Name: Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Poznaj metodę kriogenicznego transferu próbek do spektrometru MAS NMR z zachowaniem żywotności komórek ssaków. Protokół zapobiega wilgoci i zapewnia niezawodność badań biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Cancer Research Prevention & Research Institute of Texas [RR150076], National Science Foundation [1751174]; National Institutes of Health [NS-111236], Welch Foundation [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Foundation, Ted Nash Long Life Foundation i Kinship Foundation (Searle Scholars Program) dla K.K.F.

1. Hodowla i krioprotekcja komórek ssaków
<ol>
	<li>Hodowla i pobieranie komórek ssaków
	<ol>
		<li>Rozmrozić podwielokrotność zamrożonych ludzkich embrionalnych komórek nerkowych (HEK 293).</li>
		<li>Hodowla komórek HEK 293 w pożywkach wzrostowych (np. DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% Pen-Strep) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w 100 mm płytkach przez dwa do trzech pasaży (7-10 dni).</li>
		<li>Podziel komórki i kulturę na płytce o średnicy 150 mm, aż komórki osiągną 90-95% zbieżności. 
		UWAGA: Płyta 150 mm przy > 90% zbiegu wystarczy do wypełnienia dwóch szafirowych wirników o średnicy 3,2 mm.</li>
		<li>Zebrać komórki za pomocą 4 ml trypsyny (patrz tabela materiałów) i 10 ml pożywki. Przenieść zawiesinę do sterylnego stożka o pojemności 15 ml i odwirować przy 673 x g (1000 obr./min) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Przepłukać osad komórkowy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (pH 7,4, −CaCl2, −MgCl2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krioprotekcja komórek
	<ol>
		<li>Zebrać 50 μl osadu komórkowego w probówce do mikrowirówki. Przygotować mieszaninę 50 μl PBS i 18 μl glicerolu w osobnej probówce.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj 50 μl osadu komórkowego z 68 μl mieszaniny glicerolu-PBS, dodając mieszaninę glicerolu-PBS do górnej części osadu i ponownie zawieszając osad, delikatnie stukając w bok probówki, aż nie pozostaną żadne grudki. 
		UWAGA: Delikatne pipetowanie może być również stosowane do ponownego zawieszenia ogniwa, jednak należy upewnić się, że integralność komórkowa nie jest naruszona.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kriokonserwacja komórek ssaków w wirniku NMR
<ol>
	<li>Przeniesienie komórek do szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm.
	<ol>
		<li>Aby wykonać lejek, odetnij końcówkę pipety o pojemności 200 μl i włóż wąską końcówkę odciętej końcówki pipety do wirnika o średnicy 3,2 mm.</li>
		<li>Przenieś komórki do lejka znajdującego się na wirniku. Umieścić rotor wraz z lejkiem w probówce do mikrowirówki i osadzać komórki na dnie wirnika przez odwirowanie przy 673 x g przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant i nadmiar próbki z wirnika. Powtarzaj te dwa kroki, aż wirnik zostanie całkowicie wypełniony komórkami. 
		UWAGA: Opcjonalnie należy określić żywotność komórkową próbki przed zamrożeniem. Zawiesić 10 μl nadmiaru osadu komórkowego w 100 μl DMEM wolnego od FBS. Zmieszać 10 μl zawiesiny z 0,4% roztworem błękitu trypanowego i natychmiast ocenić żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Do rozcieńczania komórek należy używać wyłącznie pożywki wolnej od FBS, ponieważ surowica zakłóca barwienie błękitem trypanowym.</li>
		<li>Uszczelnij wirnik silikonową zatyczką za pomocą dostępnego w handlu narzędzia do pakowania.</li>
		<li>Zamknij wirnik za pomocą ceramicznej końcówki napędowej, dociskając ją pionowo w dół. Unikaj dotykania delikatnych żeber z boku końcówki napędu.</li>
		<li>Zaznacz połowę dolnej krawędzi wirnika szafirowego srebrnym markerem permanentnym, a drugą połowę dolnej krawędzi wirnika czarnym markerem permanentnym, aby umożliwić dokładne monitorowanie wirowania wirnika wewnątrz spektrometru. 
		UWAGA: Niedoskonałości w oznaczeniu wirnika uniemożliwią dokładne zliczenie częstotliwości wirowania, skutkując nieuzyskaniem stabilnego wirowania. Ponieważ znaczniki nie będą pisać na zamarzniętym wirniku, a ocieplenie wirnika narusza integralność próbki, oznaczenie wirnika przed zamrożeniem jest krytycznym krokiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja komórek wewnątrz szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm.
	<ol>
		<li>Umieść poduszkę wykonaną z kawałka chusteczki higienicznej lub ręcznika papierowego pod pokrywką i na dnie fiolki kriogenicznej (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Bibułka chroni oznakowanie wirnika przed uszkodzeniami powstałymi w wyniku uderzenia o boki fiolek kriogenicznych.</li>
		<li>Umieść rotor szafirowy o średnicy 3,2 mm w fiolce kriogenicznej wyściełanej bibułką z zaznaczonym końcem skierowanym w stronę dna fiolki kriogenicznej.</li>
		<li>Powoli zamrażać rotor, umieszczając fiolkę kriogeniczną w pojemniku chłodzącym o kontrolowanej szybkości (-1 °C/min) i umieścić pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 3 godziny.</li>
		<li>Przenieść fiolkę kriogeniczną zawierającą zamrożony wirnik do przechowywania ciekłego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kriogeniczny transfer zamrożonej próbki do spektrometru NMR
<ol>
	<li>Przetransportować zamrożoną próbkę do urządzenia NMR.
	<ol>
		<li>Przenieść fiolkę kriogeniczną zawierającą zamrożony wirnik do małego dewara wypełnionego ciekłym azotem w celu transportu do urządzenia NMR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeniesienie zamrożonego wirnika do kąpieli ciekłego azotu.
	<ol>
		<li>Napełnij suchą, izolowaną termicznie piankę dewara o szerokich ustach 500 ml – 1 l ciekłego azotu.</li>
		<li>Przenieść wirnik z fiolki kriogenicznej do pianki Dewara o szerokich ustach wypełnionej ciekłym azotem.
		<ol>
			<li>Weź kriogeniczną fiolkę z dewara do przenoszenia w dłoni i trzymaj ją tuż nad powierzchnią ciekłego azotu, aby chronić ją przed atmosferą.</li>
			<li>Trzymając fiolkę kriogeniczną z ustami skierowanymi lekko w dół, odkręć nakrętkę i pozwól rotorowi wsunąć się do kąpieli ciekłego azotu. 
			UWAGA: Po odkręceniu nakrętki wirnik musi szybko wpaść z fiolki kriogenicznej do kąpieli ciekłego azotu (poniżej 1 sekundy), aby zapobiec gromadzeniu się kondensatu na wirniku. Parowanie ciekłego azotu tworzy "chmurę azotu" w pianie Dewara o szerokich ustach i zapobiega kondensacji na wirniku, zanim zostanie on zanurzony w ciekłym azocie. Dłuższa ekspozycja wirnika na działanie powietrza może prowadzić do kondensacji wilgoci na ściankach wirnika, która ponownie skondensuje się w lód.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriogeniczny transfer wirnika do łapacza próbek NMR.
	<ol>
		<li>Schłodzić wstępnie probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, zanurzając ją w kąpieli ciekłego azotu. Nie zamykaj tuby. 
		UWAGA: Sprawdź wirnik przed przeniesieniem do probówki mikrowirówkowej. Za pomocą pęsety przytrzymaj wirnik tuż pod powierzchnią ciekłego azotu i sprawdź, czy oznaczenia wirnika są nienaruszone, czy na jego ściankach nie utworzyły się osady lodu i czy końcówka napędu jest nienaruszona. Osady kryształków lodu na ściankach wirnika mają postać białego proszku. Należy uważać, aby zawsze trzymać wirnik za jego korpus, a nie za końcówkę napędu. Nie zdrapuj oznaczenia z wirnika końcówkami pęsety.</li>
		<li>Pod powierzchnią kąpieli ciekłego azotu za pomocą pęsety przenieś wirnik do probówki mikrowirówki z końcówką napędową skierowaną do dolnej części probówki mikrowirówki, a oznaczeniami skierowanymi w stronę otworu probówki. 
		UWAGA: Zawsze susz pęsetę przed zanurzeniem w ciekłym azocie lub dotknięciem wirnika.</li>
		<li>Za pomocą pęsety przytrzymaj rurkę zawierającą wirnik pod ciekłym azotem za szyjkę.</li>
		<li>Trzymając drugą parę pęsety w ręku, przygotuj się do zanurzenia łapacza próbek NMR w kąpieli ciekłego azotu i trzymania go tak, aby był nachylony pod ostrym kątem w stosunku do probówki mikrowirówkowej. 
		UWAGA: Zminimalizuj czas, w którym łapacz próbek ma kontakt z ciekłym azotem, aby uniknąć zamarznięcia pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym. Jeśli O-ring zamarznie, bardzo trudno będzie włożyć łapacz do spektrometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfer wirnika kriogenicznego z łapacza próbek NMR do spektrometru NMR 
	UWAGA: Ten krok wymaga dwóch osób, jednej do obsługi krioszafki, a drugiej do przeniesienia próbki z ciekłego azotu do sondy.
	<ol>
		<li>Ustaw krioszafkę w trybie wysuwania, naciskając "EJECT" na szafce. 
		UWAGA: Tryb wyrzutu usuwa suchy i zimny strumień azotu pod wysokim ciśnieniem z sondy do atmosfery, aby zapobiec przedostawaniu się wilgoci atmosferycznej.</li>
		<li>Przenieść wirnik do łapacza próbek NMR.
		<ol>
			<li>Włóż otwarty koniec łapacza próbek NMR do probówki mikrowirówki, pozostając jeszcze pod powierzchnią ciekłego azotu.</li>
			<li>Podnieś zarówno probówkę mikrowirówki, jak i łapacz próbek NMR, aby wirnik mógł wpaść do łapacza próbek. Potrząśnij chwytaczem próbek NMR i probówką mikrowirówki w przypadku, gdy wirnik utknął na krawędzi łapacza próbek.</li>
			<li>Pozostaw pustą probówkę mikrowirówki na górze łapacza próbek NMR, aby osłonić wirnik przed powietrzem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyjmij drugi pusty łapacz próbek NMR z sondy i połóż go na podłodze.</li>
		<li>Przenieś łapacz próbek NMR zawierający wirnik do wolnej ręki, wyjmij rurkę mikrowirówki i natychmiast włóż ją do sondy. 
		UWAGA: Jeśli pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym zamarznie, trudno będzie dokręcić łapacz próbek. Naciskaj siłę, aż wsunie się na swoje miejsce.</li>
		<li>Zasygnalizuj osobie obsługującej krioszafkę, aby "STOP WYSUWAĆ" i "WŁÓŻ". 
		UWAGA: Tryb wstawiania prowadzi wirnik od łapacza próbek do sondy.</li>
		<li>Odwirować próbkę do żądanej prędkości wirowania (np. 12 kHz), regulując łożysko i ciśnienie przepływu sterującego kontrolowane przez krioszafkę. (np. Natychmiast zwiększ gaz łożyskowy do ~200 mBar, a gaz napędowy do 10 mBar. Gdy próbka zacznie się obracać, zwiększ ciśnienie gazu w łożysku do 1000 mBar i napędzaj gaz do 200 mBar. Gdy wirowanie się ustabilizuje, zwiększ łożysko do 2400 mBar, a następnie zwiększ gaz napędowy z 200 mBar do 1700 mBar w ciągu kilku minut. Gaz chłodzący VT jest stały na poziomie ~1070 L/h.) 
		UWAGA: Podczas wyjmowania probówki mikrowirówki i łapacza próbek NMR z kąpieli ciekłego azotu należy upewnić się, że w probówce mikrowirówki znajduje się wystarczająca ilość ciekłego azotu, aby otoczyć wirnik. Zminimalizuj czas między przeniesieniem wirnika do łapacza próbek NMR a włożeniem łapacza próbek NMR do spektrometru. Wszystkie kroki opisane w punkcie 3.4 powinny zostać wykonane w ciągu 30 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kriogeniczne usuwanie próbki ze spektrometru NMR
<ol>
	<li>Przygotowanie kąpieli z ciekłym azotem i fiolki kriogenicznej
	<ol>
		<li>Wlej 500 ml - 1 l ciekłego azotu do piany dewara o szerokich ustach i umieść kąpiel pod spektrometrem.</li>
		<li>Wstępnie schłodzić fiolkę kriogeniczną. Zanurzyć pustą fiolkę kriogeniczną zawierającą kawałek bibułki w kąpieli z ciekłym azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriogeniczny transfer wirnika z sondy do fiolki kriogenicznej
	<ol>
		<li>Zmniejsz prędkość wirowania do 0 kHz, zmniejszając przepływ gazu napędowego i łożyskowego, a następnie wyrzuć wirnik, przełączając się w tryb wyrzutu.</li>
		<li>Pozostaw włączony tryb wyrzutu, wyjmij łapacz próbki z sondy, wrzuć wirnik bezpośrednio do pianki Dewara o szerokich ustach zawierającej ciekły azot.</li>
		<li>Za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety przenieś wirnik do wstępnie schłodzonej fiolki kriogenicznej pod powierzchnią ciekłego azotu.</li>
		<li>Zakręć fiolkę kriogeniczną. Wstępnie schłodzić nasadkę fiolki kriogenicznej, zanurzając ją w ciekłym azocie. Wyjąć fiolkę kriogeniczną zawierającą rotor i ciekły azot z kąpieli i zakryć probówkę wstępnie schłodzoną nasadką. Nie dokręcaj nakrętki, aby można było bezpiecznie uwolnić odparowujący azot.</li>
		<li>Ponownie zanurz fiolkę kriogeniczną w ciekłym azocie. Próbkę można przenieść do długoterminowego przechowywania ciekłego azotu lub natychmiast rozpakować w celu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Rozpakowywanie rotora i pomiary żywotności
<ol>
	<li>Rozpakowanie wirnika i pomiar żywotności
	<ol>
		<li>Wstępnie podgrzej pożywkę wolną od surowicy (DMEM) lub PBS do 37 °C.</li>
		<li>Usuń wirnik z ciekłego azotu. Usuń końcówkę napędu i silikonową wtyczkę. 
		UWAGA: Szafir jest doskonałym przewodnikiem ciepła. Unikaj dotykania wirnika palcami, ponieważ wymiana ciepła może powodować lokalne zamarzanie i rozmrażanie, które zagrażają żywotności komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar żywotności
	<ol>
		<li>Dodać 20 μl ciepłej pożywki do zamrożonych osadów komórkowych w wirniku i ponownie zawiesić komórki. Usunąć zawiesinę pipetą i wymieszać zawiesinę ze 100 μl pożywki.</li>
		<li>Usunąć 10 μl zawiesiny komórek i wymieszać z równą objętością 0,4% roztworu błękitu trypanowego (v/v). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s do 1 minuty.</li>
		<li>Mierz żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNP-Assisted+NMR+Investigation+of+Proteins+at+Endogenous+Levels+in+Cellular+Milieu%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu.</a> Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).</li>
<li>Hall, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-Enhanced+NMR+Spectroscopy+of+Biomolecules+in+Frozen+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution.</a> Science. 276 (5314), 930-932 (1997).</li>
<li>Akbey, Ü, Oschkinat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+applications+of+solid+state+MAS+DNP+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR.</a> Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).</li>
<li>Matsuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helium-cooling+and+-spinning+dynamic+nuclear+polarization+for+sensitivity-enhanced+solid-state+NMR+at+14T+and+30K%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K.</a> Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Cryopreservation+of+Human+and+other+Mammalian+Cells+at+-80+%C2%B0C+for+8+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years.</a> Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+solid+state+NMR+studies+of+fibrils+of+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid-%CE%B2+peptide%3A+perspectives+for+DNP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP.</a> Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+nuclear+polarization+enhanced+MAS+NMR+spectroscopy+for+structural+analysis+of+HIV-1+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).</li>
<li>Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targetable+Tetrazine-Based+Dynamic+Nuclear+Polarization+Agents+for+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).</li>
<li>Jaudzems, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+nuclear+polarization-enhanced+biomolecular+NMR+spectroscopy+at+high+magnetic+field+with+fast+magic-angle+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).</li>
<li>Chaytor, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+ice+recrystallization+and+optimization+of+cell+viability+after+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation.</a> Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).</li>
<li>Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+water+loss+from+cells+at+subzero+temperatures+and+the+likelihood+of+intracellular+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing.</a> The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).</li>
<li>Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Freezing+Damage+to+Living+Cells+by+Dimethyl+Sulphoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide.</a> Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).</li>
<li>Bald, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+merits+of+various+cooling+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The relative merits of various cooling methods.</a> Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).</li>
<li>Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectant-free+cryopreservation+of+mammalian+cells+by+superflash+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-contact+vitrification+of+cell-laden+droplets+based+on+cell+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17928(2015).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).</li>
<li>Ramilo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+covalent+intermediate+of+UDP-N-acetylglucosamine+enolpyruvyl+transferase+by+solution-state+and+time-resolved+solid-state+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).</li>
<li>Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+millisecond+time-resolved+solid+state+NMR+to+the+kinetics+and+mechanism+of+melittin+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717(2019).</li>
<li>Pievo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+freeze-quench+setup+for+multi-frequency+EPR+spectroscopy+of+enzymatic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions.</a> Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).</li>
<li>Cherepanov, A. V., de Vries, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsecond+freeze-hyperquenching%3A+development+of+a+new+ultrafast+micro-mixing+and+sampling+technology+and+application+to+enzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).</li>
<li>Hu, K. N., Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+solid+state+NMR+contribute+to+our+understanding+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding.</a> Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).</li>
<li>Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+a+transient+intermediate+in+a+rapid+protein+folding+process+by+solid-state+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).</li>
<li>Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of cell viability.</a> Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).</li>
<li>Frederick, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity-enhanced+NMR+reveals+alterations+in+protein+structure+by+cellular+milieus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus.</a> Cell. 163 (3), 620-628 (2015).</li>
<li>Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+DNP-supported+NMR+spectroscopy+using+Site-directed+spin+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling.</a> Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).</li>
<li>Schlagnitweit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+an+antisense+drug+complex+in+intact+human+cells+by+in-cell+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).</li>
<li>Debelouchina, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+nuclear+polarization-enhanced+solid-state+NMR+spectroscopy+of+GNNQQNY+nanocrystals+and+amyloid+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics+%3A+PCCP%22%5BJournal%5D)">Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils.</a> Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).</li>
<li>Schmidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+freezing+permits+cryoprotectant-free+EPR+doubled+electron-electron+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kriogeniczny transfer zamrożonych próbek do spektrometru NMR z powodzeniem pozwala zachować żywotność zamrożonych komórek ssaków poprzez akwizycję danych NMR. Sukces tej metodologii został wykazany w pomiarach żywotności przed i po MAS NMR. Takie podejście jest skuteczne i można je uogólnić na każdy system, w którym wahania temperatury mogą zagrozić integralności próbki. Obecnie prezentowany protokół wykonywany jest na linii komórkowej HEK 293. Ponieważ warunki kriokonserwacji dla wielu linii komórkowych ssaków są bardzo podobne, jest prawdopodobne, że opisane tutaj warunki można przełożyć na inne systemy komórkowe; Mogą jednak wymagać dalszej optymalizacji krioprotektantów, objętości próbek i szybkości zamrażania, aby osiągnąć te same wyniki.
Metodologię tę można ulepszyć, rozpakowując wirnik szybciej po eksperymencie NMR. Ten krok jest obecnie nieoptymalny, a jego wykonanie wpływa na żywotność komórek. Zanim ogniwa będą mogły zostać ponownie zawieszone w mediach, końcówka napędowa i silikonowa wtyczka muszą zostać usunięte z wirnika. Próbka rozmraża się nierównomiernie, gdy wirnik jest przytrzymywany podczas wyjmowania końcówki napędowej i korka silikonowego, dzięki czemu krótszy czas obsługi wirnika skutkuje wyższą żywotnością. Opracowanie uchwytów wirników lub innych narzędzi ułatwiających równomierne rozmrażanie i szybkie usuwanie końcówki napędowej i korka silikonowego pomogłoby w dokładniejszej ocenie żywotności po NMR.
Podejście do kriogenicznego ładowania próbek opisane w tym artykule ogranicza się do sond NMR, które obsługują wkładanie i wyrzucanie próbki z sondą umieszczoną w otworze magnesu NMR. Podczas gdy wprowadzanie i wyrzucanie próbek zewnętrznych jest standardem w komercyjnych systemach DNP, sondy niestandardowe nie zawsze mają tę opcję. Ponadto takie podejście do ładowania próbek kriogenicznych może wymagać pewnych modyfikacji dla sond NMR zbudowanych tak, aby były kompatybilne z wirnikami o różnych rozmiarach. Protokół ten został zoptymalizowany dla wirników o średnicy 3,2 mm i może wymagać modyfikacji, jeśli zewnętrzna średnica łapacza próbki przekracza wewnętrzną średnicę probówki do mikrowirówki (np. krok 3.4.2).
Dzięki zastosowaniu DNP do MAS NMR możliwe jest teraz wykrywanie białek i innych biomolekuł w endogennych stężeniach fizjologicznych 24,25,26. Otwiera to możliwość badania biomolekuł w ich naturalnym środowisku. Utrzymanie integralności i żywotności komórek przez cały czas trwania eksperymentu może mieć kluczowe znaczenie dla powiązania wyników eksperymentalnych spektroskopii ze zjawiskami biologicznymi. Niekontrolowane zamrażanie próbek zawierających oczyszczone białka lub lizaty komórkowe zazwyczaj nie wpływa negatywnie na jakość próbki 7,27, chociaż istnieją pewne przesłanki, że szybkość zamarzania może być ważną zmienną nawet w systemach oczyszczonych28. Jednak próbki komórek ssaków muszą być zamrażane w kontrolowanej szybkości, jeśli zachowanie nienaruszonej i żywotności komórek jest ważne dla interpretacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół zamrażania i przenoszenia zamrożonych próbek komórek ssaków do wstępnie schłodzonego instrumentu DNP MAS NMR, który pozwala uniknąć potencjalnie szkodliwych wahań temperatury i wspomaga pomiary na żywotnych komórkach.

Wprowadzenie dynamicznej polaryzacji jądrowej dla spektroskopii magnetycznego rezonansu magnetycznego z wirowaniem pod magicznym kątem może zwiększyć czułość MAS NMR o kilka rzędów wielkości. Umożliwiło to wykrycie biomolekuł na poziomie lub w pobliżu ich stężeń fizjologicznych. DNP może zapewnić i zapewnia czułość wymaganą do wykrywania izotopowo znakowanego białka w endogennych (~1 μM) stężeniach w złożonym środowisku biologicznym1. Ponieważ istnieją ugruntowane protokoły wprowadzania izotopowo znakowanych cząsteczek do nieznakowanych komórek ssaków bez wpływu na ich żywotność, otwiera to możliwość badania izotopowo wzbogaconych biomolekuł na ich endogennych poziomach w ich naturalnym środowisku. Co więcej, ponieważ ulepszenia DNP są bardziej wydajne w niższych temperaturach2,3,4, temperatury eksperymentalne dla DNP MAS NMR są dokładnie zgodne z tymi, które są wymagane do długotrwałego przechowywania żywotnych komórek ssaków5. Jednak konwencjonalna metoda przenoszenia próbki do spektrometru DNP MAS NMR poddaje ją wahaniom temperatury, które powodują rozerwanie komórek ssaków.
MAS NMR eksperymenty wymagają obrócenia próbki wokół magicznego kąta z częstotliwościami równymi lub większymi niż wielkość oddziaływania anizotropowego, aby można było ją uśrednić do zera, zazwyczaj co najmniej 4 kHz, a często znacznie więcej6,7,8,9. Próbki są zatem pakowane do wirników, które mają żebrowaną końcówkę, która służy do napędzania obrotu wirnika przez strumień gazu i mają znak na drugim końcu, dzięki czemu częstotliwość obrotów może być monitorowana przez obrotomierz. Przenoszenie próbki dla większości przyrządów MAS NMR odbywa się poprzez wstrzyknięcie wirnika z zewnątrz przyrządu do stojana na końcu sondy NMR za pomocą strumienia suchego powietrza lub azotu. Po tym, jak wirnik dotrze do stojana, który utrzymuje wirnik pod magicznym kątem, obrót próbki jest napędzany przez mechanizm turbiny powietrznej. Oddzielne strumienie gazu podtrzymują, napędzają i kontrolują temperaturę wirnika. Wprowadzenie wirnika do spektrometru NMR i uzyskanie stabilnego wirowania MAS wymaga precyzyjnie obrobionych końcówek napędowych oraz ścisłej kontroli temperatury i ciśnienia poszczególnych strumieni gazu. Pomimo tych wymagań technicznych, wprowadzanie i uzyskiwanie stabilnego MAS jest w dużej mierze zautomatyzowane w przypadku komercyjnych sond MAS NMR do zastosowań w temperaturze pokojowej.
Jednak sytuacja jest bardziej skomplikowana w przypadku zastosowań niskotemperaturowych. Próbki do zastosowań niskotemperaturowych są zwykle wprowadzane do spektrometru w temperaturze pokojowej i zamrażane w stojanie. W pierwszej minucie temperatura próbki szybko spada (> −100 °C/min), a temperatura układu potrzebuje kilku minut, aby się zrównoważyć. Ze względu na wzajemne oddziaływanie temperatury i ciśnienia, wprowadzanie i zbliżanie się do żądanego MAS jest często obsługiwane ręcznie w przypadku zastosowań niskotemperaturowych. Pomimo konieczności ręcznej interwencji, zamrożenie wirnika wewnątrz przyrządu jest korzystne, ponieważ minimalizuje wprowadzanie wody i kondensatu do sondy, co ma kluczowe znaczenie dla udanego wirowania. Nie tylko kondensacja i nagromadzenie lodu z wilgoci otoczenia mogą blokować przewody gazowe, ale kondensacja lub szron na samym wirniku mogą mechanicznie zapobiegać MAS. W związku z tym próbki do niskotemperaturowego MAS NMR są zwykle zamrażane wewnątrz urządzenia z szybkością przekraczającą -100 °C/min.
Komórki ssaków mogą zachować swoją integralność w cyklu zamrażania i rozmrażania, jeśli chłodzenie jest powolne5,10,11,12, z szybkością równą lub wolniejszą niż 1 °C/min. Alternatywnie, komórki zachowują również swoją integralność, jeśli szybkość chłodzenia jest bardzo szybka13,14,15, z szybkością większą niż 104 °C/min. Szybkości pośrednie do tych dwóch skrajności rozrywają i zabijają komórki ssaków z powodu tworzenia się kryształków lodu zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek, nawet w obecności środków krioprotekcyjnych16. Szybkość chłodzenia próbki dla wirnika o temperaturze pokojowej wewnątrz wstępnie schłodzonej sondy mieści się między tymi dwoma skrajnościami, dlatego w celu zbadania kriogenicznie zachowanych nienaruszonych żywotnych komórek ssaków, próbki muszą zostać zamrożone przed przeniesieniem do instrumentu i przeniesione do instrumentu bez wahań temperatury, które mogłyby uszkodzić próbkę lub nagromadzenie szronu na wirniku, które mogłoby zapobiec obracaniu się wirnika. Protokół opisuje metodę wprowadzania bezmrozowego, wstępnie schłodzonego wirnika do kriogenicznego systemu MAS NMR w celu badania kriogenicznie zachowanych nienaruszonych próbek żywych komórek ssaków. Opisany tutaj transfer próbek kriogenicznych został opracowany w celu scharakteryzowania NMR żywotnych nienaruszonych komórek. Ma jednak zastosowanie do każdego systemu, w którym wahania temperatury mogą zagrozić integralności próbki. Obejmuje to wiele różnych złożonych systemów, takich jak reakcje z chłodzeniem w zamrażaniu do chemicznej i strukturalnej charakterystyki uwięzionych produktów pośrednich reakcji17,18, enzymology19,20 lub składanie białek21,22.

<table><tbody><tr><td>0,4% Barwienie błękitem trypanowym</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm</td><td>Thomas Scientific 430167</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 150 mm</td><td>Nunc</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>Rotor szafirowy 3,2 mm</td><td>Kleszcze kątowe Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>45 & deg.</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-859</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td></td><td></td>C010P005</tr><tr><td>Czarno-srebrny marker</td><td>Narzędzie do usuwania Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cap</td><td>Bruker</td><td>HZ16913</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy hodowli komórkowej</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka ceramiczna</td><td>Cortecnet</td><td>HZ12372</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning/ Biocision</td><td>UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komory do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10288</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess II</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne</td><td>Nalgene</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>d8-glicerol</td><td>Aldrich</td><td>447498</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru, 99,8 % atom D</td><td>Aldrich</td><td>756822-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>System DNP NMR z żyrotronem z dopasowaną częstotliwością</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foam dewar</td><td>Spearlab</td><td>FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimwipes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do pakowania</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sproszkowany PBS</td><td>VWR</td><td>VWRRV0780</td><td></td></tr><tr><td>Protonowany PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Wtyczka silikonowa</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>Standard Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>do naczyń</tr><tr><td>Tryp-L</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td></td></tr></tbody></table>

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamiczna polaryzacja jądrowa (DNP) może znacznie zwiększyć czułość spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS). Te przyrosty czułości rosną wraz ze spadkiem temperatury i są wystarczająco duże, aby umożliwić badanie cząsteczek w bardzo niskich stężeniach w temperaturach roboczych (~100 K) większości komercyjnych spektrometrów NMR wyposażonych w DNP. Prowadzi to do możliwości zaobserwowania w komórkach kriokonserwowanych komórek makrocząsteczek na ich endogennych poziomach w ich naturalnym środowisku. Jednak szybkości zamrażania wymagane do kriokonserwacji komórkowej są przekroczone podczas typowego obchodzenia się z próbkami dla DNP MAS NMR, co powoduje utratę integralności komórkowej i żywotności. W artykule opisano szczegółowy protokół przygotowania i kriogenicznego transferu zamrożonej próbki komórek ssaków do spektrometru MAS NMR.

Kriogeniczne wprowadzanie zamrożonych wcześniej próbek komórek ssaków do spektrometru NMR pozwala zachować ich żywotność przez cały czas trwania eksperymentu NMR. Schematy kriogenicznego przenoszenia zamrożonej próbki do wcześniejszy schłodzonej sondy NMR przedstawiono na Rysunku 1. Żywotność i integralność komórek można ocenić za pomocą różnych metod. W niniejszej pracy zastosowano standardowy pomiar integralności błony oparty na barwniku, który jest spójny z innymi metodami23. Komórki nienaruszone są nieprzepuszczalne dla błękitu trypanu, natomiast komórki z naruszoną integralnością błony są przepuszczalne. Liczbę komórek przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych dla błękitu trypanu można szybko ocenić za pomocą automatycznego licznika komórek. Stosując opisany tutaj protokół, przepuszczalność błękitu trypanu w komórkach ssaków po MAS NMR (tj. w punkcie 5.2.3) jest podobna do przepuszczalności błękitu trypanu w komórkach ssaków przed jakąkolwiek zmianą temperatury (tj. w punkcie 2.1.3). Jednakże, jeśli komórki są zamrażane powoli, a następnie ogrzewane do temperatury pokojowej przed wprowadzeniem (tj. zgodnie z protokołem do punktu 3, przed ogrzaniem rotora do temperatury pokojowej i wprowadzeniem go do schłodzonej sondy), żywotność komórkowa oceniana za pomocą błękitu trypanu spada do poziomu poniżej 10% komórek (Rysunek 2). Zatem zamrażanie komórek wewnątrz spektrometru prowadzi do utraty integralności błon komórkowych, podczas gdy kriogeniczne wprowadzanie zamrożonych próbek komórek ssaków pozwala zachować żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu NMR.
<img alt="Proces kriokonserwacji z wykorzystaniem ciekłego azotu i probówek do mikrocentryfugi; przewodnik krok po kroku dotyczący obsługi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat kriogenicznego przenoszenia zamrożonej próbki do wstępnie schłodzonej głowicy NMR. (AZbliżyć się do powierzchni ciekłego azotu i odkręcić korek probówki kriogenicznej.B) Wsuń wirnik do kąpieli z ciekłym azotem. (C) Za pomocą pęsety zanurzyć probówkę do mikrocentryfugi i przytrzymać ją w tej pozycji do całkowitego ochłodzenia. (D) Włożyć wirnik do mikrowirówki tak, aby końcówka napędowa była skierowana w stronę dna probówki. Docisnąć wirnik pęsetą, zamiast chwytać go nią. (E) Przetrzymuj probówkę do mikrocentryfugi tuż poniżej powierzchni kąpieli w ciekłym azocie i dokonaj wizualnej inspekcji rotora, aby upewnić się, że jest on wolny od szronu i prawidłowo oznakowany. (F) Trzymać chwytak do próbek pod kątem nad powierzchnią. (GWyjmij uchwyt na próbkę i probówkę z ciekłego azotu natychmiast po umieszczeniu uchwytu wewnątrz probówki do mikrocentryfugi.H) Wstrząśnij uchwytem próbek, jeśli rotor zaciął się na krawędzi. (I) Zdejmij pusty chwytak próbek z sondy i połóż go na podłożu. (J) Wyjąć probówkę do mikrocentryfugi z uchwytem na próbkę wraz z rotorem, włożyć i dokręcić uchwyt na próbkę w sondzie, a następnie nacisnąć przycisk „INSERT” na konsoli sterującej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres żywotności; warunki wkładki dla MAS NMR, cryo i RT; porównanie metod; analiza wyników eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Kriogeniczne wprowadzanie wcześniej zamrożonej próbki komórek ssaków pozwala na uzyskanie pomiarów nienaruszenia komórek podobnych do tych otrzymywanych z próbek komórek ssaków, które nigdy nie były mrożone. Procent komórek nieprzepuszczalnych dla błękitu trypanu w przypadku próbek, które nigdy nie były mrożone (np. krok 2.1.3), jest zbliżony do wartości dla komórek z próbek po badaniu MAS NMR (np. krok 5.2.3 przy MAS 12 kHz). Komórki mrożone powoli (np. krok 3), które zostały ogrzane do temperatury pokojowej przed wprowadzeniem do instrumentu NMR schłodzonego uprzednio do 10 K, wykazały znacznie niższy procent nienaruszonych komórek po badaniu MAS NMR z MAS 12 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Czułość spektroskopii MAS NMR wspomaganej DNP pozwala nam scharakteryzować białka wewnątrz nienaruszonych komórek w ich endogennym stężeniu. Ta aplikacja wymaga starannego obchodzenia się z próbką. Niektóre morfologie są zachowane, a komórki są żywotne, gdy są kriogenicznie przenoszone do spektrometru przy użyciu tego protokołu.Wprowadzenie zimnego wirnika może powodować gromadzenie się wilgoci i lodu, co może mechanicznie uniemożliwić obracanie się próbki. Demonstracja ta posłuży do przeprowadzenia eksperymentów w celu przeprowadzenia transferu kriogenicznego z pewnością siebie. Na początek umieść poduszkę wykonaną z kawałka chusteczki lub ręcznika papierowego pod pokrywką i na dnie fiolki kriogenicznej.Umieść rotor szafirowy o średnicy 3,2 milimetra w fiolce kriogenicznej wyściełanej bibułką, tak aby zaznaczony koniec był skierowany do dna fiolki. Powoli zamrażać rotor, umieszczając fiolkę w pojemniku chłodzącym o kontrolowanej szybkości i umieszczając pojemnik w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza na co najmniej trzy godziny. Przenieść fiolkę kriogeniczną zawierającą zamrożony wirnik do małej kolby próżniowej wypełnionej ciekłym azotem.Użyć kolby próżniowej, aby przenieść próbkę do spektrometru. Napełnij suchą, izolowaną termicznie piankową kolbę próżniową z szerokimi ustami w proporcjach od 500 mililitrów do jednego litra ciekłego azotu. Wyjmij fiolkę kriogeniczną z kolby transferowej i trzymaj ją tuż nad powierzchnią ciekłego azotu, aby chronić ją przed atmosferą.Trzymając fiolkę kriogeniczną z otworem fiolki skierowanym lekko w dół, odkręć nakrętkę i pozwól rotorowi wsunąć się do kąpieli ciekłego azotu. Wstępnie schłodź 1,5-mililitrową probówkę mikrowirówki, zanurzając ją w ciekłym azocie. Pod powierzchnią kąpieli z ciekłym azotem za pomocą pęsety przenieś wirnik do probówki mikrowirówki z końcówką napędową skierowaną do dna probówki, a oznaczeniami skierowanymi w stronę otworu.Użyj pęsety, aby przytrzymać rurkę zawierającą wirnik pod ciekłym azotem za szyjkę. Za pomocą drugiej pęsety przytrzymaj łapacz próbek NMR nad powierzchnią ciekłego azotu nachyloną pod ostrym kątem w stosunku do probówki mikrowirówki. Aby przenieść wirnik z łapacza próbek NMR do spektrometru NMR, należy przełączyć komorę kriogeniczną w tryb wysuwania, naciskając przycisk wysuwania.Włóż otwarty koniec łapacza próbek NMR do probówki mikrowirówki, pozostając jeszcze pod powierzchnią ciekłego azotu. Podnieś zarówno probówkę mikrowirówki, jak i łapacz próbek NMR, aby wirnik mógł wpaść do łapacza próbek. Potrząśnij chwytaczem próbek i rurką, jeśli wirnik utknie na krawędzi.Pozostaw pustą probówkę mikrowirówki na górze łapacza próbek NMR, aby osłonić wirnik przed powietrzem. Wyjmij drugi pusty łapacz próbek z sondy i połóż go na podłodze. Przenieś łapacz próbek NMR zawierający wirnik do drugiej ręki.Następnie wyjmij probówkę mikrowirówki i natychmiast włóż ją do sondy. Zasygnalizuj osobie obsługującej szafę kriogeniczną, aby nacisnęła przycisk zatrzymania, wysuń i włoż. Odwiruj próbkę do żądanej prędkości wirowania, regulując łożysko i ciśnienie przepływu napędu.Wlać 500 mililitrów na jeden litr ciekłego azotu do kolby próżniowej z pianką o szerokich ustach i umieścić kąpiel pod spektrometrem. Zanurzyć pustą fiolkę kriogeniczną zawierającą kawałek bibułki w kąpieli z ciekłym azotem. Zmniejsz prędkość wirowania do zera kiloherców, zmniejszając przepływ gazu napędowego i łożyskowego, a następnie wyrzuć wirnik, przełączając się w tryb wyrzutu.Trzymając włączony tryb wyrzutu, wyjmij łapacz próbki z sondy i wrzuć wirnik bezpośrednio do kolby piankowej o szerokich otworach zawierającej ciekły azot. Za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety przenieś wirnik do wstępnie schłodzonej fiolki kriogenicznej pod powierzchnią ciekłego azotu. Wstępnie schłodzić nakrętkę fiolki kriogenicznej, zanurzając ją w ciekłym azocie.Wyjąć fiolkę zawierającą rotor i ciekły azot z kąpieli i zakryć probówkę wstępnie schłodzoną nakrętką. Ponownie zanurz fiolkę kriogeniczną w ciekłym azocie. Próbkę można przenieść do długoterminowego przechowywania ciekłego azotu lub natychmiast rozpakować w celu dalszej analizy.Kriogeniczne wprowadzanie wstępnie zamrożonych próbek komórek ssaków do spektrometru NMR potwierdza żywotność przez cały czas trwania eksperymentu NMR. Korzystając z tego protokołu, przepuszczalność błękitu trypanowego komórek ssaków po MAS NMR jest podobna do przepuszczalności komórek nienarażonych na żadną zmianę temperatury. Jeśli komórki są powoli zamrażane, a następnie podgrzewane do temperatury pokojowej przed włożeniem, żywotność komórek spada do mniej niż 10%Tymczasem kriogeniczne wprowadzanie zamrożonych próbek komórek ssaków wspiera żywotność komórek przez cały eksperyment NMR.Podczas próby wykonania protokołu poproś o pomoc w naciśnięciu przycisku wyrzutu i odkręceniu próbki, aby próbka mogła zostać wprowadzona do sondy przed jej rozgrzaniem, upewniając się, że do sondy nie zostanie wprowadzona wilgoć, mając pewność, że spektrometr będzie zimny przez wiele tygodni. Protokół ten ma zastosowanie do każdego systemu, w którym wahania temperatury mogą zagrozić integralności próbki, takiego jak reakcje z zamrożeniem lub charakterystyka uwięzionych produktów pośrednich reakcji i enzymologia i fałdowanie białek.

cryogenic-sample-loading-into-magic-angle-spinning-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania biologicznych próbek kriogenicznych do eksperymentów z synchrotronową spektroskopią absorpcyjną promieniowania rentgenowskiego. Opisujemy wszystkie kroki wymagane do optymalizacji przygotowania próbek i kriokonserwacji wraz z przykładami protokołu z komórkami nowotworowymi i fitoplanktonem. Metoda ta zapewnia uniwersalny standard krioprzygotowania próbek.

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

Struktury molekularne i dynamika ciał stałych, cieczy, gazów i mieszanin są niezwykle interesujące dla różnych dziedzin nauki. Wysokotemperaturowy, wysokociśnieniowy MAS NMR in situ umożliwia detekcję środowiska chemicznego składników w układach fazy mieszanej w ściśle kontrolowanym środowisku chemicznym.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego in situ z magicznym kątem wirowania

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Poznaj metodę kriogenicznego transferu próbek do spektrometru MAS NMR z zachowaniem żywotności komórek ssaków. Protokół zapobiega wilgoci i zapewnia niezawodność badań biologicznych.

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek (Wideo) | JoVE Journal

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Przeglądaj więcej filmów