Name: Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj przygotowanie próbek biologicznych do spektroskopii absorpcyjnej rentgenowskiej w temperaturze kriogenicznej. Ta metoda umożliwia zachowanie integralności chemicznej próbek komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wkład finansowy w rozwój linii badawczej przez CEMHTI (Orlean, Francja, ANR-13-BS08-0012-01) i Labex OSUG@2020 (Grenoble, Francja, ANR-10-LABX-0056). Projekt FAME-UHD jest wspierany finansowo przez francuską firmę EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), konsorcjum CEA-CNRS CRG oraz instytut INSU CNRS. Jesteśmy wdzięczni za wszystkie wkłady wniesione podczas eksperymentów, a szczególnie wszystkim osobom pracującym przy BM30B i BM16. Autorzy dziękują Europejskiemu Ośrodkowi Promieniowania Synchrotronowego za zapewnienie czasu wiązki promieniowania synchrotronowego. Dziękujemy również projektowi PHYTOMET ANR za wsparcie finansowe (ANR-16-CE01-0008) oraz projektowi SEDMAC za wsparcie finansowe (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

<ol><li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104(2012).</li>
<li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy%3A+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Quality%22%5BJournal%5D)">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li>
<li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li>
<li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAME%3A+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental%2C+material+and+biological+interests%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+Scripta%22%5BJournal%5D)">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li>
<li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li>
<li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+in+Agronomy%22%5BJournal%5D)">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li>
<li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li>
<li>Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018).</li>
<li>Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry">http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry</a> (2019).</li>
<li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells%3A+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li>
<li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae%3A+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li>
<li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li>
<li>Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018).</li>
<li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li>
<li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATHENA%2C+ARTEMIS%2C+HEPHAESTUS%3A+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li>
<li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIXpack%3A+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+Scripta%22%5BJournal%5D)">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011(2005).</li>
<li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIPER+for+Windows%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li>
<li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+of+XAFS%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Mineralogy+%26+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li>
<li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+%28XANES%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Mineralogy+%26+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li>
<li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Atomic+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li>
<li>Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019).</li>
<li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół ten został wykorzystany do badania formy chemicznej selenu i żelaza w próbkach biologicznych za pomocą spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego. Koncentruje się na krioprzygotowaniu i przechowywaniu próbek biologicznych i związków referencyjnych, a także na pomiarach HERFD-XAS.
Krioprzygotowanie i przechowywanie Kriopreparacja granulek próbek biologicznych luzem pozwala na zachowanie integralności chemicznej gatunków obecnych w próbkach. Ma to za...

Badanie komórkowych biotransformacji niezbędnych lub toksycznych pierwiastków wymaga technik specjacji o wysokiej czułości i powinno zminimalizować etapy przygotowania próbek, które często są podatne na modyfikację związków chemicznych.
Pierwiastki fizjologiczne, takie jak selen i żelazo, są szczególnie trudne do wyspecyfikowania ze względu na ich złożoną chemię, różne stabilności gatunków selenu lub żelaza oraz ich niskie stężenie w zakresie ppm (mg/kg) lub nawet poniżej ppm. W związku z tym badanie specjacji tych pierwiastków przez XAS może być niezwykle trudne. Synchrotron XAS, a w szczególności XAS (HERFD-XAS), który pozwala na bardzo niski stosunek sygnału do tła><, jest dostępny w źródłach synchrotronowych do specyfikacji wysoce rozcieńczonych pierwiastków w złożonych matrycach biologicznych2,3. Konwencjonalne pomiary fluorescencji-XAS mogą być wykonywane przy użyciu detektora półprzewodnikowego o wysokiej rozdzielczości (SSD) o szerokości pasma energii ~150–250 eV, na linii badawczej CRG-FAME w Europejskim Zakładzie Promieniowania Synchrotronowego (ESRF)4, natomiast pomiary HERFD-XAS wymagają spektrometru analizatora kryształów (CAS), o szerokości pasma energii ~1–3 eV, na linii badawczej CRG-FAME-UHD na ESRF2. Fotony fluorescencyjne są rozróżniane pod względem energii odpowiednio za pomocą procesów elektronicznych lub optycznych.
Przygotowanie próbki jest niezbędne do zachowania struktur i utrzymania integralności chemicznej składu, umożliwiając tym samym analizę zbliżoną do naturalnego stanu biologicznego5. Co więcej, analizy przeprowadzone w temperaturach kriogenicznych tak niskich jak 10 K przy użyciu chłodzenia kriogenicznego ciekłym helem (LN2) pozwalają na spowolnienie uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i zachowanie specjacji pierwiastkowej dla XAS. Chociaż niektóre przeglądy technik XAS stosowanych do próbek biologicznych wskazują na konieczność przygotowania i analizy próbek w warunkach kriogenicznych (np. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), żaden z nich nie opisuje jasno powiązanego szczegółowego protokołu. W niniejszej publikacji opisano metodę kriopreparacji komórek nowotworowych i mikroorganizmów planktonowych dla specjacji HERFD-XAS Se8 i Fe9 w temperaturze kriogenicznej.
Dobra praktyka dotycząca przygotowania próbek i środowiska podczas najnowocześniejszych pomiarów spektroskopii XAS wymaga 1) konfiguracji; 2) procedurę analizy, która w jak największym stopniu ogranicza skutki uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem; oraz 3) próbkę (lub odniesienie do związku modelowego) możliwie najbardziej jednorodną w odniesieniu do wielkości wiązki fotonów promieniowania rentgenowskiego. Pierwsza pozycja jest brana pod uwagę, wykonując akwizycję w niskiej temperaturze, przy użyciu kriostatu z ciekłym helem. Drugi element jest wykonywany poprzez wykonanie każdej akwizycji na świeżym obszarze próbki, przesuwając ją względem wiązki. Wreszcie, biorąc pod uwagę trzeci warunek, próbki (granulki) i odniesienia (proszki) są kondycjonowane w sprasowanych granulkach luzem w celu maksymalnego ograniczenia porowatości i niejednorodności oraz uniknięcia chropowatości w odniesieniu do wielkości wiązki na powierzchni próbki badanej promieniami rentgenowskimi. Wyjaśniamy, w jaki sposób protokół odnosi się do wszystkich tych punktów.
Użyliśmy ludzkiej linii komórkowej prostaty PC-3 (wysoki potencjał przerzutowy) i linii komórek jajnika OVCAR-3 (która stanowi do 70% wszystkich przypadków raka jajnika) do zbadania właściwości antyproliferacyjnych nanocząsteczek selenu (Se-NPs) w stosunku do komórek rakowych oraz okrzemki Phaeodactylum tricornutum jako gatunku modelowego do zbadania sekwestracji żelaza w fitoplanktonie.

<table><tbody><tr><td>Azotan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3795</td><td>NH4NO3, 2,66 mg/L miliQ wody</td></tr><tr><td>Komora beztlenowa</td><td>Coy Laboratory, USA</td><td></td><td>wyposażone w monitor beztlenowy (CAM-12)</td></tr><tr><td>Zapas antybiotyku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166 dla ampicyliny, S9137 dla siarczanu streptomycyny</td><td>1 ml/L wody miliQ (ampicylina sodowa i siarczan streptomycyny, 100 mg/ml)</td></tr><tr><td>Azotek boru w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255475</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> zliczania komórek <td>Neubauer lub Malassez</td></tr><tr><td>Skrobak</td><td></td><td></td><td></td>do komórek</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td>Bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td></td><td></td><td>0,5 ml i 1,5 ml</td></tr><tr><td>Falcon</td><td></td><td></td><td>15 ml i 50 ml</td></tr><tr><td>cytrynian żelaza Fe/cytrynian = 1/20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388</td><td>wodny roztwór FeCl3 50 mM i Na-cytrynianu 1M pH 6,5</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu GIBCO</td><td>A31604-02</td><td>Performance Plus, certyfikowany format One Shot, pochodzenie z USA</td></tr><tr><td>Kolby</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503</td><td>TPP 150 cm2 powierzchnia</td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td><td>Sanyo</td><td>Sanyo MLR-352</td><td>przy 20 &deg; C i w 12:12 jasnym (3,000 luksów) ciemnym</td></tr><tr><td>reżimie Bufor HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>1 g/L miliQ wody HEPES</td></tr><tr><td>Wysokiej jakości surowica, OVCAR-3</td><td>ATCC, Rockville, MD</td><td>HTB-161</td><td>Temperatura przechowywania: temperatura par ciekłego azotu</td></tr><tr><td>Inkubator Inkubator</td><td></td><td></td><td>przy 37&deg; C, nawilżona atmosfera z 5% CO2</td></tr><tr><td>Roztwór insuliny z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td>10 mg / ml insuliny w 25 mM HEPES, pH 8,2, Bioodczynnik, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Ręczna prasa hydrauliczna</td><td>Specac, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okrzemki morskie Phaeodactylum tricornutum</td><td>Kolekcja kultur Roscoff</td><td>RCC69</td><td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td></tr><tr><td>Kwas morpholinepropanosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td>MOPS, 250 mg/L miliQ wody (pH 7,3)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>optyczny</tr><tr><td>PC-3</td><td>ECCAC, Salisbury, Wielka Brytania</td><td>90112714</td><td>Temperatura przechowywania: temperatura pary ciekłego azotu</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Stabilizowany roztworem, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny/ml, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pipeta-chłopiec</td><td></td><td></td><td>25 mL, 10 ml i 5 ml sterylne pipety plastikowe Produkty hodowli</td></tr><tr><td>planktonu, podłoże Mf: Sole morskie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883</td><td>40g/L miliQ wody. Skład: Cl- 19,29 g, Na+ 10,78 g, SO42- 2,66 g, Mg2+ 1,32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8,8 mg, BO2- 5,6 mg, Br- 56 mg, I- 0,24 mg, Li+ 0,3 mg, F- 1 mg</td></tr><tr><td>Pęseta plastikowa</td><td>Oxford Instrument</td><td>AGT 5230</td><td></td></tr><tr><td>RPMI MEDIUM 1640 (modyfikacja ATCC)</td><td>GIBCO</td><td>A10491-01</td><td>Roztwór zawierający 4,5 g/l D-glukozy, 1,5 g/l wodorowęglanu sodu, 110 mg/l (1 mM) pirogronianu sodu, 2,388 g/l (10 mM) buforu HEPES i 300 mg/l L-glutaminy do użytku badawczego</td></tr><tr><td>Nanocząstki selenu (Se-NPs), powlekane BSA, 2 mg/ml</td><td>NANOCS Company, USA</td><td>Se50-BS-1</td><td>BSA stabilizowany roztwór Se-NPs. Średni rozmiar około 30 nm. Przechowywany w 4&deg; C w ciemności, chroniony przed światłem.</td></tr><tr><td>Nanocząstki selenu (Se-NPs), powlekane chitozanem, 2 mg/ml</td><td>NANOCS Company, USA</td><td>11. Se50-CS-1</td><td>Stabilizowany chitozanem roztwór Se-NPs. Średni rozmiar około 30 nm. Przechowywany w 4&deg; C w ciemności, chroniony przed światłem.</td></tr><tr><td>Metakrzemian sodu pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71746</td><td>Na2SiO3,5H2O, 22,8 mg/L wody miliQ</td></tr><tr><td>Azotan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5022</td><td>NaNO3, 75 mg/L wody miliQ</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>NaH2PO4, 15 mg/L wody miliQ</td></tr><tr><td>kolby</td><td></td><td></td><td></td>T-75</tr><tr><td>Kaptur</td><td></td><td></td> <td>do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Zapas metali śladowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td><td>1 ml/L wody miliQ (MnCl2,4H2O 200 mg/L, ZnSO4,7H2O 40 mg/L, Na2MoO4,2H2O 20mg/L, CoCl2,6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>GIBCO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Zapas witamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270 dla tiaminy, B4639 dla biotyny, V6629 dla B12</td><td>1 ml/L wody miliQ (tiamina HCl 20 mg/L, biotyna 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna 37&deg; Z</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Badanie pierwiastków za pomocą spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego (XAS) jest szczególnie interesujące podczas badania roli metali w systemach biologicznych. Przygotowanie próbek jest kluczową i często złożoną procedurą, szczególnie w przypadku próbek biologicznych. Chociaż techniki specjacji rentgenowskiej są szeroko stosowane, nie opublikowano jeszcze szczegółowego protokołu dla użytkowników tej techniki. Ponadto modyfikacja stanu chemicznego jest niepokojąca i zaleca się techniki kriogeniczne do analizy próbek biologicznych w ich prawie natywnym stanie uwodnionym, aby zapewnić maksymalne zachowanie integralności chemicznej komórek lub tkanek. W tym przypadku proponujemy protokół przygotowania komórkowego oparty na próbkach kriokonserwowanych. Wykazano to w badaniu spektroskopii absorpcji promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości energetycznej wykrywanej fluorescencją selenu w komórkach rakowych oraz badaniu żelaza w fitoplanktonie. Protokół ten może być stosowany z innymi próbkami biologicznymi i innymi technikami rentgenowskimi, które mogą zostać uszkodzone przez napromieniowanie.

Głównymi celami tych preparatów było zbadanie oddziaływania między nanocząsteczkami selenu (Se-NPs) a komórkami nowotworowymi oraz wiązania i sekwestracji żelaza w fitoplanktonie.
Widma HERFD-XANES selenu w stanie początkowym (BSA Se-NPs) oraz w komórkach inkubowanych w pożywce (BSA Se-NPs po 24 h inkubacji) przedstawiono na Rysunku 10. Wyniki wykazały, że selen w początkowych Se-NPs występował zarówno w formie Se(0), jak i formach przypominających sele...

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania biologicznych próbek kriogenicznych do eksperymentów z synchrotronową spektroskopią absorpcyjną promieniowania rentgenowskiego. Opisujemy wszystkie kroki wymagane do optymalizacji przygotowania próbek i kriokonserwacji wraz z przykładami protokołu z komórkami nowotworowymi i fitoplanktonem. Metoda ta zapewnia uniwersalny standard krioprzygotowania próbek.

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Protokół ten został ustandaryzowany dla próbek komórkowych, umożliwiając porównanie eksperymentów prowadzonych w różnych lokalizacjach synchrotronowych. Główną zaletą tej techniki jest prosty i nieskomplikowany przebieg pracy, który pozwala na szybkie i niezawodne zachowanie chemicznej integracji próbki. Osoby, które są nowicjuszami w tej technice, mogą mieć problemy z granulowaniem zamrożonych iterowanych komórek i szybkim ładowaniem osadu komórkowego do kolejności kriopróbek.Precyzyjne i szybkie odłączenie próbek w temperaturze kriogenicznej ma kluczowe znaczenie. W związku z tym demonstracja wizualna jest niezbędna, aby zrozumieć, jak wykonać tę technikę. Aby przygotować granulki komórek linii komórkowej ludzkiego raka prostaty i jajnika do specjacji selenu, wysiewaj odpowiednią liczbę komórek z każdej linii komórkowej do trzech kolb T-75 na warunki w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowych w kapturze z przepływem laminarnym i umieść kolby w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż komórki będą zlewać się w 80%.Aby wystawić komórki rakowe na działanie selenu, należy najpierw poddać sonicyzacji świeżo przygotowane roztwory podstawowe nanocząstek w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie seryjnie rozcieńczyć roztwór nanocząstek selenu w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej do odpowiednich stężeń roboczych. W okapie z przepływem laminarnym delikatnie umyj komórki dwa razy pięcioma mililitrami PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pranie i użyj sterylnej pipety o pojemności 25 mililitrów, aby ostrożnie dodać 15 mililitrów interesującego nas roztworu selenu na dno kolby. Zamknąć pokrywki, nie zamykając całkowicie kolby, a następnie umieścić kolby poziomo w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.Aby przygotować osady komórkowe po umyciu i uzupełnieniu pożywki, należy użyć jednego skrobaka do komórek na kolbę, aby delikatnie odłączyć komórki. Użyć pożywki, aby przepłukać wszystkie komórki przyklejone do kolby do supernatantu i zebrać zdysocjowane komórki przez odwirowanie. Przemyj granulki dwa razy w pięciu mililitrach PBS na probówkę na pranie, aby usunąć wszystkie pozostałe ślady leczenia i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze PBS.Przenieś komórki do 1,5 mililitrowej probówki polipropylenowej i zbierz komórki za pomocą kolejnego wirowania. Następnie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby delikatnie usunąć cały supernatant i zanurz dolną część każdej 1,5 mililitrowej probówki w ciekłym azocie do poziomu osadu komórkowego. Natychmiast po zamrożeniu przenieś probówki do dewara z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.W przypadku spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości zoptymalizuj wszystkie kryształy ze spektrometru analizatora kryształów w warunkach Bragga w odniesieniu do energii linii fluorescencji będącej przedmiotem zainteresowania i użyj odniesienia, dla którego położenie energii krawędzi absorpcji jest znane do kalibracji padającej energii wiązki monochromatycznej. Przenieś uchwyt próbki do kriostatu z ciekłym helem dla próbek biologicznych i ustaw kriostat na 10 stopni Kelvina, a następnie zamknij klatkę doświadczalną zgodnie z zasadami bezpieczeństwa synchrotronu i rozpocznij analizę. W tym przypadku reprezentatywne widma absorpcyjnej spektroskopii promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości selenu w stanie początkowym i w komórkach inkubowanych do pożywki wykazują, że selen w początkowych nanocząstkach selenu był obecny zarówno w postaci selenu zero, jak i w formach podobnych do cellulitu.Jednak po interakcjach z komórkami PC3 selen był obecny w komórkach głównie jako selen zerowy, co świadczy o zmianie gatunku selenu w komórkach. W przypadku żelaza, widma referencyjne spektroskopii absorpcji promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości wykazują wyraźne położenie krawędzi w zależności od stopnia utlenienia żelaza, ze zredukowanymi gatunkami żelaza przesuniętymi do niskich wartości energii. Dwa kolejne widma zebrane w tym samym miejscu pastylki okrzemki były podobne, co wskazuje, że uszkodzenie wiązki było ograniczone między dwoma akwizycjami przy użyciu kriostatu helowego o temperaturze 10 kelwinów.Co więcej, widma z różnych pozycji pastylki okrzemki były identyczne, co pokazuje, że osad próbki był jednorodny i że widma można uśrednić w celu uzyskania lepszego stosunku sygnału do szumu. Najbardziej krytycznymi etapami są przygotowanie rozcieńczenia nanocząstek, granulowanie w temperaturze kriogenicznej oraz przygotowanie standardowych próbek referencyjnych. Procedura ta może być stosowana do innych masowych technik analitycznych, takich jak ICP-MS lub HPLC-ICP-MS lub innych niesynchrotronowych technik spektroskopowych, które można wykonać w temperaturze kriogenicznej.Za pomocą tej procedury można badać inne kwestie naukowe, szczególnie w dziedzinie biogeologii, biochemii i nauk o środowisku lub badań toksykologicznych. Związki selenu i nanocząsteczki selenu mogą być równie uciążliwe dla zdrowia i powinny być manipulowane w dedykowanym kapturze chemicznym za pomocą rękawiczek, okularów i maski na twarz.

biological-samples-preparation-for-speciation-at-cryogenic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Opisujemy protokół pobierania próbek, konserwacji i sekcji nienaruszonych korzeni i otaczającej je gleby ryzosfery ze środowisk podmokłych przy użyciu ryżu (Oryza sativa L.) jako gatunku modelowego. Po zakonserwowaniu próbka może być analizowana przy użyciu technik obrazowania elementarnego, takich jak obrazowanie specjacji chemicznej za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej (XRF).

Metoda ochrony korzeni i ryzosfer mokradeł do obrazowania pierwiastków

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania siatek próbek w temperaturach tak wysokich jak 70 °C, przed zamrożeniem zanurzeniowym do eksperymentów krio-EM.

Przygotowanie wysokotemperaturowych siatek na próbki do Cryo-EM

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj przygotowanie próbek biologicznych do spektroskopii absorpcyjnej rentgenowskiej w temperaturze kriogenicznej. Ta metoda umożliwia zachowanie integralności chemicznej próbek komórkowych.

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów