Name: Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę oceny ekspresji MHC klasy I na pierwotnych neuronach mysiego hipokampa przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół ten pozwala badać interakcje immunologiczno-neuronalne in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIA R00 AG053412 (KEF).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health oraz zgodnie z Międzynarodowymi Wytycznymi dla Badań Biomedycznych z udziałem Zwierząt. Protokół został zatwierdzony przez University of North Carolina at Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protokół #19-020).
1. Przygotowanie do kultury
UWAGA: Te procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego przeznaczonej do hodowli tkankowej. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z nośnikami i rozwiązaniami.
<ol>
	<li>Sterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne przez autoklawowanie w samozamykających się workach sterylizacyjnych.</li>
	<li>Przygotuj zapasy robocze poli-D-lizyny do obróbki 12-dołkowych naczyń hodowlanych.
	<ol>
		<li>Rozpuścić poli-D-lizynę w 1x buforze boranowym do stężenia 100 μg/ml (10x zagęszczony). Przechowywać około 1 ml porcji w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
		<li>Rozcieńczyć 10x skoncentrowaną poli-D-lizynę w dPBS do 10 μg/ml (1x) i wysterylizować filtrem.</li>
		<li>Traktuj 12-dołkowe płytki hodowlane 0,5 ml na zagłębienie 1x poli-D-lizyny w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc do użycia następnego dnia. Upewnij się, że objętość poli-D-lizyny jest wystarczająca, aby w pełni pokryć dno obszaru hodowli.</li>
		<li>Tuż przed użyciem usuń poli-D-lizynę z płytki hodowlanej, spłucz 3x w sterylnej wodzie i trzymaj w sterylnej wodzie, aż będą gotowe do płytki komórek. Usuń wszelkie ślady cieczy poprzez dokładne zasysanie przed posiewem komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pożywkę wzrostu neuronów i bufor FACS. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Pożywka Neuron Growth Media może być przechowywana przez około 2 tygodnie; Bufor FACS może być przechowywany przez około 4 tygodnie.</li>
</ol>
2. Preparowanie embrionalnego hipokampa
UWAGA: Ta procedura może być wykonana na stole, ponieważ wymaga użycia mikroskopu stereoskopowego do usunięcia opon mózgowych i mikrodysekcji hipokampa. Przestrzegaj ścisłej techniki aseptycznej, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie.
<ol>
	<li>Poddać eutanazji samicę myszy C57BL/6J w 18. dniu embrionalnym w komorze CO2 w ciąży w ciąży w czasie.</li>
	<li>Spryskaj skórę brzucha i sierść 70% EtOH, a następnie uszczypnij skórę kleszczami tkankowymi i wykonaj małe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi. Naciąć otrzewną, aby odsłonić wnętrzności i macicę.</li>
	<li>Chwyć macicę za pomocą standardowych kleszczy, wyjmij z jamy i odetnij połączenie z mezometrium cienkimi nożyczkami. Przenieść macicę z zarodkami do sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm umieszczonego na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek i cienkich kleszczy ostrożnie przetnij macicę i usuń woreczki embrionalne, aby uwolnić zarodki. Przenieść zarodki do nowego sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego dPBS umieszczonego na lodzie.</li>
	<li>Odetnij głowy embrionalnym młodem za pomocą cienkich nożyczek i przenieś głowy do nowego sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego pożywkę Hibernate-E, umieszczonej na lodzie.</li>
	<li>Aby usunąć mózg, przytrzymaj głowę parą cienkich kleszczy w jednej ręce. Używając zakrzywionych kleszczy Dumont #7 w drugiej ręce, włóż końcówkę kleszczy u podstawy czaszki i ściśnij kość i leżącą nad nią skórę przesuwającą się do przodu wzdłuż linii środkowej, nie przebijając mózgu.</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy rozsuń skórę i czaszkę, aby odsłonić mózg. Zamiataj zakrzywione kleszcze pod mózgiem od odsłoniętej opuszki węchowej do móżdżku, aby wyjąć mózg z czaszki. Przenieś mózg do nowego sterylnego plastikowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego pożywkę Hibernate-E, umieszczonej na lodzie. Powtórz te czynności dla każdego mózgu. 
	UWAGA: Wszystkie mózgi można zebrać w jednym naczyniu hodowlanym, chyba że jest to konieczne do oddzielnych celów specyficznych dla eksperymentu.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym, pracując z jednym mózgiem na raz i dwiema parami sterylnych kleszczy Dumont #5, uszczypnij opuszki węchowe i odciągnij opony mózgowe. Dokładne usunięcie opon mózgowych jest konieczne, aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli innymi komórkami i umożliwić dalszą sekcję.</li>
	<li>Po prawidłowym usunięciu opon mózgowych górna strona kory otwiera się bocznie, co odsłania hipokamp. Za pomocą kleszczyków Dumont #5 uszczypnij hipokamp z dala od przyczepionej kory i ostrożnie przenieś izolowany hipokamp do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki Hibernate-E na lodzie.</li>
	<li>Powtórz sekcję dla obu półkul mózgowych dla każdego embrionalnego szczeniaka myszy i połącz wszystkie hipokampy w jedną stożkową rurkę o pojemności 15 ml, chyba że jest to potrzebne osobno do celów specyficznych dla eksperymentu.
	<ol>
		<li>Aby wyhodować neurony korowe, kora może być oddzielona od podkory i przetwarzana identycznie jak neurony hipokampa. 
		UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany. Przechowuj mózgi lub wypreparowane hipokampy w pożywce Hibernate-E uzupełnionej witaminą B27 (2%) w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca, chociaż dłuższe opóźnienie może zagrozić liczbie żywotnych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dysocjacja i hodowla neuronów hipokampa
UWAGA: Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego przeznaczonej do hodowli tkankowej.
<ol>
	<li>Przygotować 0,5 ml roztworu dysocjacji papainy na zarodek do dysocjacji hipokampa. Objętość potrzebnego roztworu dysocjacyjnego będzie się różnić w zależności od liczby preparowanych mózgów embrionalnych. 
	UWAGA: Do hodowli neuronów korowych przygotuj 1,0 ml roztworu papainy na zarodek.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 20 μl zawiesiny papainy na 1 ml pożywki Hibernate E, wirując przez około 3 minuty.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu papainy dodać 1 μl DNazy I na 1 ml roztworu. Nie należy mieszać roztworu po dodaniu DNazy I, ponieważ może to spowodować dezaktywację enzymu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować 15 ml stożkowej probówki zawierającej tkankę hipokampa (krok 2.10) przy 1 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i dodać roztwór papainy. Ponownie zawieś tkankę, odwracając kilka razy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, odwracając w celu ponownego zawieszenia tkanki co 10 minut.
	<ol>
		<li>W przypadku hodowli neuronów korowych przenieś całą korę do nowego sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm, ostrożnie odessaj pożywkę z płytki i zmiel tkankę cienkimi nożyczkami lub żyletką. Dodać roztwór papainy do szalki hodowlanej i przenieść tkankę korową z roztworem papainy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia. Inkubować roztwór tkanek i enzymów w temperaturze 37 °C przez 30 minut, mieszając co 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas 30-minutowej inkubacji przygotuj 3 szklane pipety Pasteura polerowane ogniowo: 1 całkowicie otwartą, 1 półotwartą i 1 ćwiartkę otwartą.</li>
	<li>Po 30 minutowej inkubacji odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą strawione tkanki mózgowe w stężeniu 125 x g przez 10 minut. Usunąć roztwór enzymu i zastąpić równą objętością świeżej pożywki Hibernate E.</li>
	<li>Za pomocą całkowicie otwartej pipety Pasteura rozcierać tkankę 10 razy. Pozwól tkance osiąść na 2 minuty, a następnie przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj równą objętość pożywki Hibernate E z powrotem do tkanki.</li>
	<li>Za pomocą półotwartej pipety Pasteura rozcieraj tkankę 10x. Pozwól tkance osiąść na 2 minuty, a następnie przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, co w poprzednim kroku. Dodaj równą objętość pożywki Hibernate E z powrotem do tkanki.</li>
	<li>Używając ćwiartki otwartej pipety Pasteura, rozcieraj tkankę 10x. Pozwól tkance osiąść na 2 minuty, a następnie ponownie przenieś zawiesinę komórek sklarowanych nad osadem do tego samego stożkowego 50 ml, jak w poprzednich krokach. Wyrzuć pozostałą tkankę, która nie uległa dysocjacji.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą supernatant z zawiesiny komórek o sile 125 x g przez 5 minut. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, umyj płytki pokryte poli-D-lizyną sterylną wodą i usuń wszelkie ślady płynu przez dokładne zasysanie podczas wirowania.</li>
	<li>Po odwirowaniu wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 5 ml pożywki Neuron Growth Media. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
	<ol>
		<li>W przypadku hodowli neuronów korowych dodaj co najmniej 10 ml pożywki do wzrostu neuronów, aby uzyskać mniej gęste komórki i dokładniejsze liczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki za pomocą pożywki Neuron Growth Media, aby uzyskać końcową gęstość posiewu 5 x 105 żywych komórek na ml i dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdego dołka na 12-dołkowej płytce. Utrzymuj neurony w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Zazwyczaj hipokampy z 1 embrionalnego mózgu myszy, tj. 2 hipokampy, dają około 1 x 106 żywotnych komórek. Liczba ta jest podawana wyłącznie do celów planowania eksperymentu i nie powinna być traktowana jako substytut do liczenia komórek dla każdej hodowli.</li>
	<li>Zmień pożywkę wzrostową dzień po hodowli, usuwając połowę objętości pożywki z każdej studzienki, tj. 0,5 ml, i dodaj równą objętość świeżej pożywki z boku dołka, aby uniknąć zakłócenia pracy hodowanych komórek. Dokonuj połówkowej wymiany pożywki dwa razy w tygodniu przez cały okres życia kultury.</li>
</ol>
4. Ocena ekspresji MHCI za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotować leczenie, rozcieńczając interferon beta (IFNβ) lub równą objętość rozcieńczalnika w pożywce Neuron Growth Media. Ponieważ zmiana pożywki będzie zmianą o połowę objętości, należy przygotować pożywkę zabiegową z 2x skoncentrowanym IFNβ. tj. aby potraktować 3 dołki 12-dołkowej płytki 100 U/ml IFNβ, przygotuj 1,5 ml z 200 U/ml IFNβ lub równą objętość IFNβ lub równą objętość IFNβ dla kontroli poddanych działaniu pożywki.</li>
	<li>Usuń 0,5 ml z każdej studzienki neuronów i dodaj 0,5 ml pożywki do wzrostu neuronów z IFNβ lub bez niego do każdej studzienki. Inkubować w normalnych warunkach wzrostu (37 °C, 5% CO2 ) przez 6-72 h, w zależności od warunków eksperymentalnych i optymalizacji sygnału.</li>
	<li>Po upływie czasu leczenia usuń wszystkie pożywki hodowlane i delikatnie umyj je w zimnym podłożu neurobazalnym, w którym brakuje suplementów (B27, L-glutamina, Pen-Strep).</li>
	<li>Dodać 0,5 ml niesuplementowanego zimnego podłoża neurobazalnego zawierającego 1 μg/ml bloku Fc i 1 μg/ml fluorescencyjnego sprzężonego przeciwciała anty-MHCI do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem przez 45 minut.</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą przeciwciała i ostrożnie umyć raz w zimnym dPBS. Dodaj 0,5 ml bezenzymatycznego buforu dysocjacji komórek o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i mieszaj, aby usunąć komórki. Obserwuj dysocjację za pomocą mikroskopu odwróconych kultur tkankowych.</li>
	<li>Po odłączeniu komórek od naczynia hodowlanego dodaj 0,5 ml buforu FACS do każdej studzienki, rozdziel komórki, aby rozproszyć grudki i przenieś całkowitą objętość każdej studzienki do pojedynczych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl buforu FACS i przenieść całkowitą objętość każdej probówki do indywidualnych studzienek 96-dołkowej płytki dennej w kształcie litery U.</li>
	<li>Dodać 100 μl odczynnika utrwalającego do każdej studzienki. Kilkakrotnie rozcierać, aby uniknąć zbrylania się komórek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl buforu FACS.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl odczynnika permeabilizacyjnego zawierającego fluorescencyjnie sprzężone przeciwciało anty-NeuN (rozcieńczenie 1:100) do każdej studzienki. Dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, kołysząc przez 20 minut.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu FACS. Powtórz 2 razy.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 100 μl 2% paraformaldehydu rozcieńczonego w buforze FACS. Dobrze wymieszaj, aby zapobiec zbrylaniu się komórek. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu, gdy będzie gotowe do odczytu na cytometrze przepływowym. Przeczytaj próbki tak szybko, jak to możliwe, w ciągu 1 tygodnia.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja i ocena danych
<ol>
	<li>Zmierz kontrolki kompensacji dla każdego barwnika fluorescencyjnego i skoryguj wszelkie nakładanie się widma. Idealna kontrola kompensacji obejmuje hodowane neurony, które są niebarwione, barwione tylko anty-MHCI i barwione tylko anty-NeuN.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, zarejestruj 100 000 zdarzeń dla każdej próbki (co najmniej 10 000) i zapisz jako pliki FCS.</li>
	<li>Aby przeanalizować dane, używając odpowiedniego oprogramowania do analizy, ustaw bramki sekwencyjne, jak pokazano na Rysunek 1A-C, aby wybrać neurony NeuN-dodatnie.
	<ol>
		<li>Wykres SSC-A (log) vs FSC-A (liniowy). Narysuj bramkę na populacji komórkowej (P1), aby wyeliminować zanieczyszczenia komórkowe z analizy.</li>
		<li>W populacji komórkowej P1 wykreśl FSC-H (liniowy) vs FSC-A (liniowy). Narysuj bramkę na populacji pojedynczej komórki.</li>
		<li>W populacji pojedynczej komórki wykreśl SSC-A (log) vs NeuN (log). Narysuj bramkę w populacji NeuN-dodatniej, używając jako przewodnika niebarwionych komórek lub komórek barwionych tylko MHCI.</li>
		<li>Wykreśl histogram fluorescencji MHCI ze zdarzeniami komórkowymi znormalizowanymi do trybu na osi y. Używając niebarwionych neuronów lub neuronów barwionych tylko NeuN jako przewodnika, narysuj poziomą bramkę, aby określić ilościowo procent neuronów dodatnich dla MHCI.</li>
		<li>Wyeksportuj procent komórek dodatnich dla MHCI, a także medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla MHCI w populacji NeuN-dodatniej w celu oceny statystycznej i rysunku graficznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+immune+privilege+%28not%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What is immune privilege (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).</li>
<li>Morimoto, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Immune+System+in+the+Development+of+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 916(2019).</li>
<li>Klein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+During+RNA+Viral+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation During RNA Viral Infections.</a> Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).</li>
<li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+receptor+as+a+multicomponent+signalling+machine%3A+CD4%2FCD8+coreceptors+and+CD45+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation.</a> Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).</li>
<li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).</li>
<li>Donaldson, J. G., Williams, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Assembly+and+Trafficking+of+MHC+Class+I+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules.</a> Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).</li>
<li>Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharles%2C+A+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease.+5th+edition%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition</a>. , (2001).</li>
<li>Guidotti, L. G., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncytolytic+control+of+viral+infections+by+the+innate+and+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.</a> Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).</li>
<li>Chevalier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+are+MHC+class+I-dependent+targets+for+CD8+T+cells+upon+neurotropic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393(2011).</li>
<li>Shrestha, B., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CD8%2B+T+Cells+in+Control+of+West+Nile+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection.</a> Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).</li>
<li>Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+mediated+suppression+of+neurotropic+coronavirus+replication+in+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells.</a> Virology. 449, 235-243 (2014).</li>
<li>Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+virus-specific+CD8%2B+-T-cell+expansion+and+trafficking+following+central+nervous+system+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection.</a> Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).</li>
<li>Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I%3A+an+unexpected+role+in+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity.</a> Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).</li>
<li>Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+I+MHC+gene+expression+in+the+developing+and+mature+CNS+by+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity.</a> Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).</li>
<li>Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CNS+synapses+by+neuronal+MHC+class+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).</li>
<li>Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I+molecules+are+present+both+pre-+and+postsynaptically+in+the+visual+cortex+during+postnatal+development+and+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).</li>
<li>Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSyken%2C+J+%22Science%22">Science</a>. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).</li>
<li>Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtwal%2C+JK+%22Science%22">Science</a>. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).</li>
<li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+immunoglobulin-like+receptors+and+their+MHC+class+I+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition.</a> Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+elimination+and+learning+rules+co-regulated+by+MHC+class+I+H2-Db%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.</a> Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).</li>
<li>Ribic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+MHC+class+I+expression+in+the+developing+primary+visual+cortex+of+the+common+marmoset+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+and+Brain+Functions%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey.</a> Behavioral and Brain Functions. 7, 1(2011).</li>
<li>Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+neurons+from+rat+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuronal+Signaling%22%5BJournal%5D)">Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex.</a> Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).</li>
<li>Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+induced+pluripotent+stem+cell+neuronal+models+to+study+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431(2020).</li>
<li>Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+Current+Challenges+Associated+with+the+Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Modeling+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).</li>
<li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Single-Cell+Transcriptomics+in+Adult+Rodent+Brain%3A+The+Medium+Spiny+Neuron+Transcriptome+Revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159(2018).</li>
<li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Flow+Cytometric+Analysis+of+Central+Nervous+System+Tissue+Reveals+Novel+Functional+Relationships+Among+Cells+Expressing+CD133%2C+CD15%2C+and+CD24%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).</li>
<li>Snaidero, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Myelination at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).</li>
<li>Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurocytometry%3A+Flow+Cytometric+Sorting+of+Specific+Neuronal+Populations+from+Human+and+Rodent+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).</li>
<li>Lv, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+MHC+Class+I+Expression+Is+Regulated+by+Activity+Driven+Calcium+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling.</a> PLoS One. 10 (8), 0135223(2015).</li>
<li>Barco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+facilitated+L-LTP+in+VP16-CREB+mice+reveals+that+BDNF+is+critical+for+the+maintenance+of+LTP+and+its+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture.</a> Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).</li>
<li>Glynn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li>
<li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Rodent+Cortical%2C+Hippocampal%2C+and+Striatal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje sekcję i hodowlę pierwotnych neuronów hipokampa od prenatalnych szczeniąt myszy w 18 dniu embrionalnym. Wykorzystanie pierwotnych neuronów wyhodowanych od gryzoni jest jedną z najbardziej podstawowych metodologii opracowanych we współczesnej neurobiologii22. Chociaż unieśmiertelnione linie komórkowe mogą modelować pewne aspekty neuronów, ich natura jako komórek pochodzących z nowotworu, brak rozwoju zdefiniowanych aksonów i ciągły podział komórek budzi wątpliwości, czy wiernie odwzorowują właściwości neuronów postmitotycznych in vivo23. Inną alternatywą dla neuronów pierwotnych jest wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (HiPSC). Technologia wykorzystania HiPSC, zwłaszcza tych, które są pobierane od pacjenta, rozwinęła się w ostatnich latachbardzo daleko 24 . Jednak nadal istnieją ograniczenia w pracy z HiPSC, w tym zmienność między liniami komórkowymi, brak dojrzałości funkcjonalnej i różnice w profilach epigenetycznych25. Chociaż istnieją również ograniczenia w pracy z redukcjonistycznym modelem pierwotnych neuronów gryzoni, hodowane neurony zachowują postmitotyczną naturę neuronów in vivo. Ponadto ekspansywne narzędzia biologii molekularnej i modyfikacje genetyczne dostępne dla myszy faworyzują wykorzystanie pierwotnych neuronów zamiast HiPSC w wielu zastosowaniach, a badania na myszach można łatwo przełożyć na bardziej złożone organizmy in vivo bez utraty eksperymentalnego systemu genetycznego. Z tych powodów wielu badaczy wykorzystuje pierwotne neurony gryzoni do weryfikacji kluczowych aspektów, jeśli nie większości, swoich badań.
W przypadku niektórych testów neurony mogą być analizowane bezpośrednio po izolacji od mózgu ex vivo. Jest to szczególnie pożądane w przypadku eksperymentów z udziałem dorosłych myszy, które mogą być poddane określonym warunkom eksperymentalnym lub które mogą zależeć od interakcji wielu typów komórek; Istnieje jednak kilka kwestii, które ograniczają rodzaj analiz, które można wykonać. Przygotowanie zawiesiny neuronów w pojedynczej komórce z mózgów dorosłych myszy jest technicznie trudne, ponieważ neurony są unikalnie połączone i otoczone mieliną26. Nieenzymatyczne metody rozszczepiania tkanek są nieskuteczne w dysocjacji tkanki i powodują śmierć komórki, podczas gdy preparaty enzymatyczne często rozszczepiają antygeny powierzchniowe komórek27. Ponadto, chociaż mielina jest w dużej mierze nieobecna u embrionalnych myszy, stanowi około 20% dorosłego mózgu i może upośledzać żywą izolację komórek i utrudniać analizę cytometrii przepływowej28. Wiele z opracowanych technik ostatecznie pozbawia neurony cytozolu i pozostawia małe, zaokrąglone ciała komórkowe, które składają się głównie z jąder29. Chociaż jest to dopuszczalne w przypadku niektórych analiz, nie jest to odpowiednie do ilościowego określania cytoplazmatycznej lub zewnątrzkomórkowej ekspresji białek. Co więcej, redukcjonistyczny system hodowli komórkowych pozwala na testowanie konkretnych pytań mechanistycznych w krótszym czasie, niż jest to często możliwe w przypadku systemu in vivo.
W niniejszym protokole opisano również metody farmakologicznej stymulacji ekspresji MHCI za pomocą IFNβ oraz ilościowe oznaczanie zewnątrzkomórkowej ekspresji MHCI za pomocą cytometrii przepływowej. Stymulacja przez IFNβ jest użyteczną kontrolą pozytywną do testowania innych warunków eksperymentalnych, ale można zauważyć, że IFNγ i kwas kainowy mogą również stymulować ekspresję MHCI w neuronach 9,30, podczas gdy tetrodotoksyna zmniejsza ekspresję MHCI14. Poprzednie metody wykrywania ekspresji MHCI opierały się na hybrydyzacji in situ i analizie immunohistochemicznej 14,15,20,31. Podczas gdy testy oparte na mRNA, takie jak hybrydyzacja in situ i qRT-PCR, mogą określić lokalizację czasoprzestrzenną, specyficzność typu komórki i poziomy transkrypcji genów, testy te nie mogą ocenić translacji białka ani transportu do błony komórkowej. Analiza immunohistochemiczna i western blot mogą określić różnice w ekspresji białek i potencjalnie lokalizacji komórkowej, ale mogą być trudne do dokładnego określenia ilościowego. Co więcej, wiele przeciwciał MHCI rozpoznaje trzeciorzędową strukturę kompleksu i jest bardzo wrażliwych na zmiany konformacyjne. Tak więc warunki przepuszczalności lub denaturacji powodują utratę immunoreaktywności MHCI32. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje barwienie immunologiczne in situ dla MHCI, które pozwala na rozpoznanie białka przez przeciwciało w jego natywnej konformacji, a następnie metody utrwalania i przepuszczalności.
Z niewielkimi modyfikacjami, opisane tutaj metody mogą być wykorzystane do hodowli innych populacji neuronów lub do oceny ekspresji innych białek zewnątrzkomórkowych będących przedmiotem zainteresowania. W tym protokole odnotowano łatwe modyfikacje, które można wprowadzić w celu hodowli neuronów korowych, ale opisane tutaj metody mogą być również wykorzystane do hodowli innych populacji neuronów, takich jak neurony prążkowia33. Ponadto, chociaż protokół ten określa barwienie immunologiczne MHCI i NeuN, inne markery komórkowe można zidentyfikować w podobny sposób. Ogólnie rzecz biorąc, markery zewnątrzkomórkowe mogą być traktowane jak MHCI, a markery wewnątrzkomórkowe mogą być leczone jak NeuN. Należy jednak zauważyć, że na etapie dysocjacji komórkowej wypustki aksonalne są odcinane od somy. Ponieważ zdefiniowana tutaj strategia bramkowania odsiewa szczątki komórkowe i koncentruje się na markerze jąder neuronalnych NeuN, białka, które ulegają ekspresji wyłącznie w projekcjach aksonalnych, mogą nie zostać wykryte.
Do niedawna uważano, że neurony wyrażają MHCI tylko w odpowiedzi na uszkodzenie, infekcję lub stymulację cytokinami in vitro w celu zaangażowania cytotoksycznych limfocytów T CD8 + 9. Nowe badania wyjaśniły inną funkcję MHCI w regulacji połączeń synaptycznych podczas rozwoju13. Opisany tutaj protokół wykorzystuje IFNβ do stymulowania ekspresji MHCI w neuronach hodowanych w typie dzikim, ale podobne metody mogą być stosowane z różnymi bodźcami komórkowymi lub modyfikacjami genetycznymi w celu przetestowania określonych hipotez. Metoda ta umożliwi naukowcom zbadanie mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję MHCI, co poprawi zrozumienie dychotomicznej roli MHCI w tych dwóch odrębnych funkcjach komórkowych.

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) był kiedyś uważany za pozbawiony nadzoru immunologicznego, określany jako "immune privileged1." Teraz jest jasne, że ten przywilej nie jest równoznaczny z absolutnym brakiem składników immunologicznych, ale raczej z wyspecjalizowaną regulacją, która działa w celu ograniczenia uszkodzeń związanych z immunopatologią1. W rzeczywistości komunikacja między OUN a układem odpornościowym to ciągła rozmowa, która jest niezbędna do zdrowego rozwoju mózgu i odpowiedzi na infekcje2,3.
Główne cząsteczki kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHCI) są poligenicznymi i polimorficznymi białkami transbłonowymi, najbardziej znanymi ze swojej funkcji w prezentowaniu antygenowych peptydów limfocytom T CD8+ podczas infekcji4. Klasyczne kompleksy MHCI składają się z transbłonowego łańcucha α i zewnątrzkomórkowego łańcucha lekkiego, zwanego β2-mikroglobuliną. Łańcuch α zawiera polimorficzny rowek, który wiąże peptyd antygenowy do prezentacji5. Właściwa ekspresja MHCI na błonie zewnątrzkomórkowej wymaga skoordynowanego działania molekularnych białek opiekuńczych w retikulum endoplazmatycznym, aby zapewnić prawidłowe fałdowanie łańcucha α i β2-mikroglobuliny wraz z obciążeniem ligandu peptydowego o wysokim powinowactwie5. Dopiero po złożeniu kompleksów MHCI są one eksportowane z retikulum endoplazmatycznego do błony plazmatycznej6. Po zaangażowaniu pokrewnego receptora limfocytów T z kompleksem MHCI obciążonym peptydami, limfocyty T CD8 + pośredniczą w zabijaniu komórek poprzez uwalnianie ziarnistości litycznych zawierających perforynę i granzymy lub poprzez indukowanie apoptozy poprzez wiązanie receptora Fas na błonie komórki docelowej7. Dodatkowo limfocyty T CD8 + wytwarzają cytokiny, takie jak interferon gamma (IFNγ) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), które mogą aktywować mechanizmy przeciwwirusowe w zakażonych komórkach bez skutków cytopatycznych8,9. W przypadku wielu wirusów neurotropowych limfocyty T CD8 + są niezbędne do usunięcia infekcji z CNS10,11,12.
Wcześniej sądzono, że neurony wyrażają MHCI tylko w warunkach uszkodzenia, infekcji wirusowej lub stymulacji cytokin in vitro. Ostatnio badania zidentyfikowały rolę neuronalnej ekspresji MHCI w przebudowie synaps i plastyczności13,14. Chociaż dokładne mechanizmy leżące u podstaw regulacji synaps nie są dobrze poznane, dane wskazują, że poziom ekspresji MHCI jest regulowany przez aktywność synaptyczną15,16. Jedna z hipotez zakłada, że neurony presynaptycznie wyrażają sparowany receptor podobny do immunoglobuliny B (PirB), który wiąże MHCI transynaptycznie13,17. Ta interakcja inicjuje kaskadę sygnalizacyjną PirB, która przeciwstawia się szlakom zaangażowanym w przebudowę synaptyczną, wzmacniając w ten sposób i stabilizując połączenie synaptyczne17,18,19. W przypadku braku aktywności neuronalnej, ekspresja MHCI jest zmniejszona14, a utrata MHCI powoduje wadliwą eliminację synaps i niezorganizowaną organizację obwodów synaptycznych20,21.
Opisany tutaj test, który został zaadaptowany z Chevalier et al.9, wykorzystuje analizę cytometryczną przepływową do ilościowej oceny zewnątrzkomórkowej ekspresji białka MHCI w pierwotnych hodowlach mysich neuronów hipokampa. Protokół ten ilustruje początkowe techniki mikropreparowania tkanki hipokampa od embrionalnych szczeniąt myszy. Następnie szczegółowo opisano procesy enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji tkanki w zawiesinę pojedynczej komórki oraz metody utrzymywania kultur in vitro. Ponieważ neurony nie dzielą się, po znalezieniu się w hodowli muszą być posiane w naczyniu o gęstości odpowiedniej dla ich eksperymentalnego punktu końcowego. Następnie przedstawiono etapy indukcji ekspresji MHCI za pomocą interferonu beta (IFNβ), znakowania immunologicznego MHCI i markera jąder neuronalnych NeuN oraz analizy komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Na koniec opisano procedury oceny danych cytometrii przepływowej w celu identyfikacji neuronów MHCI-dodatnich i ilościowego określenia poziomu ekspresji MHCI. W tym protokole odnotowuje się również niewielkie korekty, które można wprowadzić w celu hodowli neuronów korowych oprócz lub zamiast neuronów hipokampa. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu przetestowania określonych hipotez przy użyciu wariacji genetycznych lub leczenia farmakologicznego.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>100 mm sterylne naczynie hodowlane</td><td>Fisher</td><td>FB012924</td><td>Materiały do kultur tkankowych</td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Genesee</td><td>21-103</td><td>Materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Genesee</td><td>21-108</td><td>Materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>Odczynnik buforowy FACS</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Fisher</td><td>BP82031Gal</td><td>Hodowla tkankowa Dostarcza</td></tr><tr><td>96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U</td><td>Genesee</td><td>25-221</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Odczynnik do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Bufor boranowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>28341</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe Pipeta Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13 678 20C</td><td>Materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>Bufor do dysocjacji komórek</td><td>Gibco</td><td>13 151 014</td><td>Materiały do cytometrii</td></tr><tr><td>przepływowej DNase I</td><td>Thermo</td><td>90083</td><td>Roztwór dysocjacyjny Odczynnik</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-235</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>91150-20</td><td>Narzędzie do preparacji</td></tr><tr><td>Dumont #7 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki o jakości</td><td>91197-00</td><td>Narzędzie do preparowania</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki o</td> nauce <td>91113-10</td><td>Narzędzie do preparacji</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Narzędzia do</td> nauki o naprawach i trwałej ondulacji <td>91460-11</td><td>Narzędzie do preparowania</td></tr><tr><td>Napraw i trwałą ondulację komórek</td><td>Invitrogen</td><td>GAS003</td><td>Cytometria przepływowa Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Odczynnik do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>Gibco</td><td>A1247601</td><td>Odczynnik do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem</td><td>Fisher</td><td>181254</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Test interferonu beta</td><td>PBL Science</td><td>12405-1</td><td>Materiały do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało Milli-Mark Anty-NeuN-PE, klon A60</td><td>MiliporeSigma</td><td>FCMAB317PE</td><td>Cytometria przepływowa Przeciwciało</td></tr><tr><td>Neurobaseal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Odczynnik do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Pacific Blue anty-mysie przeciwciało H-2Kb</td><td>BioLegend</td><td>116513</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Roztwór papainy</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do roztworu dysocjacyjnego Worth LS003126 ingtonParaformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15714</td><td>Utrwalająca</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Odczynnik do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td>Odczynnik do hodowli neuronów</td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>Narzędzia do nauki o</td> naborze <td>91100-12</td><td>Narzędzie do preparacji</td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny</td><td>Swift</td><td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td><td>Narzędzie do preparacji</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>91401-10</td><td>Narzędzie do preparacji</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Corning</td><td>357575</td><td>Materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>TruStain FcX (anty-mysie CD16/32) Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>101319</td><td>Cytometria przepływowa Przeciwciało</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154-100ML</td><td>Materiały do hodowli tkankowych</td></tr></tbody></table>

ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy i na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Coraz więcej dowodów potwierdza hipotezę, że interakcje neuro-immunologiczne wpływają na funkcjonowanie układu nerwowego zarówno w warunkach homeostatycznych, jak i patologicznych. Dobrze zbadaną funkcją głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHCI) jest prezentacja peptydów pochodzenia komórkowego dla adaptacyjnego układu odpornościowego, szczególnie w odpowiedzi na infekcję. Niedawno wykazano, że ekspresja cząsteczek MHCI na neuronach może modulować zależne od aktywności zmiany w połączeniach synaptycznych podczas normalnego rozwoju i zaburzeń neurologicznych. Znaczenie tych funkcji dla zdrowia mózgu potwierdza potrzebę czułego testu, który łatwo wykrywa ekspresję MHCI na neuronach. W tym miejscu opisano metodę pierwotnej hodowli mysich neuronów hipokampa, a następnie oceny ekspresji MHCI za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Mysi hipokamp jest mikropreparowany od prenatalnych szczeniąt myszy w 18 dniu embrionalnym. Tkanka jest dysocjowana do zawiesiny pojedynczej komórki przy użyciu technik enzymatycznych i mechanicznych, a następnie hodowana w pożywce wolnej od surowicy, która ogranicza wzrost komórek nieneuronalnych. Po 7 dniach in vitro ekspresja MHCI jest stymulowana przez farmakologiczne traktowanie hodowanych komórek interferonem beta. Cząsteczki MHCI są znakowane in situ fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem, a następnie komórki są nieenzymatycznie dysocjowane w zawiesinę pojedynczej komórki. Aby potwierdzić tożsamość neuronalną, komórki są utrwalane paraformaldehydem, permeabilizowane i znakowane fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem, które rozpoznaje neuronalny antygen jądrowy NeuN. Ekspresja MHCI jest następnie oznaczana ilościowo na neuronach za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Hodowle neuronów mogą być łatwo manipulowane przez modyfikacje genetyczne lub interwencje farmakologiczne w celu przetestowania określonych hipotez. Z niewielkimi modyfikacjami, metody te mogą być stosowane do hodowli innych populacji neuronów lub do oceny ekspresji innych białek będących przedmiotem zainteresowania.

Zgodnie z przedstawioną tutaj procedurą, tkanka hipokampa została wypreparowana z płodów myszy w 18. dniu embrionalnym. Tkankę rozdzielono do postaci zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą metod enzymatycznych i mechanicznych, a następnie hodowano na płytkach 12-dołkowych uprzednio potraktowanych poli-D-lizyną. Po 7 dniach in vitro komórki poddano działaniu 10 U/mL IFNβ lub samej pożywki przez 72 h, co stymulowało ekspresję MHCI. Neurony barwiono in situ pod kątem obecności MHCI przed nieenzymatycznym rozdzieleniem ich do zawiesiny pojedynczych komórek. Neurony utrwalono i permeabilizowano, a następnie barwiono wewnątrzkomórkowo markerem jąder neuronalnych NeuN. Próbki oceniano metodą cytometrii przepływowej, a dane analizowano przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Neurony zidentyfikowano poprzez sekwencyjne bramkowanie całkowitej liczby zdarzeń w celu wykluczenia debris komórkowego i dubletów (Rycina 1A,B). Neurony jednoznacznie zidentyfikowano na podstawie pozytywności dla NeuN (Rycina 1C). Komórki NeuN+ analizowano dalej pod kątem pozytywności dla MHCI, nanosząc komórki na histogram, gdzie na osi y znajdowała się liczba komórek znormalizowana do mody, a na osi x fluorescencja MHCI. Bramkę MHCI+ wyznaczono w punkcie rozdzielenia szczytów pozytywnych i negatywnych (Rycina 1D). Na tej podstawie obliczono procent neuronów wykazujących pozytywne barwienie MHCI (Rycina 1E) oraz medianę intensywności fluorescencji (MFI; Rycina 1F). Wyniki pokazują, że traktowanie IFNβ znacząco zwiększyło odsetek neuronów pozytywnych w barwieniu zewnątrzkomórkowym MHCI, a także poziom ekspresji, co wskazuje MFI. Analizę statystyczną i reprezentację graficzną wykonano przy użyciu dostępnego komercyjnie oprogramowania statystycznego.
<img alt="Wykresy z cytometrii przepływowej oraz wykresy słupkowe przedstawiające analizę komórek NeuN+ z porównaniem efektów leczenia IFNβ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywna strategia bramkowania i kwantyfikacja MHCI. 
Pierwotne neurony hipokampa poddano działaniu 10 J/ml IFNβ lub samych pożywek. Po 72 h neurony zbarwiono zewnątrzkomórkowo przeciwciałem przeciwko MHC I skoniugowanym z barwnikiem Pacific Blue (1 μg/mL H2-Kb), a następnie poddano wewnątrzkomórkowemu znakowaniu przeciwciałem NeuN koniugowanym z PE (rozcieńczenie 1:100). Fluorescencję komórkową oceniono metodą cytometrii przepływowej, a następnie przeanalizowano dane. (AWszystkie zdarzenia przedstawiono na wykresie SSC-A (log) w funkcji FSC-A (liniowo), a następnie wyznaczono bramkę dla komórek (P1), aby wykluczyć zanieczyszczenia.BW obrębie populacji P1 komórki wykreślono jako FSC-H (liniowo) względem FSC-A (liniowo) w celu wyznaczenia bramki dla populacji pojedynczych komórek.C) W obrębie populacji pojedynczych komórek naniesiono na wykres SSC-A (log) w funkcji NeuN-PE (log). NeuN+ komórki poddano bramkowaniu w celu zidentyfikowania neuronów.D) W obrębie populacji neuronów komórki naniesiono na histogram, gdzie na osi X umieszczono MHCI-PacBlu, a na osi Y liczbę komórek znormalizowaną do mody. Wyznaczono bramkę poziomą w celu ilościowego określenia odsetka neuronów wykazujących pozytywność w barwieniu na MHCI. (E) Ilościowe oznaczenie procentowego udziału MHCI+ NeuN+ komórki w samym medium oraz neurony traktowane IFNβ. (F) Ilościowe oznaczenie średniej intensywności fluorescencji (MFI) cząsteczek MHCI na NeuN+ komórki w medium (czarny) oraz neurony traktowane IFNβ (czerwony). Istotność statystyczną obliczono za pomocą nieparzystego testu t. **, P &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Pożywka do wzrostu neuronów (50 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasu</td>
			<td>Dla 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement B27</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina-streptomycyna</td>
			<td>10 U/ml</td>
			<td>10 00 U/ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka Neurobasal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">bufor FACS (50 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Stężenie roztworu zapasowego</td>
			<td>Dla 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surowica płodowa wołu</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpBS (bufor fosforanowo-solny bez wapnia i magnezu)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Roztwór dysocjujący z papainą</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Stężenie roztworu macierzystego</td>
			<td>Dla 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawiesina papainy</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>10 U/ml</td>
			<td>0,020 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza I</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>250 U/ml</td>
			<td>0,01 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Uwaga: Wymagana objętość roztworu do dysocjacji papainą będzie zależeć od liczby preparowanych mózgów embrionalnych. Przygotować 0,5 ml na jeden mózg w przypadku neuronów hipokampa lub 1,0 ml na jeden mózg w przypadku neuronów korowych.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Uwaga: Roztwór do dysocjacji należy przygotować, mieszając zawiesinę papainy w medium Hibernate-E za pomocą wibratora typu vortex przez około 3 min. Po całkowitym rozpuszczeniu papainy należy dodać DNazę I. DNazy I nie wolno mieszać wibratorem typu vortex.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Pożywki i roztwory.

Ten protokół opisuje metodę hodowli pierwotnych neuronów hipokampa z embrionalnego mózgu myszy. Ekspresja głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na zewnątrzkomórkowej powierzchni hodowanych neuronów jest następnie oceniana za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Protokół ten wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowej oceny zewnątrzkomórkowej ekspresji MHC klasy 1 na pierwotnych neuronach hodowanych od myszy. Barwienie immunologiczne NC2 pod kątem ekspresji MHC1 można również przeprowadzić, aby uniknąć utraty sygnału z powodu zmian białkowych, trzeciorzędowych, strukturalnych, przepuszczalności lub denaturacji. Oprócz kierowania odpowiedzią immunologiczną na infekcje, MHC klasy 1 moduluje neuronalne połączenia synaptyczne.Jednak czynniki regulujące ekspresję MHC klasy 1 są nadal nieznane. Etapy sekcji mózgu embrionalnego wymagają praktyki, aby je opanować. Ucząc się tej techniki, zadbaj o to, aby ćwiczyć sekcję, nie martwiąc się o czas lub późniejszy proces hodowli.W celu wyizolowania embrionalnego hipokampa, umieść pierwszy pobrany mózg embrionalny myszy pod mikroskopem stereopreparacyjnym. I użyj dwóch par sterylnych kleszczy Dumont numer 5, aby uszczypnąć opuszki węchowe i dokładnie odciągnąć opony mózgowe. Gdy opony mózgowe zostaną całkowicie usunięte, górna strona kory otworzy się bocznie, odsłaniając hipokamp.Użyj kleszczy, aby uszczypnąć hipokamp z dala od przyczepionej kory i ostrożnie przenieś izolowany hipokamp do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów pożywki Hibernate-E na lodzie. Kiedy wszystkie hipokampy zostaną zebrane do jednej 15-mililitrowej probówki, osadź tkankę mózgową przez odwirowanie. Zastąp supernatant 0,5 mililitra świeżo przygotowanej dysocjacji papainy na zarodek i kilkakrotnie wymieszaj probówkę przez inwersję.Umieść tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, mieszając próbki przez odwrócenie co 10 minut przed ponownym pobraniem tkanki przez odwirowanie. Zastąp supernatant równą objętością świeżej pożywki Hibernate-E i użyj całkowicie otwartej, szklanej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura, aby rozcierać tkankę 10 razy. Po pozostawieniu tkanki na dwa minuty przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Dodaj równą objętość Hibernate-E Medium z powrotem do tkanki i użyj do połowy otwartej, szklanej, polerowanej pipety Pasteura, aby rozcierać tkankę 10 razy. Po pozostawieniu tkanki na kolejne dwie minuty, zbierz supernatant w 50-mililitrowej probówce. Dodać równą objętość pożywki Hibernate-E do tkanek i rozcierać tkankę 10 razy za pomocą ćwiartki otwartej, szklanej, polerowanej pipety Pasteura.Po pozostawieniu tkanki na dwa minuty zbierz supernatant w 50-mililitrowej probówce. Zebrać zdysocjowane komórki w supernatencie przez odwirowanie. I ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach pożywki do wzrostu neuronów do liczenia: Rozcieńczyć komórki do końcowej gęstości posiewu pięć razy 10 do piątych żywotnych komórek na mililitr pożywki wzrostu neuronów i dodaj jeden mililitr komórek do każdej studzienki 12-dołkowej płytki pokrytej poli-D-lizyną.Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, zastępując połowę pożywki równą objętością świeżej pożywki dwa razy w tygodniu przez cały okres życia hodowli. Aby ocenić zdolność hodowanych neuronów do ekspresji MHC1, w odpowiednim dniu hodowli zastąp 0,5 mililitra supernatantu w każdym dołku 0,5 mililitra świeżej pożywki wzrostu neuronów uzupełnionej 200 jednostkami na mililitr interferonu beta na sześć do 72 godzin inkubacji w inkubatorze hodowli komórkowej. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę jeden raz zimnym pożywką neuropodstawową bez suplementów, a następnie dodać 0,5 mililitra nieuzupełnionej zimnej pożywki neuropodstawowej uzupełnionej jednym mikrogramem na mililitr bloku FC i jednym mikrogramem na mililitr fluorescencyjnego przeciwciała anty-MHC1 do każdej studzienki.Po 45-minutowej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza chroń go przed światłem. Umyj każdą studzienkę jeden raz zimnym Dulbeccos PBS. Następnie dodaj 0,5 mililitra bezenzymatycznego buforu dysocjacji komórek o temperaturze pokojowej do każdej studzienki i zamieszaj, aby usunąć komórki.Potwierdź dysocjację pod odwróconym mikroskopem hodowli tkankowej i dodaj 0,5 mililitra buforu FACS do każdej studzienki. Rozetrzeć komórki, aby rozproszyć grudki i przenieść całą objętość z każdej studzienki do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,7 mililitra. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach świeżego buforu FACS na probówkę.Przenieść każdą zawiesinę do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U i dodać 100 mikrolitrów odczynnika utrwalającego do każdej studzienki. Rozcierać kilka razy, aby uniknąć zbrylania się komórek i inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji odwirować w celu zebrania komórek na dnie studzienek i ponownego zawieszenia granulek w 200 mikrolitrach świeżego buforu FACS na studzienkę.Po odwirowaniu ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach odczynnika do permeabilizacji uzupełnionego fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem przeciwko jądrom neuronalnym na dołek. Po wymieszaniu inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej z kołysaniem chronionym przed światłem. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez trzykrotne odwirowanie, ponownie zawieszając granulki w 100 mikrolitrach świeżego buforu FACS między wirowaniami.Po ostatnim praniu ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach 2% pary formaldehydu w buforze FACS z dokładnym wymieszaniem. Neurony można zidentyfikować poprzez sekwencyjne bramkowanie całkowitych zdarzeń w celu wykluczenia szczątków komórkowych i dubletów oraz na podstawie pozytywności ich jąder neuronalnych. Komórki dodatnie w jądrach neuronalnych mogą być następnie dalej analizowane pod kątem dodatniego wyniku MHC1.Na podstawie tych danych można obliczyć odsetek neuronów z dodatnim wynikiem barwienia MHC1 i medianę intensywności fluorescencji, ujawniając, że na przykład leczenie interferonem beta znacznie zwiększa procent i intensywność ekspresji neuronów MHC1. Z niewielkimi modyfikacjami metody te mogą być stosowane do hodowli innych populacji neuronów, takich jak neurony korowe, lub do testowania różnych markerów komórkowych, cząsteczek stymulujących lub modyfikacji genetycznych.

assessing-expression-major-histocompatibility-complex-class-i-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Hidmark, A. S., et al. {{}}Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Ten film demonstruje zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w nerwach kulszowych myszy i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Proces ten polega na znakowaniu komórek odpornościowych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem i biotyną, stabilizacji i...

Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj metodę oceny ekspresji MHC klasy I na pierwotnych neuronach mysiego hipokampa przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół ten pozwala badać interakcje immunologiczno-neuronalne in vitro.

Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Ocena ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I na pierwotnych mysich neuronach hipokampa za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów