Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

W celu wykrycia interakcji białko-białko na podstawie anizotropii fluorescencji należy rozpocząć od rekombinowanych białek docelowych oznaczonych C-końcowymi motywami tetracysteiny w odpowiednim buforze anizotropii.

Dodaj barwnik zawierający fluorofor — wiążący się z białkami docelowymi poprzez motyw tetracysteiny. Dializować buforem anizotropii, usuwając niezwiązany barwnik. Przenieś mieszaninę do kuwet kwarcowych. Zmierz absorbancję, określając procent pomyślnie znakowanych białek docelowych.

W kuwecie fluorescencyjnej wymieszaj białka docelowe znakowane fluoroforem z białkami nieznakowanymi. Za pomocą spektrofluorometru zmierz anizotropię fluorescencji.

Gdy docelowe białka swobodnie zawieszają się w buforze, przyłączone do nich fluorofory obracają się losowo wokół swoich osi z powodu ruchów Browna. Po wzbudzeniu światłem spolaryzowanym pionowo o odpowiedniej długości fali, fluorofory emitują światło spolaryzowane w płaszczyźnie pionowej i poziomej. Mierzy się stosunek intensywności fluorescencji emisji spolaryzowanych pionowo i poziomo — anizotropię.

Kiedy nieznakowane białka wiążą się z celami znakowanymi fluoroforem, rozmiar cząsteczkowy kompleksu białkowego wzrasta, zmniejsza