Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Metoda ta umożliwia obrazowanie kriogeniczne w super rozdzielczości na całych komórkach biologicznych w celu precyzyjnej identyfikacji struktur komórkowych. Może być również używany w połączeniu z innymi modalnościami w ramach przepływu pracy obrazowania korelacyjnego. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że obrazowanie w super rozdzielczości można szybko wykonać w warunkach kriogenicznych przy użyciu konwencjonalnych fluoroforów i stosunkowo niskich dawek światła.

CyroSIM to potężne narzędzie, które zapewnia wgląd w zrozumienie dynamiki ultrastruktury komórkowej w odpowiedzi na sygnały wewnętrzne lub zewnętrzne. Jego zastosowanie obejmuje produkcję i wprowadzanie szczepionek, kontrolę jakości, nadzór po wprowadzeniu do obrotu, inżynierię i optymalizację przeciwciał, a także charakterystykę nanocząstek. Manewrowanie próbkami w krioetapie wymaga praktyki, aby zapewnić bezpieczeństwo sieci.

Najlepiej jest również zapoznać się z elementami sterującymi w oknie Kokpit przed zebraniem danych. Aby rozpocząć, zdejmij pokrywkę z zewnętrznego dewara kriostolika i wlej przefiltrowany ciekły azot, aż będzie wypełniony w około jednej czwartej. Poczekaj, aż początkowe gotowanie ustąpi, zanim nalejesz więcej i napełnij naczynie do około dwóch trzecich.

Ostrożnie załóż pokrywę, kierując dyszę z dala od obsługi, gdy ciekły azot się wygotuje. Gdy ciekły azot przestanie wydostawać się z wylotu, umieść rurę wylotową nad stolikiem Dewar na krio-stage. Podłącz źródło zasilania, podłącz USB i podłącz zewnętrzny Dewar do stage.

Po dostarczeniu ciekłego azotu naciśnij przycisk zwalniający na kriostoliku, aby umożliwić mu wejście do komory próbki i odczekaj od 30 do 45 minut, aż system ostygnie i ustabilizuje się przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. Użyj klucza imbusowego na narzędziu do kasety, aby otworzyć dwie płytki kasety do przenoszenia próbek. Otwórz płyty na tyle szeroko, aby upuścić siatkę między dwiema płytami, ale nie otwieraj ich do pozycji maksymalnej.

Użyj długich kleszczy, aby podnieść pojemnik z siatką próbki z ciekłego azotu. Obróć go tak, aby wycięcie zrównało się z pozycją przechowywania wewnątrz stolika i umieść go na stoliku. Użyj odpowiedniego urządzenia, aby otworzyć pokrywę schowka do właściwej pozycji próbki.

Za pomocą odwróconych kleszczyków wyjmij siatkę TEM z uchwytu próbki, zanurz ją w ciekłym azocie, upewniając się, że strona z folią węglową jest umieszczona tak, aby ostatecznie była skierowana w stronę celu na mostku próbki i upuść ją na miejsce w kasecie do przenoszenia próbki. Zamknij kasetę z próbką za pomocą klucza imbusowego na kasecie. Użyj punktu magnesu na narzędziu kasetowym, aby podnieść i zamontować wkład zawierający siatkę na mostku próbki.

Trzymaj go zanurzony lub blisko ciekłego azotu i we właściwej orientacji. Umieść kasetę płasko w kołkach pozycjonujących mostka i delikatnie ją popchnij, aby upewnić się, że jest zamocowana. Zamknij i wyjmij schowek wraz z pozostałymi próbkami.

Przesuń otwór pokrywy kriostolika do pozycji obrazowania i wyłącz oświetlenie komory próbki. Przesuń stolik w kierunku optyki, aby ustawić go pod soczewką obiektywu, a następnie delikatnie upuść obiektyw na miejsce za pomocą dźwigni, upewniając się, że spoczywa w pokrywie kriostolika, ale go nie dotyka. Zakryj scenę i optykę nieprzezroczystą czarną kurtyną, a następnie uruchom oprogramowanie sterujące Cockpit na komputerze cryoSIM. Kliknij przycisk trybu odczytu dla każdej kamery i ustaw go na CONV3 megaherców.

Sprawdź, czy temperatura każdej kamery wynosi 80 stopni Celsjusza i czy wentylator kamery jest wyłączony. Włącz odbitą kamerę, pod światłem, wybierz otoczenie i pod linkam, sprawdź kondensator, a następnie kliknij przycisk trybu wideo. W oknie Widok mozaiki pomniejsz widok, aby zobaczyć kontur siatki.

Kliknij Znajdź scenę, jeśli nie jest widoczna, i wyśrodkuj siatkę, klikając dwukrotnie lewym przyciskiem myszy w środku koła. Użyj w górę i w dół, aby ustawić ostrość próbki, aż siatka podtrzymująca, folia lub inna istotna funkcja będzie ostra. Użyj dziewięciu i trzech na klawiaturze numerycznej, aby zmienić krok Z.

Po wyśrodkowaniu stołu montażowego wyłącz tryb wideo. Zbierz mozaikę światła widzialnego, klikając Uruchom mozaikę w widoku mozaiki, aby utworzyć kafelki obrazów światła widzialnego, które spiralnie rozchodzą się na zewnątrz od środka. Zapisz widok, klikając Zapisz mozaikę.

Sprawdź mozaikę jasnego pola wraz z poprzednimi obrazami mapy fluorescencji, wyłączając światło otoczenia i kondensator, a także tryb wideo, a następnie włącz wymagany laser wzbudzający i wybierz odpowiednią kamerę i filtr, początkowo o mocy 50 miliwatów, co daje czas naświetlania 50 milisekund. Naciśnij zero, aby przyciągnąć obraz i gwiazdkę, aby uzyskać automatyczny kontrast. Możesz też ręcznie dostosować kontrast za pomocą suwaka u dołu obrazu.

Po znalezieniu biologicznie interesujących komórek o odpowiedniej fluorescencji zaznacz ich położenie za pomocą przycisku oznaczania miejsca w widoku mozaiki. Kontynuuj oznaczanie wszystkich potencjalnych witryn przed rozpoczęciem pozyskiwania obrazu. Ponownie zapisz mozaikę z zaznaczonymi witrynami, klikając Zapisz witryny do pliku.

Aby zszyć obraz mozaiki za pomocą oprogramowania stitchEm, przeciągnij i upuść plik mozaiki tekstowej do pliku stitchEm z rozszerzeniem BAT i zapisz połączony obraz TIF płytek mozaiki w tym samym folderze. Aby zapisać obraz z zaznaczonymi witrynami, przeciągnij i upuść jednocześnie plik tekstowy mozaiki i plik tekstowy znaczników na ikonę. Ustaw czas ekspozycji lasera na podstawie zliczeń i zakresu dynamicznego na obrazie fluorescencyjnym u dołu okna view kamery.

Wybierz filtr, który chcesz zastosować, i zoptymalizuj ustawienia dla każdej długości fali światła wzbudzenia, które ma być użyte, włączając każdy laser osobno. Kliknij obie kamery, aby je włączyć. Wróć do jednego z zaznaczonych miejsc i ponownie skup się na żądanej głębokości.

Po ustawieniu ostrości w obszarze zainteresowania, przesuń się poza ostrość za pomocą strzałki w górę w oknie XY na scenie makro, aby wybrać wysokość stosu Z, który chcesz uzyskać, i kliknij Zapisz górę. Przesuń się poza ostrość za pomocą strzałki w dół, kliknij Zapisz na dole, a następnie Przejdź do środka, sprawdź, czy obraz jest nadal ostry. W oknie Kokpit wybierz opcję Eksperyment w jednym miejscu.

Z listy rozwijanej wybierz opcję Oświetlenie strukturalne. Zmień wysokość stosu tak, aby była równa wysokości Z plus jeden mikrometr. Wprowadź czasy naświetlania w milisekundach dla laserów 405 i 488 nanometrów w górnym rzędzie dla odbitej kamery oraz czasy naświetlania dla laserów 561 i 647 nanometrów w dolnym wierszu dla transmitowanej kamery.

Wprowadź nazwę pliku i kliknij aktualizuj, aby utworzyć nowy plik zawierający datę i godzinę bez zastępowania poprzednich plików, a następnie kliknij Start. Jeśli ciekły azot Dewara ponownie napełni kriostolik podczas akwizycji obrazu, przerwij proces, klikając przycisk ABORT w oprogramowaniu Cockpit. W każdej pozycji zbierz stos Z za pomocą światła widzialnego, wyłączając lasery i włączając światło otoczenia i kondensator.

W obszarze Eksperyment w jednym miejscu wybierz opcję Z-stack (Stos osi) i ustaw światło otoczenia na 20 milisekund ekspozycji, zachowując wysokość Z. Powtórz ten proces dla wszystkich oznaczonych witryn. Po zakończeniu obrazowania odłącz stolik i usuń wszystkie próbki.

Wyłącz oświetlenie komory na próbkę. Odłącz zewnętrzny Dewar i zdekantuj pozostały ciekły azot do innego pojemnika kompatybilnego z kriowizją, umożliwiając Dewarowi bezpieczny powrót do normalnej temperatury. Poczekaj, aż opcja wypalenia wyświetlacza krio-stage stanie się dostępna, gdy w stoliku Dewara nie pozostanie już ciekły azot.

Naciśnij przycisk pieczenia, aby przejść do trybu grzania. Umieść zatyczkę pokrywy na kriostage. Rozdzielczość w cryoSIM jest znacznie wyższa niż w standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Mapa fluorescencji z konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego może być wykorzystana do zlokalizowania obszarów zainteresowania do obrazowania, a odpowiedni obraz cryoSIM można uzyskać z miejsca na siatce. Próbka zawierająca komórki U2OS została wybarwiona mieszaniną zielonego barwnika cytoszkieletu mikrotubul i czerwonego barwnika mitochondriów, co spowodowało zabarwienie składnika mikrotubul cytoszkieletu i mitochondriów. Późniejsze obrazowanie wykazało lokalizację mitochondriów w komórce, a także rozmieszczenie mikrotubul, podkreślając strukturę strukturalną, którą zapewniają komórce i montaż cytoszkieletu wokół organelli.

Proces rekonstrukcji karty SIM może generować artefakty, które można zidentyfikować za pomocą SIMCheck, darmowej wtyczki imageJ. Mapa kontrastu modulacji wygenerowana za pomocą SIMCheck pokazuje obszary o niskim kontraście modulacji w obszarze jądra, co wskazuje, że obszar ten będzie bardziej podatny na artefakty rekonstrukcyjne. Biała strzałka wskazuje artefakt rekonstrukcji.

Podczas korzystania z tego protokołu upewnij się, że próbka pozostaje zanurzona lub zbliżona do ciekłego azotu przez cały czas, aby uniknąć dewitryfikacji. Należy również zwrócić uwagę na czasy naświetlania i zliczenia w zakresie dynamicznym, ponieważ wpływa to na jakość danych i pozwala uniknąć uszkodzenia próbki przez laser. Po obrazowaniu kriogenicznym te same próbki mogą być obrazowane za pomocą innych modalności, takich jak kriomiękka tomografia rentgenowska, którą mamy tutaj, na linii badawczej B24.

Łącząc obrazy cryoSIM z obrazami zawierającymi informacje strukturalne o komórce, możemy odpowiedzieć na kluczowe dodatkowe pytania dotyczące ultrastruktury i funkcji komórki.