Ekstrakcja i oznaczanie ilościowe rozpuszczalnych, znakowanych radioaktywnie polifosforanów inozytolu z różnych gatunków roślin przy użyciu SAX-HPLC

Zaprezentowany tutaj protokół może pomóc w wyjaśnieniu biosyntezy polifosforanów inozytolu w roślinach i odpowiedzieć na pytania dotyczące ich roli w niektórych aspektach metabolizmu i rozwoju roślin. Metoda ta jest bardzo czuła, ponieważ zastosowanie znakowanego radioaktywnie prekursora fosforanów inozytolu pozwala na niezawodne wykrycie wszystkich gatunków fosforanu inozytolu w roślinach. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ większość biologów roślin nie jest zaznajomiona z analizą HPLC i potrzebną konfiguracją.

Ponadto kluczowe etapy tego protokołu, takie jak ekstrakcja fosforanów inozytolu, są trudne do naśladowania bez odpowiedniego wykazania. Zacznij od skonfigurowania systemu składającego się z dwóch niezależnych pomp HPLC, jednej dla buforu A i jednej dla bufora B. Obie pompy muszą być sterowane razem za pomocą komputera lub pompy głównej. Wdrożyć płukanie uszczelnienia tłoka dla obu pomp, albo za pomocą siły grawitacji, albo za pomocą trzeciej pompy niskiego ciśnienia.

Podłącz obie pompy do mieszalnika dynamicznego, a następnie podłącz mieszalnik do zaworu wtryskowego z pętlą próbki o pojemności co najmniej jednego mililitra. Za pomocą kapilar połączyć zawór wtryskowy z kolumną, a kolumnę z kolektorem frakcji. Wysiewaj nasiona lotosu w jednym rzędzie na kwadratowych szalkach Petriego wypełnionych stałą pożywką wzrostową składającą się z 0,8% agaru bakteriologicznego w wodzie dejonizowanej.

Pozwól nasionom rozwarstwić się przez co najmniej trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Umieść nasiona w inkubatorze wzrostu. Przenieś od 10 do 20 sadzonek do jednego dołka 12-dołkowej klarownej płytki do hodowli komórek z płaskim dnem, wypełnionej dwoma mililitrami roztworu soli MS o połowie mocy, który jest uzupełniony 1% sacharozą i dostosowany do pH 5,7.

Na płytkę dodaj 45 mikrokiurów mio-inozytolu 3H i delikatnie zamieszaj. Przykryj płytkę pokrywką i uszczelnij ją mikroporowatą taśmą chirurgiczną. Następnie umieść go z powrotem w inkubatorze wzrostu.

Po pięciu dniach etykietowania usuń sadzonki z podłoża i krótko je umyj wodą dejonizowaną. Osusz je ręcznikami papierowymi i przenieś do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby nie przepełnić probówki. Zamroź probówkę w ciekłym azocie i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji.

Pobrać próbki z zamrażarki i przechowywać je w ciekłym azocie do czasu, gdy będą gotowe do użycia. Zmiel je tłuczkiem do probówki do mikrowirówki, aż zaczną się rozmrażać, a następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego. Kontynuuj mielenie, aż próbka zostanie zhomogenizowana, a roztwór zabarwiony.

Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 18 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza. Następnie przenieś supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Probówki używane do ekstrakcji są uważane za stałe odpady promieniotwórcze i muszą być odpowiednio zutylizowane.

Ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów buforu neutralizującego do ekstraktu, co natychmiast spowoduje wytrącanie się białek i bulgotanie. Po minucie wymieszaj próbkę z końcówką pipety i odpipetuj pięć mikrolitrów na bibułę pH, aby upewnić się, że pH wynosi od siedmiu do ośmiu. W razie potrzeby dodać niewielkie ilości buforu neutralizacyjnego lub buforu ekstrakcyjnego aż do osiągnięcia pożądanego pH i pozostawić próbki na lodzie przez co najmniej godzinę z otwartą pokrywką.

Następnie odwiruj je przez 10 minut i przenieś supernatant do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wyposażyć kolektor frakcji w 96 małych fiolek scyntylacyjnych i napełnić każdą fiolkę dwoma mililitrami odpowiedniego koktajlu scyntylacyjnego, który jest kompatybilny z o niskim pH i wysokimi stężeniami fosforanu amonu. Uruchom system HPLC, a następnie aktywuj płukanie uszczelnienia tłoka i utrzymuj go włączone przez cały przebieg.

Ręcznie wstrzyknąć próbkę za pomocą odpowiedniej strzykawki. Uruchom pompy i gradient. Podczas trwania HPLC należy regularnie sprawdzać ciśnienie.

Ciśnienie początkowe powinno wynosić około 18 do 24 barów i powinno powoli wzrastać do 50 do 60 barów po osiągnięciu 100% bufora B. Po serii szczelnie zamknij fiolki i energicznie potrząśnij frakcjami z koktajlem scyntylacyjnym do wymieszania. Jeśli nie przystąpisz bezpośrednio do pomiaru, trzymaj fiolki w pozycji pionowej w ciemności.

Aby zmierzyć frakcje, włóż fiolki do stojaków licznika scyntylacyjnego za pomocą stojaków pasujących do małych fiolek i mierz każdą fiolkę przez pięć minut w płynnym liczniku scyntylacyjnym. Przygotuj wykres liniowy 2D, na którym zmierzone liczby na minutę lub CPM są wykreślane w stosunku do czasu przechowywania. Aby porównać próbki ze sobą, znormalizuj dane, sumując CPM z każdej eluowanej frakcji od 25 do 96 minuty dla każdej pojedynczej próbki i dzieląc całkowity CPM z tej próbki przez całkowity CPM pozostałych próbek.

Aby przeprowadzić względne kwantyfikacje niektórych pików polifosforanu inozytolu, a następnie utworzyć wykresy słupkowe zawierające dane replikacji do analiz statystycznych, należy kontynuować analizę za pomocą specjalistycznego oprogramowania, które może obliczyć obszary pików chromatogramów. Pełne spektrum polifosforanu inozytolu otrzymanego z ekstraktów A.thaliana po zliczeniu scyntylacyjnym przedstawiono tutaj. Piki są ładnie oddzielone i można je przypisać do różnych izomerów.

Gdy stosuje się starzoną kolumnę, widoczna jest wyraźna redukcja heksakisfosforanu inozytolu i brak pirofosforanu inozytolu. Analizę SAX-HPLC przeprowadzono również na siewkach L. japonica, które były uprawiane i znakowane w tych samych warunkach, co siewki rzodkiewnika. Chociaż przypuszczalnie można zobaczyć wszystkie gatunki polifosforanu inozytolu i piki znane z Arabidopsis, istnieją różnice we względnych ilościach określonych izomerów polifosforanu inozytolu między tymi dwoma gatunkami.

Aby wykazać, że próbki nie muszą być analizowane natychmiast po ekstrakcji, jedną próbkę podzielono na dwie części, a połowę z nich analizowano następnego dnia po przechowywaniu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Różnice między profilami SAX-HPLC próbek świeżych i mrożonych nie były znaczące, co pokazuje, że jeden cykl zamrażania i rozmrażania nie szkodzi próbce, a sama metoda daje powtarzalne wyniki. Wypróbowując ten protokół, zawsze dokładnie miel próbki, zamrożone i z buforem ekstrakcyjnym, a po neutralizacji dąż do uzyskania pH zbliżonego do neutralnego, aby zapewnić maksymalny odzysk znakowanego radioaktywnie fosforanu inozytolu do analizy SAX-HPLC.

Możliwe jest oczyszczanie znakowane radioaktywnie z serii SAX-HPLC w celu późniejszego wykorzystania, na przykład we wzajemnych reakcjach, poprzez zbieranie frakcji bez koktajli scyntylacyjnych i mierzenie tylko małych podwielokrotności.