Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii
14 lutego 2022
Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.
Szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe można uzyskać w ciągu 2,5 godziny w moczu i krwi, co uważa się za ogromne skrócenie czasu analizy w porównaniu z konwencjonalną metodą mikrorozcieńczania bulionu. Może monitorować aktywność metaboliczną bakterii w złożonym środowisku, takim jak krew pełna. Na początek sprawdź stężenie bakterii w próbkach, mierząc gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nanometrów.
Aby osiągnąć końcowe stężenie komórek osiem razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonię lub CFU na mililitr, rozcieńczyć roztwór bakteryjny za pomocą normalnego podłoża MHB bez deuteru. Po wymieszaniu komórek bakteryjnych za pomocą wiru usuń 300 mikrolitrów podwielokrotności roztworu bakteryjnego w siedmiu 1,5-mililitrowych mikroprobówkach i 600-mikrolitrową porcję roztworu bakteryjnego w jednej 1,5-mililitrowej mikroprobówce. Następnie dodaj 4,8 mikrolitra podstawowego roztworu antybiotyku do mikroprobówki zawierającej 600 mikrolitrów roztworu bakteryjnego, aby osiągnąć końcowe stężenie antybiotyku wynoszące osiem mikrogramów na mililitr.
Dodać 300 mikrolitrów roztworu bakteryjnego z antybiotykiem do 300 mikrolitrów podwielokrotności roztworu bakteryjnego bez antybiotyku, aby uzyskać dwukrotnie rozcieńczony roztwór o końcowym stężeniu antybiotyku wynoszącym cztery mikrogramy na mililitr. Powtórzyć dwukrotne seryjne rozcieńczenie badanych antybiotyków, aż do osiągnięcia najniższego stężenia 0,25 mikrograma na mililitr. Wyrzuć 300 mikrolitrów roztworu z ostatniej mikroprobówki.
Przydziel jedną probówkę bez antybiotyków do kontroli pozytywnej z traktowaniem deuterem, a kontroli negatywnej bez deuteru. Inkubować podwielokrotność bakteryjną z pożywką zawierającą antybiotyk MHB przez jedną godzinę. W międzyczasie należy przygotować seryjne rozcieńczanie antybiotyków pożywką zawierającą 100% deuter MHB o tych samych gradientach stężeń, jak opisano wcześniej.
Po jednej godzinie inkubacji dodać 700 mikrolitrów antybiotyku seryjnie rozcieńczonego 100% pożywką zawierającą deuter do 300 mikrolitrów bakterii wstępnie potraktowanych antybiotykiem w tym samym stężeniu antybiotyku. Homogenizować mieszaninę, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowej pożywki 100% deuteru zawierającej MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontroli pozytywnej.
Dodaj 700 mikrolitrów bezantybiotykowej pożywki 0% deuteru zawierającej MHB do 300 mikrolitrów bakterii wolnych od antybiotyków jako kontroli negatywnej. Inkubuj wszystkie mikroprobówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę przez 30 minut. Po inkubacji odwirować jeden mililitr próbki bakteryjnej poddanej działaniu antybiotyku i deuteru o masie 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie umyj granulkę dwukrotnie oczyszczoną wodą. Utrwal próbki w 10% objętościowym roztworze formaliny i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sprawdź stężenie Escherichia coli w świeżo przygotowanej próbce bakteryjnej, mierząc gęstość optyczną za pomocą fotometru o długości fali 600 nanometrów.
Aby naśladować kliniczne próbki infekcji dróg moczowych, należy wbić próbkę Escherichia coli do 10 mililitrów pozbawionych identyfikacji próbek moczu, aby osiągnąć końcowe stężenie od 10 do sześciu CFU na mililitr. Przefiltruj mocz z kolcami Escherichia coli za pomocą filtra o grubości pięciu mikronów i podziel przefiltrowany roztwór bakteryjny na 300 mikrolitrów na siedem mikroprobówek o pojemności 1,5 mililitra i podwielokrotność 600 mikrolitrów w jednej mikroprobówce o pojemności 1,5 mililitra. Zabieg inkorporacji deuteru należy przeprowadzić w obecności antybiotyków, jak opisano wcześniej.
Aby naśladować kliniczne próbki infekcji krwi, należy zwiększyć Pseudomonas aeruginosa w jednym mililitrze pozbawionej identyfikacji ludzkiej krwi, aby osiągnąć końcowe stężenie od 10 do szóstego CFU na mililitr. Aby zlizować krew, dodaj dziewięć mililitrów sterylnej, oczyszczonej wody. Przefiltruj krew wzbogaconą Pseudomonas aeruginosa za pomocą filtra o grubości pięciu mikronów.
Następnie zbierz bakterie z przefiltrowanej próbki do objętości jednego mililitra przez odwirowanie w temperaturze 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu podzielić wzbogacony roztwór krwi Pseudomonas aeruginosa w 300 mikrolitrowych podwielokrotnościach na siedem 1,5-mililitrowych mikroprobówek i 600-mililitrową porcję roztworu bakteryjnego w jednej 1,5-mililitrowej mikroprobówce i przeprowadzić leczenie wprowadzaniem deuteru w obecności antybiotyków, jak opisano wcześniej. W celu przygotowania próbki przemyj jeden mililitr utrwalonego roztworu bakteryjnego oczyszczoną wodą i odwiruj umyty roztwór bakteryjny o temperaturze 6 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usunąć supernatant i wzbogacić roztwór bakteryjny do około 20 mikrolitrów wysterylizowaną wodą. Umieść roztwór bakteryjny na szkle nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną, ułóż na kanapce z innym szkłem nakrywkowym i zamknij próbkę. W mikroskopie SRS przestrajalny laser femtosekundowy o częstotliwości powtarzania 80 megaherców zapewnia pompę i lasery wzbudzające Stokesa.
Wiązka Stokesa jest modulowana przez modulator akustyczno-optyczny o częstotliwości 2,4 megaherca. Obie wiązki są połączone kolirowo za pomocą zwierciadła dichroicznego. Następnie pompa i wiązki Stokesa są kierowane do zbudowanego w laboratorium laserowego mikroskopu skaningowego z lustrem 2D Galvo do skanowania laserowego.
Obiektyw wodny o powiększeniu 60x skupia lasery na próbce, a skraplacz oleju zbiera sygnał z próbki. Dwa filtry służą do odfiltrowywania wiązki Stokesa, podczas gdy wiązka pompy jest wykrywana przez fotodiodę, po czym stymulowany sygnał Ramana jest wydobywany przez wzmacniacz typu lock-in. Korzystając z oprogramowania sterującego, wprowadź i dostosuj długość fali pompy do 852 nanometrów.
Dostosuj częstotliwość drgań C do D na liczbę fal 2, 168, aby obrazować bakterie za pomocą mikroskopu SRS. Zmierz moc lasera za pomocą miernika mocy. Ustaw moc lasera pompującego na próbce na osiem miliwatów, a moc lasera Stokesa na próbce na 50 miliwatów, regulując płytkę półfalową przed wyjściem lasera.
Umieść standardową próbkę DMSO d6 na stoliku na próbkę i użyj 60-krotnego obiektywu zanurzającego w wodzie, aby skupić pompę i lasery Stokesa na próbce. Regulując luster odbiciowych, wyrównaj przestrzennie pompę i wiązki Stokesa i skieruj obie wiązki do pionowego mikroskopu wyposażonego w system luster 2D Galvo do skanowania laserowego. W programowym panelu sterowania ustaw każdy obraz SRS tak, aby zawierał 200 na 200 pikseli, a czas przebywania pikseli na 30 mikrosekund.
Całkowity czas akwizycji jednego obrazu wynosi około 1,2 sekundy. Ustaw rozmiar kroku na 150 nanometrów, tak aby rozmiar obrazu wynosił około 30 na 30 mikrometrów do kwadratu. Po zoptymalizowaniu systemu wyjmij standardową próbkę i umieść próbkę bakteryjną na stoliku próbki pod obiektywem 60-krotnego zanurzenia w wodzie.
Rozpocznij obrazowanie SRS próbek bakteryjnych. Należy narysować co najmniej trzy pola widzenia dla każdej próbki. Wpływ czasu inkubacji na inkorporację deuteru mierzy się za pomocą spontanicznej mikrospektroskopii Ramana w regionach CD i CH.
Wykres stosunku intensywności CD do CH w czasie inkubacji deuteru dla pojedynczych bakterii wykazał wzrost intensywności CD nad CH w czasie inkubacji od zera do 180 minut. Obrazowanie SRS Pseudomonas aeruginosa przeprowadzono po inkubacji z gentamycyną i 70% deuterem. Dalsza ilościowa analiza statystyczna wykazała, że sygnały CD bakterii były znacznie niższe przy dwóch mikrogramach na mililitr, czyli wyższe stężenie gentamycyny niż bez leczenia gentamycyną.
Próg intensywności granicznej wynoszący 0,60 wykazał, że Pseudomonas aeruginosa była metabolicznie hamowana przy dwóch mikrogramach na mililitr i wyższych stężeniach gentamycyny. Określono SC-MIC dla Pseudomonas aeruginosa przeciwko gentamycynie w normalnym pożywce MHB na dwa mikrogramy na mililitr, co mieściło się w zakresie jednokrotnej różnicy z MIC wynoszącym cztery mikrogramy na mililitr określonym metodą mikrorozcieńczenia bulionu. Szybkie testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) próbek moczu z dodatkiem Escherichia coli przeprowadzono za pomocą obrazowania SRS.
SC-MIC dla próbki moczu z dodatkiem Escherichia coli przeciwko amoksycylinie określono na cztery mikrogramy na mililitr, co ma taki sam odczyt wrażliwości jak MIC wynoszący osiem mikrogramów na mililitr przy konwencjonalnej metodzie rozcieńczania bulionu dla czystej Escherichia coli w normalnym pożywce MHB. Przydatność szybkiej AspAT Pseudomonas aeruginosa wzbogaconej do ludzkiej krwi badano za pomocą obrazowania SRS. Intensywność CD obrazu SRS na głębokości 2,168 cm była zdominowana przez sygnały bakteryjne pochodzące z metabolicznego włączenia deuteru przez żywe bakterie.
Określono SC-MIC dla Pseudomonas aeruginosa we krwi na dwa mikrogramy na mililitr, co dobrze zgadzało się z konwencjonalnym standardowym wynikiem MIC dla Pseudomonas aeruginosa w normalnej pożywce wzrostowej. Liczba komórek bakteryjnych używana do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe jest utrzymywana na poziomie około pięć razy 10 do piątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr, zgodnie z zaleceniami Instytutu Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych. Wyższe stężenie bakterii może prowadzić do wzrostu minimalnego stężenia hamującego.
Połączenie identyfikacji patogenów in situ i szybkiej diagnostyki wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe może mieć ogromny potencjał w zakresie przełożenia na praktykę kliniczną, która umożliwia terminową identyfikację odpowiednich środków przeciwdrobnoustrojowych do precyzyjnego leczenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szybką metodę testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) z wykorzystaniem obrazowania za pomocą stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego (SRS) w celu analizy metabolicznego wbudowania wody ciężkiej (D2O). Podejście to umożliwia ilościową ocenę wpływu antybiotyków na patogeny na poziomie pojedynczych komórek w ciągu 2,5 godziny, co znacząco skraca czas wymagany w porównaniu z konwencjonalnymi metodami AST. Technika ta znajduje bezpośrednie zastosowanie w złożonych próbkach klinicznych, takich jak mocz i krew pełna, oferując przełomowy potencjał dla szybkiego fenotypowego AST w warunkach klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Diagnostyka kliniczna
- Technologia obrazowania
Wstęp
- Oporność na środki przeciwdrobnowe jest rosnącym problemem zdrowia publicznego w skali globalnej.
- Konwencjonalne metody AST są powolne i często wymagają kilku dni oczekiwania na wyniki.
- Szybkie AST jest niezbędne do terminowego i precyzyjnego doboru terapii przeciwdrobnoustrojowej.
- Istniejące metody nie zawsze są kompatybilne z bezpośrednimi próbkami klinicznymi.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej, ilościowej metody AST z wykorzystaniem obrazowania SRS w celu monitorowania metabolicznego wbudowywania D2O.
- Umożliwienie wykrywania aktywności metabolicznej i wrażliwości na antybiotyki bakterii na poziomie pojedynczej komórki.
- Zwalidowanie przydatności tej metody w złożonych próbkach biologicznych, takich jak mocz i krew.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek bakteryjnych i seryjne rozcieńczanie antybiotyków w podłożu MHB.
- Znakowanie metaboliczne bakterii D2O w obecności antybiotyków.
- Opracowanie próbek z macierzy moczu i krwi w celu odwzorowania infekcji klinicznych.
- Mikroskopia SRS w celu obrazowania i kwantyfikacji wbudowania deuteru na poziomie pojedynczej bakterii.
- Porównanie stężenia inaktywacji metabolizmu pojedynczej komórki (SC-MIC) z konwencjonalnymi wartościami MIC.
Główne wyniki
- Szybkie wyniki AST uzyskano w czasie 2,5 godziny zarówno dla próbek moczu, jak i krwi.
- Obrazowanie SRS precyzyjnie wykryło hamowanie metaboliczne bakterii przy określonych stężeniach antybiotyków.
- Wartości SC-MIC wyznaczone za pomocą obrazowania SRS ściśle odpowiadały konwencjonalnym wynikom MIC.
- Metoda okazała się skuteczna w złożonych środowiskach biologicznych, w tym w przypadku wzbogaconych próbek moczu i krwi.
Wnioski
- Obrazowanie SRS w celu wykrycia wbudowania D2O umożliwia szybkie, pojedynczocząsteczkowe fenotypowe AST.
- Metoda ta znacząco skraca czas oczekiwania na wynik AST i jest kompatybilna z bezpośrednimi próbkami klinicznymi.
- Podejście to daje nadzieję na terminową i precyzyjną terapię przeciwdrobnoustrojową w praktyce klinicznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) z wykorzystaniem obrazowania metodą stymulowanego rozpraszania Ramanowskiego (SRS) w celu oceny wbudowy deuteru umożliwiają praktyczną, ilościową ocenę skuteczności antybiotyków na poziomie pojedynczej bakterii w czasie poniżej 2,5 godziny. Podejście to rozwiązuje kluczowy problem w procesie opracowywania leków przeciwzakaźnych, dostarczając danych fenotypowych w czasie zbliżonym do rzeczywistego bezpośrednio z złożonych matryc klinicznych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze terapii i wspiera decyzje dotyczące portfela projektów R&D w obszarze leków przeciwzakaźnych, uwzględniając analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę odpowiedzi metabolicznej bakterii na kandydujące antybiotyki z rozdzielczością pojedynczych komórek.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów przeciwdrobnoustrojowych poprzez ilościowe odczyty hamowania metabolizmu.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez rozróżnianie efektów bakteriostatycznych od bakteriobójczych w złożonych próbach.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze wiodących związków przeciwinfekcyjnych na podstawie szybkich wyników fenotypowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe analizy metaboliczne pojedynczych komórek dla szybkich procedur AST.
- Umożliwia powtarzalny, skalowalny screening skuteczności antybiotyków w matrycach istotnych klinicznie, takich jak mocz i krew.
- Wspiera standaryzację analiz i powtarzalność międzylaboratoryjną dzięki zdefiniowanym progom SC-MIC.
- Przygotowuje solidne platformy do wysokoprzepustowego screeningu fenotypowego bibliotek substancji przeciwdrobnoustrojowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia fenotypowe wyniki AST ze strategiami translacyjnymi dotyczącymi biomarkerów dla modeli infekcji.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania inhibicji metabolicznej do walidacji przedklinicznej w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez dostarczanie szybkich, klinicznie istotnych danych o wrażliwości z złożonych próbek biologicznych.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp w rozwoju kandydatów na leki przeciwinfekcyjne w oparciu o wyniki uzyskane z próbek rzeczywistych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda AST oparta na SRS integruje proces od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, wspierając szybkie podejmowanie decyzji go/no-go dla portfeli leków przeciwinfekcyjnych.
- Biologia odkrywcza: dostarcza ilościowych danych dotyczących inhibicji metabolicznej do weryfikacji hipotez i ograniczania ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
- Screening: oferuje szybkie, powtarzalne testy AST na pojedynczych komórkach, gotowe do zastosowania w wysokoprzepustowych procesach analitycznych.
- Analityka: umożliwia pomiary SC-MIC oraz aktywności metabolicznej w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego efektów działania antybiotyków.
- Badania translacyjne: łączą fazę odkrywczą z fazą przedkliniczną, umożliwiając bezpośrednie testy w macierzach moczu i krwi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: ustanawia wielokrotnie wykorzystywalną platformę fenotypowego AST, którą można dostosować do różnych gatunków bakterii i rodzajów próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie skuteczności przeciwdrobnoustrojowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i przyspiesza przepływy pracy AST dzięki powtarzalnym, ilościowym wynikom.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze, oparte na danych podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz poprawia efektywność kapitałową w obszarze B+R środków przeciwinfekcyjnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów w oparciu o szybkie dane fenotypowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii SRS oraz ilościowej analizy obrazowania pojedynczych komórek.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej mikroskopii laserowej oraz infrastruktury do przygotowania próbek.
- Konieczna jest standaryzacja progów SC-MIC oraz protokołów testowych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych gatunków bakterii i typów próbek klinicznych poprzez optymalizację protokołu.
- Przepustowość próbek oraz dostępność aparatury mogą ograniczać skalowalność w warunkach wysokiej objętości badań.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Deuterium (D2O) Incorporation Treatment in the Presence of Antibiotics
3:50
Preparation of Bacteria in Urine Environment and Blood Environment
5:42
Stimulated Raman Scattering (SRS) Imaging of D2O Metabolic Incorporation in a Single Bacterium
8:44
Results: The Influence of Deuterium Incorporation on Bacterial Growth
11:14
Conclusion
