Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Techniki mikroiniekcji zarodków utorowały drogę do opracowania wielu genetycznych narzędzi kontroli wektorów. Chociaż wiele gatunków owadów ma już dobrze rozwinięte protokoły, Culex quinquefasciatus pozostaje stosunkowo słabo zbadany. Ten protokół mikroiniekcji został specjalnie zaprojektowany, aby uwzględnić unikalne cechy biologiczne Culex quinquefasciatus, w tym pobieranie jaj, separację tratw jajowych i procedury po wstrzyknięciu.

Metoda ta może być prawdopodobnie dostosowana do każdego interesującego gatunku Culex i może być wykorzystana do badania funkcji genów lub do generowania opartych na genach technologii kontroli dla gatunków Culex. Zacznij od oddzielenia jaj od tratwy. Użyj kleszczy lub pędzla, aby docisnąć tratwę i rozdzielić poszczególne jaja.

Ułóż jajka na cienkim pasku dwustronnej taśmy klejącej umieszczonej na górze szklanego szkiełka, starając się skierować przednią stronę każdego jajka w tym samym kierunku. Przygotuj mieszankę halowęglowodorów, delikatnie mieszając odczynniki halowęglowodorowe z wodą i inkubując mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc. Przykryj wyrównane jaja mieszanką oleju halowęglowodorowego.

Aby wygenerować igły do mikroiniekcji, umieść glinokrzemianową szklaną szybę kapilarną w ściągaczu igieł, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw ciepło na 560, prędkość na 100, opóźnienie na 70, pociągnięcie na 97, a ciśnienie na 500. Następnie aktywuj ściągacz igieł.

Delikatnie dotknij końcówki ciągniętej igły na obracającej się diamentowej płytce ściernej przez około 10 sekund pod kątem 50 stopni, aby ukosować końcówkę igły. Osadź ciągnięte i skośne igły w liniach gliny modelarskiej na szalce Petriego. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań składającą się z odczynników modyfikujących genom i przechowywać ją na lodzie.

Za pomocą końcówki do mikroładowarki załadować dwa mikrolitry mieszaniny iniekcyjnej do igły iniekcyjnej. Umieścić napełnioną igłę iniekcyjną w mikromanipulatorze połączonym z elektronicznym mikrowstrzykiwaczem i umieścić szklane szkiełko z wyrównanymi jajami na stoliku mikroskopu złożonego. Za pomocą mikromanipulatora ustaw igłę tak, aby celowała w tylny koniec zarodka pod kątem od 25 do 35 stopni.

Ostrożnie wprowadzić igłę do zarodka i wstrzyknąć mieszaninę w ilości około 10% objętości zarodka. Wstrzyknij jednorazowo 20 komórek jajowych, a następnie przerwij i wykonaj zabiegi odzyskiwania zarodków. W ciągu 20 minut po wstrzyknięciu ostrożnie usuń olej halowęglowy z jaj, delikatnie szczotkując je czystym pędzlem.

Podnieś jajka pędzlem i umieść je w filiżance podwójnie destylowanej wody, uważając, aby jajka pozostały na powierzchni. Przez następne siedem dni codziennie sprawdzaj jaja pod kątem wylęgu i postępuj zgodnie z normalnymi procedurami hodowli larw. Przebadaj wstrzyknięte komary pod kątem zmutowanych fenotypów za pomocą stereoskopu.

Metoda ta została wykorzystana do skutecznego wygenerowania mutacji somatycznych i germinalnych genu krytycznego dla rozwoju ciemnej pigmentacji oczu. Mutacje somatyczne generowane przez CRISPR-Cas9 oceniano poprzez badania przesiewowe pod kątem utraty pigmentacji w oczach w fazie źrenicy osób, którym wstrzyknięto. Mutacje somatyczne były na ogół obecne jako fenotypy mozaikowe, w których niektóre, ale nie wszystkie komórki mają zmutowany fenotyp.

Wskaźniki mutacji linii zarodkowej określono poprzez krzyżowanie mozaiki G zero osobników i punktację na całkowicie białookie potomstwo. Eksperymenty te wykazały 64 do 82% przeżywalności zarodków, 37 do 57% wskaźnika mutagenezy somatycznej i ponad 61% wskaźnika mutagenezy linii zarodkowej. Dzięki multipleksowaniu sgRNA w celu ukierunkowania na wiele loci w tym samym genie, wskaźniki mutagenezy somatycznej i linii zarodkowej wzrosły aż do 86%Ponadto przez wiele pokoleń żywotne homozygotyczne stada białych mutantów były z powodzeniem utrzymywane w laboratorium.

Aby zoptymalizować przeżywalność i mutagenezę, wszystkie materiały, w tym olej halowęglowy, płyn iniekcyjny i igły, powinny być odpowiednio przygotowane przed próbą mikroiniekcji. Pozwoli to na bardziej usprawniony i skoncentrowany proces mikroiniekcji.