Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

Protokół ten został ustandaryzowany dla próbek komórkowych, umożliwiając porównanie eksperymentów prowadzonych w różnych lokalizacjach synchrotronowych. Główną zaletą tej techniki jest prosty i nieskomplikowany przebieg pracy, który pozwala na szybkie i niezawodne zachowanie chemicznej integracji próbki. Osoby, które są nowicjuszami w tej technice, mogą mieć problemy z granulowaniem zamrożonych iterowanych komórek i szybkim ładowaniem osadu komórkowego do kolejności kriopróbek.

Precyzyjne i szybkie odłączenie próbek w temperaturze kriogenicznej ma kluczowe znaczenie. W związku z tym demonstracja wizualna jest niezbędna, aby zrozumieć, jak wykonać tę technikę. Aby przygotować granulki komórek linii komórkowej ludzkiego raka prostaty i jajnika do specjacji selenu, wysiewaj odpowiednią liczbę komórek z każdej linii komórkowej do trzech kolb T-75 na warunki w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowych w kapturze z przepływem laminarnym i umieść kolby w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż komórki będą zlewać się w 80%.

Aby wystawić komórki rakowe na działanie selenu, należy najpierw poddać sonicyzacji świeżo przygotowane roztwory podstawowe nanocząstek w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie seryjnie rozcieńczyć roztwór nanocząstek selenu w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej do odpowiednich stężeń roboczych. W okapie z przepływem laminarnym delikatnie umyj komórki dwa razy pięcioma mililitrami PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pranie i użyj sterylnej pipety o pojemności 25 mililitrów, aby ostrożnie dodać 15 mililitrów interesującego nas roztworu selenu na dno kolby. Zamknąć pokrywki, nie zamykając całkowicie kolby, a następnie umieścić kolby poziomo w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.

Aby przygotować osady komórkowe po umyciu i uzupełnieniu pożywki, należy użyć jednego skrobaka do komórek na kolbę, aby delikatnie odłączyć komórki. Użyć pożywki, aby przepłukać wszystkie komórki przyklejone do kolby do supernatantu i zebrać zdysocjowane komórki przez odwirowanie. Przemyj granulki dwa razy w pięciu mililitrach PBS na probówkę na pranie, aby usunąć wszystkie pozostałe ślady leczenia i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze PBS.

Przenieś komórki do 1,5 mililitrowej probówki polipropylenowej i zbierz komórki za pomocą kolejnego wirowania. Następnie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby delikatnie usunąć cały supernatant i zanurz dolną część każdej 1,5 mililitrowej probówki w ciekłym azocie do poziomu osadu komórkowego. Natychmiast po zamrożeniu przenieś probówki do dewara z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

W przypadku spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości zoptymalizuj wszystkie kryształy ze spektrometru analizatora kryształów w warunkach Bragga w odniesieniu do energii linii fluorescencji będącej przedmiotem zainteresowania i użyj odniesienia, dla którego położenie energii krawędzi absorpcji jest znane do kalibracji padającej energii wiązki monochromatycznej. Przenieś uchwyt próbki do kriostatu z ciekłym helem dla próbek biologicznych i ustaw kriostat na 10 stopni Kelvina, a następnie zamknij klatkę doświadczalną zgodnie z zasadami bezpieczeństwa synchrotronu i rozpocznij analizę. W tym przypadku reprezentatywne widma absorpcyjnej spektroskopii promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości selenu w stanie początkowym i w komórkach inkubowanych do pożywki wykazują, że selen w początkowych nanocząstkach selenu był obecny zarówno w postaci selenu zero, jak i w formach podobnych do cellulitu.

Jednak po interakcjach z komórkami PC3 selen był obecny w komórkach głównie jako selen zerowy, co świadczy o zmianie gatunku selenu w komórkach. W przypadku żelaza, widma referencyjne spektroskopii absorpcji promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości wykazują wyraźne położenie krawędzi w zależności od stopnia utlenienia żelaza, ze zredukowanymi gatunkami żelaza przesuniętymi do niskich wartości energii. Dwa kolejne widma zebrane w tym samym miejscu pastylki okrzemki były podobne, co wskazuje, że uszkodzenie wiązki było ograniczone między dwoma akwizycjami przy użyciu kriostatu helowego o temperaturze 10 kelwinów.

Co więcej, widma z różnych pozycji pastylki okrzemki były identyczne, co pokazuje, że osad próbki był jednorodny i że widma można uśrednić w celu uzyskania lepszego stosunku sygnału do szumu. Najbardziej krytycznymi etapami są przygotowanie rozcieńczenia nanocząstek, granulowanie w temperaturze kriogenicznej oraz przygotowanie standardowych próbek referencyjnych. Procedura ta może być stosowana do innych masowych technik analitycznych, takich jak ICP-MS lub HPLC-ICP-MS lub innych niesynchrotronowych technik spektroskopowych, które można wykonać w temperaturze kriogenicznej.

Za pomocą tej procedury można badać inne kwestie naukowe, szczególnie w dziedzinie biogeologii, biochemii i nauk o środowisku lub badań toksykologicznych. Związki selenu i nanocząsteczki selenu mogą być równie uciążliwe dla zdrowia i powinny być manipulowane w dedykowanym kapturze chemicznym za pomocą rękawiczek, okularów i maski na twarz.