Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Czułość spektroskopii MAS NMR wspomaganej DNP pozwala nam scharakteryzować białka wewnątrz nienaruszonych komórek w ich endogennym stężeniu. Ta aplikacja wymaga starannego obchodzenia się z próbką. Niektóre morfologie są zachowane, a komórki są żywotne, gdy są kriogenicznie przenoszone do spektrometru przy użyciu tego protokołu.

Wprowadzenie zimnego wirnika może powodować gromadzenie się wilgoci i lodu, co może mechanicznie uniemożliwić obracanie się próbki. Demonstracja ta posłuży do przeprowadzenia eksperymentów w celu przeprowadzenia transferu kriogenicznego z pewnością siebie. Na początek umieść poduszkę wykonaną z kawałka chusteczki lub ręcznika papierowego pod pokrywką i na dnie fiolki kriogenicznej.

Umieść rotor szafirowy o średnicy 3,2 milimetra w fiolce kriogenicznej wyściełanej bibułką, tak aby zaznaczony koniec był skierowany do dna fiolki. Powoli zamrażać rotor, umieszczając fiolkę w pojemniku chłodzącym o kontrolowanej szybkości i umieszczając pojemnik w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza na co najmniej trzy godziny. Przenieść fiolkę kriogeniczną zawierającą zamrożony wirnik do małej kolby próżniowej wypełnionej ciekłym azotem.

Użyć kolby próżniowej, aby przenieść próbkę do spektrometru. Napełnij suchą, izolowaną termicznie piankową kolbę próżniową z szerokimi ustami w proporcjach od 500 mililitrów do jednego litra ciekłego azotu. Wyjmij fiolkę kriogeniczną z kolby transferowej i trzymaj ją tuż nad powierzchnią ciekłego azotu, aby chronić ją przed atmosferą.

Trzymając fiolkę kriogeniczną z otworem fiolki skierowanym lekko w dół, odkręć nakrętkę i pozwól rotorowi wsunąć się do kąpieli ciekłego azotu. Wstępnie schłodź 1,5-mililitrową probówkę mikrowirówki, zanurzając ją w ciekłym azocie. Pod powierzchnią kąpieli z ciekłym azotem za pomocą pęsety przenieś wirnik do probówki mikrowirówki z końcówką napędową skierowaną do dna probówki, a oznaczeniami skierowanymi w stronę otworu.

Użyj pęsety, aby przytrzymać rurkę zawierającą wirnik pod ciekłym azotem za szyjkę. Za pomocą drugiej pęsety przytrzymaj łapacz próbek NMR nad powierzchnią ciekłego azotu nachyloną pod ostrym kątem w stosunku do probówki mikrowirówki. Aby przenieść wirnik z łapacza próbek NMR do spektrometru NMR, należy przełączyć komorę kriogeniczną w tryb wysuwania, naciskając przycisk wysuwania.

Włóż otwarty koniec łapacza próbek NMR do probówki mikrowirówki, pozostając jeszcze pod powierzchnią ciekłego azotu. Podnieś zarówno probówkę mikrowirówki, jak i łapacz próbek NMR, aby wirnik mógł wpaść do łapacza próbek. Potrząśnij chwytaczem próbek i rurką, jeśli wirnik utknie na krawędzi.

Pozostaw pustą probówkę mikrowirówki na górze łapacza próbek NMR, aby osłonić wirnik przed powietrzem. Wyjmij drugi pusty łapacz próbek z sondy i połóż go na podłodze. Przenieś łapacz próbek NMR zawierający wirnik do drugiej ręki.

Następnie wyjmij probówkę mikrowirówki i natychmiast włóż ją do sondy. Zasygnalizuj osobie obsługującej szafę kriogeniczną, aby nacisnęła przycisk zatrzymania, wysuń i włoż. Odwiruj próbkę do żądanej prędkości wirowania, regulując łożysko i ciśnienie przepływu napędu.

Wlać 500 mililitrów na jeden litr ciekłego azotu do kolby próżniowej z pianką o szerokich ustach i umieścić kąpiel pod spektrometrem. Zanurzyć pustą fiolkę kriogeniczną zawierającą kawałek bibułki w kąpieli z ciekłym azotem. Zmniejsz prędkość wirowania do zera kiloherców, zmniejszając przepływ gazu napędowego i łożyskowego, a następnie wyrzuć wirnik, przełączając się w tryb wyrzutu.

Trzymając włączony tryb wyrzutu, wyjmij łapacz próbki z sondy i wrzuć wirnik bezpośrednio do kolby piankowej o szerokich otworach zawierającej ciekły azot. Za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety przenieś wirnik do wstępnie schłodzonej fiolki kriogenicznej pod powierzchnią ciekłego azotu. Wstępnie schłodzić nakrętkę fiolki kriogenicznej, zanurzając ją w ciekłym azocie.

Wyjąć fiolkę zawierającą rotor i ciekły azot z kąpieli i zakryć probówkę wstępnie schłodzoną nakrętką. Ponownie zanurz fiolkę kriogeniczną w ciekłym azocie. Próbkę można przenieść do długoterminowego przechowywania ciekłego azotu lub natychmiast rozpakować w celu dalszej analizy.

Kriogeniczne wprowadzanie wstępnie zamrożonych próbek komórek ssaków do spektrometru NMR potwierdza żywotność przez cały czas trwania eksperymentu NMR. Korzystając z tego protokołu, przepuszczalność błękitu trypanowego komórek ssaków po MAS NMR jest podobna do przepuszczalności komórek nienarażonych na żadną zmianę temperatury. Jeśli komórki są powoli zamrażane, a następnie podgrzewane do temperatury pokojowej przed włożeniem, żywotność komórek spada do mniej niż 10%Tymczasem kriogeniczne wprowadzanie zamrożonych próbek komórek ssaków wspiera żywotność komórek przez cały eksperyment NMR.

Podczas próby wykonania protokołu poproś o pomoc w naciśnięciu przycisku wyrzutu i odkręceniu próbki, aby próbka mogła zostać wprowadzona do sondy przed jej rozgrzaniem, upewniając się, że do sondy nie zostanie wprowadzona wilgoć, mając pewność, że spektrometr będzie zimny przez wiele tygodni. Protokół ten ma zastosowanie do każdego systemu, w którym wahania temperatury mogą zagrozić integralności próbki, takiego jak reakcje z zamrożeniem lub charakterystyka uwięzionych produktów pośrednich reakcji i enzymologia i fałdowanie białek.