Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe można uzyskać w ciągu 2,5 godziny w moczu i krwi, co uważa się za ogromne skrócenie czasu analizy w porównaniu z konwencjonalną metodą mikrorozcieńczania bulionu. Może monitorować aktywność metaboliczną bakterii w złożonym środowisku, takim jak krew pełna. Na początek sprawdź stężenie bakterii w próbkach, mierząc gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nanometrów.

Aby osiągnąć końcowe stężenie komórek osiem razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonię lub CFU na mililitr, rozcieńczyć roztwór bakteryjny za pomocą normalnego podłoża MHB bez deuteru. Po wymieszaniu komórek bakteryjnych za pomocą wiru usuń 300 mikrolitrów podwielokrotności roztworu bakteryjnego w siedmiu 1,5-mililitrowych mikroprobówkach i 600-mikrolitrową porcję roztworu bakteryjnego w jednej 1,5-mililitrowej mikroprobówce. Następnie dodaj 4,8 mikrolitra podstawowego roztworu antybiotyku do mikroprobówki zawierającej 600 mikrolitrów roztworu bakteryjnego, aby osiągnąć końcowe stężenie antybiotyku wynoszące osiem mikrogramów na mililitr.

Dodać 300 mikrolitrów roztworu bakteryjnego z antybiotykiem do 300 mikrolitrów podwielokrotności roztworu bakteryjnego bez antybiotyku, aby uzyskać dwukrotnie rozcieńczony roztwór o końcowym stężeniu antybiotyku wynoszącym cztery mikrogramy na mililitr. Powtórzyć dwukrotne seryjne rozcieńczenie badanych antybiotyków, aż do osiągnięcia najniższego stężenia 0,25 mikrograma na mililitr. Wyrzuć 300 mikrolitrów roztworu z ostatniej mikroprobówki.

Przydziel jedną probówkę bez antybiotyków do kontroli pozytywnej z traktowaniem deuterem, a kontroli negatywnej bez deuteru. Inkubować podwielokrotność bakteryjną z pożywką zawierającą antybiotyk MHB przez jedną godzinę. W międzyczasie należy przygotować seryjne rozcieńczanie antybiotyków pożywką zawierającą 100% deuter MHB o tych samych gradientach stężeń, jak opisano wcześniej.

Po jednej godzinie inkubacji dodać 700 mikrolitrów antybiotyku seryjnie rozcieńczonego 100% pożywką zawierającą deuter do 300 mikrolitrów bakterii wstępnie potraktowanych antybiotykiem w tym samym stężeniu antybiotyku. Homogenizować mieszaninę, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowej pożywki 100% deuteru zawierającej MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontroli pozytywnej.

Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowej pożywki 0% deuteru zawierającej MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontroli negatywnej. Inkubuj wszystkie mikroprobówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę przez 30 minut. Po inkubacji odwirować jeden mililitr próbki bakteryjnej poddanej działaniu antybiotyku i deuteru o masie 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie umyj granulkę dwukrotnie oczyszczoną wodą. Utrwal próbki w 10% objętościowym roztworze formaliny i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sprawdź stężenie Escherichia coli w świeżo przygotowanej próbce bakteryjnej, mierząc gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nanometrów.

Aby naśladować kliniczne próbki infekcji dróg moczowych, należy wbić próbkę Escherichia coli do 10 mililitrów pozbawionych identyfikacji próbek moczu, aby osiągnąć końcowe stężenie od 10 do sześciu CFU na mililitr. Przefiltruj mocz z kolcami Escherichia coli za pomocą filtra o grubości pięciu mikronów i podziel przefiltrowany roztwór bakteryjny na 300 mikrolitrów na siedem mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra i podwielokrotność 600 mikrolitrów w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Zabieg inkorporacji deuteru należy przeprowadzić w obecności antybiotyków, jak opisano wcześniej.

Aby naśladować kliniczne próbki infekcji krwi, należy zwiększyć Pseudomonas aeruginosa w jednym mililitrze pozbawionej identyfikacji ludzkiej krwi, aby osiągnąć końcowe stężenie od 10 do szóstego CFU na mililitr. Aby zlizować krew, dodaj dziewięć mililitrów sterylnej, oczyszczonej wody. Przefiltruj krew wzbogaconą Pseudomonas aeruginosa za pomocą filtra o grubości pięciu mikronów.

Następnie zbierz bakterie z przefiltrowanej próbki do objętości jednego mililitra przez odwirowanie w temperaturze 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu podzielić wzbogacony roztwór krwi Pseudomonas aeruginosa w 300 mikrolitrowych podwielokrotnościach na siedem 1,5-mililitrowych mikroprobówek i 600-mililitrową porcję roztworu bakteryjnego w jednej 1,5-mililitrowej mikroprobówce i przeprowadzić leczenie wprowadzaniem deuteru w obecności antybiotyków, jak opisano wcześniej. W celu przygotowania próbki przemyj jeden mililitr utrwalonego roztworu bakteryjnego oczyszczoną wodą i odwiruj umyty roztwór bakteryjny o temperaturze 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usunąć supernatant i wzbogacić roztwór bakteryjny do około 20 mikrolitrów wysterylizowaną wodą. Umieść roztwór bakteryjny na szkle nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną, ułóż na kanapce z innym szkłem nakrywkowym i zamknij próbkę. W mikroskopie SRS przestrajalny laser femtosekundowy o częstotliwości powtarzania 80 megaherców zapewnia pompę i lasery wzbudzające Stokesa.

Wiązka Stokesa jest modulowana przez modulator akustyczno-optyczny o częstotliwości 2,4 megaherca. Obie wiązki są połączone kolirowo za pomocą zwierciadła dichroicznego. Następnie pompa i wiązki Stokesa są kierowane do zbudowanego w laboratorium laserowego mikroskopu skaningowego z lustrem 2D Galvo do skanowania laserowego.

Obiektyw wodny o powiększeniu 60x skupia lasery na próbce, a skraplacz oleju zbiera sygnał z próbki. Dwa filtry służą do odfiltrowywania wiązki Stokesa, podczas gdy wiązka pompy jest wykrywana przez fotodiodę, po czym stymulowany sygnał Ramana jest wydobywany przez wzmacniacz typu lock-in. Korzystając z oprogramowania sterującego, wprowadź i dostosuj długość fali pompy do 852 nanometrów.

Dostosuj częstotliwość drgań C do D na liczbę fal 2, 168, aby obrazować bakterie za pomocą mikroskopu SRS. Zmierz moc lasera za pomocą miernika mocy. Ustaw moc lasera pompującego na próbce na osiem miliwatów, a moc lasera Stokesa na próbce na 50 miliwatów, regulując płytkę półfalową przed wyjściem lasera.

Umieść standardową próbkę DMSO d6 na stoliku na próbkę i użyj 60-krotnego obiektywu zanurzającego w wodzie, aby skupić pompę i lasery Stokesa na próbce. Regulując luster odbiciowych, wyrównaj przestrzennie pompę i wiązki Stokesa i skieruj obie wiązki do pionowego mikroskopu wyposażonego w system luster 2D Galvo do skanowania laserowego. W programowym panelu sterowania ustaw każdy obraz SRS tak, aby zawierał 200 na 200 pikseli, a czas przebywania pikseli na 30 mikrosekund.

Całkowity czas akwizycji jednego obrazu wynosi około 1,2 sekundy. Ustaw rozmiar kroku na 150 nanometrów, tak aby rozmiar obrazu wynosił około 30 na 30 mikrometrów do kwadratu. Po zoptymalizowaniu systemu wyjmij standardową próbkę i umieść próbkę bakteryjną na stoliku próbki pod obiektywem 60-krotnego zanurzenia w wodzie.

Rozpocznij obrazowanie SRS próbek bakteryjnych. Należy narysować co najmniej trzy pola widzenia dla każdej próbki. Wpływ czasu inkubacji na inkorporację deuteru mierzy się za pomocą spontanicznej mikrospektroskopii Ramana w regionach CD i CH.

Wykres stosunku intensywności CD do CH w czasie inkubacji deuteru dla pojedynczych bakterii wykazał wzrost intensywności CD nad CH w czasie inkubacji od zera do 180 minut. Obrazowanie SRS Pseudomonas aeruginosa przeprowadzono po inkubacji z gentamycyną i 70% deuterem. Dalsza ilościowa analiza statystyczna wykazała, że sygnały CD bakterii były znacznie niższe przy dwóch mikrogramach na mililitr, czyli wyższe stężenie gentamycyny niż bez leczenia gentamycyną.

Próg intensywności granicznej wynoszący 0,60 wykazał, że Pseudomonas aeruginosa była metabolicznie hamowana przy dwóch mikrogramach na mililitr i wyższych stężeniach gentamycyny. Określono SC-MIC dla Pseudomonas aeruginosa przeciwko gentamycynie w normalnym pożywce MHB na dwa mikrogramy na mililitr, co mieściło się w zakresie jednokrotnej różnicy z MIC wynoszącym cztery mikrogramy na mililitr określonym metodą mikrorozcieńczenia bulionu. Szybkie testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) próbek moczu z dodatkiem Escherichia coli przeprowadzono za pomocą obrazowania SRS.

SC-MIC dla próbki moczu z dodatkiem Escherichia coli przeciwko amoksycylinie określono na cztery mikrogramy na mililitr, co ma taki sam odczyt wrażliwości jak MIC wynoszący osiem mikrogramów na mililitr przy konwencjonalnej metodzie rozcieńczania bulionu dla czystej Escherichia coli w normalnym pożywce MHB. Przydatność szybkiej AspAT Pseudomonas aeruginosa wzbogaconej do ludzkiej krwi badano za pomocą obrazowania SRS. Intensywność CD obrazu SRS na głębokości 2,168 cm była zdominowana przez sygnały bakteryjne pochodzące z metabolicznego włączenia deuteru przez żywe bakterie.

Określono SC-MIC dla Pseudomonas aeruginosa we krwi na dwa mikrogramy na mililitr, co dobrze zgadzało się z konwencjonalnym standardowym wynikiem MIC dla Pseudomonas aeruginosa w normalnej pożywce wzrostowej. Liczba komórek bakteryjnych używana do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe jest utrzymywana na poziomie około pięć razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr, zgodnie z zaleceniami Instytutu Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych. Wyższe stężenie bakterii może prowadzić do wzrostu minimalnego stężenia hamującego.

Połączenie identyfikacji patogenów in situ i szybkiej diagnostyki wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe może mieć ogromny potencjał w zakresie przełożenia na praktykę kliniczną, która umożliwia terminową identyfikację odpowiednich środków przeciwdrobnoustrojowych do precyzyjnego leczenia.