Chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej

Protokół ten jest istotny, ponieważ ma na celu udzielenie odpowiedzi na pytania dotyczące korelatu funkcji struktury mysiej zastawki płucnej, która jest na ogół trudna ze względu na jej nieodłączną niejednorodność. Kontrolowana fiksacja i obrazowanie korelacyjne zostały wykorzystane do uchwycenia struktury w wielu skalach długości. Lokalne obrazy o wysokiej rozdzielczości mogą być następnie odwzorowane z powrotem do dokładnej lokalizacji anatomicznej na zastawce płucnej.

Procedurę zademonstruje dr Tai Yi, dyrektor ds. mikrochirurgii w Centrum Medycyny Regeneracyjnej w Nationwide Children's Hospital. Zacznij od autoklawowania narzędzi potrzebnych do sekcji myszy, w tym cienkich nożyczek, mikrokleszczy, zacisków mikronaczyniowych, kleszczyków zaciskowych, uchwytów do mikroigieł, nożyczek sprężynowych i retraktorów. Po eutanazji dorosłej myszy C57BL/6 umieść ją w grzbietowej pozycji leżącej na tacy, zabezpiecz jej kończyny taśmą i wykonaj torakotomię.

Odsłoń serce, usuwając nadmiar tkanki tłuszczowej i powięzi, a następnie usuń prawy przedsionek i przelej lewą komorę roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej. Usuń całe serce, przecinając żyłę główną górną, żyłę główną dolną, tętnicę płucną i aortę, a następnie przeciąć około dwóch milimetrów powyżej połączenia komorowo-przedsionkowego, które będzie służyć jako kanał do zwiększania ciśnienia. Usuń lewą i prawą komorę, aby wystawić komory na ciśnienie atmosferyczne, upewniając się, że struktura pnia płucnego nie została naruszona przez usunięcie komór.

Rurka do pomiaru ciśnienia w zespoleniu z tętnicą płucną, pozostawiając około jednego milimetra odległości między połączeniem sinotubularnym a końcem rurki, aby dostosować się do dużych ruchów płatków i pnia płucnego. Podnieś zbiornik do analogicznego ciśnienia fizjologicznego i napełnij go roztworem soli fizjologicznej. Przetestuj system przepływowy, aby upewnić się, że nie ma zatorów ani pęcherzyków powietrza.

Podłączyć kran do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić odpowiedni przepływ przez rurkę poprzez przełączenie przewodu odpływowego. Gdy przepływ jest wystarczający, przełączyć odpływ na zespolenie zastawki płucnej i zapewnić ciśnienie w pniu płucnym identyfikowane przez rozdęcie tułowia. Po potwierdzeniu ciśnienia w pniu płucnym, stopniowo wprowadzaj pierwotny roztwór utrwalający, aż 25% pojemności zbiornika roztworu soli zostanie usunięte.

Umieść gazę nasączoną utrwalaczem na próbce tkanki, aby zapobiec wysuszeniu. Utrwalacz utrwalacz przez trzy godziny, ponownie napełniając zbiornik, aby utrzymać stałe ciśnienie. Po perfuzji przechowuj zastawkę serca w roztworze utrwalającym w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia przez okres do jednego tygodnia.

W celu barwienia należy trzykrotnie przemyć stałą próbkę zastawki serca zimnym 0,15-molowym buforem kakodylowym przez pięć minut i całkowicie zanurzyć zastawkę serca w roztworze 1,5 żelazocyjanku potasu, 0,15 molowego kakodylanu, dwóch milimolowych chlorków wapnia i 2% tetratlenku osmu na lodzie na jedną godzinę. Umyć próbki podwójnie destylowaną wodą o temperaturze pokojowej, umieszczając je w probówce na pięć minut z lekkim mieszaniem. Po trzech kolejnych przepłukaniach umieścić próbkę w przefiltrowanym roztworze tiokarbohydrazydu o temperaturze pokojowej.

Po 20 minutach przemyć próbkę trzykrotnie wodą, jak pokazano wcześniej. Następnie umieść próbkę w 2% tetratlenku osmu w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach przemyj ją wodą trzy razy przez pięć minut każdy i inkubuj próbkę w 1% octanie uranylu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W międzyczasie przygotuj roztwór azotanu ołowiu. Następnego dnia wykonaj etap płukania trzy razy, jak pokazano wcześniej, a następnie inkubuj tkankę zastawki serca w roztworze asparaginianu ołowiu w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Umyj próbki jeszcze trzy razy, a następnie wykonaj seryjne odwodnienie tkanek zastawki serca świeżo przygotowanym 20, 50, 70 i 90% etanolem na lodzie przez pięć minut każde, a następnie wykonaj dwie kolejne zabiegi ze 100% etanolem.

Po odwodnieniu przenieś tkanki do lodowatego acetonu, a następnie umieść go w świeżym acetonie w temperaturze pokojowej na 10 minut. Do zatapiania należy przygotować mieszaninę żywic zgodnie ze specyfikacją producenta. Umieść tkanki w kolejnych zabiegach mieszaniny żywicy do acetonu od 25 do 75, 50 do 50 i 75 do 25 na dwie godziny każda.

Na koniec umieść chusteczki na noc w 100% żywicy. Następnego dnia umieść chusteczki w świeżej 100% żywicy. Po dwóch godzinach przenieś chusteczki do kapsułki do zatapiania, dodaj świeżą 100% żywicę i umieść ją w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na 48 godzin do utwardzenia.

Poniżej przedstawiono wyciętą tętnicę płucną z zespoleniem przed i po zastosowaniu ciśnienia hydrostatycznego. Tułów płucny rozszerza się promieniście, co wskazuje, że płatki zastawki płucnej są w konfiguracji zamkniętej. Tomografia mikrokomputerowa potwierdziła potwierdzenie zastawki płucnej.

Płatki były zamknięte, a pierścień był okrągły, podczas gdy obserwowano różne stopnie niewystarczającego ciśnienia w zastawce płucnej przez stabilizację lub zapadnięcie się tętnicy. Wirtualne przekroje poprzeczne renderujące objętość mikro CT skorelowano z obrazami optycznymi, aby potwierdzić kierunek i lokalizację krojenia. Obrazy SBF SEM o wysokiej rozdzielczości zostały wykonane w lokalnym regionie w ulotce, gdy blok próbki znajdował się w pożądanym miejscu i orientacji.

W tym miejscu pokazano skorelowane obrazy między wirtualnym przekrojem renderującym objętość mikro CT, obrazy SBF SEM o niskiej i wysokiej rozdzielczości. W reprezentacji 3D segmentowanego obszaru zastawki płucnej można zidentyfikować elementy zewnątrzkomórkowe, takie jak komórki śródbłonka, zastawkowe komórki śródmiąższowe i włókna zewnątrzkomórkowe. Wypróbowując ten protokół, należy pamiętać, że zwiększenie ciśnienia ma kluczowe znaczenie i zapewni jak najwyższą wydajność.