Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Ta metoda eksperymentalna pozwala na długotrwałe przechowywanie pojedynczych komórek wielokrotnego użytku do badań epigenomicznych. Umożliwia również analizę wielu znaczników epigenetycznych i czynników transkrypcyjnych w tej samej pojedynczej komórce. W obecnych metodach analizy epigenomu pojedynczych komórek te same pojedyncze komórki nie mogą być ponownie analizowane.

Jednak w przypadku pojedynczych komórek wielokrotnego użytku te same pojedyncze komórki mogą być wielokrotnie analizowane. Technika ta jest przydatna w diagnostyce i projektowaniu terapii epigenetycznej, szczególnie gdy liczba komórek pacjenta jest ograniczona. Metoda ta jest najbardziej odpowiednia do badania epigenomu, regulacji ekspresji genów i innych systemów, o ile dostępne są specyficzne przeciwciała dla znaczników epigenetycznych.

Kiedy po raz pierwszy wypróbowujesz tę technikę, zalecamy ćwiczenie na próbkach, które nie są zbyt cenne, i walidację eksperymentu za pomocą płytkiego sekwencjonowania, takiego jak MiSeq lub iSeq 100. Na początek w czystym okapie z przepływem laminarnym wymieszaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej i 199 mililitrów jednego milimolowego EDTA PBS zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA. Po wymieszaniu przenieść 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.

Umieść pokrywę na płytce 96-dołkowej i zeskanuj płytkę za pomocą mikroskopu skaningowego. Następnie przechyl płytkę i poczekaj kilka minut, aż pojedyncza komórka opadnie na dolną krawędź studzienki. Następnie umieść końcówkę pipety w dolnym rogu i przenieś pojedynczą komórkę i bufor do probówki PCR.

Sprawdź studnię za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić transfer. Jeśli pojedyncza komórka nadal znajduje się w studzience, dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę jednego milimolowego PBS EDTA zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA i powtórz transfer. Po przeniesieniu należy umieścić pokrywę na 96-dołkowej płytce do PCR i odwirować płytkę za pomocą rotora wahadłowego bez przerwy.

Po odwirowaniu umieść płytkę na pokładzie automatycznego robota do obsługi cieczy. Następnie przeciągnij i upuść kod uzupełniający do okna oprogramowania robota obsługującego ciecze i uruchom program, aby usunąć 195 mikrolitrów supernatantu z bardzo małą prędkością pipetowania. Dodaj 50 mikrolitrów 4% TEMEDU lub oleju mineralnego i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia usuń olej mineralny za pomocą pipetowania i przemyj komórki pięciokrotnie 200 mikrolitrami ujemnego buforu magnezowego TP. Po ostatnim płukaniu usunąć supernatant, dodać 15 mikrolitrów buforu do wyżarzania i inkubować na lodzie przez godzinę. Po inkubacji umieść probówki PCR na termocyklerze i podgrzewaj w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty.

Następnie przenieś probówki do metalowego bloku chłodzonego lodem i inkubuj przez dwie minuty. Następnie dodaj cztery mikrolitry siarczanu magnezu i chlorku sodu, wymieszaj DNTP i wymieszaj, wirując z maksymalną prędkością. Następnie dodaj jeden mikrolitr dużego fragmentu polimerazy BST, wymieszaj przez wirowanie i inkubuj przez cztery godziny na shakerze.

Po inkubacji umieść probówkę PCR na termocyklerze i uruchom program czterogodzinny lub nocny, jak opisano w tekście. W celu związania przeciwciał dodać do probówki 1,625 mikrolitra roztworu chlorku sodu EDTA BSA. Mieszaj przez wirowanie z małą prędkością i inkubuj probówkę na lodzie przez godzinę.

Następnie dodać 0,1 mikrograma na mililitr przeciwciała i kontrolować IgG sprzężoną z sondą przeciwciała. Po dodaniu przeciwciał inkubować probówki na lodzie, delikatnie wstrząsając. Następnego dnia dwukrotnie przemyj komórki 200 mikrolitrami buforu TPM-T na lodzie.

Następnie usunąć supernatant i przemyć raz buforem ligazy DNA T4. Następnie dodaj 19 mikrolitrów roztworu adaptera do ligacji i inkubuj przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie dodaj jedną mikrolitrową ligazę DNA T4 i wymieszaj probówkę, wirując ze średnią prędkością.

Umieść rurkę na termocyklerze i uruchom program ligacji zbliżeniowej. Po przebiegu umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami dodatniego buforu magnezowo-ujemnego EDTA BST i przechowuj komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami ujemnego buforu magnezowo-ujemnego EDTA BST i dodaj 20 mikrolitrów mieszaniny zawierającej BST, DNTP i siarczan magnezu.

Następnie wymieszaj z mieszalnikiem wirowym i inkubuj probówkę przez cztery godziny na wytrząsarce orbitalnej. Po inkubacji umieść probówkę na termocyklerze i uruchom pełny program rozszerzający zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Następnie, w celu wzmocnienia wielokrotnego przemieszczenia, dodaj 0,4 mikrolitra 100 mikromolowego drugiego losowego startera i wymieszaj przez wirowanie.

Następnie inkubuj probówkę przez dwie godziny na wytrząsarce orbitalnej przed umieszczeniem probówki na termocyklerze w celu podgrzania w temperaturze 94 stopni Celsjusza. Po trzech minutach umieść probówki w metalowym bloku chłodzonym lodem i dodaj jeden mikrolitr polimerazy DNA BST. Wiruj rurki z małą prędkością.

Następnie umieść lampy na termocyklerze, aby uruchomić program amplifikacji wielokrotnego przemieszczenia. Po zakończeniu programu przenieś około 20 mikrolitrów supernatantu do probówki PCR i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 20 mikrolitrów 0,05% buforu TWEEN 20 i 0,1X TE do probówki PCR zawierającej pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku i inkubuj probówkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia należy pobrać supernatant i połączyć go z supernatantem zebranym wcześniej. Następnie namocz pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku i bufor TBS zawierający 50% glicerolu, pięć milimolowych EDTA, 0,5% BSA i 0,05% TWEEN 20, a następnie inkubuj je przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej. Po inkubacji pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia.

Na koniec dodaj 40 mikrolitrów ujemnej mieszanki głównej Exo i umieść probówkę na termocyklerze, aby uruchomić program zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Przy użyciu tego protokołu wygenerowano pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku K562. Pojedyncze komórki osadzono w zewnętrznej warstwie kulki poliakrylamidu i uwidoczniono za pomocą barwnika interkalatorowego do barwienia DNA.

Przedstawiono tutaj produkty DNA przed i po trawieniu BciVI. Trawienie enzymu restrykcyjnego wygenerowało oczekiwane 19 do 20, 31 do 32, 49 i więcej niż 49 fragmentów par zasad. Następnie skonstruowaną bibliotekę DNA przeanalizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej pod kątem pożądanych produktów.

Wyniki sekwencjonowania wykazały, że unikalne zmapowane odczyty z antyhistonu H3 acetylowanej lizyny 27 i antyhistonu H3 trimetylowanej lizyny 27 były znacznie liczniejsze niż z kontrolnej IgG. Sygnały sekwencjonowania REpi oceniono, porównując dane sekwencjonowania REpi z danymi sekwencjonowania zbiorczego ChIP. Średnio około 91% sygnałów histonu H3 acetylowanej lizyny 27 z sekwencjonowania REpi pokrywało się z pikami histonu H-3 acetylowanej lizyny 27 w masowym sekwencjonowaniu ChIP.

Precyzja sekwencjonowania REpi dla nieaktywnego znacznika histonowego, histonu H3 trimetylowanej lizyny 27 wynosiła 52%Czułość sekwencjonowania REpi analizowano w celu zmierzenia, ile pików masowego sekwencjonowania ChIP wykryto za pomocą sekwencjonowania REpi odtworzonych odczytów. Czułość sekwencjonowania REpi wynosiła 55,30% w histonie H3 acetylowanej lizynie 27 i 50,94% w histonie H3 trimetylowanej lizynie 27. Upewnij się, że używasz odczynników wolnych od DNS.

Ponadto wszystkie operacje, które obejmują otwieranie przewodów rurki lub przewodów odczynników, należy wykonywać w czystym kapturze. Produkty DNA tej procedury są sekwencjonowane, a następnie mapowane do genomu, aby ujawnić, które modyfikacje histonów są obecne, w których regionach genomu w pojedynczych komórkach. Technologia ta umożliwiła analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i utorowała drogę do analizy multiomicznej w dowolnej pojedynczej komórce.