Name: Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i oznaczania polifosforanów inozytolu w roślinach przy użyciu chromatografii SAX-HPLC z zastosowaniem radioaktywnych markerów. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę metabolizmu roślinnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecką Fundację Badawczą) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), Grupy Szkolenia Badawczego GRK2064 oraz indywidualnych grantów badawczych SCHA1274/4-1 i SCHA1274/5-1 dla G.S. Dziękujemy również Li Schlüterowi i Brigitte Ueberbach za pomoc techniczną.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy wszechstronną i czułą metodę ilościowego oznaczania InsP, w tym PP-InsP w ekstraktach roślinnych, oraz udzielamy praktycznych wskazówek, jak ustalić tę metodę. Mimo że protokół jest ogólnie solidny, mogą wystąpić nieoptymalne przebiegi i analizy. W większości przypadków przebiegi te można zidentyfikować po silnym zmniejszeniu lub nawet całkowitej utracie silnie ufosforylowanych InsP, zwłaszcza gatunków PP-InsP InsP7 i InsP8. Możliwymi przyczynami mogą być zanieczyszczenia mikrobiologiczne materiału roślinnego oraz niewystarczająca dezaktywacja endogennych roślinnych hydrolaz PP-InsP podczas ekstrakcji z powodu niewystarczającego zmielenia i rozmrożenia materiału roślinnego, który nie będzie miał bezpośredniego kontaktu z buforem ekstrakcyjnym. Dalsze przyczyny to niedokładne dostosowanie pH przez niewystarczające lub nadmierne dodanie buforu neutralizującego lub po prostu niewystarczający materiał próbki. Te ostatnie mogą utrudniać wykrycie PP-InsP, ponieważ są one często obecne w bardzo małych ilościach w komórkach. Nadmiar materiału próbki lub nieefektywne suszenie na etapie 3.5 może spowodować rozcieńczenie kwasu nadchlorowego, co prowadzi również do niewystarczającej dezaktywacji enzymów i specyficznej utraty InsP6 i PP-InsP. Ilość materiału roślinnego, a także radioznaku użytego w tym protokole zostały zoptymalizowane w oparciu o koszty i wydajność, a zatem są bliskie najniższej ilości, która jest nadal wystarczająca do zapewnienia optymalnych wyników. Ponadto żywica kolumny będzie stopniowo tracić swoją zdolność rozdzielczą. Pierwszą oznaką tego procesu jest (z przyczyn nie do końca jasnych dla autorów) specyficzna utrata wyżej ufosforylowanych gatunków InsP, takich jak PP-InsP w widmie HPLC. Wraz z dalszym starzeniem się nawet InsP6 nie zostanie prawidłowo rozwiązany przez kolumnę (rysunek 1D). Dlatego użycie odpowiedniej kolumny, a także skrupulatne obchodzenie się z próbką i właściwa konserwacja składników HPLC mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładnych wyników.
Podczas porównywania próbek i serii, zwłaszcza gdy są one generowane przy użyciu różnych urządzeń (np. systemów i kolumn HPLC) lub w różnych dniach, kluczowe znaczenie ma normalizacja próbek względem siebie (zgodnie z opisem w kroku 7.3) i analizowanie ich w ten sam sposób. Tylko dzięki normalizacji możliwe i dokładne jest pokazanie wielu próbek na tym samym wykresie (rysunek 3). W celu ilościowego określenia poszczególnych InsP w stosunku do całkowitych InsP lub do innych określonych gatunków InsP nie jest konieczna normalizacja, o ile pokazane są tylko wartości względne, a nie wartości bezwzględne. Idealnie byłoby, gdyby pokazane były zarówno profile InsP, jak i kwantyfikacje. Jednak w niektórych przypadkach nie jest możliwe odpowiednie pokazanie dwóch lub więcej przebiegów na tym samym wykresie. Różne czasy przechowywania lub różne poziomy aktywności w tle mogą utrudniać porównywanie samych nieoznaczonych ilościowo profili SAX-HPLC. To samo dotyczy sytuacji, gdy trzeba porównać wiele próbek. W takich przypadkach konieczna jest dalsza ocena przy użyciu dodatkowego oprogramowania (np. Origin) do ilościowego oznaczania poszczególnych pików.
Autorzy są świadomi, że opisany tu protokół może być optymalizowany i musi być dostosowany do każdego indywidualnego pytania badawczego. Chociaż metoda ta jest zoptymalizowana pod kątem ekstraktów z Arabidopsis 7,17 w tym protokole, jest wszechstronna i może pomóc w określeniu profili InsP również innych gatunków roślin. Tutaj ilustrujemy tę możliwość, prezentując po raz pierwszy profil InsP dla L. japonicus, który nie wymagał modyfikacji warunków znakowania, ekstrakcji InsP ani przebiegu SAX-HPLC (ryc. 2). Warto zauważyć, że chociaż ogólnie rzecz biorąc, obserwuje się różnice między profilami InsP L. japonicus i Arabidopsis. Na przykład w L. japonicus InsP5 [4-OH] lub jego enancjomeryczna forma InsP5 [6-OH] są liczniejsze niż InsP5 [1-OH] lub jego enancjomeryczna forma InsP5 [3-OH] w porównaniu z Arabidopsis, gdzie InsP5 [1-OH] lub jego enancjomeryczna forma InsP5 [3-OH] są dominującymi gatunkami InsP5. Przewidujemy również, że zmiany w składzie pożywki, stężeniu [3H]-mio-inozytolu, wieku roślin, warunkach środowiskowych (np. świetle i temperaturze), dodawaniu związków chemicznych lub analizach interakcji roślina-mikroorganizmy wśród innych czynników, mogą wymagać zbadania i dostosowania.
Jedną z ważnych wad tej metody, którą należy wziąć pod uwagę, jest to, że etykietowanie odbywa się w (sterylnej) płynnej kulturze, która nie stanowi środowiska fizjologicznego dla większości roślin lądowych. Ponadto, ze względu na wysokie koszty [³H]-mio-inozytolu, objętość roztworu do etykietowania i wielkość naczynia hodowlanego są na ogół ograniczone, co również ogranicza wielkość roślin, które można wykorzystać. Uprawy w kulturze płynnej można uniknąć, infiltrując na przykład liście roślin uprawianych w glebie [³H]-mio-inozytolem, a następnie postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, jak wcześniej opisano10.
Istnieje kilka wad tego protokołu w porównaniu z alternatywnymi metodami, takimi jak TiO2 pull-down, a następnie PAGE lub techniki oparte na spektrometrii mas. Ze względu na znakowanie [3H]-mio-inozytolem, tylko gatunki InsP, które bezpośrednio pochodzą z radioznakowanego mio-inozytolu, zostaną ostatecznie wykryte. Opisana tutaj metoda jest ślepa na inne izomery Ins, takie jak scyllozytol i inne izomery, z których niektóre zostały zidentyfikowane w niektórych roślinach44. Ponadto wykluczone zostaną mio-InsP pochodzące z innych szlaków, w tym te syntetyzowane przez syntezę de novo mio-inozytolu i mio-inozytolo-3-fosforanu poprzez izomeryzację glukozo-6-fosforanu, katalizowaną przez białka syntazy mio-inozytolo-3-fosforanowej (MIPS)45. Chociaż [32P] lub [33P]-ortofosforan mogą być używane jako alternatywne etykiety, ich stosowanie stanowi poważną wadę, ponieważ każda cząsteczka zawierająca fosforan, w tym obfite nukleotydy i ich pochodne, będzie znakowana. Cząsteczki te mogą być również ekstrahowane za pomocą tego protokołu i wiązać się z kolumną SAX, co spowoduje wysoki poziom aktywności tła, który będzie zakłócał identyfikację poszczególnych pików InsP5. Ponadto na oznaczanie ilościowe InsP i PP-InsP znakowanych znakami [32P] lub [33P] może mieć silny wpływ obrót ugrupowań fosforanowych i pirofosforanowych i może nie wykazywać masowego odczytu dla gatunków inozytolu.
Z drugiej strony, [3H]-mio-inozytol specyficznie znakuje cząsteczki zawierające mio-inozytol. InsP, lipidy zawierające inozytol, takie jak fosfoinozytydy i galaktynol są w tym przypadku oznakowane. Jednak tylko InsP będą analizowane za pomocą tego protokołu, ponieważ lipidy są nierozpuszczalne w buforze ekstrakcyjnym, a galaktynol nie wiąże się z kolumną SAX.
Jak dotąd, różnice w stosunku do profilu roślinnego InsP generowanego przez znakowanie [3H]-mio-inozytolem w porównaniu z profilem określonym za pomocą TiO2 pulldown/PAGE pozostają nieznane, ponieważ takich porównań nie przeprowadzono w roślinach. Niedawne badanie na komórkach zwierzęcych odpowiedziało na to pytanie46. W tej pracy zidentyfikowano pulę InsP6, która jest niewidoczna przez znakowanie [3H]-mio-inozytolem, która powinna zatem pochodzić bezpośrednio z glukozo-6-fosforanu, porównując profile SAX-HPLC z żelami PAGE linii komórkowych ssaków. 24 godziny głodu fosforanów spowodowały 150% wzrost InsP6 podczas ilościowego oznaczania żeli PAGE InsP oczyszczonych za pomocą TiO2 pulldown. Analizy SAX-HPLC komórek znakowanych [3H]-mio-inozytolem, które były traktowane identycznie, wykazały wzrost tylko o 15% [3H]-InsP6. Jak wcześniej wspomniano, InsP niższe niż InsP5 są w większości przypadków niewykrywalne za pomocą analizy PAGE. Znakowanie radioaktywne, a następnie SAX-HPLC wydaje się być metodą z wyboru, o ile protokoły spektrometrii mas nie są zoptymalizowane pod kątem wykrywania tej grupy wysoce ujemnie naładowanych cząsteczek.
Kolejnym wyzwaniem pozostaje rozróżnienie enancjomerów w analizach SAX-HPLC (lub w dowolnej innej metodzie analizy InsP)10,17. Temu wyzwaniu można sprostać poprzez dodanie selektorów chiralnych, tj. związków enancjopurowych, takich jak amid L-argininy, które oddziałują z odpowiednimi cząsteczkami enancjomerycznymi, tworząc kompleksy diastereomeryczne, które można rozdzielić10. Według naszej wiedzy, podejście to zostało wdrożone tylko w celu rozróżnienia enancjomerycznych izomerów InsP5 InsP5 [1-OH] i InsP5 [3-OH] za pomocą analiz NMR10. Dyskryminacja innych par enancjomerowych lub skuteczna dyskryminacja enancjomerów za pomocą chiralnej analizy SAX-HPLC lub metod opartych na chiralnej PAGE nie została jeszcze zgłoszona i powinna być dalej rozwijana. Biorąc pod uwagę syntezę konserwatywną i konserwatywną regulację PP-InsP przez dostępność fosforu, przewidujemy, że szczególnie metody nieradioaktywne, takie jak metody oparte na PAGE lub MS, wraz z analizami składników odżywczych, pomogą w ugruntowaniu wysiłków na rzecz kalibracji danych teledetekcyjnych przeznaczonych do diagnozowania niedoborów składników odżywczych w uprawach 17,18,24,25. Jednak przedstawiona tutaj metoda może być nadal uważana za złoty standard w analizach InsP i będzie miała zasadnicze znaczenie dla odkrycia nowych funkcji tych intrygujących przekaźników w roślinach.

Prawie cztery dekady temu, fosforany inozytolu (InsP) pojawiły się jako cząsteczki sygnałowe, po tym jak Ins(1,4,5)P3 (InsP3) został zidentyfikowany jako drugi przekaźnik, który aktywuje uwalnianie Ca2+ za pośrednictwem receptora w komórkach zwierzęcych1,2. Do tej pory nie zidentyfikowano żadnego receptora InsP3 (IP3-R) u roślin, co kwestionuje bezpośrednią rolę sygnalizacyjną InsP3 w komórkach roślinnych3. Niezależnie od tego, InsP3 służy jako prekursor dla innych InsP zaangażowanych w kilka procesów rozwojowych roślin, w tym regulację określonych szlaków sygnałowych3,4,5,6,7,8. Na przykład InsP3 może być dalej fosforylowany do InsP6, znanego również jako "kwas fitynowy", który stanowi główne źródło fosforanów, mio-inozytolu i kationów, i wykazano, że odgrywa kluczową rolę w obronie roślin przed patogenami, eksportem mRNA i homeostazą fosforanów5,9,10,11,12.
Pirofosforany inozytolu (PP-InsPs) to klasa InsP, które zawierają co najmniej jedno wysokoenergetyczne wiązanie di-fosfo, początkowo zidentyfikowane w komórkach zwierzęcych, amebach i drożdżach, gdzie odgrywają kluczową rolę w różnych procesach komórkowych13,14,15. Pomimo przełomowych prac nad PP-InsP w roślinach16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, funkcje biologiczne i tożsamość izomerów tych cząsteczek nadal pozostają w dużej mierze zagadkowe. W modelowej roślinie Arabidopsis thaliana zaproponowano komórkowy InsP8 w celu regulacji obrony przed owadami, roślinożercami i grzybami nekrotroficznymi poprzez koincydencyjne wykrywanie InsP8 i aktywnego jasmonianu przez kompleks receptorów ASK1-COI1-JAZ17. Ponadto zaproponowano rolę InsP8 i innych PP-InsP w homeostazie energetycznej i wykrywaniu składników odżywczych, a także homeostazie fosforanów17,23,24,25,26.
Niezależnie od zastosowanego systemu biologicznego, jednym z głównych wyzwań metodologicznych podczas badania InsP było niezawodne wykrywanie i precyzyjne oznaczanie ilościowe tych molekuł. Metody oparte na spektrometrii mas zostały wykorzystane do wykrycia InsP, w tym PP-InsP, z ekstraktów komórkowych. Jednak badania te nie zdołały rozróżnić różnych izomerów26,27. Inne podejście do analizy InsP wykorzystuje ściąganie InsP z lizatów komórkowych za pomocą kulek TiO2, a następnie elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE) eluowanych InsP. InsP mogą być następnie barwione błękitem toluidynowym lub DAPI24,28,29. Jednak do tej pory nie jest możliwe wiarygodne wykrycie InsP niższych niż InsP5 z ekstraktów roślinnych przy użyciu tej metody. Niedawno opublikowano metodę wykorzystującą [13C]-mio-inozytol do analizy InsP metodą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jako alternatywę dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wymianą silnego anionu (SAX-HPLC)30. Doniesiono, że technika ta osiąga podobną czułość w porównaniu z SAX-HPLC i umożliwia wykrywanie 5-InsP7, a także rozróżnianie różnych nieenancjomerycznych izomerów InsP5 z ekstraktów komórkowych. Jednak implementacja metody opartej na NMR wymaga chemicznie zsyntetyzowanego i niedostępnego komercyjnie [13C]-mio-inozytolu. Dlatego metodą stosowaną w większości przypadków jest znakowanie radioizotopowe próbek za pomocą [3H]-mio-inozytolu, a następnie SAX-HPLC31,32,33. Technika ta opiera się na wychwytywaniu radioaktywnego mio-inozytolu do rośliny i jego przekształcaniu w różne InsP przez połączoną aktywność dedykowanych kinaz komórkowych i fosfataz.
InsP znakowane [3H] są następnie ekstrahowane kwasem i frakcjonowane za pomocą SAX-HPLC. Ze względu na ich ujemny ładunek, InsP silnie oddziałują z dodatnio naładowaną fazą stacjonarną kolumny SAX-HPLC i mogą być eluowane za pomocą gradientu buforu zawierającego rosnące stężenia fosforanów, aby wyprzedzić InsP z kolumny. Czas elucji zależy zatem od ładunku i geometrii gatunków InsP, które mają być oddzielone. W przypadku braku kolumn chiralnych, tylko izomery nieenancjomeryczne mogą być oddzielone przez ten protokół. Jednak wzorce znakowane radioaktywnie mogą być używane do przypisania izomerycznego charakteru określonego piku InsP. Wielokrotne wysiłki podejmowane w przeszłości przez różne laboratoria w celu wygenerowania oznakowanych i nieoznakowanych wzorców metodami (bio)chemicznymi lub oczyszczenia ich z różnych komórek i organizmów pomogły przypisać piki niektórym gatunkom InsP, a także zawęzić tożsamość izomeryczną poszczególnych gatunków InsP5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Również niedawne wyjaśnienie szlaków enzymatycznych prowadzących do powstawania PP-InsP w roślinach, a także odkrycie efektora bakteryjnego typu III o specyficznej aktywności 1-fitazy, dostarczają informacji o tym, jak generować użyteczne standardy dla tych analiz10,17,18,22,23.
Wynikowe frakcje mogą być mierzone w liczniku scyntylacyjnym cieczy ze względu na β-rozpad trytu (3H). Wraz ze wzrostem czasu znakowania osiągana jest równowaga izotopowa w stanie ustalonym, po której uzyskane profile InsP powinny reprezentować status InsP rośliny31. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z innymi dostępnymi technikami jest wysoka czułość osiągnięta dzięki zastosowaniu bezpośredniego prekursora InsP i pomiarowi sygnału radioaktywnego.
SAX-HPLC próbek wyekstrahowanych z roślin lub innych organizmów znakowanych [3H]-mio-inozytolem jest powszechnie używany do wykrywania i kwantyfikacji InsP, począwszy od niższych gatunków InsP do PP-InsPs, stanowiąc cenne narzędzie do lepszego zrozumienia metabolizmu, funkcji i sposobów działania InsP. Jak dotąd, metoda ta jest również najodpowiedniejszym wyborem dla badaczy szczególnie zainteresowanych gatunkami o niższym poziomie InsP. Chociaż podstawy tej procedury, na której opiera się opisany tutaj protokół, zostały już wcześniej opisane7,21,31,34, nadal brakuje szczegółowego protokołu dostosowanego do analizy InsP pochodzenia roślinnego, a zwłaszcza PP-InsPs. W poprzednich publikacjach informowano o trudnościach w wiarygodnym wykryciu niskiej zawartości PP-InsP, zwłaszcza InsP8, ze względu na jeden lub więcej z następujących czynników: stosunkowo małe ilości materiału roślinnego, [3H]-mio-inozytol o niskiej aktywności właściwej (> 20 Ci/mmol), stosowanie ekstrakcyjnych, które albo nie są oparte na kwasie nadchlorowym, albo są stężone poniżej 1 M, różne neutralizujące, a także nieoptymalne gradienty lub detekcja [3H] za pomocą detektora on-line. W porównaniu z tamtymi badaniami, przedstawiony tutaj protokół został zaprojektowany z myślą o niezawodnym wykrywaniu PP-InsPs7,21,34.
Tutaj prezentujemy szczegółowy przebieg pracy, począwszy od konfiguracji sprzętu, poprzez uprawę roślin i etykietowanie, ekstrakcję InsP i sam przebieg SAX-HPLC. Chociaż metoda została zoptymalizowana pod kątem modelowej rośliny A. thaliana, można ją łatwo zmodyfikować w celu zbadania innych gatunków roślin, jak pokazano tutaj z pierwszym zgłoszonym profilem InsP modelowej rośliny strączkowej Lotus japonicus. Chociaż użycie różnych gatunków roślin może wymagać pewnej optymalizacji, przewidujemy, że będą one niewielkie, co czyni ten protokół dobrym punktem wyjścia do dalszych badań nad InsP roślin. Aby ułatwić ewentualne optymalizacje, wskazujemy każdy krok w protokole, w którym możliwe są modyfikacje, a także wszystkie krytyczne kroki, które mogą być wyzwaniem przy ustalaniu metody po raz pierwszy. Dodatkowo informujemy, w jaki sposób dane uzyskane tą metodą można wykorzystać do ilościowego oznaczania określonych InsP oraz jak można analizować i porównywać różne próbki.

<table><tbody><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf AG</td><td>model: 5430 R</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan diamonu, &ge; 97 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0268.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna, &ge; 99 %, rocznie, ACS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12-dołkowa, przezroczysta, płaska płytka do hodowli komórkowej z wielodołkową powłoką TC, z pokrywką, pakowana pojedynczo, sterylna</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>Kolektor frakcji</td><td>LAMBDA Instruments GmbH</td><td>model: Kolektor</td><td></td>jednokanałowy OMNICOLL</tr><tr><td>Inkubator wzrostu</td><td>poly klima GmbH</td><td>model: Pompy HPLC PK 520-LED</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kontron Instruments</td><td>model: 420</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka HPLC do zaworów Rheodyne, 1 ml</td><td>Hamilton Company</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz do HPLC</td><td>Model Supelco</td><td>: Reodyne 9725</td><td></td></tr><tr><td>Inositol, mio-[1,2-3H(N)]</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td><td>ART 0261</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Uniwersytet, Wydział</td><td></td><td></td>Chemii</tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny cieczy</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>model: TRI-CARB 2900TR</td><td></td></tr><tr><td>Mikro tłuczek</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CXH7.1</td><td></td></tr><tr><td>Filtr estrowy z mieszanej celulozy, seria ME (ME 24), zwykły, 0,2 i mikro; m wielkość porów, koło 47 mm</td> GE <td>Healthcare Nauki 10401770</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik do HPLC</td><td>Kontron Instruments</td><td>model: M 800</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog podłoże, mieszanka soli</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie OriginPro</td><td>OriginLab Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas ortofosforowy, &ge; 85 %, rocznie, ISO</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>Partisphere 5 & m Kolumna nabojowa SAX, 125 x 4,6 mm</td><td>Hichrom Limited</td><td>4621-0505</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy, 70 %, 99,999 % na bazie metali śladowych</td><td>Szalka Petriego Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td></td></tr>, <tr><td>kwadratowa, PS, przezroczysta, 120/120/17 mm, sterylna</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>bibuła wskaźnikowa pH pH 5,5 - 9,0, Neutralit</td><td>Merck KGaA</td><td>109564</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Węglan potasu</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>P743.2</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-Lock, 1,5 ml</td><td>Eppendorf AG</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Pętla na próbkę do wtryskiwaczy 9725, objętość 2 mL, PEEK</td><td>Supelco</td><td>57648</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna SNAPTWIST, 6,5 ml</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>S207-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna ławka</td><td>LaboGene</td><td>model: ScanLaf MARS 900</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza, &ge; 99,5 % rocznie</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-Flo AP płynny koktajl scyntylacyjny</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>6013599</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda dejonizowana</td><td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw końcówek WVS bez klucza</td><td>Hichrom Limited</td><td>4631-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu sax-hplc

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Estry fosforanowe mio-inozytolu, zwane również fosforanami inozytolu (InsP), to klasa regulatorów komórkowych odgrywających ważną rolę w fizjologii roślin. Ze względu na ich ujemny ładunek, niską liczebność i podatność na aktywność hydrolityczną, wykrycie i kwantyfikacja tych cząsteczek jest wyzwaniem. Dotyczy to w szczególności wysoce ufosforylowanych form zawierających "wysokoenergetyczne" wiązania difosfo, zwanych również pirofosforanami inozytolu (PP-InsP). Ze względu na wysoką czułość, wysokosprawna chromatografia cieczowa z silną wymianą anionową (SAX-HPLC) roślin znakowanych [3H]-mio-inozytolem jest obecnie metodą z wyboru do analizy tych cząsteczek. Stosując [3H]-mio-inozytol do znakowania radioizotopem siewek roślin, różne gatunki InsP, w tym kilka izomerów nieenancjomerycznych, mogą być wykrywane i rozróżniane z wysoką czułością. W tym miejscu opisano konfigurację odpowiedniego systemu SAX-HPLC, a także cały przebieg procesu od uprawy roślin, znakowania radioaktywnego i ekstrakcji InsP po przebieg SAX-HPLC i późniejszą analizę danych. Przedstawiony tutaj protokół pozwala na dyskryminację i kwantyfikację różnych gatunków InsP, w tym kilku izomerów nieenancjomerycznych oraz PP-InsPs, InsP7 i InsP8, i może być łatwo dostosowany do innych gatunków roślin. Jako przykłady przeprowadzono analizy SAX-HPLC siewek rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) i siewek rzodkiewnika japońskiego (Arabidopsis thaliana) oraz przedstawiono i omówiono pełne profile InsP. Opisana tutaj metoda stanowi obiecujące narzędzie do lepszego zrozumienia biologicznych ról InsP w roślinach.

Przedstawione tutaj wyniki mają na celu zilustrowanie możliwych rezultatów uzyskanych w zależności od zmiennych na poziomie technicznym i biologicznym. Pierwszy przypadek egzemplifikują analizy z użyciem nowych i zużytych kolumn (Rycina 1) oraz świeżych i przechowywanych próbek (Rycina 3), a drugi ocena ekstraktów z dwóch różnych systemów roślinnych: A. thaliana (Rycina 1, Rycina 3) oraz L. japonicus (Rycina 2).
Optymalny przebieg analizy SAX-HPLC przedstawiono na Rysunku 1A‒C, który ukazuje kompletne spektrum polifosforanów inozytolu otrzymane z ekstraktów A. thaliana po liczeniu scyntylacyjnym. Należy zauważyć, że piki są dobrze rozdzielone i mogą zostać przypisane do różnych izomerów (lub par enancjomerów) na podstawie opisanych wcześniej mobilności chromatograficznych5,7.
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny wynik analizy SAX-HPLC siewek L. japonicus, które były hodowane i znakowane w tych samych warunkach co siewki Arabidopsis. Chociaż prawdopodobnie widoczne są wszystkie gatunki InsP i piki znane z Arabidopsis, występują istotne różnice w względnej ilości (np. stosunkach między izomerami) konkretnych izomerów InsP przy porównaniu profili obu gatunków. Na przykład ekstrakty z Lotus wykazały zwiększoną ilość InsP3c, InsP4b, InsP5b oraz zmniejszoną ilość InsP3a, InsP4a, InsP5a i InsP5c w porównaniu do Arabidopsis, co stwarza przestrzeń do dalszych badań. Rysunek 2D ilustruje różne stosunki między izomerami InsP u Arabidopsis i Lotus.
Rysunek 3 przedstawia dwa profile InsP próbki, która została podzielona po ekstrakcji. Pierwsza połowa została przeanalizowana natychmiast, a druga dzień później, po przechowywaniu w temperaturze -80 °C. Należy zauważyć, że między różnymi próbkami obserwuje się jedynie niewielkie różnice (tj. czarne i czerwone linie na Rysunku 3A‒C oraz Rysunku 3D). Ilustruje to, że jeden cykl zamrażania i rozmrażania nie uszkadza próbki, a sama metoda pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników.
<img alt="Chromatogram HPLC przedstawiający rozdział fosforanów inozytolu; analiza czasu retencji w funkcji aktywności ³H." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Typowy profil InsP z udanej i nieudanej analizy SAX-HPLC przeprowadzonej zgodnie z niniejszym protokołem. (A‒C) profil SAX-HPLC rośliny typu dzikiego (Col-0) w 17. dniu wzrostu0) Arabidopsis siewki znakowane promieniotwórczo [3H]-myo-inozytolu. Ogólną ekstrakcję InsP oraz analizę SAX-HPLC przeprowadzono tego samego dnia. (A) Pełne widma; (B, C) Powiększenia profilu przedstawionego w A. Wszystkie widoczne piki zostały wyróżnione i przypisane do odpowiadających im gatunków InsP. Na podstawie opublikowanych wartości mobilności chromatograficznej5,7, InsP4a prawdopodobnie odpowiada Ins(1,4,5,6)P4 lub Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a reprezentuje InsP5 [2-OH], InsP5b reprezentuje InsP5 [4-OH] lub jego forma enancjomeryczna InsP5 [6-OH] oraz InsP5c reprezentuje InsP5 [1-OH] lub jego forma enancjomeryczna InsP5 [3-OH]. Natura izomeryczna InsP3a-c, InsP4b, InsP7, oraz InsP8 nadal nie są znane. Panel (D) przedstawia profil SAX-HPLC roślin hodowanych w identyczny sposób, lecz z użyciem zużytej kolumny (&gt;40 serii). Wyraźna redukcja InsP6 w porównaniu do innych gatunków InsP, widoczny jest brak PP-InsP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii i wykres słupkowy porównujący zawartość InsP w gatunkach roślin; analiza czasu retencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywny profil InsP dla L. japonicus rośliny profil SAX-HPLC (A‒C) 17-dniowych osobników typu dzikiego (Gifu) L. japonicus siewki znakowane promieniotwórczo za pomocą [3H]-mio--inozytol. (A) pełne widma; (B, C) Powiększenia profilu przedstawionego w A. Wszystkie widoczne piki zostały zaznaczone i przypisane do odpowiednich gatunków InsP. Na podstawie opublikowanych ruchliwości chromatograficznych5,7, InsP4a prawdopodobnie reprezentuje Ins(1,4,5,6)P4 lub Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b prawdopodobnie odpowiada InsP5 [4-OH] lub jego forma enancjomericzna InsP5 [6-OH] oraz InsP5c prawdopodobnie reprezentuje InsP5 [1-OH] lub jego forma enancjometryczna InsP5 [3-OH]. Natura izomeryczna InsP3a-c, InsP4b, InsP7oraz InsP8 są nieznane. (D) Porównanie poszczególnych gatunków InsP (w % całkowitej aktywności z elucji 25–96) dla A. thaliana (dane z Rycina 1A‒C) i L. japonicus (dane z Rycina 2A–C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Chromatogramy HPLC (A-C) oraz wykres słupkowy (D) porównujące próbki świeże i mrożone, przedstawiające zawartość InsP6-InsP8." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Profile InsP z podzielonej próbki, ilustrujące powtarzalność analiz SAX-HPLC. (A‒C) profile SAX-HPLC 17-dniowych roślin typu dzikiego (Col-0) Arabidopsis siewki oznakowane radioaktywnie [3H]-myo-inozytol. Przed analizą próbkę podzielono; jedną połowę przeanalizowano niezwłocznie, a drugą dzień później, po przechowywaniu w temperaturze -80 °C. (A) Pełne widma; (B, C) Powiększenia profilu przedstawionego w A. Wszystkie widoczne piki zostały zaznaczone i przypisane do odpowiadających im gatunków InsP. Na podstawie opublikowanych mobilności chromatograficznych5,7, InsP4a prawdopodobnie odpowiada Ins(1,4,5,6)P4 lub Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a reprezentuje InsP5 [2-OH], InsP5a reprezentuje InsP5 [2-OH], InsP5b reprezentuje InsP5 [4-OH] lub jego forma enancjomerowa InsP5 [6-OH] oraz InsP5c reprezentuje InsP5 [1-OH] lub jego forma enancjomeryczna InsP5 [3-OH]. Natura izomeryczna InsP3a-c, InsP4b, InsP7oraz InsP8 nadal nie są znane. Panel D przedstawia ilościowe oznaczenie InsP6 oraz PP-InsPy InsP7 oraz InsP8 z obu serii pomiarowych. Wartości reprezentują zawartość (w %) poszczególnych gatunków InsP w stosunku do wszystkich InsP (całkowita aktywność z elucji 25–96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek dodatkowy 1: Ustawienia oprogramowania do pomiaru z wykorzystaniem ciekłego licznika scyntylacyjnego. Przedstawiono zrzuty ekranu pokazujące wersję oprogramowania oraz ustawienia zastosowane do liczenia scyntylacyjnego próbek [3H] wykonanego zgodnie z tym protokołem. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten rysunek.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Reprezentatywny przykład normalizacji danych. Zrzut ekranu z arkusza pokazuje wszystkie kroki i formuły użyte do wzajemnej normalizacji serii pomiarów SAX-HPLC. W celu uproszczenia przedstawiono jedynie frakcje 25–35 próbek. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>
Rycina dodatkowa 3: Wyznaczanie piku, odejmowanie tła i integracja przy użyciu oprogramowania analitycznego. (A) Dane z analizy SAX-HPLC są wczytywane do oprogramowania (minuty 28–96), a następnie wybierane jest narzędzie do analizy pików. (B‒E) Linia bazowa jest definiowana ręcznie poprzez wyznaczanie punktów pomiędzy poszczególnymi pikami, a następnie odejmowane jest tło. (F) Piki są wyznaczane ręcznie na podstawie ich wyglądu oraz opublikowanych wartości ruchomości chromatograficznej5,7. (G) Zakresy pików są definiowane ręcznie na podstawie wartości cpm. (H) Piki są integrowane i obliczane jako % wszystkich pików. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>

Tutaj opisujemy wysokosprawną chromatografię cieczową z silną wymianą anionów siewek znakowanych [3H]-mio-inozytolem, która jest bardzo czułą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania polifosforanów inozytolu w roślinach.

Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Zaprezentowany tutaj protokół może pomóc w wyjaśnieniu biosyntezy polifosforanów inozytolu w roślinach i odpowiedzieć na pytania dotyczące ich roli w niektórych aspektach metabolizmu i rozwoju roślin. Metoda ta jest bardzo czuła, ponieważ zastosowanie znakowanego radioaktywnie prekursora fosforanów inozytolu pozwala na niezawodne wykrycie wszystkich gatunków fosforanu inozytolu w roślinach. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ większość biologów roślin nie jest zaznajomiona z analizą HPLC i potrzebną konfiguracją.Ponadto kluczowe etapy tego protokołu, takie jak ekstrakcja fosforanów inozytolu, są trudne do naśladowania bez odpowiedniego wykazania. Zacznij od skonfigurowania systemu składającego się z dwóch niezależnych pomp HPLC, jednej dla buforu A i jednej dla bufora B. Obie pompy muszą być sterowane razem za pomocą komputera lub pompy głównej. Wdrożyć płukanie uszczelnienia tłoka dla obu pomp, albo za pomocą siły grawitacji, albo za pomocą trzeciej pompy niskiego ciśnienia.Podłącz obie pompy do mieszalnika dynamicznego, a następnie podłącz mieszalnik do zaworu wtryskowego z pętlą próbki o pojemności co najmniej jednego mililitra. Za pomocą kapilar połączyć zawór wtryskowy z kolumną, a kolumnę z kolektorem frakcji. Wysiewaj nasiona lotosu w jednym rzędzie na kwadratowych szalkach Petriego wypełnionych stałą pożywką wzrostową składającą się z 0,8% agaru bakteriologicznego w wodzie dejonizowanej.Pozwól nasionom rozwarstwić się przez co najmniej trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Umieść nasiona w inkubatorze wzrostu. Przenieś od 10 do 20 sadzonek do jednego dołka 12-dołkowej klarownej płytki do hodowli komórek z płaskim dnem, wypełnionej dwoma mililitrami roztworu soli MS o połowie mocy, który jest uzupełniony 1% sacharozą i dostosowany do pH 5,7.Na płytkę dodaj 45 mikrokiurów mio-inozytolu 3H i delikatnie zamieszaj. Przykryj płytkę pokrywką i uszczelnij ją mikroporowatą taśmą chirurgiczną. Następnie umieść go z powrotem w inkubatorze wzrostu.Po pięciu dniach etykietowania usuń sadzonki z podłoża i krótko je umyj wodą dejonizowaną. Osusz je ręcznikami papierowymi i przenieś do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie przepełnić probówki. Zamroź probówkę w ciekłym azocie i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji.Pobrać próbki z zamrażarki i przechowywać je w ciekłym azocie do czasu, gdy będą gotowe do użycia. Zmiel je tłuczkiem do probówki do mikrowirówki, aż zaczną się rozmrażać, a następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego. Kontynuuj mielenie, aż próbka zostanie zhomogenizowana, a roztwór zabarwiony.Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 18 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przenieś supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Probówki używane do ekstrakcji są uważane za stałe odpady promieniotwórcze i muszą być odpowiednio zutylizowane.Ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów buforu neutralizującego do ekstraktu, co natychmiast spowoduje wytrącanie się białek i bulgotanie. Po minucie wymieszaj próbkę z końcówką pipety i odpipetuj pięć mikrolitrów na bibułę pH, aby upewnić się, że pH wynosi od siedmiu do ośmiu. W razie potrzeby dodać niewielkie ilości buforu neutralizacyjnego lub buforu ekstrakcyjnego aż do osiągnięcia pożądanego pH i pozostawić próbki na lodzie przez co najmniej godzinę z otwartą pokrywką.Następnie odwiruj je przez 10 minut i przenieś supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wyposażyć kolektor frakcji w 96 małych fiolek scyntylacyjnych i napełnić każdą fiolkę dwoma mililitrami odpowiedniego koktajlu scyntylacyjnego, który jest kompatybilny z o niskim pH i wysokimi stężeniami fosforanu amonu. Uruchom system HPLC, a następnie aktywuj płukanie uszczelnienia tłoka i utrzymuj go włączone przez cały przebieg.Ręcznie wstrzyknąć próbkę za pomocą odpowiedniej strzykawki. Uruchom pompy i gradient. Podczas trwania HPLC należy regularnie sprawdzać ciśnienie.Ciśnienie początkowe powinno wynosić około 18 do 24 barów i powinno powoli wzrastać do 50 do 60 barów po osiągnięciu 100% bufora B. Po serii szczelnie zamknij fiolki i energicznie potrząśnij frakcjami z koktajlem scyntylacyjnym do wymieszania. Jeśli nie przystąpisz bezpośrednio do pomiaru, trzymaj fiolki w pozycji pionowej w ciemności.Aby zmierzyć frakcje, włóż fiolki do stojaków licznika scyntylacyjnego za pomocą stojaków pasujących do małych fiolek i mierz każdą fiolkę przez pięć minut w płynnym liczniku scyntylacyjnym. Przygotuj wykres liniowy 2D, na którym zmierzone liczby na minutę lub CPM są wykreślane w stosunku do czasu przechowywania. Aby porównać próbki ze sobą, znormalizuj dane, sumując CPM z każdej eluowanej frakcji od 25 do 96 minuty dla każdej pojedynczej próbki i dzieląc całkowity CPM z tej próbki przez całkowity CPM pozostałych próbek.Aby przeprowadzić względne kwantyfikacje niektórych pików polifosforanu inozytolu, a następnie utworzyć wykresy słupkowe zawierające dane replikacji do analiz statystycznych, należy kontynuować analizę za pomocą specjalistycznego oprogramowania, które może obliczyć obszary pików chromatogramów. Pełne spektrum polifosforanu inozytolu otrzymanego z ekstraktów A.thaliana po zliczeniu scyntylacyjnym przedstawiono tutaj. Piki są ładnie oddzielone i można je przypisać do różnych izomerów.Gdy stosuje się starzoną kolumnę, widoczna jest wyraźna redukcja heksakisfosforanu inozytolu i brak pirofosforanu inozytolu. Analizę SAX-HPLC przeprowadzono również na siewkach L. japonica, które były uprawiane i znakowane w tych samych warunkach, co siewki rzodkiewnika. Chociaż przypuszczalnie można zobaczyć wszystkie gatunki polifosforanu inozytolu i piki znane z Arabidopsis, istnieją różnice we względnych ilościach określonych izomerów polifosforanu inozytolu między tymi dwoma gatunkami.Aby wykazać, że próbki nie muszą być analizowane natychmiast po ekstrakcji, jedną próbkę podzielono na dwie części, a połowę z nich analizowano następnego dnia po przechowywaniu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Różnice między profilami SAX-HPLC próbek świeżych i mrożonych nie były znaczące, co pokazuje, że jeden cykl zamrażania i rozmrażania nie szkodzi próbce, a sama metoda daje powtarzalne wyniki. Wypróbowując ten protokół, zawsze dokładnie miel próbki, zamrożone i z buforem ekstrakcyjnym, a po neutralizacji dąż do uzyskania pH zbliżonego do neutralnego, aby zapewnić maksymalny odzysk znakowanego radioaktywnie fosforanu inozytolu do analizy SAX-HPLC.Możliwe jest oczyszczanie znakowane radioaktywnie z serii SAX-HPLC w celu późniejszego wykorzystania, na przykład we wzajemnych reakcjach, poprzez zbieranie frakcji bez koktajli scyntylacyjnych i mierzenie tylko małych podwielokrotności.

extraction-quantification-soluble-radiolabeled-inositol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Pirofosforany inozytolu odgrywają istotną rolę w patologiach ludzkich, takich jak nowotwory, cukrzyca i otyłość; jednak dokładny mechanizm ich działania pozostaje kwestią sporną. Brak komercyjnie dostępnych pirofosforanów inozytolu sprawia, że szczegółowe badania są problematyczne. W niniejszej pracy opisujemy prosty protokół produkcji i izolacji miligramowych ilości pirofosforanów inozytolu.

Przygotowanie wysokiej jakości pirofosforanów inozytolu

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Biomasa roślinna stanowi źródło odnawialne dla wielu produktów, w tym paliwa, paszy, żywności i różnych materiałów. W artykule badamy właściwości drzewa tytoniowego (Nicotiana glauca) i topoli jako odpowiednich źródeł dla rurociągu biorafineryjnego.

Profilowanie transkryptu i metabolitów w celu oceny drzewa tytoniowego i topoli jako surowca dla przemysłu biotechnologicznego

Ten protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowaną ekstrakcję płynu do mycia apoplast z liści roślin, używając francuskiej fasoli (Phaseolus vulgaris) jako przykładu modelu.

Technika infiltracjjno-wirowa do ekstrakcji płynu apoplastycznego z liści roślin na przykładzie Phaseolus vulgaris

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

Tutaj opisujemy bardzo szczegółowo sprawdzony i solidny protokół ekstrakcji glukozynolanów z mielonych materiałów roślinnych. Po zastosowaniu sulfatazy w kolumnie ekstraktów, desulfoglucozynolany są eluowane i analizowane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.

Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Ten protokół skupia się na identyfikacji białek, które wiążą się z fosforanami inozytolu lub fosfonozytydami. Wykorzystuje chromatografię powinowactwa z biotynylowanymi fosforanami inozytolu lub fosfoinozytydami, które są unieruchamiane przez streptawidynę do agarozy lub kulek magnetycznych. Fosforan inozytolu lub białka wiążące fosfoinozytol są identyfikowane za pomocą Western blot lub spektrometrii mas.

Identyfikacja białek oddziałujących z fosforanem inozytolu lub fosfoinozytylem za pomocą chromatografii powinowactwa sprzężonej ze spektrometrią Western Blot lub spektrometrią mas

Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

Opisano procedurę elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania do bezwzględnego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórkowych ssaków.

Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania

Poznaj metodę ekstrakcji i oznaczania polifosforanów inozytolu w roślinach przy użyciu chromatografii SAX-HPLC z zastosowaniem radioaktywnych markerów. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę metabolizmu roślinnego.

Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC (Wideo) | JoVE Journal

Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC

Przeglądaj więcej filmów