Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus
24 maja 2020
Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.
Techniki mikroiniekcji zarodków utorowały drogę do opracowania wielu genetycznych narzędzi kontroli wektorów. Chociaż wiele gatunków owadów ma już dobrze rozwinięte protokoły, Culex quinquefasciatus pozostaje stosunkowo słabo zbadany. Ten protokół mikroiniekcji został specjalnie zaprojektowany, aby uwzględnić unikalne cechy biologiczne Culex quinquefasciatus, w tym pobieranie jaj, separację tratw jajowych i procedury po wstrzyknięciu.
Metoda ta może być prawdopodobnie dostosowana do każdego interesującego gatunku Culex i może być wykorzystana do badania funkcji genów lub do generowania opartych na genach technologii kontroli dla gatunków Culex. Zacznij od oddzielenia jaj od tratwy. Użyj kleszczy lub pędzla, aby docisnąć tratwę i rozdzielić poszczególne jaja.
Ułóż jajka na cienkim pasku dwustronnej taśmy klejącej umieszczonej na górze szklanego szkiełka, starając się skierować przednią stronę każdego jajka w tym samym kierunku. Przygotuj mieszankę halowęglowodorów, delikatnie mieszając odczynniki halowęglowodorowe z wodą i inkubując mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc. Przykryj wyrównane jaja mieszanką oleju halowęglowodorowego.
Aby wygenerować igły do mikroiniekcji, umieść glinokrzemianową szklaną szybę kapilarną w ściągaczu igieł, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw ciepło na 560, prędkość na 100, opóźnienie na 70, pociągnięcie na 97, a ciśnienie na 500. Następnie aktywuj ściągacz igieł.
Delikatnie dotknij końcówki ciągniętej igły na obracającej się diamentowej płytce ściernej przez około 10 sekund pod kątem 50 stopni, aby ukosować końcówkę igły. Osadź ciągnięte i skośne igły w liniach gliny modelarskiej na szalce Petriego. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań składającą się z odczynników modyfikujących genom i przechowywać ją na lodzie.
Za pomocą końcówki do mikroładowarki załadować dwa mikrolitry mieszaniny iniekcyjnej do igły iniekcyjnej. Umieścić napełnioną igłę iniekcyjną w mikromanipulatorze połączonym z elektronicznym mikrowstrzykiwaczem i umieścić szklane szkiełko z wyrównanymi jajami na stoliku mikroskopu złożonego. Za pomocą mikromanipulatora ustaw igłę tak, aby celowała w tylny koniec zarodka pod kątem od 25 do 35 stopni.
Ostrożnie wprowadzić igłę do zarodka i wstrzyknąć mieszaninę w ilości około 10% objętości zarodka. Wstrzyknij jednorazowo 20 komórek jajowych, a następnie przerwij i wykonaj zabiegi odzyskiwania zarodków. W ciągu 20 minut po wstrzyknięciu ostrożnie usuń olej halowęglowy z jaj, delikatnie szczotkując je czystym pędzlem.
Podnieś jajka pędzlem i umieść je w filiżance podwójnie destylowanej wody, uważając, aby jajka pozostały na powierzchni. Przez następne siedem dni codziennie sprawdzaj jaja pod kątem wylęgu i postępuj zgodnie z normalnymi procedurami hodowli larw. Przebadaj wstrzyknięte komary pod kątem zmutowanych fenotypów za pomocą stereoskopu.
Metoda ta została wykorzystana do skutecznego wygenerowania mutacji somatycznych i germinalnych genu krytycznego dla rozwoju ciemnej pigmentacji oczu. Mutacje somatyczne generowane przez CRISPR-Cas9 oceniano poprzez badania przesiewowe pod kątem utraty pigmentacji w oczach w fazie źrenicy osób, którym wstrzyknięto. Mutacje somatyczne były na ogół obecne jako fenotypy mozaikowe, w których niektóre, ale nie wszystkie komórki mają zmutowany fenotyp.
Wskaźniki mutacji linii zarodkowej określono poprzez krzyżowanie mozaiki G zero osobników i punktację na całkowicie białookie potomstwo. Eksperymenty te wykazały 64 do 82% przeżywalności zarodków, 37 do 57% wskaźnika mutagenezy somatycznej i ponad 61% wskaźnika mutagenezy linii zarodkowej. Dzięki multipleksowaniu sgRNA w celu ukierunkowania na wiele loci w tym samym genie, wskaźniki mutagenezy somatycznej i linii zarodkowej wzrosły aż do 86%Ponadto przez wiele pokoleń żywotne homozygotyczne stada białych mutantów były z powodzeniem utrzymywane w laboratorium.
Aby zoptymalizować przeżywalność i mutagenezę, wszystkie materiały, w tym olej halowęglowy, płyn iniekcyjny i igły, powinny być odpowiednio przygotowane przed próbą mikroiniekcji. Pozwoli to na bardziej usprawniony i skoncentrowany proces mikroiniekcji.
Przegląd
Ten protokół opisuje techniki mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, zoptymalizowane dla edycji genów CRISPR/Cas9. Umożliwia efektywne generowanie dziedzicznych mutacji linii komórkowej dla badań genetycznych i technologii kontroli wektorów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria genetyczna
- Biologia wektorów
- Technologia CRISPR/Cas9
Tło
- Culex quinquefasciatus jest słabo przebadanym wektorem chorób.
- Techniki mikroiniekcji są kluczowe dla rozwoju narzędzi kontroli genetycznej.
- Istniejące protokoły dla innych gatunków owadów są dobrze ustalone.
- Ta metoda dostosowuje się do unikalnych cech biologicznych gatunków Culex.
Cel badania
- Opracować protokół mikroiniekcji dla Culex quinquefasciatus.
- Ułatwić badania nad funkcją genów i technologie kontroli genetycznej.
- Optymalizacja wskaźników przeżywalności i mutageneza u zastrzykiwanych zarodków.
Stosowane metody
- Techniki zbierania jaj i separacji tratw.
- Przygotowanie mieszanki oleju halokarbonowego i do wstrzyknięcia.
- Mikroiniekcja zarodków za pomocą mikromanipulatora.
- Wykrywanie fenotypu mutantów po wstrzyknięciu.
Główne wyniki
- Osiągnięto wskaźnik przeżywalności zarodków od 64-82%.
- Wskaźniki mutageneza somatycznej wahają się od 37-57%.
- Wskaźniki mutageneza linii komórkowej przekraczają 61%.
- Wielokrotność sgRNA zwiększyło wskaźniki mutageneza do 86%.
Wnioski
- Protokół z powodzeniem generuje mutacje somatyczne i linii komórkowej.
- Żywotne homozygotyczne zapasy mutantów były utrzymywane w laboratorium.
- Właściwa przygotowanie materiałów poprawia proces mikroiniekcji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient embryo microinjection enables site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus, a key vector for diseases such as West Nile virus and lymphatic filariasis. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by generating heritable mutations for functional gene studies. The protocol addresses species-specific barriers, improving predictive confidence in vector control target identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise gene knockout in a disease-relevant insect vector.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate germline mutations for functional validation of targets involved in pathogen transmission.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene disruption to phenotypic outcomes critical for vector competence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable mutagenesis readouts (somatic and germline rates) to assess editing efficiency across guide RNA designs.
- Operational Value: Standardizes embryo handling and injection conditions, improving assay reproducibility across experimental batches.
- Scalability: Enables multiplexed sgRNA delivery to increase mutagenesis rates, supporting high-throughput target screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates heritable white-eye mutants to establish stable genetic lines for long-term phenotypic and transmission studies.
- Operational Value: Achieves embryo survival rates of 64–82%, ensuring sufficient viable mutants for downstream phenotypic screening.
- Translational Continuity: Maintains viable homozygous mutant stocks across generations, supporting preclinical evaluation of genetic control strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification by enabling functional genomics in an understudied vector species.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis to clarify gene function in pathogen-vector interactions.
- Screening: Delivers quantitative mutagenesis rates (37–57% somatic, >61% germline) to compare guide RNA efficacy and optimize editing conditions.
- Analytics: Enables scoring of mutant phenotypes through stereoscopic screening, providing measurable outputs for hit validation.
- Translational Research: Facilitates continuity from gene discovery to preclinical model development by generating stable mutant lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized microinjection workflow adaptable across Culex species, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct genotype-phenotype linkage in a vector-borne disease model.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized egg alignment, halocarbon overlay, and needle preparation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional validation of targets essential for vector survival or pathogen transmission.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on heritable mutation rates and phenotypic severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, micromanipulation, and fluorescent or stereoscopic screening.
- Dependent on needle puller, microinjector, and halocarbon oil preparation for embryo viability.
- Necessitates cross-team standardization of egg collection and raft separation techniques.
- Adaptation across Culex species may require adjustments to injection volume and needle geometry.
- Practical limitations include embryo fragility and the need for immediate post-injection recovery to maintain survival rates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
