Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

W celu wykrycia interakcji białko-białko na podstawie anizotropii fluorescencji należy rozpocząć od rekombinowanych białek docelowych oznaczonych C-końcowymi motywami tetracysteiny w odpowiednim buforze anizotropii.

Dodaj barwnik zawierający fluorofor — wiążący się z białkami docelowymi poprzez motyw tetracysteiny. Dializować buforem anizotropii, usuwając niezwiązany barwnik. Przenieś mieszaninę do kuwet kwarcowych. Zmierz absorbancję, określając procent pomyślnie znakowanych białek docelowych.

W kuwecie fluorescencyjnej wymieszaj białka docelowe znakowane fluoroforem z białkami nieznakowanymi. Za pomocą spektrofluorometru zmierz anizotropię fluorescencji.

Gdy docelowe białka swobodnie zawieszają się w buforze, przyłączone do nich fluorofory obracają się losowo wokół swoich osi z powodu ruchów Browna. Po wzbudzeniu światłem spolaryzowanym pionowo o odpowiedniej długości fali, fluorofory emitują światło spolaryzowane w płaszczyźnie pionowej i poziomej. Mierzy się stosunek intensywności fluorescencji emisji spolaryzowanych pionowo i poziomo — anizotropię.

Kiedy nieznakowane białka wiążą się z celami znakowanymi fluoroforem, rozmiar cząsteczkowy kompleksu białkowego wzrasta, zmniejszając jego ruch obrotowy. W efekcie emitowane światło staje się bardziej spolaryzowane, przy wyższej emisji w płaszczyźnie pionowej niż w płaszczyźnie poziomej – zwiększając anizotropię.

Dodać rosnące stężenia nieznakowanego białka i powtórzyć pomiar anizotropii.

Nieliniowy wzrost anizotropii ze zwiększoną addycją nieznakowanego białka wskazuje na nieznakowane wiązanie białek w wielu nieidentycznych miejscach wiązania na białkach docelowych znakowanych fluoroforem.

Wymieszaj 3 nanomole białka SBDS-FlAsH z 3 nanomolami barwnika Lumio Green w 5-mikrolitrowej objętości buforu anizotropii. Pozwól reakcji postępować przez 8 godzin w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po 8 godzinach należy dializować próbkę z buforem anizotropii przez noc, aby usunąć wolny barwnik. Zmierz absorbancję przy 280 nanometrach i 508 nanometrach w spektrofotometrze za pomocą kuwety kwarcowej. Następnie użyj prawa Lamberta-Beera, aby określić procentowo zawartość znakowanego białka, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przed pomiarem wartości anizotropii należy dokładnie wykonać każdy etap miareczkowania liganda białkowego, upewniając się, że cała próbka jest dozowana do roztworu i staje się jednorodna.

W kuwecie fluorescencyjnej umieść 200 mikrolitrów 30 nanomolowych SBDS-FlAsH w buforze anizotropii i miareczkuj 2 mikrolitry 30 mikromolowych EFL1. Dokładnie wymieszaj i odstaw reakcję na 3 minuty przed pomiarem anizotropii i wartości fluorescencji. Powtarzaj ten proces, aż zostanie dodana całkowita objętość 40 mikrolitrów EFL1. W ostatnim kroku dopasuj dane do przypuszczalnego modelu powiązania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.