Name: Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Naucz się technik mikroiniekcji zarodków Culex quinquefasciatus zoptymalizowanych pod edycję CRISPR/Cas9. Protokół umożliwia generowanie dziedzicznych mutacji w linii zarodowej z przeżywalnością embrionów do 82% i mutagenezą germinalną powyżej 61%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze startowe UCSD skierowane do O.S.A.

1. Hodowla kolonii C. quinquefasciatus
<ol>
	<li>Zakładaj wiele kolonii dorosłych osobników C. quinquefasciatus w klatkach dla owadów. 
	UWAGA: Kolonie zostały dostarczone przez dr Laurę Harrington z Cornell University20. Szczegółowe protokoły hodowli komarów Culex można znaleźć w innej literaturze21.
	<ol>
		<li>Utrzymuj komary w temperaturze 25 ± 1 °C przy wilgotności 30% w cyklu dzień-noc o godzinie 12:12.</li>
		<li>Dostarczyć 20% roztwór cukru ad libitum, wprowadzając do klatki pojemnik z roztworem cukru z lub nasycając waciki roztworem cukru i umieszczając go w klatce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól komarom łączyć się w pary przez co najmniej 3 dni przed karmieniem krwią (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
</ol>
2. Zbiór zarodków C. quinquefasciatus w stadium preblastoderm
<ol>
	<li>Po 3-6 dniach od eclozji podaj samicom 1-2 ml cytrynowanej mączki z krwi bydlęcej przez syntetyczną membranę i podgrzej do około 40 °C w systemie karmienia krwią (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B). Istnieją również alternatywne protokoły nawożenia krwią, które można stosować w przypadku komarów Culex (np. patrz ref21). 
	UWAGA: C. quinquefasciatus jest znany z preferencji do ptasiej krwi. Niektóre laboratoria używają znieczulonych żywych ptaków lub ptasiej krwi jako mączki krwiodawczej source21,22,23. Jednak kolonie mogą być trenowane/selekcjonowane do żywienia się krwią bydlęcą lub małymi gryzoniami, jeśli ta cecha jest wybrana na wiele pokoleń.
	<ol>
		<li>Pozwól samicom odpocząć przez co najmniej 3 dni po karmieniu krwią, aby poddały się oogenezie i dojrzewaniu jaj przed wywołaniem składania jaj do eksperymentów z mikrowstrzyknięciami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu mikroiniekcji embrionalnych należy utworzyć miseczkę do składania jaj z organicznie nasyconą wodą do składania jaj. Woda do składania jaj powinna być wytwarzana przez fermentację odchodów królika (50 g/L), rozkładu trawy (4,5 g/L) lub pokarmu dla ryb (25 g/L) w wodzie w ciągu 5 lub więcej dni24,25.</li>
	<li>Umieść miseczkę do składania jaj w klatce i umieść całą klatkę w ciemnym miejscu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C).</li>
	<li>Po każdych 30 minutach sprawdzaj, czy w kubku nie ma tratwy z jajkami.
	<ol>
		<li>Jeśli obecne są tratwy z jajkami, zbierz je, zgarniając je pędzlem i umieść na mokrej bibule filtracyjnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D,E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wyrównanie zarodków C. quinquefasciatus w stadium preblastoderm
<ol>
	<li>Oddziel jaja od tratwy, naciskając na tratwę i oddzielając jajka pojedynczo za pomocą pędzla z cienką końcówką i kleszczyków (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Ułóż pojedyncze jajka na cienkim pasku dwustronnej taśmy klejącej umieszczonej na górze szklanego szkiełka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Podczas wyrównywania staraj się skierować przednią stronę każdego jajka w tym samym kierunku, aby ułatwić dostępność. 
	UWAGA: Alternatywną metodę wyrównywania jaj bez dwustronnej taśmy klejącej można znaleźć we wcześniej opublikowanym protokole mikroiniekcji zarodka Nasonia vitripennis26.</li>
	<li>Przykryj jajka mieszanką oleju halowęglowego. 
	UWAGA: Mieszankę halowęglowodorów można przygotować z wyprzedzeniem, delikatnie mieszając dwa odczynniki halowęglowodorowe i wodę (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : woda ultraczysta), a następnie inkubując mieszaninę przez noc w temperaturze 25οC, aby ułatwić nasycenie oleju halowęglowodorowego wodą.</li>
</ol>
4. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Wygeneruj igły ze szkła kapilarnego glinokrzemianowego za pomocą ściągacza do szklanych mikropipet.
	<ol>
		<li>Umieść glinokrzemianową szklaną szklankę kapilarną w ściągaczu do igieł, zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza igieł. 
		UWAGA: Można również użyć igieł kapilarnych kwarcowych i borokrzemianowych, ale w tym eksperymencie preferowany jest glinokrzemian ze względu na jego względną przystępność cenową i trwałość.</li>
		<li>Ustaw ciepło na 516, prędkość na 100, opóźnienie na 70, pociągnięcie na 97 i nacisk na 500 na ściągaczu igły.</li>
		<li>Aktywuj ściągacz igieł zgodnie z instrukcjami ściągacza i powtórz w razie potrzeby dla dodatkowych igieł. 
		UWAGA: Podczas procesu wstrzykiwania igły często się zatykają lub przypadkowo łamią, dlatego zdecydowanie zaleca się wyciągnięcie dodatkowych igieł do pojedynczego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ukosuj końcówkę igły, delikatnie dotykając końcówki ciągniętej igły na obracającej się diamentowej płycie ściernej przez około 10 sekund pod kątem 50°. 
	UWAGA: Ukosowanie igły otwiera ją, aby umożliwić przepływ płynu, jednocześnie tworząc ostrzejszą końcówkę dla łatwiejszej penetracji zarodka. Przykład prawidłowej igły można zobaczyć w poprzednim artykule26.</li>
	<li>Ciągnięte i fazowane igły należy przechowywać, osadzając je w liniach gliny modelarskiej na szalce Petriego. 
	UWAGA: Aby zapewnić najlepszą jakość końcówek igieł, igły powinny być świeżo wyciągnięte i skośne jak najbliżej czasu wstrzyknięcia.</li>
</ol>
5. Ładowanie mieszanki iniekcyjnej
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań składającą się z odczynników do modyfikacji genomu (np. 200 ng/μL sgRNA i 200 ng/μL mieszaniny Cas9) lub preferowane roztwory do wstrzykiwań i przechowywać ją na lodzie. 
	UWAGA: Tę mieszankę można przygotować w oczekiwaniu na złożenie jaj. Więcej szczegółów na temat produkcji i przygotowania Cas9 i sgRNA do mikroiniekcji można znaleźć w poprzednich publikacjach27,28,29,30.</li>
	<li>Załadować 2 μl mieszaniny iniekcyjnej do igły iniekcyjnej za pomocą końcówki do mikroładowania.</li>
</ol>
6. Konfiguracja mikroiniekcji
<ol>
	<li>Umieścić napełnioną igłę do wstrzykiwań w zestawie mikromanipulacyjnym połączonym z elektronicznym mikrowstrzykiwaczem.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko zawierające wyrównane jaja na stoliku mikroskopu złożonego.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora i mikroskopu złożonego ustaw igłę tak, aby celowała w tylny koniec zarodka pod kątem 25-35°.</li>
</ol>
7. Mikroiniekcja zarodka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G)
<ol>
	<li>Ostrożnie wprowadzić igłę do zarodka i wstrzyknąć mieszaninę w ilości około 10% objętości zarodka (700-800 pL w zależności od wielkości jaj). 
	UWAGA: Podczas wstrzykiwania jajo powinno lekko pęcznieć, jednak jeśli wstrzyknie się zbyt dużo płynu, jaja mogą pęknąć lub płyn cytoplazmatyczny może wyciekać.</li>
	<li>Wstrzyknąć około 20 komórek jajowych na raz, a następnie przerwać i wykonać zabieg odzyskiwania zarodków. 
	UWAGA: Podczas wstrzykiwania istnieje duże prawdopodobieństwo zatkania lub złamania igieł. Jeśli dojdzie do zatkania, które może być spowodowane brakiem płynu iniekcyjnego przepływającego przez igłę, należy spróbować wyczyścić igłę za pomocą funkcji czyszczenia w elektronicznym mikrowstrzykiwaczu lub spróbować ponownie ukosować igłę. Jeśli żaden z tych kroków nie zadziała, szybko zmień igłę na nową, upewniając się, że przygotowane jajka pozostają zwilżone.</li>
</ol>
8. Odzyskiwanie i wylęganie się zarodków
<ol>
	<li>Pozostaw jajka w spokoju na co najmniej 5 minut. W ciągu 20 minut po wstrzyknięciu ostrożnie usuń olej halowęglowy, delikatnie szczotkując czystym pędzlem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2H).</li>
	<li>Delikatnie podnieś jajka za pomocą pędzla i umieść je w filiżance z podwójnie destylowaną wodą (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I). Uważaj, aby jaja trzymały się na powierzchni wody.</li>
	<li>Sprawdzaj jaja codziennie przez 7 dni pod kątem wylęgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z normalnymi procedurami hodowli larw21.</li>
</ol>
9. Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu
<ol>
	<li>Przebadaj wstrzyknięte komary pod kątem zmutowanych fenotypów za pomocą stereoskopu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2K).
	<ol>
		<li>Zweryfikuj mutacje, które nie mają łatwo rozpoznawalnego fenotypu, poprzez amplifikację PCR, test endonukleazy T7 I i sekwencjonowanie przez subklonowanie regionu docelowego31.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw dodatkowe krzyżówki między osobami, którym wstrzyknięto implant, aby wykryć dziedziczne mutacje w linii zarodkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019).</li>
<li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020).</li>
<li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li>
<li>van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Epizootiology+and+Ecological+Significance+of+Malaria+in+Hawaiian+Land+Birds%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Monographs%22%5BJournal%5D)">The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds.</a> Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).</li>
<li>Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigating+Future+Avian+Malaria+Threats+to+Hawaiian+Forest+Birds+from+Climate+Change%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change.</a> PloS One. 12 (1), 0168880(2017).</li>
<li>Martins, W. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406(2019).</li>
<li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha%2C+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Ecology%3A+Journal+of+the+Society+for+Vector+Ecology%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li>
<li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin%2C+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+tropica%22%5BJournal%5D)">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li>
<li>Yadouléton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites & Vectors. 8, 17(2015).</li>
<li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288(2015).</li>
<li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440(2011).</li>
<li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+%28Diptera%3B+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%3A+Journal+of+Molecular+Epidemiology+and+Evolutionary+Genetics+in+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701(2020).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11(2007).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li>
<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103(2020).</li>
<li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017(2011).</li>
<li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Cytochrome+P450+genes%3A+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes%2C+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403(2011).</li>
<li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542(2017).</li>
<li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Ecology%3A+Journal+of+the+Society+for+Vector+Ecology%22%5BJournal%5D)">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1(2012).</li>
<li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Midland+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253(1954).</li>
<li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+and+electrophysiological+evaluation+of+oviposition+attractants+for+Culex+quinquefasciatus+say+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae).</a> Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).</li>
<li>Allgood, D. W., Yee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviposition+preference+and+offspring+performance+in+container+breeding+mosquitoes%3A+evaluating+the+effects+of+organic+compounds+and+laboratory+colonisation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation.</a> Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).</li>
<li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56990(2017).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li>
<li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li>
<li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li>
<li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020).</li>
</ol>

W związku z ostatnimi wysiłkami zmierzającymi do stworzenia genetycznie zmodyfikowanych narzędzi do zwalczania komarów, istnieje potrzeba opracowania i optymalizacji protokołów mikroiniekcji zarodków dla powszechnych wektorów chorób komarów. Chociaż metody zostały opracowane dla komarów Aedes i Anopheles , protokół opracowany specjalnie dla Culex został minimalnie zbadany. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły wstrzykiwania zarodków komarów można podzielić na 3 ogólne etapy: 1) pobranie i przygotowanie zarodków, 2) wstrzyknięcie zarodka i 3) powrót do zdrowia po wstrzyknięciu. Aby skutecznie wygenerować mutanty, wszystkie trzy kroki muszą być zoptymalizowane pod kątem gatunku docelowego. Ten zmodyfikowany protokół mikroiniekcji zarodków jest specyficzny dla udanej inżynierii genomu komarów Culex .
Maksymalizacja pobierania zarodków jest częstym wąskim gardłem w protokołach mikroiniekcji zarodków. W celu zwiększenia liczby jaj zbieranych w krótkim czasie, komary nie miały dostępu do podłoża do składania jaj przez 2-3 dni po posiłku z krwi. Ważne jest, aby pamiętać, że C. quinquefasciatus ma tendencję do preferowania źródeł krwi ptaków w przeciwieństwie do źródeł ssaków lub karmienia błonowego krwią ssaków. Jednak wielu badaczy ma trudności ze znalezieniem wiarygodnego źródła żywego ptasiego źródła krwi ptaków do karmienia krwią, więc zapasy laboratoryjne można dostosować do żywienia się bardziej dostępnymi źródłami krwi. Bardzo ważne jest również stosowanie wody bogatej w składniki odżywcze jako podłoża do składania jaj, ponieważ zapewnia ona wskazówki dotyczące składania jaj dla C. quinquefasciatus i większości innych wektorów Culex . Istnieje wiele metod wytwarzania wody bogatej w składniki odżywcze, które mogą wymagać optymalizacji między laboratoriami, aby zapewnić dostępność odpowiedniej liczby jaj do mikroiniekcji. Na przykład, podczas gdy ta metoda była najbardziej skuteczna w przypadku odchodów królików fermentowanych w wodzie dejonizowanej przez 5 lub więcej dni, inni badacze odnieśli większy sukces z trawą lub pokarmem dla ryb jako źródłem składników odżywczych, a niektórzy nawetz wodą destylowaną.
Ponieważ komary Culex składają grupy jaj na tratwach, zbieranie jaj jest dość proste. Jajka można po prostu zbierać, zgarniając całą tratwę pędzlem. Separacja komórek jajowych jest bardziej skomplikowana, ale niezbędna do udanego wstrzyknięcia. Jaja można ostrożnie oddzielić od tratwy, delikatnie uciskając je w dół między jajkami za pomocą pędzla lub kleszczy. Przy pewnej wprawie wielu użytkowników było w stanie niezawodnie oddzielić pojedyncze jaja od tratw z jajami. Po oddzieleniu każdego jajka, jaja są ustawiane w tej samej orientacji na dwustronnej taśmie klejącej, która stabilizuje jaja podczas mikroiniekcji. Jaja są wstrzykiwane do zwężającego się tylnego końca, a dodatek oleju halowęglowego utrzymuje jaja wilgotne podczas manipulacji.
Aby ograniczyć uszkodzenia zarodków podczas mikroiniekcji, igły iniekcyjne muszą mieć odpowiednią wytrzymałość i być ukosowane pod odpowiednim kątem. Igły glinokrzemianowe fazowane przez 10 sekund pod kątem 50° przyniosły najlepsze rezultaty, ale igły borokrzemianowe i kwarcowe również mogą się sprawdzić, mimo że mogą być mniej trwałe i droższe. Ponadto odpowiednie ukosowanie igły ułatwia lepszy przepływ mieszanin Cas9 i sgRNA oraz tworzy ostrzejszy punkt ułatwiający penetrację zarodka. W wielu przypadkach ukosowanie jest również skutecznym sposobem na szybkie naprawienie zatkanych igieł zamiast poświęcania czasu i wysiłku na wymianę zatkanych igieł.
Po wstrzyknięciu jaja powinny pozostać nienaruszone przez co najmniej 5 minut, a olej halowęglowy należy natychmiast usunąć poprzez delikatne zetrzepanie go czystym pędzlem. Po usunięciu oleju halowęglowego, wstrzyknięte jaja można umieścić w wodzie w celu wylęgu, co zwykle następuje w ciągu 3 dni po wstrzyknięciu. Przy odrobinie wprawy i wystarczającej liczbie jaj protokół ten może osiągnąć spójne mutacje somatyczne i germinalne u C. quinquefasciatus i jest na tyle wszechstronny, że powinien łatwo przystosować się do innych komarów Culex .

C. quinquefasciatus, powszechnie znany jako południowy komar domowy, jest kompetentnym wektorem wielu patogenów, w tym wirusa Zachodniego Nilu (WNV), japońskiego zapalenia mózgu, zapalenia mózgu Saint Louis i wschodniego zapalenia mózgu koni. W szczególności, odkąd po raz pierwszy wykryto ją w Nowym Jorku w 1999 roku, WNV stała się główną chorobą przenoszoną przez wektory w kontynentalnych Stanach Zjednoczonych (USA) z ponad 50 000 zgłoszonymi przypadkami u ludzi, które spowodowały około 2 300 zgonów w latach 1999-20181, a także ponad 4 500 zgłoszonych przypadków koni w latach 2008-20192. Ponadto co najmniej 23 gatunki ptaków występujące w Ameryce Północnej zostały dotknięte infekcjami WNV, przy czym co najmniej 12 gatunków zostało sklasyfikowanych jako nieodwracalne w wyniku WNV3. Wpływ WNV na populacje ludzi, koni i ptaków wynika z oportunistycznych zachowań żywieniowych jego wektorów. Zazwyczaj ptaki są głównymi żywicielami WNV, a ludzie i konie są przypadkowymi lub ślepymi zaułkami. Niektóre patogeny przenoszone przez C. quinquefasciatus infekują tylko ptaki, takie jak ptasi pasożyt malarii, Plasmodium relictum. Na Hawajach C. quinquefasciatus jest głównym wektorem ptasiej malarii i spowodował wyginięcie wielu rodzimych gatunków ptaków4,5.
Aby kontrolować choroby przenoszone przez C. quinquefasciatus, badacze i agencje kontroli wektorów korzystali z powszechnie uznanych narzędzi kontroli populacji komarów, takich jak stosowanie środków owadobójczych6, jednak te metody są kosztowne, nie są specyficzne dla gatunku i mają ograniczoną skuteczność, ponieważ odporność na insektycydy jest wysoka w wielu populacjach C. quinquefasciatus6,7,8,9. Inne techniki kontroli, takie jak strategie kontroli populacji oparte na Wolbachii, zostały opracowane w ostatnich latach10,11, ale koszty przystosowania związane z infekcją Wolbachia ograniczają wykonalność tego podejścia dla tego wektora12. Istnieją również metody zwalczania oparte na genetyce, które zostały opracowane u innych gatunków komarów, takich jak Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 i Anopheles stephensi16, w tym rozwój komarów odpornych na patogeny17,18,19, które mogą również zostać opracowany dla C. quinquefasciatus, jeżeli zostaną opracowane niezbędne narzędzia inżynierii genomu dla tego gatunku. Jednak biologia C. quinquefasciatus znacznie różni się od innych wektorów komarów Aedes i Anopheles, co utrudniło rozwój podobnych technologii genetycznych w tym wektorze. Wraz z pojawieniem się technologii inżynierii genomu opartych na CRISPR, precyzyjna inżynieria genomu stała się coraz bardziej trywialna, przystępna cenowo i elastyczna, a w konsekwencji doprowadziła do opracowania nowych narzędzi genetycznych u wielu różnych gatunków.
Aby wygenerować mutacje za pomocą technologii opartych na CRISPR, do zarodków w stadium preblastoderm mikrowstrzykuje się mieszaninę białka Cas9 i syntetycznego przewodnika RNA (sgRNA), komplementarnego do pożądanych loci. Ponieważ samice C. quinquefasciatus składają jaja w grupach połączonych w pływającą strukturę tratwy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1), w przeciwieństwie do składania jaj pojedynczych, co jest cechą komarów Aedes i Anopheles, mikroiniekcje zarodków są coraz bardziej skomplikowane u tego gatunku. Larwy Culex wyłaniają się również z przedniej strony każdego jaja, która styka się z powierzchnią wody (<silna klasa="xfig">Ryc. 1), więc u tego gatunku ważna jest manipulacja orientacją jaja. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół przeznaczony do mikroiniekcji białka Cas9 i sgRNA do zarodków C. quinquefasciatus. Protokół ten został opracowany w celu uwzględnienia cech unikalnych dla biologii Culex w celu poprawy przeżywalności zarodków i wskaźników mutacji genomu poprzez pewne kroki, które są kluczowe dla terminowego pobrania jaj i przeżycia jaj.

<table><tbody><tr><td>9 uncji przezroczystego plastikowego kubka dla zwierząt</td><td>Karat</td><td>C-KC9</td><td>Hodowla owadów i zbieranie jaj</td></tr><tr><td>Rurka kapilarna ze szkła glinokrzemianowego 1 mm (średnica zewnętrzna) X 0,58 mm (średnica wewnętrzna)</td> <td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td> Można <td>również użyć igieł do mikroiniekcji, borokrzemianów i kwarcu, ale woleliśmy glinokrzemian</td></tr><tr><td>Blood</td><td>Colorado Serum Company</td><td>31025</td><td>Kolonia potrzebowała wielu pokoleń, aby przystosować się do tego źródła krwi. Inne źródła krwi są prawdopodobnie równie odpowiednie. Patrz uwagi protokolarne dotyczące wyboru źródła krwi.</td></tr><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>4F2222</td><td>Klatka do hodowli owadów</td></tr><tr><td>Białko Cas9 z NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td> Mikroskop do <td>mikroiniekcji</td></tr><tr><td></td><td>Mikroiniekcja Olympus BX41</td><td></td><td>, do wstrzykiwań zarodków</td></tr><tr><td>Diamentowa płytka ścierna (rozmiary końcówek od 0,7 u do 2,0 u)</td> <td>Mikroiniekcja Sutter Instruments</td><td>104E</td><td>, do stosowania z ukosowarem</td></tr><tr><td>Destylowany bez DNaz / RNaz Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma</td> do mikroiniekcji <td>Scotch</td><td>B084NVQGXD</td><td>Mikroiniekcja, wyrównanie zarodków</td></tr><tr><td>Programowalny mikrowtryskiwacz Femtojet 4x lub 4i</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Femtotips Końcówki do mikroładowarek</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td> Bibuła <td>filtracyjna do mikroiniekcji</td></tr><tr><td></td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Mikroiniekcja, pobieranie zarodków</td></tr><tr><td>Pędzel z cienką końcówką</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td>Mikroiniekcja, wyrównanie zarodków</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Mikroiniekcja, wyrównanie zarodka</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Mikroiniekcja, wyrównanie zarodków</td></tr><tr><td>Hemotek</td><td>Hemotek</td><td>PS5</td><td>Konserwacja linii</td></tr><tr><td>Mikroelektroda Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td>Mikroiniekcja, ukosowanie igły</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 lub P-2000</td><td>Mikroiniekcja, ciągnięcie igły</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Mikroiniekcja, wyrównanie zarodków</td></tr><tr><td>Nieschnąca plastelina</td><td>Jovi</td><td>B0025Z71IM</td><td>Mikroiniekcja, igła przechowywanie</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>Mikroiniekcja, do wyrównania zarodków</td></tr><tr><td>Sugar</td><td>Domino</td><td></td><td>20% roztwór cukru dla dorosłego źródła cukru.</td></tr><tr><td>T7 Endonukleaza I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Przygotowanie materiałów do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>TOPO TA Zestaw do klonowania</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K451020</td><td>Przygotowanie materiałów do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Ultracienkie kleszczyki z końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td>Mikroiniekcja, wyrównanie zarodka</td></tr></tbody></table>

techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w culex quinquefasciatus

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus jest wektorem różnorodnych chorób przenoszonych przez wektory, takich jak malaria ptaków, wirus Zachodniego Nilu (WNV), japońskie zapalenie mózgu, wschodnie zapalenie mózgu koni, filarioza limfatyczna i zapalenie mózgu Saint Louis. Warto zauważyć, że ptasia malaria odegrała główną rolę w wyginięciu wielu endemicznych gatunków ptaków wyspiarskich, podczas gdy WNV stała się ważną chorobą przenoszoną przez wektory w Stanach Zjednoczonych. Aby uzyskać więcej informacji na temat biologii C. quinquefasciatus i poszerzyć ich zestaw narzędzi do kontroli genetycznej, musimy opracować bardziej wydajne i przystępne cenowo metody inżynierii genomu u tego gatunku. Jednak niektóre cechy biologiczne unikalne dla komarów Culex, w szczególności ich tratwy jajowe, utrudniają wykonywanie procedur mikroiniekcji wymaganych do inżynierii genomu. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodków, który koncentruje się na łagodzeniu przeszkód technicznych związanych z unikalnymi cechami komarów Culex. Procedury te demonstrują zoptymalizowane metody zbierania jaj, oddzielania tratw jajowych i innych procedur obchodzenia się z C. quinquefasciatus. W połączeniu z technologią edycji genomu CRISPR/Cas9, procedury te pozwalają nam uzyskać specyficzne dla danego miejsca, wydajne i dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które są niezbędne do przeprowadzenia zaawansowanej inżynierii genomu i opracowania technologii kontroli genetycznej w tym ważnym, ale obecnie niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

W wcześniej opublikowanych eksperymentach metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do generowania mutacji somatycznych i linii zarodkowej w genie kluczowym dla rozwoju ciemnej pigmentacji oczu, white (CPIJ005542)30 (Tabela 1). Somatyczne mutacje wygenerowane za pomocą CRISPR/Cas9 oceniano poprzez przesiewowe badanie utraty pigmentacji w oczach osobników w stadium poczwarki z grupy wstrzykniętej (G0). Mutacje somatyczne występowały zazwyczaj jako fenotypy mozaikowe, w których niektóre, ale nie wszystkie komórki, wykazywały fenotyp mutantyczny. Na przykład mutacje somatyczne genu white prowadziły do powstania mieszaniny ommatidiów o fenotypach pozbawionych pigmentacji oraz takich o pigmentowanym fenotypie typu dzikiego30. Jednak w przypadku wystąpienia mutacji linii zarodkowej genu white, następne pokolenie (G1) dziedziczyło pełny fenotyp białych oczu. Częstość mutacji linii zarodkowej określano poprzez krzyżowanie osobników mozaikowych G0 i ocenę potomstwa o całkowicie białych oczach (G1). Eksperymenty te zaowocowały przeżywalnością zarodków na poziomie od 64% do 82%, a także częstością mutagenezy somatycznej od 37% do 57% oraz częstością mutagenezy linii zarodkowej &gt;61% (Tabela 1). Dzięki zastosowaniu multipleksowych sgRNA w celu ukierunkowania na wiele loci w tym samym genie, częstość mutagenezy somatycznej i linii zarodkowej wzrosła nawet do 86% (Tabela 1). Ponadto przez wiele pokoleń w laboratorium z powodzeniem utrzymywano żywotne homozygotyczne linie mutantów white.
<img alt="Etapy rozwoju jaj owadów, schemat, identyfikacja bieguna przedniego (A) i tylnego (P), mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
Rysunek 1: Morfologia tratwy jaj oraz pojedynczego jaja C. quinquefasciatus. 
Widoki grzbietowy (A), boczny (B) i brzuszny (C) tratw jaj C. quinquefasciatus. Samice C. quinquefasciatus składają jaja w taki sposób, że bardziej wypukła strona przednia styka się z powierzchnią wody, podczas gdy bardziej zaostrzona strona tylna jest skierowana w stronę przeciwną do powierzchni wody (D). A- przedni; P- tylny <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Hodowla komarów; zbieranie jaj, iniekcja, konfiguracja mikroskopowa; oś czasu etapów rozwoju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Harmonogram tworzenia mutantów C. quinquefasciatus drogą mikroiniekcji. 
Harmonogram przygotowania kolonii C. quinquefasciatus i zbierania embrionów do mikroiniekcji (A-D). Zebrane jaja są następnie rozdzielane (E), ustawiane w tej samej orientacji i pokrywane olejem halokarbonowym (F). Następnie wykonuje się iniekcję jaj (G), po której pozostawia się je na minimum 5 min przed usunięciem oleju halokarbonowego (H). Jaja są następnie przenoszone do czystej wody (I) w celu wylęgu (J), a następnie poddawane przesiewowi w celu zidentyfikowania fenotypów mutantów (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Przeżywalność</td>
			<td colspan="3">Mozaicyzm somatyczny (G0)</td>
			<td>Mutageneza linii zarodkowej (G1)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>sgRNA</td>
			<td>liczba wstrzykniętych</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Suma (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Suma (%)</td>
			<td>Mutanty G1 (%)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Przeżywalność i częstość mutacji embrionów wstrzykniętych z pojedynczymi i zmaksymalizowanymi gRNA celującymi w gen white. Tabela przedrukowana za zgodą30

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Techniki mikroiniekcji zarodków utorowały drogę do opracowania wielu genetycznych narzędzi kontroli wektorów. Chociaż wiele gatunków owadów ma już dobrze rozwinięte protokoły, Culex quinquefasciatus pozostaje stosunkowo słabo zbadany. Ten protokół mikroiniekcji został specjalnie zaprojektowany, aby uwzględnić unikalne cechy biologiczne Culex quinquefasciatus, w tym pobieranie jaj, separację tratw jajowych i procedury po wstrzyknięciu.Metoda ta może być prawdopodobnie dostosowana do każdego interesującego gatunku Culex i może być wykorzystana do badania funkcji genów lub do generowania opartych na genach technologii kontroli dla gatunków Culex. Zacznij od oddzielenia jaj od tratwy. Użyj kleszczy lub pędzla, aby docisnąć tratwę i rozdzielić poszczególne jaja.Ułóż jajka na cienkim pasku dwustronnej taśmy klejącej umieszczonej na górze szklanego szkiełka, starając się skierować przednią stronę każdego jajka w tym samym kierunku. Przygotuj mieszankę halowęglowodorów, delikatnie mieszając odczynniki halowęglowodorowe z wodą i inkubując mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc. Przykryj wyrównane jaja mieszanką oleju halowęglowodorowego.Aby wygenerować igły do mikroiniekcji, umieść glinokrzemianową szklaną szybę kapilarną w ściągaczu igieł, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw ciepło na 560, prędkość na 100, opóźnienie na 70, pociągnięcie na 97, a ciśnienie na 500. Następnie aktywuj ściągacz igieł.Delikatnie dotknij końcówki ciągniętej igły na obracającej się diamentowej płytce ściernej przez około 10 sekund pod kątem 50 stopni, aby ukosować końcówkę igły. Osadź ciągnięte i skośne igły w liniach gliny modelarskiej na szalce Petriego. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań składającą się z odczynników modyfikujących genom i przechowywać ją na lodzie.Za pomocą końcówki do mikroładowarki załadować dwa mikrolitry mieszaniny iniekcyjnej do igły iniekcyjnej. Umieścić napełnioną igłę iniekcyjną w mikromanipulatorze połączonym z elektronicznym mikrowstrzykiwaczem i umieścić szklane szkiełko z wyrównanymi jajami na stoliku mikroskopu złożonego. Za pomocą mikromanipulatora ustaw igłę tak, aby celowała w tylny koniec zarodka pod kątem od 25 do 35 stopni.Ostrożnie wprowadzić igłę do zarodka i wstrzyknąć mieszaninę w ilości około 10% objętości zarodka. Wstrzyknij jednorazowo 20 komórek jajowych, a następnie przerwij i wykonaj zabiegi odzyskiwania zarodków. W ciągu 20 minut po wstrzyknięciu ostrożnie usuń olej halowęglowy z jaj, delikatnie szczotkując je czystym pędzlem.Podnieś jajka pędzlem i umieść je w filiżance podwójnie destylowanej wody, uważając, aby jajka pozostały na powierzchni. Przez następne siedem dni codziennie sprawdzaj jaja pod kątem wylęgu i postępuj zgodnie z normalnymi procedurami hodowli larw. Przebadaj wstrzyknięte komary pod kątem zmutowanych fenotypów za pomocą stereoskopu.Metoda ta została wykorzystana do skutecznego wygenerowania mutacji somatycznych i germinalnych genu krytycznego dla rozwoju ciemnej pigmentacji oczu. Mutacje somatyczne generowane przez CRISPR-Cas9 oceniano poprzez badania przesiewowe pod kątem utraty pigmentacji w oczach w fazie źrenicy osób, którym wstrzyknięto. Mutacje somatyczne były na ogół obecne jako fenotypy mozaikowe, w których niektóre, ale nie wszystkie komórki mają zmutowany fenotyp.Wskaźniki mutacji linii zarodkowej określono poprzez krzyżowanie mozaiki G zero osobników i punktację na całkowicie białookie potomstwo. Eksperymenty te wykazały 64 do 82% przeżywalności zarodków, 37 do 57% wskaźnika mutagenezy somatycznej i ponad 61% wskaźnika mutagenezy linii zarodkowej. Dzięki multipleksowaniu sgRNA w celu ukierunkowania na wiele loci w tym samym genie, wskaźniki mutagenezy somatycznej i linii zarodkowej wzrosły aż do 86%Ponadto przez wiele pokoleń żywotne homozygotyczne stada białych mutantów były z powodzeniem utrzymywane w laboratorium.Aby zoptymalizować przeżywalność i mutagenezę, wszystkie materiały, w tym olej halowęglowy, płyn iniekcyjny i igły, powinny być odpowiednio przygotowane przed próbą mikroiniekcji. Pozwoli to na bardziej usprawniony i skoncentrowany proces mikroiniekcji.

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

W tym filmie demonstrujemy integrację transgenu w zarodku Anopheles za pośrednictwem phiC31 za pośrednictwem mikroiniekcji. Metoda ta pomaga wprowadzić pożądane geny do systemu gospodarza do zastosowań badawczych i przemysłowych.

phiC31-Integraza-Medi-Site-Directed Transgene Integration: Technika mikroiniekcji do specyficznej dla miejsca integracji transgenu z wektorem Anopheles

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Naucz się technik mikroiniekcji zarodków Culex quinquefasciatus zoptymalizowanych pod edycję CRISPR/Cas9. Protokół umożliwia generowanie dziedzicznych mutacji w linii zarodowej z przeżywalnością embrionów do 82% i mutagenezą germinalną powyżej 61%.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Przeglądaj więcej filmów