Name: Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj szybkie badanie wrażliwości na antybiotyki w pojedynczych bakteriach za pomocą obrazowania SRS z indukcją deuteru. Ta metoda dostarcza wyniki w ciągu 2,5 godziny bezpośrednio z moczu i krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH R01AI141439 do J.-X.C i M.S, a R35GM136223 do J.-X.C.

Wykorzystanie próbek ludzkiej krwi jest zgodne z wytycznymi IRB Uniwersytetu Bostońskiego i Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH). W szczególności okazy pochodzą z banku i są całkowicie pozbawione elementów pozwalających na identyfikację. Okazy te nie są uważane za osoby badane przez ludzi przez biuro Institutional Review Board (IRB) na Uniwersytecie Bostońskim.
1. Przygotowanie podstawowego roztworu bakterii i antybiotyków
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy antybiotyków (siarczan gentamycyny lub amoksycylina) o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczony w sterylnym rozpuszczalniku 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub dimetylosulfotlenku (DMSO) w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml. Rozpuścić siarczan gentamycyny w sterylnym roztworze PBS, a amoksycylinę w sterylnym rozpuszczalniku DMSO. Następnie roztwór antybiotyków należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C zgodnie z zaleceniami.</li>
	<li>Aby przygotowaćD2Ozawierające pożywkę bulionową Muellera-Hintona (MHB) dostosowaną kationowo, dodaj 220 mg zasady bulionowej MHB do 10 mlD2O, aby uzyskać 100% pożywki zawierającej D2O. Wysterylizuj roztwór, filtrując filtrami o wielkości porów 200 nm. 
	UWAGA: Używaj tego protokołu zawsze do sporządzania i sterylizacji roztworów pożywki w dalszych krokach.</li>
	<li>Aby przygotować próbki bakteryjne do obrazowania SRS, należy dodać 2 ml normalnej pożywki MHB, która nie zawiera deuteru, do sterylnej probówki hodowlanej z okrągłym dnem, a następnie ogrzać ją w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyj sterylnej pętli, aby wybrać jedną kolonię bakterii (Escherichia coli BW 25113 lub Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) ze świeżej kultury na tryptycznej płytce agarowej sojowej. Następnie zawieś go w podgrzanej pożywce hodowlanej i delikatnie wiruj, aby przygotować zawiesinę bakterii.</li>
	<li>Inkubować bakterie w temperaturze 37 °C w wytrząsarce z prędkością 200 obrotów na minutę (obr./min), aż osiągną fazę logarytmiczną.</li>
</ol>
2. D2O leczenie inkorekcyjne w obecności antybiotyków (<silna klasa="xfig">Rysunek 2a)
<ol>
	<li>Sprawdź stężenie bakterii, mierząc gęstość optyczną (OD) za pomocą fotometru o długości fali 600 nm.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór bakteryjny przy użyciu zwykłego podłoża MHB, które nie zawiera deuteru, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek 8 x 105 jtk/ml. Delikatnie wiruj, aby wymieszać komórki bakteryjne.</li>
	<li>Przygotować 300 μl porcji roztworu bakteryjnego w siedmiu mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml i 600 μl podwielokrotności roztworu bakteryjnego w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 4,8 μl roztworu podstawowego antybiotyku (gentamycyny lub amoksycyliny) (1 mg/ml) do mikroprobówki zawierającej 600 μl roztworu bakteryjnego, aby końcowe stężenie antybiotyku wynosiło 8 μg/ml.</li>
	<li>Pobrać 300 μl roztworu z 8 μg/ml roztworu bakterii zawierających antybiotyk i dodać do kolejnych 300 μl roztworu bakteryjnego, aby uzyskać dwukrotnie rozcieńczony roztwór bakterii zawierający antybiotyk (4 μg/ml).</li>
	<li>Powtórzyć dwukrotne seryjne rozcieńczanie badanych antybiotyków, gentamycyny lub amoksycyliny, aż do osiągnięcia mikroprobówki o najniższym stężeniu (0,25 μg/ml) i wyrzucić 300 μl z probówki. Zarówno dla gentamycyny, jak i amoksycyliny stężenia szeregowe wahają się od 0,25 μg/ml do 8 μg/ml.
	<ol>
		<li>Pozostaw jedną probówkę bez antybiotyków do ślepej próby. Będzie to kontrola pozytywna w celu sprawdzenia aktywności metabolicznej bakterii bez leczenia antybiotykami, ale z leczeniemD2O.</li>
		<li>Pozostawić jedną probówkę bez antybiotyków i bezD2Odla kontroli ujemnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować podwielokrotność bakteryjną z określonym antybiotykiem (gentamycyną lub amoksycyliną) zawierającym pożywkę MHB przez 1 godzinę.</li>
	<li>Podczas inkubacji należy przygotować seryjne rozcieńczenie antybiotyków ze 100% pożywką zawierającąD2O o tym samym gradiencie stężeń co antybiotyki przygotowane w kroku 2.6. Zarówno dla gentamycyny, jak i amoksycyliny stężenia szeregowe wahają się od 0,25 μg/ml do 8 μg/ml.</li>
	<li>Po 1 godzinie antybiotykoterapii dodać odpowiednio 700 μl seryjnie rozcieńczonego antybiotyku i 100% pożywki MHB zawierającej D2O do 300 μl bakterii wstępnie potraktowanych antybiotykiem w tym samym stężeniu antybiotyku (przygotowanym w kroku 2.6).
	<ol>
		<li>Na przykład dodaj 700 μl 100% pożywki MHB zawierającej D2O (zawierającej 8 μg/ml antybiotyku) do 300 μl bakterii wstępnie poddanych działaniu antybiotyku o stężeniu 8 μg/mL. W ten sam sposób przenieść do odpowiednich probówek o następnym stężeniu i homogenizować, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Dodać 700 μl bezantybiotykowej pożywki 100% D2O zawierającej MHB do 300 μl bakterii wolnych od antybiotyków (przygotowanych w kroku 2.6.1) jako ślepą próbę.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce inkubacyjnej z prędkością 200 obr./min przez dodatkowe 30 min. 
		UWAGA: Na tym etapie końcowe stężenieD2Ow pożywce do badania wynosi 70%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Najpierw odwirować 1 ml antybiotyku i próbki bakteryjnej poddanej działaniuD2O w temperaturze 6200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie dwukrotnie przemyć oczyszczoną wodą. Na koniec utrwalić próbki w 10% roztworze formaliny i przechowywać je w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie bakterii w środowisku moczu (Rysunek 2b)
<ol>
	<li>Aby przygotować E. coli BW 25113 w fazie logarytmicznej, wykonaj czynności opisane w punktach 1.4 i 1.5.</li>
	<li>Sprawdź stężenie bakterii, mierząc OD za pomocą fotometru o długości fali 600 nm.</li>
	<li>Aby naśladować kliniczne próbki ZUM14,18,41, wstrzyknij roztwór E. coli do 10 ml zanonimizowanego moczu, aby osiągnąć końcowe stężenie komórek 106 CFU/ml.</li>
	<li>Przefiltruj mocz z E. coli za pomocą filtra 5 μm, a następnie podziel roztwór bakteryjny na 300 μl podwielokrotności na siedem mikroprobówek o pojemności 1,5 ml i 600 μl podwielokrotności roztworu bakteryjnego w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przeprowadzić zabieg inkorporacjiD2Ow obecności antybiotyków i pobrać próbkę zgodnie z opisem w poprzednich krokach od 2.4 do 2.10.</li>
</ol>
4. Przygotowanie bakterii w środowisku krwi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2c)
<ol>
	<li>Aby przygotować Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 w fazie logarytmicznej, wykonaj czynności opisane w punktach 1.4 i 1.5.</li>
	<li>Aby naśladować kliniczne próbki zakażeń krwi42,43, wstrzyknij P. aeruginosa w 1 ml zdeidentyfikowanej krwi ludzkiej, aby osiągnąć stężenie 107 CFU/ml.</li>
	<li>Dodaj 9 ml sterylnej, oczyszczonej wody, aby zlizować krew.</li>
	<li>Przefiltruj krew wzbogaconą P. aeruginosa za pomocą filtra 5 μm. Następnie zebrać bakterie do objętości 1 ml przez odwirowanie przy 6200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 9 ml wstępnie podgrzanego normalnego MHB do roztworu bakterii i delikatnie odwirować. Końcowe stężenie bakterii wynosi 106 jtk/ml</li>
	<li>Podzielić roztwór krwi wzbogaconej P. aeruginosa na 300 μl porcji na siedem mikroprobówek o pojemności 1,5 ml i 600 μl podwielokrotności roztworu bakteryjnego w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przeprowadzić zabieg inkorporacjiD2Ow obecności antybiotyków i pobrać próbkę zgodnie z opisem w poprzednich krokach od 2.4 do 2.10.</li>
</ol>
5. Obrazowanie SRS inkorporacji metabolicznej D2O w pojedynczej bakterii
<ol>
	<li>Przemyć 1 ml utrwalonego roztworu bakteryjnego oczyszczoną wodą, a następnie odwirować przy 6200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Roztwór bakteryjny wzbogacić do około 20 μl.</li>
	<li>Umieść roztwór bakteryjny na szkle nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną. Umieścić i uszczelnić próbkę do obrazowania SRS.</li>
	<li>Obrazowanie bakterii o częstotliwości drgań C-D na wysokości 2168 cm-1 za pomocą mikroskopu SRS.
	<ol>
		<li>Wprowadź i dostosuj długość fali pompy do 852 nm za pomocą oprogramowania sterującego na komputerze.</li>
		<li>Zmierz moc lasera za pomocą miernika mocy. Ustaw moc lasera pompującego na próbce na ~8 mW, a moc lasera Stokesa na próbce na ~40 mW, regulując płytkę półfalową przed wyjściem lasera. 
		UWAGA: W mikroskopie SRS przestrajalny laser femtosekundowy o częstotliwości powtarzania 80 MHz zapewnia pompie (680 do 1300 nm) i lasery wzbudzające Stokesa (1045 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regulując zwierciadeł odbiciowych, wyrównaj przestrzennie pompę i wiązki Stokesa i skieruj obie wiązki do pionowego mikroskopu wyposażonego w system luster galvo 2D do skanowania laserowego.
	<ol>
		<li>Użyj obiektywu zanurzającego się w wodzie z 60-krotnym zanurzeniem, aby skupić pompę i lasery Stokesa na próbce.</li>
		<li>Użyj skraplacza oleju, aby zebrać sygnały z próbki w kierunku do przodu.</li>
		<li>Użyj filtra pasmowo-przepustowego, aby odfiltrować laser Stokesa przed skierowaniem go do fotodiody.</li>
		<li>Wyodrębnij wymuszony sygnał Ramana za pomocą wzmacniacza typu lock-in i wykryj sygnały za pomocą fotodiody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw każdy obraz SRS tak, aby zawierał 200 x 200 pikseli i czas przebywania pikseli wynoszący 30 μs w panelu sterowania oprogramowania. Całkowity czas akwizycji dla jednego obrazu wynosi ~1,2 s. Ustaw rozmiar kroku na 150 nm, aby rozmiar obrazu wynosił około 30 x 30 μm2. Należy narysować co najmniej trzy pola widzenia dla każdej próbki.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazów i analiza danych ( Rysunek 3)
<ol>
	<li>Aby uzyskać średnie natężenie sygnału C-D, otwórz i przetwórz obrazy SRS za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
	<li>Najpierw przekonwertuj obrazy SRS na obrazy typu 8-bitowego z odwróconym kolorem, klikając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy, a następnie Edytuj | Odwróć przyciski w oprogramowaniu ImageJ.</li>
	<li>Następnie przefiltruj obrazy za pomocą rozmycia gaussowskiego, klikając przycisk Proces | Filtry | Rozmycie gaussowskie i ustaw Sigma (promień) na 1.</li>
	<li>Użyj regulacji progu obrazu, aby wybrać obszar bakterii. Kliknij Obraz | Dostosuj | Próg, aby upewnić się, że wybrane rozmiary bakterii są zgodne z tymi na oryginalnych obrazach SRS. Wyeliminuj małe cząstki, dostosowując próg wielkości w celu określenia cząstek. Kliknij przycisk Zastosuj.</li>
	<li>Stosowanie analizy | Przyciski Analiza cząstek, aby oznaczyć i określić obszar bakterii.</li>
	<li>Klikając przycisk Pokaż wszystko w menedżerze ROI, aby uzyskać oryginalny nieprzetworzony obraz SRS, oznacz ten sam obszar bakterii, określ średnią intensywność każdego punktu danych, klikając przycisk Zmierz w menedżerze ROI.</li>
	<li>Zakreśl obszar tła na oryginalnym obrazie SRS i zmierz średnią intensywność tła. Średnią intensywność C-D każdej bakterii uzyskuje się przez odjęcie intensywności sygnału tła.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą SC-MIC
UWAGA: Wartość graniczna na poziomie 0,60 do wyznaczenia SC-MIC jest ustalana na podstawie analizy statystycznej intensywności SRS C-D w warunkach aktywnego metabolizmu i zahamowanego metabolizmu dla bakterii przy różnych stężeniach ekspozycji na lek40. Intensywności C-D dla grup wrażliwych na antybiotyki i opornych na antybiotyki dopasowano do rozkładu normalnego.
<ol>
	<li>Wykreślić krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) i ocenić próg odcięcia na poziomie 0,60. Na podstawie tej wartości granicznej można zdefiniować SC-MIC jako wskaźnik skuteczności antybiotyków w celu określenia grupy metabolicznie nieaktywnej i metabolicznie aktywnej.</li>
	<li>Aby ilościowo przeanalizować dane obrazowania SRS, należy wykreślić histogramy intensywności sygnału C-D dla każdej grupy bakterii traktowanej seryjnie rozcieńczanym stężeniem antybiotyku. Kolorowe punkty danych oznaczają różne indywidualne bakterie.</li>
	<li>Normalizować intensywność C-D w grupie leczonej antybiotykiem do średniej intensywności w grupie kontrolnej bez leczenia antybiotykami. Określ wyniki SC-MIC dla różnych kombinacji bakterii i antybiotyków, określając ilościowo intensywność sygnału SRS w regionie C-D w porównaniu z różnymi stężeniami antybiotyków przy użyciu wartości odcięcia wynoszącej 0,60.</li>
	<li>Zwaliduj i porównaj odczyt SC-MIC z odczytem MIC określonym za pomocą konwencjonalnego testu mikrorozcieńczenia bulionu.</li>
	<li>Według Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) kategoria wrażliwości na podstawie wyników obrazowania metabolicznego SRS dla każdego badanego szczepu bakteryjnego jest interpretowana jako "podatny", "oporny" lub "pośredni".</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Szybki AspAT można uzyskać, oceniając odpowiedź aktywności metabolicznej bakterii na antybiotykoterapię za pomocą obrazowania metabolicznego SRS pojedynczej komórki w ciągu 2,5 godziny od próbki do wyników SC-MIC. Odpowiedź na aktywność metaboliczną bakterii i podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe można wykryć, monitorując inkorporację metabolicznąD2Odo syntezy biomolekuł za pomocą obrazowania SRS wiązań C-D. Ponieważ woda jest powszechnie stosowana w żywych komórkach, obrazowanie metaboliczne SRS stanowi...

Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi rosnące globalne zagrożenie dla skutecznego leczenia chorób zakaźnych1. Przewiduje się, że oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe spowoduje dodatkowe 10 milionów zgonów rocznie i 100 bilionów dolarów straty globalnego PKB do 2050 roku, jeśli nie zostaną podjęte działania w celu zwalczania bakterii opornych na antybiotyki1,2. Podkreśla to pilną potrzebę szybkich i innowacyjnych metod diagnostycznych do badania wrażliwości na antybiotyki (AST) bakterii zakaźnych, aby spowolnić pojawianie się bakterii opornych na antybiotyki i zmniejszyć związany z tym wskaźnik śmiertelności3. Aby zapewnić jak najlepszy wynik kliniczny, kluczowe jest wprowadzenie skutecznej terapii w ciągu 24 godzin. Jednak obecna metoda złotego standardu, taka jak metoda dyfuzji krążkowej lub rozcieńczania bulionu, zwykle wymaga co najmniej 24 godzin na procedurę wstępnej inkubacji dla próbek klinicznych i dodatkowych 16-24 godzin na uzyskanie wyników minimalnego stężenia hamującego (MIC). Ogólnie rzecz biorąc, metody te są zbyt czasochłonne, aby pomóc w podjęciu natychmiastowej decyzji o leczeniu chorób zakaźnych w klinice, co prowadzi do pojawienia się i rozprzestrzeniania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe4.
Genotypowe metody AST, takie jak techniki oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)5, zostały opracowane w celu szybkiego wykrywania. Techniki te mierzą specyficzne sekwencje genetyczne oporności w celu uzyskania szybkich wyników AspAT. Nie polegają na czasochłonnej hodowli komórkowej; Badane są jednak tylko określone znane sekwencje genetyczne z opornością. Dlatego jego zastosowanie ogranicza się do różnych gatunków bakterii lub różnych mechanizmów oporności. Nie mogą również dostarczać wyników MIC do podejmowania decyzji terapeutycznych6,7. Poza tym opracowywane są nowatorskie metody fenotypowe dla szybkiego AST, aby przezwyciężyć te ograniczenia8, w tym urządzenia mikroprzepływowe9,10,11,12,13, optical devices14,15,16, fenotypowy AST określający ilościowo liczbę kopii kwasów nukleinowych17,18 oraz metody spektroskopowe Ramana19,20,21,22,23,24. Metody te skracają czas uzyskiwania wyników AST, jednak większość z nich ma zastosowanie tylko do izolatów bakteryjnych, a nie bezpośrednio do próbek klinicznych, i nadal wymagają długotrwałej preinkubacji.
W tej pracy prezentujemy metodę szybkiego określania podatności bakterii w moczu i krwi pełnej poprzez monitorowanie aktywności metabolicznej komórki za pomocą obrazowania SRS. Woda (H2O) bierze udział w zdecydowanej większości istotnych procesów syntezy biomolekularnej w żywych komórkach. Jako izotopolog wody, poprzez katalizowaną enzymatycznie reakcję wymiany H/D między aktywnym redoks atomem wodoru w NADPH a atomem D w D2O, deuter może zostać włączony do biomasy wewnątrz komórki25,26. W reakcji syntezy deuterowanych kwasów tłuszczowych pośredniczy NADPH znakowany deuterem. Włączenie D2O do reakcji aminokwasów (AA) powoduje produkcję białka deuterowanego26 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W ten sposób nowo zsyntetyzowane biomolekuły zawierające wiązania C-D w pojedynczych komórkach drobnoustrojów można wykorzystać jako ogólny marker aktywności metabolicznej, który ma zostać wykryty. Aby odczytać zsyntetyzowane de novo wiązania C-D, spektroskopia Ramana, wszechstronne narzędzie analityczne dostarczające specyficznych i ilościowych informacji chemicznych o biomolekułach, jest szeroko stosowana do określania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe i znacznego skracania czasu testowania do kilku godzin27,28,29,30. Jednak ze względu na nieodłącznie niską wydajność procesu rozpraszania Ramana, spontaniczna spektroskopia Ramana ma niską czułość wykrywania. W związku z tym uzyskanie wyników obrazu w czasie rzeczywistym za pomocą spontanicznej spektroskopii Ramana jest trudne. Koherentne rozpraszanie Ramana (CRS), w tym koherentne rozpraszanie Ramanowskie anty-Stokesa (CARS) i wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS), osiągnęło wysoką czułość wykrywania ze względu na koherentne pole świetlne, które generuje rzędy wielkości większe niż w przypadku spontanicznej spektroskopii Ramana, zapewniając w ten sposób szybkie, specyficzne i ilościowe obrazowanie chemiczne na poziomie pojedynczej komórki31,32,33, 34,35,36,37,38,39.
Tutaj, w oparciu o nasze najnowsze prace40, przedstawiamy protokół szybkiego określania aktywności metabolicznej i wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą femtosekundowego obrazowania C-D SRSinkorporacji D 2O bakterii w normalnym środowisku, moczu i krwi pełnej na poziomie pojedynczej komórki. Femtosekundowe obrazowanie SRS ułatwia monitorowanie stężenia inaktywacji metabolizmu pojedynczej komórki (SC-MIC) przeciwko antybiotykom na poziomie pojedynczej bakterii w ciągu 2,5 godziny. Wyniki SC-MIC są walidowane za pomocą standardowego testu MIC za pomocą mikrorozcieńczenia bulionu. Nasza metoda ma zastosowanie do określania podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe patogenów zakażeń dróg moczowych (ZUM) i zakażeń krwi (BSI) przy znacznie krótszym czasie oznaczania w porównaniu z metodą konwencjonalną, co otwiera możliwość szybkiego fenotypowego AspAT w klinice na poziomie pojedynczej komórki.

<table><tbody><tr><td>Modulacja akustyczno-optyczna</td><td>Gooch& Housego</td><td>R15180-1.06-LTD</td><td>Modulowana wiązka laserowa</td></tr><tr><td>Amoksycylina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8523-5G</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowoprzepustowy</td><td>Chroma</td><td>HQ825/150m</td><td>Blokuj wiązkę laserową stokes przed fotodiodą</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Regulacja</td></tr><tr><td>kationów Regulowany bulion Mueller-Hinton</td><td>Fisher Scientific</td><td>B12322</td><td>Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe mikroorganizmów metodami rozcieńczania bulionu</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002542</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-318</td><td></td></tr><tr><td>Probówka hodowlana z zatrzaskiem</td><td>Marka Fisher</td><td>149569B</td><td></td></tr><tr><td>Daptomycyna</td><td>Acros</td><td>A0386346</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek</td><td></td> deuteru <td>151882</td><td>Rozpuszczalnik organiczny do rozpuszczania antybiotyków</td></tr><tr><td>Tlenek deuteru-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156914</td><td>Rozpuszczalnik organiczny jako wzorzec do kalibracji systemu obrazowania SRS</td></tr><tr><td>Escherichia coli BW 25113</td><td>Centrum Genetyczne Coli</td><td>7636</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki wirówkowe Eppendorf 1,5 ml</td><td>Marka Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofilowe filtry z polifluorku winylidenu</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLSV025NB</td><td>wielkość porów 5 i mikro; m</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td>Wersja: 2.0.0-rc-69/1.52t</td><td>Przetwarzanie i analiza obrazu</td></tr><tr><td>Inkubacyjny wytrząsarka orbitalna ustawiona na 37 & stopni; C</td><td>VWR</td><td>97009-890</td><td></td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>Sigma</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee femtosekundowy laser impulsowy</td> Model <td>widmowo-fizyczny</td>: <td>insight X3</td><td>Przestrajalne źródło lasera i stałe źródło lasera o długości fali 1045 nm do obrazowania SRS</td></tr><tr><td>Wzmacniacz blokujący</td><td>Zurich Instrument</td><td>HF2LI</td><td>Demodulacja sygnałów SRS</td></tr><tr><td>Skraplacz oleju</td><td>Olympus</td><td>U-AAC</td><td>NA 1.4</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 47085</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td>Detektor</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa polipropylenowa 15 ml</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A Filtry</td><td></td></tr><tr><td>polipropylenowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2520</td><td>wielkość porów 0,2 i mikro; m</td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>07-202-031</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>marki Fisher</td><td>14955459</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model: DU 530</td><td>Pomiar gęstości optycznej przy długości fali 600 nm</td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw wodny</td><td>Olympus</td><td>UPLANAPO/IR</td><td>60 razy;, NA 1.2</td></tr></tbody></table>

szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

Aby spowolnić i zapobiec rozprzestrzenianiu się infekcji opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe, pilnie potrzebne jest szybkie testowanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST), aby ilościowo określić wpływ środków przeciwdrobnoustrojowych na patogeny. Zazwyczaj zajmuje to kilka dni, aby wykonać AST konwencjonalnymi metodami opartymi na długotrwałej hodowli, i nie działają one bezpośrednio w przypadku próbek klinicznych. W tym miejscu przedstawiamy szybką metodę AST możliwą dzięki obrazowaniu inkorporacji metabolicznej tlenku deuteru (D2O) za pomocą wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS). Za pomocą obrazowania SRS monitoruje się wprowadzanie metaboliczneD2Odo biomasy oraz hamowanie aktywności metabolicznej po ekspozycji na antybiotyki na poziomie pojedynczej bakterii. Stężenie inaktywacji metabolizmu jednokomórkowego (SC-MIC) bakterii po ekspozycji na antybiotyki można uzyskać po łącznie 2,5 godziny przygotowania próbki i jej wykrywania. Co więcej, ta szybka metoda AspAT ma bezpośrednie zastosowanie do próbek bakteryjnych w złożonych środowiskach biologicznych, takich jak mocz lub krew pełna. Obrazowanie metaboliczne SRS inkorporacji deuteru jest przełomowe dla szybkiego fenotypowego AspAT w jednej komórce w klinice.

Wpływ czasu inkubacji na wbudowywanie deuteru mierzy się za pomocą spontanicznej mikrospektroskopii Ramanowskiej w obszarach C-D (2070 do 2250 cm-1) i C-H (2,800 do 3,100 cm-1) (Rysunek 4a). Widma Ramanowskie pojedynczych komórek P. aeruginosa hodowanych w medium zawierającym 70% D2O, rejestrowane w czasie, wykazują wzrost intensywności CD/CH w miarę wydłużania czasu inkubacji od 0 do 180 min (Rysunek 4b). Rosnąca zawar...

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

Szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe można uzyskać w ciągu 2,5 godziny w moczu i krwi, co uważa się za ogromne skrócenie czasu analizy w porównaniu z konwencjonalną metodą mikrorozcieńczania bulionu. Może monitorować aktywność metaboliczną bakterii w złożonym środowisku, takim jak krew pełna. Na początek sprawdź stężenie bakterii w próbkach, mierząc gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nanometrów.Aby osiągnąć końcowe stężenie komórek osiem razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonię lub CFU na mililitr, rozcieńczyć roztwór bakteryjny za pomocą normalnego podłoża MHB bez deuteru. Po wymieszaniu komórek bakteryjnych za pomocą wiru usuń 300 mikrolitrów podwielokrotności roztworu bakteryjnego w siedmiu 1,5-mililitrowych mikroprobówkach i 600-mikrolitrową porcję roztworu bakteryjnego w jednej 1,5-mililitrowej mikroprobówce. Następnie dodaj 4,8 mikrolitra podstawowego roztworu antybiotyku do mikroprobówki zawierającej 600 mikrolitrów roztworu bakteryjnego, aby osiągnąć końcowe stężenie antybiotyku wynoszące osiem mikrogramów na mililitr.Dodać 300 mikrolitrów roztworu bakteryjnego z antybiotykiem do 300 mikrolitrów podwielokrotności roztworu bakteryjnego bez antybiotyku, aby uzyskać dwukrotnie rozcieńczony roztwór o końcowym stężeniu antybiotyku wynoszącym cztery mikrogramy na mililitr. Powtórzyć dwukrotne seryjne rozcieńczenie badanych antybiotyków, aż do osiągnięcia najniższego stężenia 0,25 mikrograma na mililitr. Wyrzuć 300 mikrolitrów roztworu z ostatniej mikroprobówki.Przydziel jedną probówkę bez antybiotyków do kontroli pozytywnej z traktowaniem deuterem, a kontroli negatywnej bez deuteru. Inkubować podwielokrotność bakteryjną z pożywką zawierającą antybiotyk MHB przez jedną godzinę. W międzyczasie należy przygotować seryjne rozcieńczanie antybiotyków pożywką zawierającą 100% deuter MHB o tych samych gradientach stężeń, jak opisano wcześniej.Po jednej godzinie inkubacji dodać 700 mikrolitrów antybiotyku seryjnie rozcieńczonego 100% pożywką zawierającą deuter do 300 mikrolitrów bakterii wstępnie potraktowanych antybiotykiem w tym samym stężeniu antybiotyku. Homogenizować mieszaninę, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowej pożywki 100% deuteru zawierającej MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontroli pozytywnej.Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowej pożywki 0% deuteru zawierającej MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontroli negatywnej. Inkubuj wszystkie mikroprobówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę przez 30 minut. Po inkubacji odwirować jeden mililitr próbki bakteryjnej poddanej działaniu antybiotyku i deuteru o masie 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie umyj granulkę dwukrotnie oczyszczoną wodą. Utrwal próbki w 10% objętościowym roztworze formaliny i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sprawdź stężenie Escherichia coli w świeżo przygotowanej próbce bakteryjnej, mierząc gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nanometrów.Aby naśladować kliniczne próbki infekcji dróg moczowych, należy wbić próbkę Escherichia coli do 10 mililitrów pozbawionych identyfikacji próbek moczu, aby osiągnąć końcowe stężenie od 10 do sześciu CFU na mililitr. Przefiltruj mocz z kolcami Escherichia coli za pomocą filtra o grubości pięciu mikronów i podziel przefiltrowany roztwór bakteryjny na 300 mikrolitrów na siedem mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra i podwielokrotność 600 mikrolitrów w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Zabieg inkorporacji deuteru należy przeprowadzić w obecności antybiotyków, jak opisano wcześniej.Aby naśladować kliniczne próbki infekcji krwi, należy zwiększyć Pseudomonas aeruginosa w jednym mililitrze pozbawionej identyfikacji ludzkiej krwi, aby osiągnąć końcowe stężenie od 10 do szóstego CFU na mililitr. Aby zlizować krew, dodaj dziewięć mililitrów sterylnej, oczyszczonej wody. Przefiltruj krew wzbogaconą Pseudomonas aeruginosa za pomocą filtra o grubości pięciu mikronów.Następnie zbierz bakterie z przefiltrowanej próbki do objętości jednego mililitra przez odwirowanie w temperaturze 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu podzielić wzbogacony roztwór krwi Pseudomonas aeruginosa w 300 mikrolitrowych podwielokrotnościach na siedem 1,5-mililitrowych mikroprobówek i 600-mililitrową porcję roztworu bakteryjnego w jednej 1,5-mililitrowej mikroprobówce i przeprowadzić leczenie wprowadzaniem deuteru w obecności antybiotyków, jak opisano wcześniej. W celu przygotowania próbki przemyj jeden mililitr utrwalonego roztworu bakteryjnego oczyszczoną wodą i odwiruj umyty roztwór bakteryjny o temperaturze 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usunąć supernatant i wzbogacić roztwór bakteryjny do około 20 mikrolitrów wysterylizowaną wodą. Umieść roztwór bakteryjny na szkle nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną, ułóż na kanapce z innym szkłem nakrywkowym i zamknij próbkę. W mikroskopie SRS przestrajalny laser femtosekundowy o częstotliwości powtarzania 80 megaherców zapewnia pompę i lasery wzbudzające Stokesa.Wiązka Stokesa jest modulowana przez modulator akustyczno-optyczny o częstotliwości 2,4 megaherca. Obie wiązki są połączone kolirowo za pomocą zwierciadła dichroicznego. Następnie pompa i wiązki Stokesa są kierowane do zbudowanego w laboratorium laserowego mikroskopu skaningowego z lustrem 2D Galvo do skanowania laserowego.Obiektyw wodny o powiększeniu 60x skupia lasery na próbce, a skraplacz oleju zbiera sygnał z próbki. Dwa filtry służą do odfiltrowywania wiązki Stokesa, podczas gdy wiązka pompy jest wykrywana przez fotodiodę, po czym stymulowany sygnał Ramana jest wydobywany przez wzmacniacz typu lock-in. Korzystając z oprogramowania sterującego, wprowadź i dostosuj długość fali pompy do 852 nanometrów.Dostosuj częstotliwość drgań C do D na liczbę fal 2, 168, aby obrazować bakterie za pomocą mikroskopu SRS. Zmierz moc lasera za pomocą miernika mocy. Ustaw moc lasera pompującego na próbce na osiem miliwatów, a moc lasera Stokesa na próbce na 50 miliwatów, regulując płytkę półfalową przed wyjściem lasera.Umieść standardową próbkę DMSO d6 na stoliku na próbkę i użyj 60-krotnego obiektywu zanurzającego w wodzie, aby skupić pompę i lasery Stokesa na próbce. Regulując luster odbiciowych, wyrównaj przestrzennie pompę i wiązki Stokesa i skieruj obie wiązki do pionowego mikroskopu wyposażonego w system luster 2D Galvo do skanowania laserowego. W programowym panelu sterowania ustaw każdy obraz SRS tak, aby zawierał 200 na 200 pikseli, a czas przebywania pikseli na 30 mikrosekund.Całkowity czas akwizycji jednego obrazu wynosi około 1,2 sekundy. Ustaw rozmiar kroku na 150 nanometrów, tak aby rozmiar obrazu wynosił około 30 na 30 mikrometrów do kwadratu. Po zoptymalizowaniu systemu wyjmij standardową próbkę i umieść próbkę bakteryjną na stoliku próbki pod obiektywem 60-krotnego zanurzenia w wodzie.Rozpocznij obrazowanie SRS próbek bakteryjnych. Należy narysować co najmniej trzy pola widzenia dla każdej próbki. Wpływ czasu inkubacji na inkorporację deuteru mierzy się za pomocą spontanicznej mikrospektroskopii Ramana w regionach CD i CH.Wykres stosunku intensywności CD do CH w czasie inkubacji deuteru dla pojedynczych bakterii wykazał wzrost intensywności CD nad CH w czasie inkubacji od zera do 180 minut. Obrazowanie SRS Pseudomonas aeruginosa przeprowadzono po inkubacji z gentamycyną i 70% deuterem. Dalsza ilościowa analiza statystyczna wykazała, że sygnały CD bakterii były znacznie niższe przy dwóch mikrogramach na mililitr, czyli wyższe stężenie gentamycyny niż bez leczenia gentamycyną.Próg intensywności granicznej wynoszący 0,60 wykazał, że Pseudomonas aeruginosa była metabolicznie hamowana przy dwóch mikrogramach na mililitr i wyższych stężeniach gentamycyny. Określono SC-MIC dla Pseudomonas aeruginosa przeciwko gentamycynie w normalnym pożywce MHB na dwa mikrogramy na mililitr, co mieściło się w zakresie jednokrotnej różnicy z MIC wynoszącym cztery mikrogramy na mililitr określonym metodą mikrorozcieńczenia bulionu. Szybkie testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) próbek moczu z dodatkiem Escherichia coli przeprowadzono za pomocą obrazowania SRS.SC-MIC dla próbki moczu z dodatkiem Escherichia coli przeciwko amoksycylinie określono na cztery mikrogramy na mililitr, co ma taki sam odczyt wrażliwości jak MIC wynoszący osiem mikrogramów na mililitr przy konwencjonalnej metodzie rozcieńczania bulionu dla czystej Escherichia coli w normalnym pożywce MHB. Przydatność szybkiej AspAT Pseudomonas aeruginosa wzbogaconej do ludzkiej krwi badano za pomocą obrazowania SRS. Intensywność CD obrazu SRS na głębokości 2,168 cm była zdominowana przez sygnały bakteryjne pochodzące z metabolicznego włączenia deuteru przez żywe bakterie.Określono SC-MIC dla Pseudomonas aeruginosa we krwi na dwa mikrogramy na mililitr, co dobrze zgadzało się z konwencjonalnym standardowym wynikiem MIC dla Pseudomonas aeruginosa w normalnej pożywce wzrostowej. Liczba komórek bakteryjnych używana do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe jest utrzymywana na poziomie około pięć razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr, zgodnie z zaleceniami Instytutu Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych. Wyższe stężenie bakterii może prowadzić do wzrostu minimalnego stężenia hamującego.Połączenie identyfikacji patogenów in situ i szybkiej diagnostyki wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe może mieć ogromny potencjał w zakresie przełożenia na praktykę kliniczną, która umożliwia terminową identyfikację odpowiednich środków przeciwdrobnoustrojowych do precyzyjnego leczenia.

rapid-antimicrobial-susceptibility-testing-stimulated-raman

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Zhang, M. i in., Szybkie testy podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana inkorporacji deuteru w pojedynczej bakterii. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje zastosowanie stymulowanej mikroskopii rozpraszającej Ramana do oceny podatności na antybiotyki poprzez śledzenie aktywności metabolycznej oznaczanej deuterem. Poprzez monitorowanie sygnałów węgla–deuteru metoda umożliwia szybkie wykrywanie populacji bakterii odpornych i podatnych.

Wykrywanie podatności na antybiotyki bakteryjne za pomocą stymulowanego mikroskopu rozpraszającego Ramana

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Opracowaliśmy platformę mikroprzepływową do szybkiego testowania wrażliwości na antybiotyki. Płyn jest przepuszczany z dużą prędkością przez bakterie unieruchomione na dnie kanału mikroprzepływowego. W obecności stresu i antybiotyku wrażliwe szczepy bakterii szybko giną. Jednak oporne bakterie mogą przetrwać te stresujące warunki.

Badanie wrażliwości na antybiotyki wywołane stresem na chipie

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Skuteczność antybiotyku jest najczęściej określana poprzez przeprowadzanie badań kinetycznych zabijania i pomiar jednostek tworzących kolonie (CFU). Integrując skaningową mikroskopię elektronową (SEM) z tymi standardowymi metodami, możemy rozróżnić efekty farmakologiczne leczenia między różnymi antybiotykami.

Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Prosty test pomiaru ATP i metoda barwienia żywych/martwych zostały użyte do ilościowego określenia i wizualizacji przeżycia Neisseria gonorrhoeae po leczeniu ceftriaksonem. Protokół ten może zostać rozszerzony w celu zbadania działania przeciwdrobnoustrojowego dowolnego antybiotyku i może być wykorzystany do określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyków w biofilmach bakteryjnych.

Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Informujemy o zastosowaniu wysokiej jakości, elastycznej komory środowiskowej do obrazowania poklatkowego żywych komórek za pomocą pionowej, stymulowanej mikroskopii rozpraszania Ramana z detekcją przesyłanego sygnału. Kropelki lipidów obrazowano w komórkach SKOV3 traktowanych kwasem oleinowym przez okres do 24 godzin w odstępie 3 minut.

Elastyczna komora do poklatkowego obrazowania żywych komórek z mikroskopią wymuszonego rozpraszania Ramana

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Poznaj szybkie badanie wrażliwości na antybiotyki w pojedynczych bakteriach za pomocą obrazowania SRS z indukcją deuteru. Ta metoda dostarcza wyniki w ciągu 2,5 godziny bezpośrednio z moczu i krwi.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Przeglądaj więcej filmów