Name: Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę wielokrotnego użytku pojedynczych komórek do iteracyjnych analiz epigenomicznych. Technika umożliwia badanie wielu modyfikacji epigenetycznych w tej samej komórce, co wspiera projektowanie terapii epigenetycznych przy ograniczonej liczbie komórek pacjenta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Davidowi Sanchezowi-Martinowi i Christopherowi B. Buckowi za komentarze na etapie konceptualizacji projektu. Dziękujemy również Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health za pomoc we wstępnych eksperymentach oraz Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH za porady w zakresie analizy obliczeniowej. Dziękujemy Pani Annie Word za pomoc w optymalizacji polimeraz DNA wykorzystywanych w metodzie. W pracy wykorzystano zasoby obliczeniowe klastra NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Projekt ten jest wspierany przez Program Stacjonarny Centrum Badań nad Rakiem, National Cancer Institute, National Institutes of Health, NCI Director's Innovation Award (#397172) oraz fundusze federalne z National Cancer Institute w ramach umowy nr. HHSN261200800001E. Dziękujemy doktorom Tomowi Misteli, Carol Thiele, Douglasowi R. Lowe'emu i wszystkim członkom Laboratorium Onkologii Komórkowej za owocne komentarze.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Doktorzy Ohnuki i Tosato są współtwórcami patentu zatytułowanego "Metody przygotowania pojedynczej komórki wielokrotnego użytku oraz metody analizy epigenomu, transkryptomu i genomu pojedynczej komórki" (EP3619307 i US20200102604). Wniosek patentowy został złożony częściowo w oparciu o wstępne wyniki związane z technologią opisaną w niniejszym manuskrypcie. Wynalazek lub wynalazki opisane i zastrzeżone w niniejszym zgłoszeniu patentowym zostały dokonane, gdy wynalazcy byli pełnoetatowymi pracownikami rządu Stanów Zjednoczonych. W związku z tym, zgodnie z 45 Kodeksem Przepisów Federalnych, część 7, wszystkie prawa, tytuły i udziały w tym zgłoszeniu patentowym zostały lub powinny być zgodnie z prawem przeniesione na rząd Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych przekazuje część otrzymywanych przez siebie tantiem, na rzecz swoich pracowników-wynalazców zgodnie z 15 Kodeksem Stanów Zjednoczonych § 3710c.

W tym artykule opisano krok po kroku protokół dla niedawno zgłoszonej analizy multiepigenomicznej pojedynczych komórek przy użyciu pojedynczych komórek wielokrotnego użytku7. W kolejnych akapitach omawiamy punkty krytyczne, podkreślając potencjalne ograniczenia w protokole. 
Jednym z krytycznych punktów w całym protokole (z kroków 7.2-13) jest unikanie zanieczyszczenia DNazą. Pojedyncza komórka ma tylko dwie kopie genomowego DNA. Dlatego uszkodzenie genomowego DNA kryty...

Technologia jednokomórkowa wkracza w erę multiomiki jednokomórkowej, która integruje indywidualne technologie porozumień jednokomórkowych1. Ostatnio transkryptomika pojedynczych komórek została połączona z metodami wykrywania dostępności chromatyny (scNMT-seq2 i SHARE-seq3) lub modyfikacji histonów (Paired-seq4 i Paired-Tag5). Niedawno transkryptomika i proteomika pojedynczych komórek została zintegrowana z dostępnością chromatyny (DOGMA-seq6). Metody te wykorzystują tagowanie oparte na transpozazie do wykrywania dostępności chromatyny lub modyfikacji histonów.
Podejścia oparte na transpozazie dzielą genomowe DNA i dodają kod kreskowy DNA na końcu fragmentu genomowego DNA. Każdy rozszczepiony fragment genomu może przyjąć tylko do dwóch kodów kreskowych DNA (= jeden znak epigenetyczny na miejsce rozszczepienia), a genomowe DNA w miejscu rozszczepienia zostaje utracone. W związku z tym podejścia oparte na rozszczepieniu wiążą się z kompromisem między liczbą badanych znaczników epigenetycznych a gęstością sygnału. Utrudnia to analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano metodę epigenomiczną pojedynczej komórki, która nie rozszczepia genomowego DNA7,8.
Oprócz wspomnianego wyżej problemu związanego z rozszczepieniem, podejścia oparte na transpozazie mają inne ograniczenia. W analizie epigenomu pojedynczej komórki kluczowe znaczenie ma znajomość lokalizacji histonów i białek związanych z DNA w genomie. W obecnych podejściach osiąga się to poprzez wykorzystanie nieutrwalonych pojedynczych komórek i zachowanie interakcji białko-DNA i białko-białko. Powoduje to jednak silne odchylenie w kierunku dostępnych regionów chromatyny, nawet w analizie modyfikacji histonów 9. Lokalizacja histonów i białek związanych z genomem w genomie może być zachowana bez sieciowania białko-DNA i białko-białko, przy użyciu rusztowania poliakrylamidowego7,8. Takie podejście zmniejsza odchylenie strukturalne obserwowane w obecnych podejściach, które zależą od interakcji białko-DNA i białko-białko.
Podejścia oparte na transpozach mogą odbierać sygnały tylko raz z pojedynczej komórki. W związku z tym trudno jest wyznaczyć pełny epigenom pojedynczej komórki ze względu na spadek sygnałów. Pojedyncze komórki wielokrotnego użytku zostały opracowane w celu przezwyciężenia obecnych ograniczeń poprzez umożliwienie iteracyjnej analizy epigenomicznej w tej samej pojedynczej komórce.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor CutSmart</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Bufor do wytrawiania</td></tr><tr><td>200 proof etanol</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 proof</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>5-hydroksymetylocytozyna (5-hmC) Przeciwciało monoklonalne [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Acridine Orange/Propidium Jodek Bejca</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>Roztwór akryloamidu, 40% w H2O, do biologii molekularnej</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>40% roztwór akryloamidu</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny typu "wszystko w jednym" BZ-X710</td><td>Mikroskop skaningowy</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td></tr> Filtr <tr><td>odśrodkowy Amicon Ultra-0,5</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>Kaseta ultrafiltracyjna</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu do biologii molekularnej</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Nadsiarczan amonu w proszku</td></tr><tr><td>Bezwodny DMF</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>S-4001-005</td><td>Bezwodny N,N-dimetyloformamid (DMF)</td></tr><tr><td>Polimeraza anty-RNA II Powtórzenie CTD YSPTSPS (fosfo S5) przeciwciało [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Przeciwciało anty-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457)</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 20 mg / ml w H2O, niskie obciążenie biologiczne, bez proteazy, do biologii molekularnej</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (Tabela 7)</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Bst, duży fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst Polimeraza DNA</td></tr><tr><td>BT10 Seria 10 i mikro; l Końcówka barierowa</td><td>Końcówka NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 o niskiej retencji</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>N/A</td><td>Zautomatyzowany robot do pobierania pojedynczych komórek</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl nanowell płytki do klonowania pojedynczych komórek, Płytka S200-100 100K, 24 dołki, ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td> 4 <td>nL płytka nanowell</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Corning Costar 96-Well, Poddana hodowli komórkowej, płaska płytka mikropłytkowa</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Płaskie 96-dołkowe płytki</td></tr><tr><td>Deep Vent (egzo-) Polimeraza DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- Probówki</td></tr> DNA <tr><td>LoBind, 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0,5 ml rurki o niskim poziomie wiązania DNA</td>Eppendorf</tr><tr><td>Oligo, 1. losowy starter</td><td>Zintegrowane technologie DNA N</td><td>/ A, patrz Tabela 3</td><td>1. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#01</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td> 2<td>.</td></tr> losowy <tr><td>starter DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#02</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#03</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>Oligo DNA, 2. losowy starter Komórka#04</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#05</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#06</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>Drugi losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Drugi losowy starter Komórka#07</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2.</td></tr> losowy starter <tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#08</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2.</td></tr> losowy starter <tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#09</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#10</td><td>Zintegrowane technologie</td> <td>DNANie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#11</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. losowy starter Komórka#12</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>2. losowy starter</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. starter syntezy</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>Drugi starter</td></tr> <tr><td>syntezyDNA Oligo, Adaptor do ligacji</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td> dotyczy<td>, patrz Tabela 3</td><td>Adaptor do ligacji</td></tr><tr><td>DNA Oligo, starter do odwrotnej transkrypcji</td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td> dotyczy<td>, patrz Tabela 3</td><td>Starter odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>DNaza I (bez RNazy)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNaza I (bez RNazy, 4 U).</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny DNazy I</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x bufor DNazy I (NEB)</td></tr> <tr><td>Mieszanka dNTP (10 mM każdy)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, pochodzenie z USA, inaktywowana termicznie</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności</td> New <td>England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>Mistrzowska mieszanka transkrypcji in vitro</td></tr><tr><td>Przeciwciało Histone H3K27ac</td><td>Motyw aktywny</td><td>39133</td><td>Anty-H3K27ac</td></tr><tr><td>Przeciwciało Histone H3K27me3</td><td>Motyw aktywny</td><td>39155</td><td>Anty-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG z surowicy królika</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Control IgG</td></tr><tr><td>Nanoproszek magnetyczny tlenku żelaza(II,III), średnia wielkość części 30 nm (TEM), funkcjonalizowany estrem NHS</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS funkcjonalizowany estrem 30 nm proszek tlenku żelaza</td></tr><tr><td>K-562</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (ATCC)</td> <td>Komórki</td> <td>CCL-243</td></tr><tr><td>Liniowy akryloamid (5 mg / ml)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Liniowy akryloamid</td></tr><tr><td>LUNA-FL Licznik komórek z podwójną fluorescencją</td><td>Logo Biosystems</td><td>L20001</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>LUNA Szkiełka do liczenia komórek, 50 slajdów</td><td>Logo Biosystems</td><td>L12001</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>Olej mineralny, Bioodczynnik, do biologii molekularnej, olej lekki</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Olej mineralny</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametyloetylenodiamina do biologii molekularnej</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyloethelenodiamine</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), bez RNaz</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Fisher</td><td>2516</td><td>&nbsp; Spektrofotometr mikroobjętościowy</td></tr><tr><td>NEST 2 ml 96-dołkowa płytka głębinowa, V Bottom</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td> 2 <td>mL głęboka płytka 96-dołkowa</td></tr> bez <tr><td>osłonki 96-dołkowa płytka PCR</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>96-dołkowa płytka do PCR</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>Agaroza</td></tr><tr><td>OmniPur Akrylamid: Bis-akrylamid 19:1, 40% roztwór</td><td>MiliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>40% Akrylamid/Bis-akryloamid</td></tr><tr><td>Robot laboratoryjny OT-2</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>Zautomatyzowany robot do obsługi cieczy</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, klasa EM, oczyszczona, 20% roztwór wodny</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15713</td><td>20% aldehyd pararmały</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>Pipeta PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>A P1000</td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1,5 ml rurka o niskim poziomie wiązania białka</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAgen Pipeta Qiagen</td><td></td><td>28706</td><td>A P1000</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA</td><td>Test Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; Specyficzny dla DNA barwnik interkalatorowy</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego ligowania</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 Ligaza DNA (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Inhibitor RNAzy</td></tr><tr><td>S-4FB Środek sieciujący (rozpuszczalny w DMF)</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidylo4-formylobenzoesan (S-4FB)</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Laboratoria</td> <td>wektoroweS-1002-105</td><td>6-hydrazynonikotynian sukcynimidylu hydrazon acetonu (S-HyNic)</td></tr><tr><td>Octan sodu, 3 M, pH 5,2, klasa biologii molekularnej</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M Octan sodu (pH 5,2)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu, roztwór buforowy 1M, pH 8,5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M bufor wodorowęglanu sodu, pH 8,5</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy do biologii molekularnej</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Fosforan sodu monozasadowy dla biologii molekularnej</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV Odwrotna transkryptaza</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Odwrotna transkryptaza</td></tr><tr><td>SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000x Koncentrat w DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td><td>Barwnik interkalatorowy dla DNA</td></tr><tr><td>T4 Bufor reakcyjny ligazy DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 Bufor reakcyjny ligazy DNA</td></tr><tr><td>Pakiet reakcyjnych ThermoPol New</td><td>England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x bufor TPM-T (Tris-HCl/chlorek potasu/siarczan magnezu/Triton X-100)</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol LS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Ekstrakcja tiocyjanianianem guanidyny, fenolem i chloroformem</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki TruSeq Nano DNA</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (patrz również instrukcja producenta)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, patrz Tabela 3</td><td>Sonda DNA modyfikowana aminami pod kątem przeciwciała</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, patrz Tabela 3</td><td>Sonda DNA modyfikowana aminami na przeciwciało</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, patrz Tabela 3</td><td>Sonda DNA modyfikowana aminami dla przeciwciała</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, patrz Tabela 3</td><td>Sonda DNA modyfikowana aminą dla przeciwciała</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, patrz Tabela 3</td><td>Sonda DNA modyfikowana aminą dla przeciwciał</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy, patrz Tabela 3</td><td>Sonda DNA modyfikowana aminami do kontroli IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana bez DNazy/RNaz</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>Ultraczysta woda</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba Splin, 7K MWCO, 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>Kolumna odsalająca</td></tr></tbody></table>

pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Obecne analizy epigenomu pojedynczych komórek są przeznaczone do jednorazowego użytku. Komórka jest wyrzucana po jednorazowym użyciu, co zapobiega analizie wielu znaczników epigenetycznych w jednej komórce i wymaga danych z innych komórek w celu odróżnienia sygnału od eksperymentalnego szumu tła w pojedynczej komórce. W artykule opisano metodę ponownego wykorzystania tej samej pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych. 
W tej eksperymentalnej metodzie, białka komórkowe są najpierw zakotwiczone w polimerze poliakrylamidowym, zamiast sieciować je z białkiem i DNA, co łagodzi strukturalne uprzedzenia. Ten krytyczny krok pozwala na wielokrotne eksperymenty z tą samą pojedynczą komórką. Następnie losowy starter z sekwencją rusztowania do ligacji zbliżeniowej jest wyżarzany do genomowego DNA, a sekwencja genomowa jest dodawana do startera przez rozszerzenie za pomocą polimerazy DNA. Następnie przeciwciało przeciwko markerowi epigenetycznemu i kontrolnej IgG, z których każda jest znakowana różnymi sondami DNA, są wiązane z odpowiednimi celami w tej samej pojedynczej komórce. 
Ligacja zbliżeniowa jest indukowana między losowym starterem a przeciwciałem poprzez dodanie konektora DNA z komplementarnymi sekwencjami do sekwencji rusztowania losowego startera i sondy przeciwciało-DNA. Podejście to integruje informacje o przeciwciałach i sekwencje pobliskiego genomu w pojedynczym produkcie DNA ligacji zbliżeniowej. Umożliwiając wielokrotne eksperymenty na tej samej pojedynczej komórce, metoda ta pozwala na zwiększenie gęstości danych z rzadkiej komórki i analizę statystyczną przy użyciu tylko danych IgG i przeciwciał z tej samej komórki. Pojedyncze komórki wielokrotnego użytku przygotowane tą metodą mogą być przechowywane przez co najmniej kilka miesięcy i ponownie wykorzystane później w celu poszerzenia charakterystyki epigenetycznej i zwiększenia gęstości danych. Metoda ta zapewnia elastyczność naukowcom i ich projektom.

Pojedyncze komórki K562 przygotowano zgodnie z protokołem opisanym w kroku 8 (patrz Rycina 5). Pojedyncze komórki osadzono w zewnętrznej warstwie kuleczki poliakrylamidowej. DNA komórkowe zabarwiono i zwizualizowano przy użyciu barwnika interkalującego do barwienia DNA.
<img alt="Obraz mikroskopowy mikrokropli w cieczy, zaznaczony do analizy w badaniu optycznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg" data-alt...

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Ta metoda eksperymentalna pozwala na długotrwałe przechowywanie pojedynczych komórek wielokrotnego użytku do badań epigenomicznych. Umożliwia również analizę wielu znaczników epigenetycznych i czynników transkrypcyjnych w tej samej pojedynczej komórce. W obecnych metodach analizy epigenomu pojedynczych komórek te same pojedyncze komórki nie mogą być ponownie analizowane.Jednak w przypadku pojedynczych komórek wielokrotnego użytku te same pojedyncze komórki mogą być wielokrotnie analizowane. Technika ta jest przydatna w diagnostyce i projektowaniu terapii epigenetycznej, szczególnie gdy liczba komórek pacjenta jest ograniczona. Metoda ta jest najbardziej odpowiednia do badania epigenomu, regulacji ekspresji genów i innych systemów, o ile dostępne są specyficzne przeciwciała dla znaczników epigenetycznych.Kiedy po raz pierwszy wypróbowujesz tę technikę, zalecamy ćwiczenie na próbkach, które nie są zbyt cenne, i walidację eksperymentu za pomocą płytkiego sekwencjonowania, takiego jak MiSeq lub iSeq 100. Na początek w czystym okapie z przepływem laminarnym wymieszaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej i 199 mililitrów jednego milimolowego EDTA PBS zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA. Po wymieszaniu przenieść 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z płaskim dnem.Umieść pokrywę na płytce 96-dołkowej i zeskanuj płytkę za pomocą mikroskopu skaningowego. Następnie przechyl płytkę i poczekaj kilka minut, aż pojedyncza komórka opadnie na dolną krawędź studzienki. Następnie umieść końcówkę pipety w dolnym rogu i przenieś pojedynczą komórkę i bufor do probówki PCR.Sprawdź studnię za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby potwierdzić transfer. Jeśli pojedyncza komórka nadal znajduje się w studzience, dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę jednego milimolowego PBS EDTA zawierającego barwnik interkalatorowy dla DNA i powtórz transfer. Po przeniesieniu należy umieścić pokrywę na 96-dołkowej płytce do PCR i odwirować płytkę za pomocą rotora wahadłowego bez przerwy.Po odwirowaniu umieść płytkę na pokładzie automatycznego robota do obsługi cieczy. Następnie przeciągnij i upuść kod uzupełniający do okna oprogramowania robota obsługującego ciecze i uruchom program, aby usunąć 195 mikrolitrów supernatantu z bardzo małą prędkością pipetowania. Dodaj 50 mikrolitrów 4% TEMEDU lub oleju mineralnego i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze pokojowej.Następnego dnia usuń olej mineralny za pomocą pipetowania i przemyj komórki pięciokrotnie 200 mikrolitrami ujemnego buforu magnezowego TP. Po ostatnim płukaniu usunąć supernatant, dodać 15 mikrolitrów buforu do wyżarzania i inkubować na lodzie przez godzinę. Po inkubacji umieść probówki PCR na termocyklerze i podgrzewaj w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez trzy minuty.Następnie przenieś probówki do metalowego bloku chłodzonego lodem i inkubuj przez dwie minuty. Następnie dodaj cztery mikrolitry siarczanu magnezu i chlorku sodu, wymieszaj DNTP i wymieszaj, wirując z maksymalną prędkością. Następnie dodaj jeden mikrolitr dużego fragmentu polimerazy BST, wymieszaj przez wirowanie i inkubuj przez cztery godziny na shakerze.Po inkubacji umieść probówkę PCR na termocyklerze i uruchom program czterogodzinny lub nocny, jak opisano w tekście. W celu związania przeciwciał dodać do probówki 1,625 mikrolitra roztworu chlorku sodu EDTA BSA. Mieszaj przez wirowanie z małą prędkością i inkubuj probówkę na lodzie przez godzinę.Następnie dodać 0,1 mikrograma na mililitr przeciwciała i kontrolować IgG sprzężoną z sondą przeciwciała. Po dodaniu przeciwciał inkubować probówki na lodzie, delikatnie wstrząsając. Następnego dnia dwukrotnie przemyj komórki 200 mikrolitrami buforu TPM-T na lodzie.Następnie usunąć supernatant i przemyć raz buforem ligazy DNA T4. Następnie dodaj 19 mikrolitrów roztworu adaptera do ligacji i inkubuj przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie dodaj jedną mikrolitrową ligazę DNA T4 i wymieszaj probówkę, wirując ze średnią prędkością.Umieść rurkę na termocyklerze i uruchom program ligacji zbliżeniowej. Po przebiegu umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami dodatniego buforu magnezowo-ujemnego EDTA BST i przechowuj komórki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami ujemnego buforu magnezowo-ujemnego EDTA BST i dodaj 20 mikrolitrów mieszaniny zawierającej BST, DNTP i siarczan magnezu.Następnie wymieszaj z mieszalnikiem wirowym i inkubuj probówkę przez cztery godziny na wytrząsarce orbitalnej. Po inkubacji umieść probówkę na termocyklerze i uruchom pełny program rozszerzający zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Następnie, w celu wzmocnienia wielokrotnego przemieszczenia, dodaj 0,4 mikrolitra 100 mikromolowego drugiego losowego startera i wymieszaj przez wirowanie.Następnie inkubuj probówkę przez dwie godziny na wytrząsarce orbitalnej przed umieszczeniem probówki na termocyklerze w celu podgrzania w temperaturze 94 stopni Celsjusza. Po trzech minutach umieść probówki w metalowym bloku chłodzonym lodem i dodaj jeden mikrolitr polimerazy DNA BST. Wiruj rurki z małą prędkością.Następnie umieść lampy na termocyklerze, aby uruchomić program amplifikacji wielokrotnego przemieszczenia. Po zakończeniu programu przenieś około 20 mikrolitrów supernatantu do probówki PCR i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 20 mikrolitrów 0,05% buforu TWEEN 20 i 0,1X TE do probówki PCR zawierającej pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku i inkubuj probówkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia należy pobrać supernatant i połączyć go z supernatantem zebranym wcześniej. Następnie namocz pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku i bufor TBS zawierający 50% glicerolu, pięć milimolowych EDTA, 0,5% BSA i 0,05% TWEEN 20, a następnie inkubuj je przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej. Po inkubacji pojedynczą komórkę wielokrotnego użytku należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia.Na koniec dodaj 40 mikrolitrów ujemnej mieszanki głównej Exo i umieść probówkę na termocyklerze, aby uruchomić program zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Przy użyciu tego protokołu wygenerowano pojedyncze ogniwa wielokrotnego użytku K562. Pojedyncze komórki osadzono w zewnętrznej warstwie kulki poliakrylamidu i uwidoczniono za pomocą barwnika interkalatorowego do barwienia DNA.Przedstawiono tutaj produkty DNA przed i po trawieniu BciVI. Trawienie enzymu restrykcyjnego wygenerowało oczekiwane 19 do 20, 31 do 32, 49 i więcej niż 49 fragmentów par zasad. Następnie skonstruowaną bibliotekę DNA przeanalizowano za pomocą elektroforezy kapilarnej pod kątem pożądanych produktów.Wyniki sekwencjonowania wykazały, że unikalne zmapowane odczyty z antyhistonu H3 acetylowanej lizyny 27 i antyhistonu H3 trimetylowanej lizyny 27 były znacznie liczniejsze niż z kontrolnej IgG. Sygnały sekwencjonowania REpi oceniono, porównując dane sekwencjonowania REpi z danymi sekwencjonowania zbiorczego ChIP. Średnio około 91% sygnałów histonu H3 acetylowanej lizyny 27 z sekwencjonowania REpi pokrywało się z pikami histonu H-3 acetylowanej lizyny 27 w masowym sekwencjonowaniu ChIP.Precyzja sekwencjonowania REpi dla nieaktywnego znacznika histonowego, histonu H3 trimetylowanej lizyny 27 wynosiła 52%Czułość sekwencjonowania REpi analizowano w celu zmierzenia, ile pików masowego sekwencjonowania ChIP wykryto za pomocą sekwencjonowania REpi odtworzonych odczytów. Czułość sekwencjonowania REpi wynosiła 55,30% w histonie H3 acetylowanej lizynie 27 i 50,94% w histonie H3 trimetylowanej lizynie 27. Upewnij się, że używasz odczynników wolnych od DNS.Ponadto wszystkie operacje, które obejmują otwieranie przewodów rurki lub przewodów odczynników, należy wykonywać w czystym kapturze. Produkty DNA tej procedury są sekwencjonowane, a następnie mapowane do genomu, aby ujawnić, które modyfikacje histonów są obecne, w których regionach genomu w pojedynczych komórkach. Technologia ta umożliwiła analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i utorowała drogę do analizy multiomicznej w dowolnej pojedynczej komórce.

reusable-single-cell-for-iterative-epigenomic-analyses

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

W tym protokole, metoda oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP) i izolacja jąder oznaczonych określonymi typami komórek (INTACT) zostały zoptymalizowane pod kątem sparowanego przesłuchania specyficznego dla komórki transkryptomu i epigenomu jajnika przy użyciu mysiego modelu NuTRAP skrzyżowanego z myszą linią Cyp17a1-Cre.

Specyficzne dla komórki sparowane badanie epigenomu jajnika myszy i transkryptomu

Protokół łączy technologię organoidów jelitowych człowieka z analizą transkryptomiczną pojedynczej komórki, aby zapewnić znaczący wgląd w wcześniej niezbadaną biologię jelit.

Wykorzystanie organoidów jelitowych człowieka do zrozumienia nabłonka jelita cienkiego na poziomie transkrypcji pojedynczej komórki

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę wielokrotnego użytku pojedynczych komórek do iteracyjnych analiz epigenomicznych. Technika umożliwia badanie wielu modyfikacji epigenetycznych w tej samej komórce, co wspiera projektowanie terapii epigenetycznych przy ograniczonej liczbie komórek pacjenta.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Przeglądaj więcej filmów