. Następnie kliknij utwórz wynik. Jeśli wynikowy obraz nie zdołał pobrać wszystkich jąder, tła lub zewnątrzkomórkowego DNA, kliknij przycisk Klasyfikator ponownego trenowania i w razie potrzeby dodaj więcej klasyfikatorów.Tutaj pokazane są obrazy jednokanałowe pokazujące reprezentatywne barwienie DNA i beta aktyny. Połączenie tych dwóch obrazów pozwala na narysowanie obszaru zainteresowania wokół obszaru kłębuszków nerkowych w celu pomiaru zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkach nerkowych myszy przy użyciu trenowalnej segmentacji Weka, jak pokazano. Model ten można zastosować do identyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w próbkach z biopsji nerki od pacjenta kontrolnego lub porównania z biopsją nerki od pacjenta z zapaleniem naczyń związanym z mielooperoksydazą ANCA.Ponadto program ten można przełożyć na inne barwienia w próbkach tkanek nerkowych, na przykład na barwienie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili i odkładanie się zewnątrzkomórkowej mieloperoksydazy w zapaleniu naczyń związanym z ANCA. Co ważne, nie obserwuje się istotnych różnic, gdy te same dane są analizowane przez wielu użytkowników. Najważniejszym etapem analizy jest dostarczenie wystarczającej liczby przykładów tła, jąder i zewnątrzkomórkowego DNA z kłębuszkami nerkowymi jako klasyfikatorami, z których można się uczyć w programie segmentacji Weka.Ta metoda jest łatwa do przeniesienia. Na przykład, dalsza analiza różnych typów śmierci komórek może być badana poprzez barwienie pod kątem specyficznych przeciwciał przeciwko markerom apoptozy lub martwicy. Nasza technika może być stosowana w innych procesach zapalnych, takich jak ocena ekspresji TLR w autoimmunologicznej chorobie nerek lub ekspresji zewnątrzkomórkowej mieloperoksydazy w biopsjach ludzkich nerek.

supervised-machine-learning-for-semi-quantification-extracellular-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje technikę barwienia zewnątrzkomórkowego DNA w skrawkach tkanek FFPE. Barwione zewnątrzkomórkowe DNA można określić ilościowo w celu określenia skuteczności dowolnego leczenia terapeutycznego, które prowadzi do śmierci komórek rakowych.

Barwienie zewnątrzkomórkowego DNA: metoda identyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w skrawkach tkanki FFPE

Technika wykorzystująca mikroskopię 2-fotonową intavital o wysokiej rozdzielczości do bezpośredniej wizualizacji i ilościowego określenia filtracji gloemrarnej w kłębuszkach nerkowych na powierzchni. Metoda ta pozwala na bezpośrednie określenie charakterystyk przepuszczalności makrocząsteczek zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

Kwantyfikacja przepuszczalności kłębuszkowej makrocząsteczek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej u szczurów Wistar w Monachium

Ten protokół opisuje pełne badanie nerek, które powinno być przeprowadzone na mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych. Metody te pozwalają na szczegółową analizę funkcjonalną, strukturalną i mechanistyczną funkcji kłębuszków nerkowych, którą można zastosować do wszystkich mysich modeli choroby kłębuszków nerkowych.

Ocena czynności nerek w mysich modelach choroby kłębuszków nerkowych

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Tutaj prezentujemy protokół do generowania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) i obsługi NETQUANT, w pełni automatycznej opcji oprogramowania do ilościowego oznaczania NET w obrazach immunofluorescencyjnych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja oparta na obrazie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili przy użyciu NETQUANT

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Obecny protokół opisuje metodę śledzenia postępu tocznia u myszy. Przedstawiono dwie dodatkowe procedury w celu scharakteryzowania toczniowego zapalenia nerek w oparciu o naciek komórek i odkładanie się białek w nerkach.

Analizy białkomoczu, naciekania leukocytów przez nerki i odkładania się białek przez nerki u myszy MRL/lpr podatnych na toczeń

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Poznaj nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek. Ta metoda umożliwia wizualizację ecDNA jako markera uszkodzenia nerek.

Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek

Przeglądaj więcej filmów