Name: Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcjonalnego wpływu mutacji RYR1 w ludzkich limfocytach B zakażonych wirusem EBV oraz komórkach mięśniowych pochodzących od pacjentów. Technika ta pozwala badać homeostazę wapnia i testować potencjalne terapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca opisana w tym manuskrypcie była wspierana przez granty ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (SNF) i Szwajcarskiej Fundacji Mięśniowej.

Opisane poniżej protokoły są zgodne z wytycznymi etycznymi Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Przygotowanie unieśmiertelnionych linii komórkowych limfocytów B Epsteina Barra11
<ol>
	<li>Po wyrażeniu świadomej zgody należy pobrać 30 ml krwi pełnej w sterylnych probówkach traktowanych EDTA od probanta z mutacją RYR1 oraz od zdrowych członków rodziny bez mutacji. 
	UWAGA: Utrzymuj wszystkie roztwory w sterylności i pracuj w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Wyizolować komórki jednojądrzaste z krwi pełnej za pomocą pożywki wirowej w gradiacji gęstości (np. Ficoll-Hypaque, 0,077 g / l).
	<ol>
		<li>Umieść 30 ml sterylnej krwi w stożkowej sterylnej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Umieścić końcówkę pipety Pasteura zawierającej pożywkę wirówkową z gradientem gęstości na dnie probówki i powoli umieścić 20 ml sterylnego roztworu pożywki wirowej z gradientem gęstości pod krwią.</li>
		<li>Wirować przez 30 min przy 900 x g w temperaturze 18°-20°C, bez przerwy. 
		UWAGA: Warstwa komórki jednojądrowej pojawia się jako mętny pierścień na przecięciu między warstwą pożywki wirującej w gradiacji gęstości a górną warstwą zawierającą osocze wzbogacone w płytki krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety delikatnie usunąć warstwę interfazową zawierającą komórki jednojądrzaste (około 3-5 ml) i przenieść roztwór do czystej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 20 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) do przepłukania komórek, odwirować przez 10 minut przy 600 x g w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w PBS. Powtórz w sumie trzy razy; Gwarantuje to, że wszystkie nośniki zostaną usunięte.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 1-2 ml pożywki do hodowli tkankowej (pożywka RPMI uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM L-glutaminą oraz 100 jednostkami penicyliny i streptomycyny). Umieścić komórki jednojądrzaste (około 1 x 106 komórek) w kolbie do hodowli tkankowej T125 zawierającej 20 ml pożywki do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Zakażenie komórek jednojądrzastych wirusem Epsteina-Barr.
	<ol>
		<li>Jako źródło EBV należy stosować supernatanty z hodowli linii komórkowych B95.8 (zawierających 102-10 3 jednostek transformujących/ml w temperaturze -80 °C).</li>
		<li>Zawiesić 1 x 106 komórek jednojądrzastych z etapu 1,5 w 20 ml pożywki do hodowli tkankowych i wystawić je na działanie 2 ml supernatantu z linii komórkowej B95.8 w obecności cyklosporyny A (stężenie końcowe 0,2 μg/ml) w celu zakażenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom rosnąć. Po tygodniu zmień pożywkę. 
	UWAGA: Gdy limfocyty B zaczną się namnażać, tworzą rozpoznawalne grudki i szybko rosną, dzięki czemu kultury mogą się rozszerzać i zamrażać.</li>
	<li>Wyodrębnij genomowe DNA z unieśmiertelnionych linii komórkowych limfocytów B EBV11, aby potwierdzić obecność lub brak danej mutacji.</li>
</ol>
2. Wewnątrzkomórkowe pomiary Ca2+
UWAGA: Zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia w liniach komórkowych limfocytów B przekształconych przez EBV mogą być monitorowane w populacjach komórkowych za pomocą spektrofluorometru wyposażonego w mieszadło magnetyczne i uchwyt na kuwetę ustawioną na 37 °C. Alternatywnie, zmianyCa2+ mogą być monitorowane w pojedynczych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W obu przypadkach komórki wyjmuje się z kolby do hodowli tkankowej, przemywa się dwukrotnie roztworem Krebsa Ringera (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5,5 mM glukozy, pH 7,4 zawierające 1 mM CaCl2) i liczy.
<ol>
	<li>Do eksperymentów na populacjach komórek przy użyciu spektrofluorometru11,13,14
	<ol>
		<li>Zawiesić komórki w końcowym stężeniu 1 x 107 komórek/ml w roztworze Krebsa Ringera i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut z końcowym stężeniem 5 μM Fura-2/AM.</li>
		<li>Odwirować komórki o stężeniu 900 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić je w roztworze Krebsa Ringera w stężeniu 2 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Zmierzyć zmiany fluorescencji (stosunek 340/380 nm) za pomocą spektrofluorometru wyposażonego w mieszadło magnetyczne ustawione na maksymalną prędkość i ustawione na 37 °C.</li>
		<li>Tuż przed eksperymentem wiruj komórki o sile 900 x g przez 5 minut w mikrowirówce i szybko zawieś osad w 1,5 ml roztworu Krebsa Ringera z 0,5 mM EGTA, ale bez dodatku Ca2+.</li>
		<li>Umieścić komórki w szklanej kuwecie spektrofluorometru o pojemności 3 ml i zapisać współczynnik fluorescencji (wzbudzenie 340 nm/380 nm, emisja 510 nm).</li>
		<li>Osiągnij stabilną linię podstawową (około 30 sekund), dodaj wybrane stężenie agonisty RyR1 (4-chloro-m-krezol lub 4-cmc) i zapisz stan przejściowy wapnia. 
		UWAGA: Jako odczynnik wyjściowy stosuje się roztwór podstawowy 4-cmc o stężeniu 300 mM wykonany w DMSO. Roztwór ten można przygotować z wyprzedzeniem, podaszkować i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
		<li>Przeprowadzaj eksperymenty dla różnych stężeń 4 cmc. 
		UWAGA: Uwzględnij 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM do 1 mM, aby wygenerować krzywą odpowiedzi na dawkę agonisty w funkcji zmiany [Ca2+]. Różne stężenia 4 cmc uzyskuje się przez dodanie odpowiedniej objętości 4 cmc z roztworu podstawowego, bezpośrednio do kuwety zawierającej ogniwa załadowane Fura-2. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie 300 μM 4-cmc, 1,5 μl roztworu podstawowego dodaje się do kuwety zawierającej 1,5 ml komórek w roztworze Krebsa Ringera. W celu uzyskania niższych stężeń agonistów roztwór podstawowy o stężeniu 300 mM należy rozcieńczyć do 75 mM za pomocą DMSO i dodać odpowiednią objętość do kuwety zawierającej 1,5 ml komórek w roztworze Krebsa Ringera.</li>
		<li>Dodaj 400 nM thapsigarginy do komórek, aby obliczyć całkowitą ilość Ca2+ obecnego w sklepach wewnątrzkomórkowych. Zapisz szczyt Ca2+.</li>
		<li>Wykreślić szczytowy poziom wapnia indukowany przez dane stężenie 4 cmc w porównaniu ze szczytowym poziomem wapnia indukowanym przez thapsigarginę, który jest uważany za 100%, i skonstruować krzywą odpowiedzi na dawkę 4 cmc, porównując komórki z probanda i zdrowego krewnego</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do eksperymentów na pojedynczych komórkach13
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć poli-L-lizynę w stosunku 1:10 w sterylnymH2Oi poddać szklane szkiełka nakrywkowe wstępnej obróbce przez 30 minut. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu pod sterylnym kapturem do hodowli tkankowych.</li>
		<li>Ponownie zawiesić limfocyty B przekształcone przez EBV do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml w roztworze Krebsa Ringera zawierającym 1 mM CaCl2 i dodać końcowe stężenie 5 μM Fura-2 / AM.</li>
		<li>Umieścić 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych poddanych działaniu poli-L-lizyny i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut, aby komórki EBV przykleiły się do szklanego szkiełka nakrywkowego podczas ładowania.</li>
		<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze perfuzyjnej i rozpocząć perfuzję (z szybkością 2 ml/min) roztworem Krebsa Ringera zawierającym 1 mM Ca2+.</li>
		<li>Do rejestrowania pomiarów on-line należy używać odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (wyposażonego w 40-krotny obiektyw z olejem (apertura numeryczna 0,17), filtry (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) z mocowaniem kamery on-line za pomocą sterowanego programowo urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).</li>
		<li>Rejestruj obrazy w odstępach 1 s przy stałym czasie ekspozycji (100 ms dla długości fali wzbudzenia 340, jak i 380 nm. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby przeanalizować zmiany fluorescencji. Zmierz średnią wartość piksela dla każdej komórki przy długościach fal wzbudzenia 340 i 380 nm13.</li>
		<li>Aby uzyskać stymulację komórek, użyj stymulatora perfuzji komórek z 12 zaworami i dodaj różne stężenia 4-cmc. Zawór spłukujący zawiera roztwór Krebsa Ringera bez dodatku Ca2+ plus 100 μM La3+ do monitorowania uwalniania wapnia tylko z zapasów wewnątrzkomórkowych.</li>
		<li>Skonstruuj krzywą dawka-odpowiedź 4 cmc w funkcji zmiany [Ca2+], jak opisano powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie ludzkich mięśni na podstawie biopsji mięśni10,12,15
UWAGA: Różne metody były używane przez różne laboratoria do uzyskania satelitarnych mioblastów i miotubek pochodzących z komórek. Poniżej znajduje się opis metody zastosowanej w Bazylei.
<ol>
	<li>Przepłucz biopsję mięśni sterylnym PBS, aby usunąć nadmiar krwi i pokrój na małe fragmenty o wielkości około 0,5-1 mm.</li>
	<li>Przygotuj 6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych z wkładką. Dodaj 1,5 ml pożywki do wzrostu mięśni ludzkich do każdej studzienki i 0,5 ml pożywki do wzrostu mięśni ludzkich do każdej wkładki. 
	UWAGA: Pożywka wzrostowa składa się z następujących elementów: 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy lub DMEM (4,5 mg / ml), zawierającej 10% surowicy końskiej, 5 ng / ml insuliny, 3 mM glutaminy, 600 ng / ml penicyliny G i streptomycyny oraz 7 mM HEPES, pH 7,4. Można również zastosować dostępne w handlu podłoże do wzrostu mięśni szkieletowych.</li>
	<li>Umieść 2-3 małe fragmenty mięśni w każdej wkładce (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i umieść szalki hodowlane w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C). Po około 8-10 dniach można zobaczyć komórki satelitarne wyrastające z biopsji mięśnia i otaczające ją, przyczepione do wkładki (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1, B i C, strzałki).</li>
	<li>Uwolnij wystarczającą liczbę komórek z biopsji (po około 10-14 dniach), trypsynizuj w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Usunąć całą pożywkę hodowlaną, przepłukać komórki raz 1 ml PBS, dodać 0,5 ml roztworu trypsyny/EDTA (0,025% trypsyny i 0,01% EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki wzrostowej do komórek, aby zneutralizować działanie trypsyny i przenieść komórki satelitarne do nowej kolby do hodowli komórek T25; dodać 3 ml pożywki wzrostowej i umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C).</li>
		<li>Zmień pożywkę wzrostową następnego dnia, aby usunąć EDTA, a następnie zmieniaj pożywkę raz w tygodniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy mioblasty są w około 75% zlewne, trypsynizuj i przenieś je na szklane szkiełko nakrywkowe nasączone lamininą. 
	UWAGA: Proporcjonalnie komórki rosnące w jednej kolbie T25 należy przenieść na jedno szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 43 mm nasączone lamininą. Szklane szkiełko nakrywkowe należy umieścić na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm zawierającej 3 ml pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Hodować komórki na szklanym szkiełku nakrywkowym w pożywce wzrostowej w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C), zmieniając pożywkę raz w tygodniu. Przy 90% zbiegu przejdź na pożywkę różnicującą utworzoną w następujący sposób: DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 mg / ml), 0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 10 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu, 0,15 mg / ml kreatyny, 5 ng / ml insuliny, 200 mg glutaminy, 600 ng / ml penicyliny G i streptomycyny oraz 7 mM HEPES, pH 7,4). Można również stosować dostępne na rynku podłoże różnicujące. Zmieniaj podłoże różnicujące raz w tygodniu.</li>
	<li>Po 7-10 dniach w pożywce różnicowej widoczne są wielojądrzaste miotuby. Oceń pod kątem zmian w [Ca2+] w ciągu jednego tygodnia, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
4. [Ca2+]i pomiary współczynnika określone za pomocą Fura-2
<ol>
	<li>Załadować szklane szkiełko nakrywkowe wyhodowane w miotubach Fura-2/AM (końcowe stężenie 5 μM) rozcieńczonym w DMEM przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Na krótko usunąć pożywkę różnicującą ze szklanych komórek hodowanych w szkiełku nakrywkowym i dodać 2 ml świeżej pożywki różnicującej. Dodać 10 μl Fura-2 AM z roztworu podstawowego 1 mM i inkubować przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C).</li>
	<li>Przenieść szklane szkiełko nakrywkowe do komory perfuzyjnej i przepłukać komórki roztworem Krebsa Ringera zawierającym 2 mM CaCl2.</li>
	<li>Pomiary on-line [Ca2+] należy wykonać zgodnie z powyższym opisem w sekcji pojedynczej komórki EBV przy użyciu obiektywu FLUAR z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie (apertura numeryczna 0,17).</li>
</ol>

<ol><li>Dlamini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RYR1+are+a+common+cause+of+exertional+myalgia+and+rhabdomyolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis.</a> Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).</li>
<li>Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+genetic+findings+in+a+large+cohort+of+patients+with+ryanodine+receptor+1+gene-associated+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies.</a> Human Mutation. 33, 981-988 (2012).</li>
<li>Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RYR1+in+malignant+hyperthermia+and+central+core+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease.</a> Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+mediated+activation+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).</li>
<li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Ca2%2B+transients+in+COS-7+cells+transfected+with+the+cDNA+encoding+skeletal-muscle+ryanodine+receptor+carrying+a+mutation+associated+with+malignant+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia.</a> Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).</li>
<li>Nakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dihydropyridine+receptor+channel+activity+in+the+presence+of+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor.</a> Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).</li>
<li>Durham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RyR1+S-nitrosylation+underlies+environmental+heat+stroke+and+sudden+death+in+Y522S+RyR1+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice.</a> Cell. 133 (81), 53-65 (2008).</li>
<li>Zvaritch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dysregulation+in+Ryr1%28I4895T%2Fwt%29+mice+causes+congenital+myopathy+with+progressive+formation+of+minicores%2C+cores%2C+and+nemaline+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).</li>
<li>Elbaz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-allelic+expression+of+the+RyR1+p.A4329D+mutation+decreases+muscle+strength+in+slow-twitch+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).</li>
<li>Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+homeostasis+in+human+primary+muscle+cells+from+malignant+hyperthermia+susceptible+and+normal+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals.</a> Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).</li>
<li>Girard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-lymphocytes+from+Malignant+Hyperthermia-Susceptible+patients+have+an+increased+sensitivity+to+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077(2001).</li>
<li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ryanodine+receptor+mutations+on+interleukin-6+release+and+intracellular+calcium+homeostasis+in+human+myotubes+from+Malignant+Hyperthermia-+Susceptible+individuals+and+patients+affected+by+Central+Core+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).</li>
<li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+ryanodine+receptors+carrying+three+amino+acid+substitutions+identified+in+patients+affected+by+multi-minicore+disease+and+central+core+disease%2C+expressed+in+immortalized+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes.</a> Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).</li>
<li>Tilgen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+four+novel+mutations+in+the+C-terminal+membrane+spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor+1%3A+association+with+central+core+disease+and+alteration+of+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis.</a> Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).</li>
<li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitation-coupled+Ca2%2B+entry+induces+nuclear+translocation+of+NFAT+and+contributes+to+IL-6+release+from+myotubes+from+patients+with+central+core+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).</li>
<li>Yasuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JP-45%2FJSRP1+variants+affect+skeletal+muscle+excitation+contraction+coupling+by+decreasing+the+sensitivity+of+the+dihydropyridine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor.</a> Human Mutation. 34, 184-190 (2013).</li>
<li>Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+ryanodine+receptor+is+involved+in+calcium+signaling+in+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).</li>
<li>Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorocresol%2C+an+additive+to+commercial+succinylcholine%2C+induces+contracture+of+human+malignant+Hyperthermia+Susceptible+muscles+via+activation+of+the+ryanodine+receptor+Ca2%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel.</a> Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).</li>
<li>Kushnir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+calcium+leak+in+circulating+B-lymphocytes+as+a+biomarker+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure.</a> Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).</li>
<li>Zullo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+ryanodine+receptor+sequence+variants+using+a+metabolic+assay+in+immortalized+B-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes.</a> Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).</li>
<li>Hoppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermetabolism+in+B-lymphocytes+from+malignant+hyperthermia+susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals.</a> Scientific Reports. 6, 33372(2016).</li>
<li>Monnier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homozygous+splicing+mutation+causing+a+depletion+of+skeletal+muscle+RYR1+is+associated+with+multi-minicore+disease+congenital+myopathy+with+ophthalmoplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia.</a> Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).</li>
<li>Schartner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dihydropyridine+receptor+%28DHPR%2C+CACNA1S%29+congenital+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy.</a> Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).</li>
<li>Ullrich, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+excitation-contraction+coupling+and+excitation+coupled+Ca2%2B+entry+in+human+myotubes+carrying+CAV3+mutations+linked+to+rippling+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease.</a> Human Mutation. 32, 1-9 (2010).</li>
<li>Rokach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+skeletal+muscle-+derived+cell+line%3A+biochemical%2C+cellular+and+electrophysiological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization.</a> Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RYR1+mutations+in+core+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Characterization of RYR1 mutations in core myopathies.</a> Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).</li>
<li>Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proton+release+from+cultured+human+myotubes+to+identify+malignant+hyperthermia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility.</a> Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokoły opisane w tym artykule zostały z powodzeniem wykorzystane przez kilka laboratoriów do badania wpływu mutacji RYR1 na homeostazę wapnia. Kluczowe etapy podejść przedstawionych w tym artykule dotyczą bezpłodności, umiejętności i technik hodowli komórek oraz dostępności materiału biologicznego. Zasadniczo zastosowanie unieśmiertelnionych przez EBV limfocytów B jest prostsze i pozwala na generowanie linii komórkowych zawierających zmutowane kanały RyR1. Komórki można zamrażać i przechowywać w ciekłym azocie przez w...

Do tej pory w populacji ludzkiej zidentyfikowano ponad 700 wariantów RYR1, które są powiązane z różnymi zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, w tym złośliwą podatnością na hipertermię (MHS), rabdomiolizą wywołaną wysiłkiem fizycznym, chorobą centralnego rdzenia (CCD), chorobą wielordzeniową (MmD), miopatią centronuklearną (CNM)1,2,3; Niemniej jednak badania mające na celu scharakteryzowanie ich efektów funkcjonalnych są opóźnione i tylko około 10% mutacji zostało przetestowanych funkcjonalnie. Do oceny wpływu danego wariantu RyR1 można zastosować różne podejścia eksperymentalne, w tym transfekcję komórek heterologicznych, takich jak komórki HEK293 i COS-7 z kodowaniem plazmidu dla WT i zmutowanego RYR1 cDNA4,5, transdukcja dyspedycznych fibroblastów myszy z plazmidami i wektorami kodującymi dla WT i zmutowanego cDNA RYR1, a następnie transdukcja z myo-D i różnicowanie do myotubes6, generacja transgenicznych modeli zwierzęcych niosących zmutowany RyR1s7,8,9, charakterystyka komórek od pacjentów wykazujących endogenną ekspresję wariantu RYR110,11,12. Takie metody pomogły ustalić, w jaki sposób różne mutacje funkcjonalnie wpływają na kanał RyR1 Ca2+.
Tutaj opisane są metody opracowane do oceny funkcjonalnych efektów mutacji RYR1. W komórkach ludzkich endogennie eksprymujących kanał wapniowy RyR1 badane są różne parametry wewnątrzkomórkowej homeostazy wapniowej, w tym w miotubach i limfocytach B unieśmiertelnionych wirusem Epsteina-Barra (EBV). Komórki są pozyskiwane od pacjentów, namnażane w hodowli i ładowane ratiometrycznymi fluorescencyjnymi wskaźnikami wapnia, takimi jak Fura-2 lub indo-1. Parametry, o których doniesiono, że uległy zmianie z powodu patogennych mutacji RYR1, w tym spoczynku [Ca2 +], wrażliwość na różnych agonistów farmakologicznych i wielkość wewnątrzkomórkowych zapasów Ca2 + są mierzone na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub w populacjach komórek za pomocą fluorymetru. Wyniki uzyskane w komórkach od nosicieli mutacji są następnie porównywane z wynikami uzyskanymi od zdrowych członków rodziny kontrolnej. Podejście to wykazało, że: (i) wiele mutacji związanych z MHS prowadzi do wzrostu spoczynku [Ca2+] i przesunięcia w lewo krzywej odpowiedzi na dawkę do depolaryzacji indukowanej przez KCl lub farmakologicznej aktywacji RyR1 za pomocą 4-chloro-m-krezolu10,11,12,13; (ii) mutacje związane z CCD prowadzą do zmniejszenia piku [Ca2+] uwalnianego przez farmakologiczną aktywację RyR1 i zmniejszenia rozmiaru, jeśli wewnątrzkomórkowy Ca2+ przechowuje 12,13,14,15; (iii) niektóre warianty nie wpływają na homeostazę Ca2+13. Zaletami tego eksperymentalnego podejścia są: białko RyR1 nie ulega nadmiernej ekspresji i występują poziomy fizjologiczne, komórki mogą być unieśmiertelnione (zarówno komórki mięśniowe, jak i limfocyty B), tworząc linie komórkowe zawierające mutacje. Niektóre wady wiążą się z faktem, że pacjenci mogą być nosicielami mutacji w więcej niż jednym genie kodującym białka zaangażowane w homeostazę wapnia i/lub sprzężenie skurczu wzbudzenia (ECC), co może komplikować wnioski eksperymentalne. Na przykład w populacji MHS i kontrolnej zidentyfikowano dwa warianty JP-45 i wykazano, że ich obecność wpływa na wrażliwość receptora dihydropirydyny (DHPR) na aktywację16. Pacjenci muszą być dostępni, materiał biologiczny musi być świeżo pobrany, a pozwolenia etyczne muszą być uzyskane od lokalnych komisji etycznych.

<table><tbody><tr><td>4-chloro-m-krezol</td><td>Fluka</td><td>24940</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi</td><td>Sarstedt</td><td>172202</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>kofeina</td><td>Merk</td><td>102584</td><td></td></tr><tr><td>Cascade 125+ Kamera CCD</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaskada 128+ CCD</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kreatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3630</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fluka</td><td>3778</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen Life Sciences</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11382II</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycyna</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Lanthanum</td><td>Fluka</td><td>61490</td><td></td></tr><tr><td>System mikroperfuzji</td> Wyspa zaworowa <td></td><td>ALA-Scientific</td><td>DAD VM 12</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Origin</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> <td>OriginLab Corp</td></tr><tr><td>Pennicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco Life Sciences</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna POC-R</td><td>Pecon</td><td>000000-1116-079</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td> Spektrofluorymetr <td>21875091</td><td></td>RPMI <td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Perkin Elmer</td><td>LS50</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do kultur tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353107</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do kultur tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop telewizyjny Zeiss Axiovert S100</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane Zeiss</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>0727-016</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego ryr1

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

Zidentyfikowano ponad 700 wariantów genu RYR1 u pacjentów z różnymi zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, w tym podatnością na hipertermię złośliwą, miopatiami rdzeniowymi i miopatią centronuklearną. Ze względu na różnorodne fenotypy związane z mutacjami RYR1 zasadnicze znaczenie ma scharakteryzowanie ich efektów funkcjonalnych, sklasyfikowanie wariantów przenoszonych przez pacjentów do przyszłych interwencji terapeutycznych i identyfikacja wariantów niepatogennych. Wiele laboratoriów było zainteresowanych opracowaniem metod funkcjonalnego charakteryzowania mutacji RYR1 ulegających ekspresji w komórkach pacjentów. Takie podejście ma wiele zalet, w tym: mutacje są wyrażane endogennie, RyR1 nie ulega nadmiernej ekspresji, unika się stosowania heterologicznych komórek eksprymujących RyR1. Ponieważ jednak pacjenci mogą wykazywać mutacje w różnych genach oprócz RYR1, ważne jest, aby porównać wyniki z materiału biologicznego od osób będących nosicielami tej samej mutacji, o różnym pochodzeniu genetycznym. Niniejszy manuskrypt opisuje metody opracowane do badania funkcjonalnych skutków endogennie eksprymowanych wariantów RYR1 w: (a) wirusie Epsteina-Barra unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz (b) komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni i zróżnicowanych w miotuby. Następnie monitorowane są zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia wywołane dodaniem farmakologicznych aktywatorów RyR1. Wybrany typ komórki jest ładowany ratiometrycznym fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, a zmiany wewnątrzkomórkowe [Ca2+] są monitorowane na poziomie pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub w populacjach komórek za pomocą spektrofluorometru. Spoczynkowe [Ca2+], agonistyczne krzywe odpowiedzi na dawkę są następnie porównywane między komórkami zdrowych osób z grupy kontrolnej a pacjentami z wariantami RYR1, co prowadzi do wglądu w efekt funkcjonalny danego wariantu.

Pomiary [Ca2+]i w populacjach unieśmiertelnionych EBV limfocytów B 
Pierwotne limfocyty B wykazują ekspresję izoformy RyR1, która pełni funkcję kanału uwalniania Ca2+ podczas procesów sygnalizacyjnych stymulowanych przez receptor antygenowy komórek B17. Unieśmiertelnienie komórek B za pomocą EBV, procedura rutynowo stosowana przez genetyków w celu uzyskania linii komórkowych zaw...

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ wykorzystuje materiał pacjenta. Jeśli pacjent cierpi na tę chorobę, użycie jego komórek powinno dokładniej odzwierciedlać odpowiedź biologiczną pacjenta. Ta technika jest prosta do wykonania, nieskomplikowana i nie wymaga wyrafinowanego sprzętu.Metody te mogą być wykorzystane do diagnostyki, na przykład w celu udowodnienia, że mutacja RYR1 funkcjonalnie zmienia homeostazę wapnia, a także do zbadania potencjalnej funkcji terapeutycznej związku. W zależności od wiedzy i umiejętności technicznych danego badacza, eksperymenty testowe powinny być wykonywane przed użyciem rzeczywistych próbek od pacjentów. Aby monitorować zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia w limfocytach B przekształconych przez EBV, ponownie zawiesić unieśmiertelnione komórki B w stężeniu od jednego razy 10 do siódmego na mililitr w roztworze Krebsa Ringera i Fura-2 AM do końcowego stężenia pięciu mikromolowców na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w świeżym roztworze Krebsa Ringera w stężeniu dwa razy od 10 do szóstych komórek na mililitr. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu ponownie odwiruj komórki i szybko zawieś je ponownie w 1,5 mililitra roztworu Krebsa Ringera uzupełnionego 0,5-milimolowym EGTA, ale bez dodatku wapnia. Przenieś komórki do szklanej, trzymililitrowej kuwety spektrofluorometru i zapisuj współczynnik fluorescencji na spektrofluorometrze wyposażonym w mieszadło magnetyczne ustawione na maksymalną prędkość i 37 stopni Celsjusza przez około 30 sekund.Aby ocenić reakcję uwalniania wapnia w pojedynczych komórkach, umieść jeden razy 106 komórek załadowanych Fura-2 AM w jednym mililitrze roztworu Krebsa Ringera uzupełnionego jednomilimolowym chlorkiem wapnia na pojedynczych szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną i inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut. Gdy komórki się przyczepią, umieść szkiełko nakrywkowe w komorze perfuzyjnej i rozpocznij perfuzję komórek przy dwóch mililitrach roztworu Krebsa Ringera uzupełnionym jednomilimolowym natężeniem przepływu wapnia na minutę. Korzystając z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w 40-krotny obiektyw zanurzający w oleju i odpowiednie filtry, rejestruj pomiary online za pomocą sterowanej programowo, sprzężonej z ładunkiem nasadki do kamery w odstępach jednosekundowych, przy stałym czasie ekspozycji.Aby uzyskać stymulację komórek, użyj stymulatora perfuzji komórek z 12 zaworami, aby dodać różne stężenia agonisty. Aby wyizolować miotubetki z biopsji mięśni ludzkich, najpierw przepłucz biopsję sterylnym PBS, aby usunąć nadmiar krwi, a następnie rozdrobnij tkankę na małe fragmenty o wielkości od 0,5 do jednego milimetra. Umieścić dwa do trzech fragmentów w indywidualnych wkładkach w każdym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 1,5 mililitra pożywki do wzrostu mięśni ludzkich na dołek i 500 mikrolitrów pożywki na wkładkę, a następnie umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych.Aby zmierzyć zmiany w ekspresji wapnia w ludzkich miotubach, gdy można zaobserwować wielojądrowe miotuby, zastąp supernatanty hodowli miotubowych świeżą pożywką różnicującą uzupełnioną 10 mikrolitrami jednomilimolowego Fura-2 AM na 30-minutową inkubację w inkubatorze hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji przenieść jedną szklaną kulturę szkiełka przykrywkowego do komory perfuzyjnej i przepłukać komórki roztworem Krebsa Ringera uzupełnionym dwumilimolowym chlorkiem wapnia. Następnie wykonaj pomiary wapnia online, jak pokazano przy użyciu obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie.W tej reprezentatywnej analizie zaobserwowano szybki wzrost wapnia w unieśmiertelnionych przez EBV limfocytach B po dodaniu agonisty, który z czasem powoli spadał z powrotem do poziomu spoczynkowego. W podobnym eksperymencie dodanie 400-nanomolowej thapsigarginy spowodowało duży stan przejściowy wapnia, który osiągnął szczytową wartość fluorescencji wynoszącą 2,4 dowolnej jednostki. Tę wartość fluorescencji uznano za równą 100%, gdy skonstruowano odpowiednią krzywą odpowiedzi na dawkę.W tej analizie unieśmiertelnione limfocyty B stymulowano pięciomilimolową kofeiną przez 20 sekund, co spowodowało natychmiastowy wzrost współczynnika fluorescencji 340 i 380 nanometrów. Dla każdego badanego stężenia kofeiny obliczono pik wywołany kofeiną w stosunku 340 na 380 nanometrów fluorescencji i wykorzystano go do skonstruowania krzywej dawka-odpowiedź. Uwalnianie wapnia ze zróżnicowanych miotub można również ocenić w odpowiedzi na płukanie chlorkiem potasu, różnymi stężeniami agonisty i/lub kofeiny, a także można wygenerować normalne krzywe odpowiedzi na dawkę.Ważne jest, aby upewnić się, że komórki są prawidłowo załadowane Fura-2 i że zarówno długości fal 340, jak i 380 nanometrów reagują na dodanie agonisty. Wewnątrzkomórkowe pomiary wapnia za pomocą fluorescencyjnych wskaźników wapnia można badać w większości komórek ssaków i można je stosować do badania wewnątrzkomórkowych zmian wapnia w odpowiedzi na różne bodźce.

functional-characterization-endogenously-expressed-human-ryr1

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Przedstawiona tutaj jest stopniowa procedura różnicowania in vitro ludzkich pierwotnych keratynocytów poprzez hamowanie kontaktu, a następnie charakterystykę na poziomie molekularnym za pomocą analizy sekwencyjnej RNA.

Charakterystyka różnicowania in vitro ludzkich keratynocytów pierwotnych za pomocą analizy RNA-Seq

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Opracowano prostą i skalowalną metodę oceny funkcjonalnego znaczenia wariantów missense w Ube3a, genie, którego utrata i zysk funkcji są związane zarówno z zespołem Angelmana, jak i zaburzeniem ze spektrum autyzmu.

Skalowalna, komórkowa metoda oceny funkcjonalnej wariantów Ube3A

Badanie to wprowadza wieloskalowe ramy, obejmujące od DNA po funkcję białek i zachowanie neuronalne. Przedstawiono w nim nowatorskie podejście do badania przewidywanych mutacji patogennych w podjednostce receptora GABAA , stawiając hipotezę, że mutacje padaczkowe i mutacje proksymalne, przewidywane jako patogenne, mogą mieć podobny wpływ na model neuronu piramidowego CA1.

Identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora GABAA pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa

Poznaj metodę oceny funkcjonalnego wpływu mutacji RYR1 w ludzkich limfocytach B zakażonych wirusem EBV oraz komórkach mięśniowych pochodzących od pacjentów. Technika ta pozwala badać homeostazę wapnia i testować potencjalne terapie.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Przeglądaj więcej filmów