Name: Poczwórna szachownica: modyfikacja trójwymiarowej szachownicy do badania kombinacji leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj technikę poczwórnej szachownicy do kompleksowej analizy kombinacji czterech leków przeciwko wielolekowym szczepom bakterii, w tym E. coli ESBL. Metoda umożliwia szybkie uzyskanie wyników i ocenę synergii lekowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Kroki przygotowawcze
<ol>
	<li>Przygotować bulion Müller-Hinton (MHB), dodając 25 g bulionu MH do 1 l wody destylowanej i wymieszać. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 2,5 h. Następnie przechowuj autoklawowane media w temperaturze pokojowej lub w lodówce.</li>
	<li>Przeprowadzić subhodowlę badanych bakterii (E. coli ESBL) na pożywce agarowej przy użyciu metody smug czterokwadrantowych i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej pętli weź jedną kolonię i rozprowadź ją w pierwszej połowie płytki agarowej MacConkey, wykonując bliskie równoległe smugi.</li>
		<li>Za pomocą pętli rozprowadź bakterie w drugiej ćwiartce, przesuwając ją od pierwszej ćwiartki.</li>
		<li>Z drugiej ćwiartki przedłuż smugi w trzeciej ćwiartce, używając bliskich równoległych smug.</li>
		<li>Rozprowadź bakterie w środku czwartej ćwiartki, przesuwając ją z trzeciej ćwiartki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie panelu
<ol>
	<li>Umieść cztery 96-dołkowe płytki obok siebie, aby utworzyć kwadrat. Za pomocą taśmy sklej ich spód razem.</li>
	<li>Powtórz ten krok, aby uzyskać cztery panele, z których każdy zawiera 4 tabliczki i nazwij je A1, A2, A3 i A4.</li>
	<li>Dodać 50 μl bulionu MH do studzienek między kolumną 2 a kolumną 11 w 16 96-dołkowych płytkach czterech paneli.</li>
	<li>Dodać 200 μl bulionu MH do studzienki H12 służącej jako studzienka kontroli ujemnej w 16 96-dołkowych płytkach czterech paneli.</li>
	<li>Dodać 150 μl bulionu MH do studzienek A1 i H1 służących jako studzienki kontroli pozytywnej w 16 96-dołkowych płytkach czterech paneli.</li>
</ol>
3. Lek 1, Cefotaksym, seryjne rozcieńczanie
<ol>
	<li>Do stożkowej probówki dodać 15 ml sterylnego dH2O.
	<ol>
		<li>Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C1V1 = C2V2. Zatem V1 = (C2 x 15 ml) / C1, 
		UWAGA: W naszym przypadku roztwór podstawowy cefotaksymu wynosi 105 μg / ml, a C2 to 256 μg / ml; zatem V1 = 38,4 μL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć obliczoną objętość z 15 ml sterylnego dH2O, a następnie dodać lek.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 50 μl przygotowanego roztworu leku do każdego studzienki w kolumnie 11 i kolumnie 12 z wyjątkiem H12.</li>
	<li>Rozcieńczanie seryjne rozpocząć od usunięcia 50 μl z kolumny 11 i umieszczenia go w odpowiednich studzienkach w kolumnie 10, a następnie od 10 aż do osiągnięcia kolumny 2, gdzie 50 μl pobrane z kolumny 2 zostanie odrzucone.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.4 i 3.5 dla wszystkich 16 96-dołkowych płytek z czterech paneli.</li>
</ol>
4. Lek 2, Amkacyna, seryjne rozcieńczanie
<ol>
	<li>Do stożkowej probówki dodać 10 ml sterylnego dH2O.</li>
	<li>Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C1V1 = C2V2. Zatem V1 = (C2 x 10 ml) / C1, 
	UWAGA: W naszym przypadku roztwór podstawowy amikacyny wynosi 103 μg / ml, a C2 to 64 μg / ml; zatem V1 = 64 μL.</li>
	<li>Usunąć obliczoną objętość z 10 ml sterylnego dH2O, a następnie dodać lek.</li>
	<li>Weź osiem oddzielnych płytek 96-dołkowych.</li>
	<li>Do każdej płytki dodać 100 μl MHB do studzienek między rzędami G i B.</li>
	<li>Dodaj 100 μl wcześniej przygotowanego roztworu leku 2 do studzienek rzędu G.</li>
	<li>Rozcieńczyć szeregowo od rzędu G do rzędu B, pobierając 100 μl z każdej studzienki i na koniec wyrzucić 100 μl z dołków rzędu B.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.5, 4.6 i 4.7, aby przygotować osiem płytek.</li>
</ol>
5. Przeniesienie leku 2 do czterech paneli
<ol>
	<li>Pobrać pipetą 50 μl leku 2 ze studzienek między rzędami G i B do odpowiednich studzienek w każdej płytce w czterech panelach. Jedna przygotowana płytka 96-dołkowa zawiera 100 μl leku 2, co wystarcza na dwie płytki w jednym panelu.</li>
</ol>
6. Lek 3, Lewofloksacyna, dodatek
<ol>
	<li>Do czterech różnych stożkowych probówek dodać 14 ml sterylnego dH2O.</li>
	<li>Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C1V1 = C2V2. Zatem V1 = (C2 x 14 ml) / C1, 
	UWAGA: W naszym przypadku lewofloksacyna jest przygotowywana w czterech różnych stężeniach z roztworu podstawowego 5 x 103 μg/mL. 
	C1 = 2 μg/ml, V1 = 5,6 μl 
	C2 = 4 μg/ml, V1 = 11,2 μl 
	C3 = 8 μg/ml, V1 = 22,4 μl 
	C4 = 16 μg/ml, V1 = 44,8 μl</li>
	<li>Z każdej probówki usunąć obliczoną objętość z 14 ml sterylnegodH2O, a następnie dodać lek.</li>
	<li>Po przygotowaniu wymaganych stężeń trzeciego leku, pobrać 50 μl i dodać go do odpowiednich studzienek między rzędami B i G oraz kolumnami 2 i 12 na odpowiedniej płytce w każdym panelu, gdzie C1 odpowiada czterem płytkom P1 w czterech panelach, C2 odpowiada czterem płytkom P2 w czterech panelach, C3 odpowiada czterem płytkom P3 w czterech panelach, a C4 odpowiada czterem tabliczkom P4 w czterech panelach.</li>
</ol>
7. Lek 4, trimetoprim-sulfametoksazol, dodatek
<ol>
	<li>Do stożkowej probówki dodać 14 ml sterylnego dH2O.</li>
	<li>Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku zgodnie ze wzorem C1V1 = C2V2. Zatem V1 = (C2 x 14 ml) / C1, 
	UWAGA: W naszym przypadku trimetoprim-sulfametoksazol jest przygotowywany w czterech różnych stężeniach z roztworu podstawowego 48 x 103 μg/ml. 
	C1 = 512 μg/ml, V1 = 149,33 μL 
	C2 = 1024 μg/ml, V1 = 298,66 μL 
	C3 = 2048 μg/ml, V1 = 597,33 μL 
	C4 = 4096 μg/ml, V1 = 1 194,66 μL</li>
	<li>Usunąć obliczoną objętość z 14 ml sterylnego dH2O z każdej probówki, a następnie dodać lek.</li>
	<li>Po przygotowaniu wymaganych stężeń czwartego leku należy pobrać 50 μl i dodać go do odpowiednich studzienek między rzędami B i G oraz kolumnami 2 i 12 na czterech płytkach w odpowiednim panelu, gdzie C1 odpowiada panelowi 1, C2 odpowiada panelowi 2, C3 odpowiada panelowi 3, a C4 odpowiada panelowi 4.</li>
</ol>
8. Przygotowanie i dodanie inokulum bakteryjnego E. coli ESBL
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli przenieś jedną kolonię izolatu bakteryjnego E. coli ESBL uprzednio wyhodowanego na płytce do 2 ml sterylnego MHB i wiru.</li>
	<li>Sprawdź zmętnienie w miejscu, w którym powinno wynosić 0,5 McFarlanda za pomocą densytometru.</li>
	<li>Dodaj 80 ml sterylnego bulionu MH do sterylnego kubka na mocz.</li>
	<li>Dodać inokulum bakteryjne z inokulum 0,5 McFarlanda do kubka na mocz zgodnie z C1V1 = C2V2, gdzie V1 = (106 x 80 ml) / 108 = 800 μL.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl roztworu inokulum 106 jtk/ml do każdej studzienki z wyjątkiem H12, która jest studzienką kontrolną sterylności.</li>
	<li>Inkubować panele w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Po inkubacji dodaj 50 μl jodotetrazolu, aby zarejestrować wzrost w studzienkach.</li>
</ol>
9. Protokół dla szablonu FIC (plik uzupełniający)
<ol>
	<li>Wpisz najwyższe stężenie leku 1 (cefotaksym) w żółtej komórce w panelu A.</li>
	<li>Wpisz najwyższe stężenie leku 2 (amikacyny) w żółtej krwince w panelu B.</li>
	<li>Wpisz najwyższe stężenie leku 3 (lewofloksacyny) w żółtej krwince w panelu C.</li>
	<li>Wpisz najwyższe stężenie leku 4 (trimetoprim-sulfametoksazol) w panelu D.</li>
	<li>Śledź czerwoną linię (interfejs Wzrost/brak wzrostu), podświetlając na czerwono studnie z wzrostem.</li>
	<li>Wpisz wartość MIC leku 1 w tabeli leku 1 (ATB1).</li>
	<li>Wpisz wartość MIC leku 2 w tabeli leku 2 (ATB2).</li>
	<li>Wpisz wartość MIC leku 3 w tabeli leku 3 (ATB3).</li>
	<li>Wpisz wartość MIC leku 4 w tabeli leku 4 (ATB4).</li>
	<li>Aby obliczyć FIC dla ATB1
	<ol>
		<li>Określ studnie w interfejsie Wzrost/brak wzrostu.</li>
		<li>W tabeli ATB1 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu A do pierwszej wybranej studni.</li>
		<li>Powtórz krok 9.10.2 dla każdej wybranej studzienki, w której studzienka 1 odpowiada FIC1, studzienka 2 odpowiada FIC2 i tak dalej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby obliczyć FIC dla ATB2
	<ol>
		<li>W tabeli ATB2 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu B do pierwszej wstępnie wybranej studni.</li>
		<li>Powtórz krok 9.11.1 dla każdej wstępnie wybranej studni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby obliczyć FIC dla ATB3
	<ol>
		<li>W tabeli ATB3 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu C do pierwszej wstępnie wybranej studni.</li>
		<li>Powtórz krok 9.12.1 dla każdej wstępnie wybranej studni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby obliczyć FIC dla ATB4
	<ol>
		<li>W tabeli ATB4 kliknij dwukrotnie komórkę obok FIC1 i przeciągnij żółtą komórkę po lewej stronie panelu D do pierwszej wstępnie wybranej studni.</li>
		<li>Powtórz krok 9.13.1 dla każdej wstępnie wybranej studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W tabeli oznaczonej ATB1+2+3+4 automatycznie zsumuj FIC1 każdego ATB. To samo stanie się z innymi FIC (FIC2, FIC3 itd.).
	<ol>
		<li>W komórce zawierającej FIC i podświetlonej na żółto kliknij na nią dwukrotnie i wybierz zsumowane ΣFIC z tabeli ATB1+2+3+4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz te kroki dla każdego z dziewięciu arkuszy reprezentujących dziewięć płyt. 
	UWAGA: W arkuszu FIC all tabela pokaże ostateczną zsumowaną FIC wraz z interpretacją uzyskanej wartości.</li>
</ol>
10. Oznaczanie MIC za pomocą testu mikrorozcieńczenia dla czterech leków
<ol>
	<li>Oznacz cztery różne wiersze skrótem każdego badanego leku. Na przykład CTX dla cefotaksymu, AMK dla amikacyny, LEVO dla lewofloksacyny i SXT dla trimetoprimu-sulfametoksazolu.</li>
	<li>Odpipetować 200 μl sterylnego bulionu Muller Hinton do dołka nr 1 i dołka nr 12 w każdym używanym rzędzie. Studnia numer 12 będzie służyć jako studnia kontroli negatywnej.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl sterylnego bulionu Mullera Hintona do studzienek od 2 do 11 w każdym używanym rzędzie.</li>
	<li>Obliczyć objętość każdego leku, który ma zostać dodany, korzystając ze wzoru C1V1 = C2V2. Zatem V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 to końcowa objętość w studzienkach, która wynosi 200 μl, C1 to stężenie roztworu podstawowego, a C2 to początkowe stężenie, które musimy mieć w pierwszym dołku. 
	UWAGA: W tym przypadku używamy następujących elementów: 
	Cefotaksym: C1 = 105 μg/ml, gdzie rozcieńczamy go do 104 μg/ml, C2 = 256 μg/ml; zatem V1 = 20,48 μL 
	Amikacyna: C1 = 103 μg/ml, C2 = 64 μg/ml; zatem V1 = 51,2 μL 
	Lewofloksacyna: C1 = 5 x 103 μg/ml, gdzie rozcieńczamy ją do 5 x 102 μg/ml, C2 = 16 μg/ml; zatem V1 = 25,6 μL 
	trimetoprim-sulfametoksazol: C1 = 48 x 103 μg/ml, C2 = 4096 μg/ml; zatem V1 = 68,26 μL</li>
	<li>Odpipetować wymaganą objętość dla każdego leku w pierwszym dołku odpowiedniego rzędu po usunięciu tej samej objętości z bulionu o objętości 200 μl, aby uzyskać całkowitą objętość 200 μl po dodaniu leku.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczać, usuwając 100 μl z dołka 1 do studzienki 2 i tak dalej, aż do osiągnięcia studzienki 10, gdzie 100 μl usunięte z dołka 10 zostanie odrzucone. Należy zauważyć, że studzienka 11 służy jako studnia kontroli pozytywnej.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl z 106 przygotowanych inokulum bakteryjnych do każdej studzienki w każdym używanym rzędzie, z wyjątkiem studzienki nr 12 służącej jako kontrola ujemna.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
</ol>

<ol><li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+resistance+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li>
<li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistance+crisis%3A+part+1%3A+causes+and+threats%5BTitle%5D)+AND+%22P+%26+T%3A+A+Peer-Reviewed+Journal+for+Formulary+Management%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li>
<li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+Are+we+in+the+post-antibiotic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+at+the+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li>
<li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+interactions%3A+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li>
<li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases%3A+role+of+antibiotic+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Diagnostic+Research%3A+JCDR%22%5BJournal%5D)">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li>
<li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy%3A+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+against+Microbial+Pathogens%3A+Communicating+Current+Research+and+Technological+Advances%22%5BJournal%5D)">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li>
<li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+drugs%2C+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li>
<li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li>
<li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li>
<li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+principles+of+antimicrobial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li>
<li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+combinations%3A+Should+they+be+tested%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li>
<li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+does+2+plus+2+equal+5%3F+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li>
<li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin%2C+meropenem%2C+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479(2015).</li>
<li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li>
<li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1(2003).</li>
</ol>

Metoda poczwórnej szachownicy przypomina w swoim protokole szachownicę i trójwymiarową szachownicę. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka kluczowych kroków, aby uniknąć błędów podczas eksperymentu.
Upewnij się, że przetestowałeś MIC każdego leku w stosunku do badanego izolatu przed rozpoczęciem protokołu, aby wiedzieć, jakie są stężenia, które są potrzebne do rozpoczęcia rozcieńczania dla leku 1 i leku 2, które należy seryjnie rozcieńczać w płytkach. W odniesieniu do leku 3 i leku 4 należy równi...

Wraz ze wzrostem oporności spowodowanym nadużywaniem i niewłaściwym stosowaniem antybiotyków1,2, potrzeba opracowania nowych leków i środków do leczenia infekcji bakteryjnych stała się kluczowa. Nowe podejścia, takie jak opracowywanie nowych leków, są bardzo ważne dla przezwyciężenia kryzysu związanego z opornością. Przemysł farmaceutyczny nie jest jednak zainteresowany opracowywaniem nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Co więcej, jeśli zostaną opracowane nowe leki, bakterie będą nadal ewoluować i rozwijać oporność przeciwko tym nowym lekom3,4. W związku z tym problem oporności nie zostanie rozwiązany, co sprawia, że potrzeba innego podejścia jest koniecznością, którą należy rozważyć i zbadać, aby przezwyciężyć oporność bakterii.
Kombinacja leków to bardzo ważna koncepcja leczenia infekcji bakteryjnych, głównie tych, które są wywoływane przez patogeny wielolekooporne5,6. Skraca przebieg leczenia, zmniejsza podawaną dawkę; W ten sposób zmniejszenie toksyczności danego leku, pomaga w zmniejszeniu tempa rozwoju oporności i w pewnym sensie uwrażliwia bakterie na dane leki, zgodnie z opisem w pojęciu czułości ubocznej5,7,8,9.
Rozwój oporności na jeden lek wymaga pojedynczej mutacji; jednak rozwój oporności na kombinację leków ukierunkowanych na wiele szlaków wymaga kilku niezależnych mutacji, które są spowalniane przez tę kombinację. Przykładem zmniejszonej oporności podczas stosowania terapii skojarzonej jest obniżony wskaźnik oporności na ryfampicynę w Mycobacterium tuberculosis10. Innym przykładem jest badanie przeprowadzone przez Gribble i wsp., które wykazało, że tempo pojawiania się opornych szczepów u pacjentów przyjmujących samą piperacylinę jest wyższe niż u pacjentów przyjmujących kombinację karboksypenicyliny i aminoglikozydu10. Badania wykazały, że rozwój oporności na aminoglikozydy u ewoluujących bakterii sprawił, że szczepy te stały się wrażliwe na różne inne leki5. Połączenie leku z grupy beta-laktamów amoksycyliny i inhibitora laktamazy, kwasu klawulanowego, wykazało sukces w leczeniu opornych szczepów bakteryjnych8.
Skrócenie czasu leczenia jest dobrą zaletą wynikającą z kombinacji leków. Na przykład, terapia skojarzoną penicyliną lub ceftriaksonem z gentamycyną przez 2 tygodnie da taką samą skuteczność, jak penicylina lub sam ceftriakson, gdy jest podawana przez 4 tygodnie11. Łączenie leków pozwala na stosowanie niższych dawek leków, które nie są skuteczne, gdy są podawane samodzielnie, takich jak Sub-MIC. Przykład sulfonamidów można podać, gdzie stosowanie potrójnych sulfonamidów minimalizuje, przy niższych dawkach, wytwarzaną toksyczność, którą jest tworzenie się kryształów lub krystaluria przy stosowaniu nierozpuszczalnych sulfonamidów w pełnych dawkach12.
Tak więc, zmniejszenie podawanej dawki i czasu leczenia ostatecznie zmniejszy toksyczność leków na organizm. Pomysł opracowania metod oceny interakcji między lekami złożonymi jest bardzo ważny. W jednym z badań wyniki wykazały, że terapia skojarzona jest bardziej skuteczna w leczeniu opornych gatunków Acinetobacter i P. aeruginosa8.
Podawanie leków w połączeniu 
Istnieją różne metody, za pomocą których możemy badać kombinacje leków, takie jak metoda szachownicy, metoda krzywej zabijania w czasie i metoda testu E13. Metoda szachownicy może badać wszystkie możliwe kombinacje między dwoma danymi lekami w jednym eksperymencie. Ponadto został opracowany do badania kombinacji trzech leków14. Teraz rozszerzamy tę metodę, aby zbadać kombinację czterech leków, głównie do leczenia patogenów wielolekoopornych.
Test krzywej zabijania w czasie jest zwykle wykonywany w celu sprawdzenia bakteriobójczego działania określonego leku. Stosowano go również do testowania wpływu kombinacji leków, w których kilka leków jest łączonych w określonych stężeniach. Protokół ten wymaga przygotowania kilku sterylnych probówek lub kubków, w których do każdej filiżanki dodajemy bulion, kombinację leków i wymagany szczep bakterii. Po inkubacji i zarejestrowaniu gęstości optycznej w kilku punktach czasowych, wyniki są porównywane z normalnym tempem wzrostu użytego szczepu, aby sprawdzić, czy tempo wzrostu wzrosło, zmniejszyło się, czy nie uległo zmianie13.
Metoda testu E jest zwykle wykonywana w celu sprawdzenia minimalnego stężenia hamującego (MIC), gdzie pasek zawierający gradientowe stężenie danego leku jest umieszczany na zaszczepionej płytce. Został on również wykorzystany do przetestowania kombinacji między dwoma lekami, w której dwa paski są dodawane do płytki w sposób prostopadły, przecinając się w ich MICs13.
Według literatury, nie ma złotego standardu do definiowania i badania synergii; dlatego trudno jest ocenić, która z metod używanych do badania kombinacji jest lepsza i która daje lepsze i bardziej wiarygodne wyniki13. Jednak test zabijania czasu jest pracochłonny, czasochłonny i kosztowny15,16, podczas gdy metoda E-test została opracowana do badania kombinacji tylko dwóch leków. Checkerboard może badać wszystkie możliwe kombinacje między dwoma testowanymi lekami i dlatego ta technika została wybrana do opracowania.

<table><tbody><tr><td>1000 &mikro; L końcówki</td><td>Citotest</td><td>4330000402</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; Końcówki L</td><td>Citotest</td><td>4330-0013-17</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>430828 do</td><td></td><td>przygotowania leku 3 i 4</td></tr><tr><td>5 ml polistyrenu okrągłodenna probówka</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Do przygotowania inokulum bakteryjnego 0,5 MacFarlanda</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 90 mm</td><td>JRZ Plastilab</td><td></td><td>Jako łóżko do dodawania roztworów za pomocą pipety wielokanałowej</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>corning</td><td>3596</td><td>Do seryjnego rozcieńczania i łączenia leków</td></tr><tr><td>Bactrim 200, 40 mg (trimetoprim-sulametoksazol</td><td>Przez CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, Francja</td><td>10177403</td><td>Lek 4</td></tr><tr><td>Ceforan, 1 g (Cefotaksym)</td><td>PHARCO Pharmaceuticals</td><td>24750/2006</td><td>Lek 1</td></tr><tr><td>Densytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczep E. Coli ESBL</td><td>Odzyskany jako szczep medyczny z Saint-George Szpital Liban</td><td></td><td>Szczep bakteryjny</td></tr><tr><td>Mac Conkey + agar krystaliczny</td><td>fioletowy BIO-RAD</td><td>64169508</td><td>Do wytwarzania płytek agarowych używanych do subkulturu</td></tr><tr><td>Miacin 500 mg/2 ml (Amikacyna)</td><td>HIKMA Pharmaceuticals</td><td>2BXMIA56N-AEF</td><td>Lek 2</td></tr><tr><td>Rosół Muller-Hinton</td><td>BIO-RAD</td><td>69444</td><td>Do wytwarzania pożywek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>GJ54761</td><td>Do seryjnego rozcieńczania i dodawania pożywki, bakterii i leków</td></tr><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td><td></td>papierowa</tr><tr><td>Pipety jednokanałowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>OH19855 HH40868</td><td>Do dodawania pożywki, bakterii i leków</td></tr><tr><td>Tavanic, 500 mg (Lewofloksacyna)</td><td>sanofi aventis</td><td>221937/2009</td><td>Lek 3</td></tr></tbody></table>

poczwórna szachownica: modyfikacja trójwymiarowej szachownicy do badania kombinacji leków

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Koncepcja terapii skojarzonej staje się bardzo ważna, głównie wraz z drastycznym wzrostem oporności na leki. Poczwórna szachownica, zwana również szachownicą Q, ma na celu maksymalizację liczby możliwych kombinacji, które można uzyskać między czterema lekami w jednym eksperymencie, aby zminimalizować czas i pracę potrzebną do osiągnięcia tych samych wyników przy użyciu innych protokołów. Protokół ten opiera się na prostej technice mikrorozcieńczania, w której leki są rozcieńczane i łączone razem w kilku 96-dołkowych płytkach.
W pierwszym zestawie 96-dołkowych płytek dodaje się bulion Mullera-Hintona, a następnie pierwszy wymagany lek (np. tutaj Cefotaxim), aby go seryjnie rozcieńczyć. Po wykonaniu pierwszego etapu, kolejny zestaw 96-dołkowych płytek jest używany do rozcieńczenia drugiego leku (np. Amikaci), który zostanie przeniesiony poprzez usunięcie określonej objętości leku 2 i umieszczony w odpowiednich dołkach w pierwszym zestawie 96-dołkowych płytek, który zawiera lek pierwszy. Trzeci krok polega na dodaniu wymaganych stężeń trzeciego leku (np. Lewofloksacyny) do odpowiednich płytek w zestawie początkowym zawierającym kombinację leku 1 i 2. Czwarty krok wykonuje się poprzez dodanie wymaganych stężeń czwartego leku (np. trimetoprimu-sulfametoksazolu) do odpowiednich płytek w pierwszym zestawie. Następnie zostanie przygotowany i dodany inokulum bakteryjne E. coli ESBL.
Ta metoda jest ważna do oceny wszystkich możliwych kombinacji i daje szerszy zakres możliwości do testowania dodatkowo do testów in vivo. Pomimo tego, że jest to męcząca technika wymagająca dużego skupienia, wyniki są niezwykłe i oszczędzają czas, ponieważ w jednym eksperymencie można przetestować wiele kombinacji.

Rysunek 2A przedstawia wyniki uzyskane po połączeniu cefotaksimu i amikacyny z określonymi stężeniami lewofloksacyny oraz trimetoprymu-sulfametoksazolu. W lewej części rysunku widoczne są cztery płytki, których schematy wraz ze stężeniami leków znajdują się w prawej części rysunku. Strzałki wskazują studzienki na granicy wzrostu/braku wzrostu. Kolorowe studzienki to te, w których odnotowano wzrost. Zauważamy, że na czwartej płytce nie występuje wzrost w kwadrancie zawierającym kombinację lek...

Ten protokół opisuje, jak badać wszystkie możliwe kombinacje, które można uzyskać między czterema lekami w jednym eksperymencie. Metoda ta opiera się na standardowym teście mikrorozcieńczania na 96-dołkowej płytce i obliczeniu frakcyjnych stężeń hamujących (FIC) w celu oceny wyników.

Poczwórna szachownica: modyfikacja trójwymiarowej szachownicy do badania kombinacji leków

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Poczwórna szachownica to technika, która bada wszystkie możliwe kombinacje, które można uzyskać, łącząc cztery leki, i ważne jest, aby znaleźć leczenie dla opornych mikroorganizmów, głównie MDR lub znanych również jako mikroorganizmy wielolekooporne. Technika ta nie jest pracochłonna, a wyniki można uzyskać następnego dnia lub po zakończeniu okresu inkubacji. Oprócz tego może badać wszystkie możliwe kombinacje, a nie tylko specyficzne i bardzo ograniczone kombinacje, które można uzyskać, łącząc te cztery leki i wszystko, wszystko w jednym eksperymencie.Oprócz tego technika ta może być stosowana w wielu dyscyplinach i to nie tylko w mikrobiologii, a nawet w mikrobiologii. Może badać wszystkie możliwe kombinacje różnych środków przeciwdrobnoustrojowych, a nie tylko środków przeciwbakteryjnych. Oprócz części mikrobiologicznej może być stosowany w celu badania kombinacji między lekami przeciwnowotworowymi, między ekstraktami roślinnymi a lekami, a nawet między panelami skutecznych molekularnych terapii molekularnych.Miejsce przygotowania 4 96, płytki dołkowe obok siebie, aby uformować kwadrat za pomocą taśmy, sklej ich dno razem. Powtórz ten krok, aby uzyskać cztery panele, z których każdy zawiera cztery płytki i nazwij je jedynką, dwójką, trójką i czwórką. Dodaj 50 mikrolitrów Muellera.Wskazówka i bulion do studzienek między kolumną drugą a kolumną 11 w 1696 r., płytki studzienne czterech paneli dodają 200 mikrolitrów bulionu Muellera Hintona do studzienki H 12, służąc jako kontrola ujemna. Otóż w 1696 r. płytki studzienkowe z czterech paneli dodać jeden 50-mikrolitrowy bulion Muellera Hintona do studzienek A jeden i jeden H, służący jako studzienki kontroli pozytywnej w 1696 r. płytki studzienkowe czterech paneli, lek jeden cefotaksym seryjne rozcieńczanie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Sterylna woda destylowana.Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku, postępując zgodnie ze wzorem C, jeden V jeden równa się C, dwa, V, dwa. Pobrać obliczoną objętość z 15 ml sterylnej wody destylowanej i dodać taką samą objętość roztworu podstawowego leku Do stożkowej probówki pipetować 50 mikrolitrów przygotowanego roztworu leku do każdej studzienki w kolumnie 11 i kolumnie 12, z wyjątkiem studzienki H 12, rozpocząć seryjne rozcieńczanie, usuwając 50 mikrolitrów z kolumny 11 i umieszczając je w odpowiednich studzienkach w kolumnie 10, a następnie od 10 do osiągnięcia kolumny drugiej, gdzie 50 mikrolitrów pobranych z kolumny drugiej zostanie odrzuconych. Powtórzyć seryjne rozcieńczanie dla każdej z 1696 płytek dołkowych z czterech paneli.Lek dwa seryjne rozcieńczenie amiki do stożkowej probówki o pojemności 10 ml. Sterylna woda destylowana. Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku.Usunąć obliczoną objętość z 10 ml sterylnej wody destylowanej i dodać taką samą objętość roztworu podstawowego leku do stożkowej probówki. Weź oddzielną 96-dołkową płytkę, dodaj sto mikrolitrów sterylnego bulionu Muellera Hintona do studzienek między różą G a B.In tej płytki, dodaj sto mikrolitrów wcześniej przygotowanego leku. Dwa, roztwór do studzienek rzędu G. Rozcieńczyć szeregowo Od rzędu G do rzędu B, pobierając sto mikrolitrów z każdej studzienki w RO G. I na koniec wyrzucając sto mikrolitrów z dołków rzędu B. Powtórz te kroki, aby przygotować osiem oddzielnych 96-dołkowych płytek, przenieść lek dwa do czterech paneli, pipetować 50 mikrolitrów leku dwa z dołków między rzędami G i B do Odpowiednie studzienki w każdej płytce w czterech panelach, jedna przygotowana 96-dołkowa płytka zawiera sto mikrolitrów drugiego narkotyku.To wystarczy na dwie płytki w jednym panelu leku. Trzy żywe schaby oprócz czterech różnych stożkowych probówek o objętości 14 ml sterylnej wody destylowanej. Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku.Pobrać obliczoną objętość z 14 ml sterylnej wody destylowanej z każdej probówki i dodać odpowiednią objętość leku. Po przygotowaniu wymaganych stężeń trzeciego leku weź 50 mikrolitrów i dodaj go do odpowiednich studzienek między rzędami B i G oraz kolumnami drugim i 12 na odpowiedniej płytce. W każdym panelu, gdzie C, jedna odpowiada czterem P, jedna tabliczka i cztery panele, C, dwie odpowiadają czterem P, dwie płytki i cztery panele, C3 odpowiadają czterem P, trzy płytki i cztery panele, a C, cztery odpowiadają czterem P, cztery płytki i cztery panele, narkotyk: cztery trimetoprim, sulfametoksazol, dodać do stożkowej probówki, dodać 14 ml.Dąż do wody destylowanej. Obliczyć objętość, która ma zostać usunięta z roztworu podstawowego leku. Usunąć obliczoną objętość z 14 ml sterylnej wody destylowanej z każdej probówki i dodać wymaganą objętość leku.Po przygotowaniu wymaganych stężeń czwartego leku weź 50 mikrolitrów i dodaj go do odpowiednich studzienek między rzędami B i G oraz kolumnami drugą i 12. W czterech tabliczkach w odpowiednim panelu, gdzie C jeden odpowiada panelowi pierwszemu, C dwa odpowiada panelowi drugiemu, C3, odpowiada panelowi trzeciemu, a C cztery odpowiada panelowi czwartemu. Przygotowanie i dodanie inokulum bakteryjnego jest równe I-E-S-B-L za pomocą sterylnego transferu pętlowego.Jedna kolonia izolatu bakteryjnego równa się uprzednio wyhodowanej na płytce na dwa ml sterylnego bulionu Muellera Hintona i wiru Sprawdź zmętnienie tam, gdzie powinno wynosić 0,5 McFarlanda za pomocą gęstości dodaj sterylny bulion Mueller Hinton TML do sterylnego kubka na mocz dodać inokulum bakteryjne z 0,5 inokulum McFarlanda do kubka na mocz według wzoru C jeden V jeden równa się C dwa V dwa, gdzie V jeden równa się 800 mikrolitrów pipeta rurowa 50 mikrolitrów roztworu inokulum i do każdej studzienki z wyjątkiem H 12, która jest kontrolą sterylności, dobrze inkubować panele w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Ten rysunek przedstawia pierwszy panel A. Kolorowe zagłębienia to studzienki, w których występują bakterie, a czarne strzałki reprezentują dołki na wzroście.Brak interfejsu wzrostu na płytce pierwszej, drugiej i trzeciej. Widzimy, że w rzędzie D występuje zahamowanie zawierające jeden na ponad osiem MIC amikacyny, oprócz kilku sub mików cefotaksymu i lewofloksacyny, a także jeden ponad osiem MIC trimetoprimu sulfametoksazolu na tablicy czwartej. Zauważyliśmy, że w kwadrancie zawierającym kombinację nie obserwuje się wzrostu bakterii.Dzieje się tak, ponieważ w tej płytce mamy MIC lewofloksacyny, która całkowicie hamuje wzrost. Rysunek pierwszy B przedstawia panel drugi. W tym panelu widzimy, że hamowanie wzrostu bakterii obserwuje się również w RD, który zawiera sub iki cefotaksymu i lewofloksacyny oprócz jednego ponad ośmiu MIC amikacyny i jednego ponad czterech MIC trimetoprimu sulfametoksazolu figura 1 C reprezentuje panel A trzy.Na tym rysunku widzimy, że zahamowanie wzrostu bakterii jest widoczne w rzędzie C i rzędzie D zawierającym kilka sub mików cefotaksymu i lewofloksacyny oraz dodatek do połowy MIC trimetoprimu sulfametoksazolu i jeden ponad cztery MIC amikacyny w rzędzie C i jeden ponad dwa MIC amikacyny w wierszu D rysunek 1D reprezentuje panel A czwarty. W tym panelu mamy jeden MIC trimetoprimu sulfametoksazolu w połączeniu z kilkoma stężeniami cefotaksymu, amikacyny i lewofloksacyny. Na tym rysunku widzimy, że wzrost bakterii jest całkowicie zahamowany w kwadrancie zawierającym kombinację, gdzie to hamowanie jest efektem jednego MIC trimetoprimu sulfametoksazolu w arkuszu FIC, wszystko w pliku Excel.Tabela pokaże końcowy FIC dźwięku, wraz z interpretacją uzyskanej wartości. Podsumowując, technika szachownicy Q bada wszystkie możliwe kombinacje między czterema lekami w jednym eksperymencie. Wyniki są uzyskiwane następnego dnia i są interpretowane w łatwy i szybki sposób za pomocą szablonu Excel.

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.

Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

W tym protokole opisujemy, jak dokonywać pomiarów interakcji leków opartych na addytywności Loewego dla par i trójdrożnych kombinacji leków.

Metoda diagonalna do pomiaru synergii między dowolną liczbą leków

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Duże badania genetyczne w organizmach modelowych doprowadziły do identyfikacji negatywnych interakcji genetycznych. W tym miejscu opisujemy proces integracji danych z wykorzystaniem danych z badań genetycznych w organizmach modelowych w celu wyznaczenia kombinacji leków ukierunkowanych na syntetyczne śmiertelne interakcje w raku.

Przepływ pracy integracji danych w celu identyfikacji kombinacji leków ukierunkowanych na syntetyczne interakcje śmiertelne

Bis-3-chloropiperydyny (B-CePs) są użytecznymi sondami chemicznymi do identyfikacji i charakteryzowania struktur G-kwadrupleksu w matrycach DNA in vitro. Protokół ten szczegółowo opisuje procedurę przeprowadzania reakcji sondowania z B-i rozpuszczania produktów reakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym o wysokiej rozdzielczości.

In vitro Mapowanie chemiczne struktur DNA G-Quadruplex za pomocą bis-3-chloropiperydyn

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Poznaj technikę poczwórnej szachownicy do kompleksowej analizy kombinacji czterech leków przeciwko wielolekowym szczepom bakterii, w tym E. coli ESBL. Metoda umożliwia szybkie uzyskanie wyników i ocenę synergii lekowej.

Poczwórna szachownica: modyfikacja trójwymiarowej szachownicy do badania kombinacji leków

Przeglądaj więcej filmów