Podejście do badania transkryptomiki zależnej od kształtu na poziomie pojedynczej komórki
November 2nd, 2020
Ten artykuł przedstawia metody hodowli miocytów serca o różnych kształtach, które reprezentują różne patologie, oraz sortowania tych przylegających miocytów serca na podstawie ich morfologii na poziomie pojedynczej komórki. Proponowana platforma zapewnia nowatorskie podejście do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badań przesiewowych leków w kierunku różnych rodzajów niewydolności serca.
Proponujemy nowatorską platformę do badania wpływu kształtu komórki na ekspresję genów, wykorzystując metody hodowli i sortowania adherencji o różnych morfologiach na poziomie pojedynczej komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona wysokoprzepustowe badanie kształtu komórki in vitro, ponieważ porównywanie komórek o różnych kształtach in vivo jest technicznie wymagające. Aby skonfigurować wzorzystą hodowlę kardiomiocytów, przenieś zawiesinę kardiomiocytów o interesującym współczynniku proporcji do 15-mililitrowej probówki do liczenia i rozcieńcz komórki do 1 razy 10 do pięciu komórek na mililitr o odpowiednim stężeniu podłoża galwanicznego.
Dodaj dwa mililitry komórek na mikrowzorzysty chip pokryty fibronektyną zanurzony w dwóch mililitrach ciepłego podłoża galwanicznego wewnątrz 35-mililitrowej szalki Greniera Petriego i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 18 godzin. Następnego dnia sprawdź chip za pomocą mikroskopii świetlnej, aby potwierdzić, że większość komórek jest przyczepiona. Wyjmij pożywkę z naczynia, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i/lub martwe komórki, a zaczynając od środka i przesuwając się w kierunku boków w sposób kropli, delikatnie dodaj PBS do komórek.
Po trzecim płukaniu zastąp PBS czteromililitrową pożywką konserwacyjną i włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po 72 godzinach delikatnie przepłucz powierzchnię frytki dwa razy dwoma mililitrami ciepłego PBS Dulbecco na mycie, jak pokazano, i użyj kleszczy, aby natychmiast przenieść umyty wiór na nową sterylną 35-mililitrową szalkę Petriego Greniera. Szybko dodaj do chipa 1,5 mikrolitra żywej dwukolorowej zieleni rozcieńczonej 1000 razy w DPBS.
Zamocuj komorę na chipie i umieść naczynie na uchwycie naczynia stopnia pobierania komórek. Włóż nasadkę magnetyczną i znajdź celownik w oknie podglądu na żywo. Skoncentruj się na celowniku, a następnie w oknie skanowania i sortowania wybierz kalibrację automatycznego wstrzykiwania i skalibruj.
Zastąp supernatant naczynia 1,5 mililitra roztworu potrójnego E w proporcji jeden do jednego, aby rozluźnić komórki z fibronektyny i otwórz zakładkę skanowania. Aby zeskanować cały chip, skup się na lewym górnym rogu chipa w polu view i kliknij pobierz aktualną pozycję mikroskopu. Następnie skoncentruj się na prawym dolnym rogu chipa i kliknij pobierz aktualną pozycję mikroskopu.
W wyskakującym okienku kliknij ustaw najostrzejszą płaszczyznę i kliknij przejdź do prawego górnego rogu i przejdź do przycisków w lewym dolnym rogu. Następnie kliknij przycisk Zakończ, aby rozpocząć skanowanie. Po zakończeniu skanowania otwórz kartę analizy i kliknij przycisk pokaż mapę, aby wybrać pojedyncze komórki, które spełniają kryteria badania.
Wyśrodkuj szklaną mikrokapilę na środku mikroskopu podgląd na żywo i otwórz klapkę pompy. Aby wytworzyć podciśnienie, wycofaj tłok z 50-mililitrowej strzykawki numer jeden, cztery mililitry i otwórz kartę sortowania. Aby umożliwić wybranie pojedynczej komórki, ustaw zawór drugi tak, aby był otwarty na 120 milisekund, a zawór pierwszy na 20 milisekund po upływie 200 milisekund.
Aby umożliwić pomyślne dostarczenie pobranej komórki do probówki PCR zawierającej bufor do lizy, należy ustawić zawór pierwszy na otwarcie na 20 milisekund i zawór drugi na 10 milisekund po upływie 10 milisekund. Po dostosowaniu ustawień zaworu kliknij przycisk Oblicz ścieżkę. Oprogramowanie obliczy najszybszą ścieżkę od komórki do komórki w celu pobrania i wstrzyknięcia wybranych komórek w całym chipie.
Następnie skoncentruj mikroskop na wzorze na powierzchni wióra. Za pomocą joysticka ostrożnie przesuń mikrokapilę w dół, aby uzyskać najostrzejszy obraz końcówki mikrokapilary bez dotykania powierzchni chipa i kliknij ustawione. Otworzy się nowe okno, pokazujące przekrój mikrokapilarny.
Aby oprogramowanie zarejestrowało przesunięcie końcówki kapilary we współrzędnych X, Y i Z, kliknij dokładny środek kapilary. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij sortowanie, aby rozpocząć sortowanie. W tej reprezentatywnej analizie wstępnie amplifikowanego cDNA z pobranej pojedynczej komórki zaobserwowano wyraźne prążki na wykresie densytometrii żelowej odpowiadającej pikowi przy 1 852 parach zasad w elektroferogramie.
Średnia wielkość fragmentów wynosiła 1 588 par zasad z niewielką liczbą fragmentów, które były krótsze niż 300 par zasad, co wskazuje na generowanie dobrej biblioteki cDNA. Można również przeprowadzić barwienie i analizę immunofluorescencyjną w celu oceny struktury sarkomeru w obrębie wzorzystych kardiomiocytów. Platforma ta toruje drogę do wysokoprzepustowych badań i badań przesiewowych leków w różnych typach niewydolności serca.
Przegląd
To badanie wprowadza nową platformę do hodowli i sortowania kardiomiocytów na podstawie ich morfologii na poziomie pojedynczych komórek. Ta metoda umożliwia wysokowydajne przesiewanie leków dla różnych rodzajów niewydolności serca.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Hodowla kardiomiocytów
- Analiza morfologii komórek
- Metody przesiewania leków
Tło
- Kardiomiocyty wykazują różnorodne kształty, które korelują z różnymi patologiami.
- Badanie wpływu kształtu komórki na ekspresję genów jest wyzwaniem in vivo.
- Techniki wysokiego przepływu są niezbędne do skutecznego przesiewania leków.
- Obecne metody nie mają wydajności w sortowaniu i analizie pojedynczych komórek na podstawie morfologii.
Cel badania
- Opracowanie platformy do badania wpływu kształtu komórki na ekspresję genów.
- Ułatwienie sortowania kardiomiocytów na podstawie ich morfologii.
- Poprawa procesów przesiewania leków dla terapii niewydolności serca.
Stosowane metody
- Przygotowanie zawiesiny kardiomiocytów i jej rozcieńczanie.
- Wykorzystanie pokrytych fibronektyną mikrowzórków do hodowli komórek.
- Mikroskopia świetlna do potwierdzenia przyczepienia komórek.
- Automatyczne skanowanie i sortowanie pojedynczych komórek za pomocą systemu mikrokapilary.
Główne wyniki
- Udane przyczepienie i utrzymanie uformowanych kardiomiocytów.
- Generowanie dobrej biblioteki cDNA z posortowanych pojedynczych komórek.
- Barwienie immunofluorescencyjne ujawniło struktury sarkomerowe.
- Platforma wspiera badania wysokowydajne i przesiewanie leków.
Wnioski
- Opracowana platforma oferuje nowatorskie podejście do badania kardiomiocytów.
- Umożliwia wydajne sortowanie i analizę komórek na podstawie morfologii.
- Ta metoda może znacząco postępować w badaniach nad terapiami niewydolności serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
