Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej

Protokół ten wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowej oceny zewnątrzkomórkowej ekspresji MHC klasy 1 na pierwotnych neuronach hodowanych od myszy. Barwienie immunologiczne NC2 pod kątem ekspresji MHC1 można również przeprowadzić, aby uniknąć utraty sygnału z powodu zmian białkowych, trzeciorzędowych, strukturalnych, przepuszczalności lub denaturacji. Oprócz kierowania odpowiedzią immunologiczną na infekcje, MHC klasy 1 moduluje neuronalne połączenia synaptyczne.

Jednak czynniki regulujące ekspresję MHC klasy 1 są nadal nieznane. Etapy sekcji mózgu embrionalnego wymagają praktyki, aby je opanować. Ucząc się tej techniki, zadbaj o to, aby ćwiczyć sekcję, nie martwiąc się o czas lub późniejszy proces hodowli.

W celu wyizolowania embrionalnego hipokampa, umieść pierwszy pobrany mózg embrionalny myszy pod mikroskopem stereopreparacyjnym. I użyj dwóch par sterylnych kleszczy Dumont numer 5, aby uszczypnąć opuszki węchowe i dokładnie odciągnąć opony mózgowe. Gdy opony mózgowe zostaną całkowicie usunięte, górna strona kory otworzy się bocznie, odsłaniając hipokamp.

Użyj kleszczy, aby uszczypnąć hipokamp z dala od przyczepionej kory i ostrożnie przenieś izolowany hipokamp do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów pożywki Hibernate-E na lodzie. Kiedy wszystkie hipokampy zostaną zebrane do jednej 15-mililitrowej probówki, osadź tkankę mózgową przez odwirowanie. Zastąp supernatant 0,5 mililitra świeżo przygotowanej dysocjacji papainy na zarodek i kilkakrotnie wymieszaj probówkę przez inwersję.

Umieść tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, mieszając próbki przez odwrócenie co 10 minut przed ponownym pobraniem tkanki przez odwirowanie. Zastąp supernatant równą objętością świeżej pożywki Hibernate-E i użyj całkowicie otwartej, szklanej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura, aby rozcierać tkankę 10 razy. Po pozostawieniu tkanki na dwa minuty przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj równą objętość Hibernate-E Medium z powrotem do tkanki i użyj do połowy otwartej, szklanej, polerowanej pipety Pasteura, aby rozcierać tkankę 10 razy. Po pozostawieniu tkanki na kolejne dwie minuty, zbierz supernatant w 50-mililitrowej probówce. Dodać równą objętość pożywki Hibernate-E do tkanek i rozcierać tkankę 10 razy za pomocą ćwiartki otwartej, szklanej, polerowanej pipety Pasteura.

Po pozostawieniu tkanki na dwa minuty zbierz supernatant w 50-mililitrowej probówce. Zebrać zdysocjowane komórki w supernatencie przez odwirowanie. I ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach pożywki do wzrostu neuronów do liczenia: Rozcieńczyć komórki do końcowej gęstości posiewu pięć razy 10 do piątych żywotnych komórek na mililitr pożywki wzrostu neuronów i dodaj jeden mililitr komórek do każdej studzienki 12-dołkowej płytki pokrytej poli-D-lizyną.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, zastępując połowę pożywki równą objętością świeżej pożywki dwa razy w tygodniu przez cały okres życia hodowli. Aby ocenić zdolność hodowanych neuronów do ekspresji MHC1, w odpowiednim dniu hodowli zastąp 0,5 mililitra supernatantu w każdym dołku 0,5 mililitra świeżej pożywki wzrostu neuronów uzupełnionej 200 jednostkami na mililitr interferonu beta na sześć do 72 godzin inkubacji w inkubatorze hodowli komórkowej. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę jeden raz zimnym pożywką neuropodstawową bez suplementów, a następnie dodać 0,5 mililitra nieuzupełnionej zimnej pożywki neuropodstawowej uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr bloku FC i jednym mikrogramem na mililitr fluorescencyjnego przeciwciała anty-MHC1 do każdej studzienki.

Po 45-minutowej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza chroń go przed światłem. Umyj każdą studzienkę jeden raz zimnym Dulbeccos PBS. Następnie dodaj 0,5 mililitra bezenzymatycznego buforu dysocjacji komórek o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i zamieszaj, aby usunąć komórki.

Potwierdź dysocjację pod odwróconym mikroskopem hodowli tkankowej i dodaj 0,5 mililitra buforu FACS do każdej studzienki. Rozetrzeć komórki, aby rozproszyć grudki i przenieść całą objętość z każdej studzienki do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,7 mililitra. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu FACS na probówkę.

Przenieść każdą zawiesinę do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U i dodać 100 mikrolitrów odczynnika utrwalającego do każdej studzienki. Rozcierać kilka razy, aby uniknąć zbrylania się komórek i inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji odwirować w celu zebrania komórek na dnie studzienek i ponownego zawieszenia granulek w 200 mikrolitrach świeżego buforu FACS na studzienkę.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach odczynnika do permeabilizacji uzupełnionego fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym na dołek. Po wymieszaniu inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej z kołysaniem chronionym przed światłem. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez trzykrotne odwirowanie, ponownie zawieszając granulki w 100 mikrolitrach świeżego buforu FACS między wirowaniami.

Po ostatnim praniu ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach 2% pary formaldehydu w buforze FACS z dokładnym wymieszaniem. Neurony można zidentyfikować poprzez sekwencyjne bramkowanie całkowitych zdarzeń w celu wykluczenia szczątków komórkowych i dubletów oraz na podstawie pozytywności ich jąder neuronalnych. Komórki dodatnie w jądrach neuronalnych mogą być następnie dalej analizowane pod kątem dodatniego wyniku MHC1.

Na podstawie tych danych można obliczyć odsetek neuronów z dodatnim wynikiem barwienia MHC1 i medianę intensywności fluorescencji, ujawniając, że na przykład leczenie interferonem beta znacznie zwiększa procent i intensywność ekspresji neuronów MHC1. Z niewielkimi modyfikacjami metody te mogą być stosowane do hodowli innych populacji neuronów, takich jak neurony korowe, lub do testowania różnych markerów komórkowych, cząsteczek stymulujących lub modyfikacji genetycznych.