Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1
June 9th, 2021
Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.
Protokół ten jest istotny, ponieważ wykorzystuje materiał pacjenta. Jeśli pacjent cierpi na tę chorobę, użycie jego komórek powinno dokładniej odzwierciedlać odpowiedź biologiczną pacjenta. Ta technika jest prosta do wykonania, nieskomplikowana i nie wymaga wyrafinowanego sprzętu.
Metody te mogą być wykorzystane do diagnostyki, na przykład w celu udowodnienia, że mutacja RYR1 funkcjonalnie zmienia homeostazę wapnia, a także do zbadania potencjalnej funkcji terapeutycznej związku. W zależności od wiedzy i umiejętności technicznych danego badacza, eksperymenty testowe powinny być wykonywane przed użyciem rzeczywistych próbek od pacjentów. Aby monitorować zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia w limfocytach B przekształconych przez EBV, ponownie zawiesić unieśmiertelnione komórki B w stężeniu od jednego razy 10 do siódmego na mililitr w roztworze Krebsa Ringera i Fura-2 AM do końcowego stężenia pięciu mikromolowców na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżym roztworze Krebsa Ringera w stężeniu dwa razy od 10 do szóstych komórek na mililitr. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu ponownie odwiruj komórki i szybko zawieś je ponownie w 1,5 mililitra roztworu Krebsa Ringera uzupełnionego 0,5-milimolowym EGTA, ale bez dodatku wapnia. Przenieś komórki do szklanej, trzymililitrowej kuwety spektrofluorometru i zapisuj współczynnik fluorescencji na spektrofluorometrze wyposażonym w mieszadło magnetyczne ustawione na maksymalną prędkość i 37 stopni Celsjusza przez około 30 sekund.
Aby ocenić reakcję uwalniania wapnia w pojedynczych komórkach, umieść jeden razy 106 komórek załadowanych Fura-2 AM w jednym mililitrze roztworu Krebsa Ringera uzupełnionego jednomilimolowym chlorkiem wapnia na pojedynczych szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut. Gdy komórki się przyczepią, umieść szkiełko nakrywkowe w komorze perfuzyjnej i rozpocznij perfuzję komórek przy dwóch mililitrach roztworu Krebsa Ringera uzupełnionym jednomilimolowym natężeniem przepływu wapnia na minutę. Korzystając z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w 40-krotny obiektyw zanurzający w oleju i odpowiednie filtry, rejestruj pomiary online za pomocą sterowanej programowo, sprzężonej z ładunkiem nasadki do kamery w odstępach jednosekundowych, przy stałym czasie ekspozycji.
Aby uzyskać stymulację komórek, użyj stymulatora perfuzji komórek z 12 zaworami, aby dodać różne stężenia agonisty. Aby wyizolować miotubetki z biopsji mięśni ludzkich, najpierw przepłucz biopsję sterylnym PBS, aby usunąć nadmiar krwi, a następnie rozdrobnij tkankę na małe fragmenty o wielkości od 0,5 do jednego milimetra. Umieścić dwa do trzech fragmentów w indywidualnych wkładkach w każdym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 1,5 mililitra pożywki do wzrostu mięśni ludzkich na dołek i 500 mikrolitrów pożywki na wkładkę, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Aby zmierzyć zmiany w ekspresji wapnia w ludzkich miotubach, gdy można zaobserwować wielojądrowe miotuby, zastąp supernatanty hodowli miotubowych świeżą pożywką różnicującą uzupełnioną 10 mikrolitrami jednomilimolowego Fura-2 AM na 30-minutową inkubację w inkubatorze hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji przenieść jedną szklaną kulturę szkiełka przykrywkowego do komory perfuzyjnej i przepłukać komórki roztworem Krebsa Ringera uzupełnionym dwumilimolowym chlorkiem wapnia. Następnie wykonaj pomiary wapnia online, jak pokazano przy użyciu obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie.
W tej reprezentatywnej analizie zaobserwowano szybki wzrost wapnia w unieśmiertelnionych przez EBV limfocytach B po dodaniu agonisty, który z czasem powoli spadał z powrotem do poziomu spoczynkowego. W podobnym eksperymencie dodanie 400-nanomolowej thapsigarginy spowodowało duży stan przejściowy wapnia, który osiągnął szczytową wartość fluorescencji wynoszącą 2,4 dowolnej jednostki. Tę wartość fluorescencji uznano za równą 100%, gdy skonstruowano odpowiednią krzywą odpowiedzi na dawkę.
W tej analizie unieśmiertelnione limfocyty B stymulowano pięciomilimolową kofeiną przez 20 sekund, co spowodowało natychmiastowy wzrost współczynnika fluorescencji 340 i 380 nanometrów. Dla każdego badanego stężenia kofeiny obliczono pik wywołany kofeiną w stosunku 340 na 380 nanometrów fluorescencji i wykorzystano go do skonstruowania krzywej dawka-odpowiedź. Uwalnianie wapnia ze zróżnicowanych miotub można również ocenić w odpowiedzi na płukanie chlorkiem potasu, różnymi stężeniami agonisty i/lub kofeiny, a także można wygenerować normalne krzywe odpowiedzi na dawkę.
Ważne jest, aby upewnić się, że komórki są prawidłowo załadowane Fura-2 i że zarówno długości fal 340, jak i 380 nanometrów reagują na dodanie agonisty. Wewnątrzkomórkowe pomiary wapnia za pomocą fluorescencyjnych wskaźników wapnia można badać w większości komórek ssaków i można je stosować do badania wewnątrzkomórkowych zmian wapnia w odpowiedzi na różne bodźce.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metody badania funkcjonalnych efektów mutacji RYR1 w komórkach pochodzących od pacjentów. Dzięki zastosowaniu unieszkodliwionych przez wirusa Epsteina-Barr ludzkich limfocytów B oraz komórek satelitarnych pochodzących z biopsji mięśniowej, naukowcy mogą uzyskać wgląd w homeostazę wapnia i potencjalne interwencje terapeutyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Genetyka
Tło
- Mutacje RYR1 są związane z różnymi zaburzeniami mięśniowymi.
- Zrozumienie homeostazy wapnia jest kluczowe dla diagnozowania tych stanów.
- Komórki pochodzące od pacjentów zapewniają bardziej dokładną odpowiedź biologiczną.
- To badanie wykorzystuje proste techniki, które nie wymagają wyszukanego sprzętu.
Cel badania
- Ocenić funkcjonalny wpływ mutacji RYR1.
- Ocenić biologiczną odpowiedź komórek pochodzących od pacjentów.
- Zbadać potencjalne opcje terapeutyczne dla zaburzeń związanych z RYR1.
Stosowane metody
- Izolacja przekształconych przez EBV limfocytów B od pacjentów.
- Inkubacja komórek z Fura-2 AM w celu monitorowania poziomów wapnia.
- Zastosowanie roztworu Krebsa-Ringera do resuspensji komórek.
- Testowanie związków w celu oceny ich potencjału terapeutycznego.
Główne wyniki
- Wykazano funkcjonalne zmiany w homeostazie wapnia z powodu mutacji RYR1.
- Potwierdzono zastosowanie komórek pochodzących od pacjentów dla dokładnych ocen biologicznych.
- Przedstawiono prostą metodologię dla badaczy.
- Podkreślono potencjał testowania terapeutycznego przy użyciu próbek od pacjentów.
Wnioski
- Ten protokół oferuje niezawodną metodę badania mutacji RYR1.
- Zastosowanie komórek pochodzących od pacjentów zwiększa istotność wyników.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu zbadania nowych terapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Functional characterization of endogenously expressed RYR1 variants in patient-derived cells enables mechanistic de-risking of neuromuscular disorder targets by linking genotype to calcium signaling phenotypes. This approach supports target validation and assay development for RYR1-related pathologies, providing predictive confidence in variant pathogenicity assessment. The method facilitates translational biomarker identification and preclinical model continuity using human B-lymphocytes and differentiated myotubes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring intracellular calcium flux in endogenously expressed RYR1 variants.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct comparison of variant effects in patient cells versus healthy controls.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying functional impact of RYR1 mutations on calcium homeostasis.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening using Fura-2 AM-loaded EBV-transformed B lymphocytes and myotubes.
- Quantitative Output: Generates dose-response curves to pharmacological agonists (e.g., caffeine, thapsigargin) for standardized calcium release measurement.
- Platform Reuse: Supports scalable screening workflows via spectrofluorometry or single-cell fluorescence microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses cells from patients with malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies, and centronuclear myopathy to model human pathophysiology.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by maintaining endogenous expression levels and native genetic background.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying non-pathogenic variants and confirming functional impact of disease-associated mutations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of RYR1 variant function prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking through direct measurement of agonist-induced calcium release in patient-derived cells.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility via ratiometric Fura-2 AM fluorescence readouts in controlled perfusion systems.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (intracellular [Ca²⁺]) enabling comparison of variant effects across genetic backgrounds.
- Translational Research: Ensures continuity from discovery to preclinical work by using human satellite cells differentiated into myotubes under physiological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for variant screening across neuromuscular disorder programs without requiring overexpression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking RYR1 genotype to calcium signaling phenotype in native cellular context.
- Operational Value: Offers standardization and reproducibility through defined cell loading, agonist perfusion, and ratiometric fluorescence detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional evidence for variant pathogenicity, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RYR1-targeted therapeutics based on validated functional assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent calcium imaging, and perfusion-based agonist stimulation.
- Dependent on access to spectrofluorometer or fluorescence microscopy with dual-wavelength excitation (340/380 nm) and emission detection.
- Necessitates standardization across laboratories when comparing results from patients with different genetic backgrounds harboring the same RYR1 variant.
- Adaptation considerations include optimizing Fura-2 AM loading and agonist concentration ranges for EBV-transformed B lymphocytes versus differentiated myotubes.
- Practical limitations include variability in patient cell viability and the need for healthy control comparisons to distinguish variant-specific effects from background noise.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:00
Intracellular Cell Culture Ca2+ Measurement
2:30
Intracellular Single Cell Ca2+ Measurement
3:56
Human Myotube Preparation
4:40
Human Myotube Inducible Calcium ([Ca2+]i) Measurement
5:33
Results: Representative Single Cell Ca2+ Release in EBV-Immortalized Human B Cells and Isolated Human Myotubes
7:11
Conclusion
