Name: Chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj protokół chirurgii i przetwarzania próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej. Metoda obejmuje hydrostatyczną presuryzację, barwienie en bloc oraz korelację μCT z SBF-SEM dla wieloskalowej analizy strukturalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez R01HL139796 i R01HL128847 granty dla CKB oraz RO1DE028297 i CBET1608058 dla DWM.

Wykorzystanie zwierząt w tym badaniu było zgodne z Ogólnokrajowym Szpitalem Dziecięcym instytucjonalnym komitetem ds. opieki i wykorzystania zwierząt zgodnie z protokołem AR13-00030.
1. Wycięcie zastawki płucnej
<ol>
	<li>Autoklaw niezbędnych narzędzi potrzebnych do sekcji myszy. Obejmuje to cienkie nożyczki, mikrokleszki, zaciski do mikronaczyń krwionośnych, kleszcze do nakładania zacisków, uchwyty do mikroigieł, nożyczki sprężynowe i zwijacze.</li>
	<li>Aklimatyzować wszystkie myszy przez minimum 2 tygodnie przed operacją. Wyjmij myszy C57BL/6 w wieku około 1 roku z klatek i zważ, a następnie poddaj eutanazji za pomocą koktajlu ketamina/ksylazyna (3:1 ketamina:ksylazyna, 0,01 ml na g) w przypadku przedawkowania.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej na tacy i zabezpiecz jej kończyny taśmą. Po zabezpieczeniu wykonaj torakotomię.
	<ol>
		<li>Odsłoń serce, usuwając nadmiar tkanki tłuszczowej i powięzi.</li>
		<li>Usunąć prawy przedsionek i przelać przez lewą komorę roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej (0,9% NaCl). Perfuzja powinna trwać około 20 ml w ciągu 30 s. Powoduje to wykrwawienie myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń całe serce, przecinając żyłę główną górną, żyłę główną dolną, tętnicę płucną i aortę. Szczególną ostrożność należy zachować w przypadku tętnicy płucnej. Wyciąć około 2 mm powyżej połączenia komorowo-tętniczego, ponieważ będzie ono służyć jako przewód do zwiększania ciśnienia.</li>
	<li>Usuń lewą i prawą komorę, aby wystawić komory na ciśnienie atmosferyczne. Upewnij się, że struktura pnia płucnego nie powinna zostać naruszona przez usunięcie komór.</li>
</ol>
2. Stabilizacja ciśnienia w zastawce płucnej
<ol>
	<li>Rurka do pomiaru ciśnienia w zespoleniu z tętnicą płucną, pozostawiając około 1 mm odległości między połączeniem sinusoidalno-rurkowym a końcem rurki, aby dostosować się do dużych ruchów płatków i pnia płucnego.</li>
	<li>Podnieś zbiornik do analogicznego ciśnienia fizjologicznego i napełnij go roztworem soli fizjologicznej. Przetestuj system przepływowy, aby upewnić się, że nie ma zatorów ani pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Podłączyć kran do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić odpowiedni przepływ przez rurkę (tj. brak pęcherzyków powietrza) poprzez przełączenie przewodu odpływowego. Gdy przepływ jest odpowiedni, przełączyć odpływ do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić ciśnienie w pniu płucnym. Identyfikuje się to po wzdęciu tułowia płucnego.</li>
	<li>Po potwierdzeniu wzrostu ciśnienia w pniu płucnym należy stopniowo wprowadzać pierwotny roztwór utrwalający (1,25% aldehydu glutarowego, 1,0% paraformaldehydu w 0,15 M kakodylatu), aż roztwór soli zostanie usunięty. Odbywa się to poprzez usunięcie części, około 25% pojemności zbiornika, roztworu soli fizjologicznej i zastąpienie go głównym utrwalaczem. 
	UWAGA: Stosowane utrwalacze (paraformaldehyd i aldehyd glutarowy) są wysoce toksyczne i w celu zapewnienia bezpieczeństwa należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
	<li>Umieść gazę nasączoną utrwalaczem na próbce tkanki, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Utrwalacz perfować przez 3 godziny, uzupełniając zbiornik w razie potrzeby, aby utrzymać stałe ciśnienie. Podczas stabilizacji nierzadko zdarza się, że zastawka płucna kurczy się z powodu utrwalenia chemicznego. W takim przypadku należy stale uzupełniać zbiornik pierwotnym utrwalaczem, aby utrzymać ciśnienie fizjologiczne.</li>
	<li>Przechowywać zastawkę serca w roztworze utrwalającym w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Próbki przechowywano przez okres do 1 tygodnia bez zauważalnej różnicy.</li>
</ol>
3. Barwienie i osadzanie próbek en bloc 15,16
UWAGA: Odczynniki barwiące używane w tej sekcji (żelazocyjanek potasu, tetratlenek osmu, tiokarbohydrazyd, asparaginian ołowiu i octan uranylu) są wysoce toksyczne i powinny być traktowane z najwyższą ostrożnością. Zaleca się stosowanie dygestorium i odpowiednich środków ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Próbkę nieruchomej zastawki serca przemywać przez 5 minut zimnym 0,15 M buforem kakodylowym. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Całkowicie zanurz zastawkę serca w roztworze 1,5% żelazocyjanku potasu, 0,15 M kakodylanu, 2 mM chlorku wapnia i 2% tetratlenku osmu na lodzie na 1 godzinę.</li>
		<li>Podczas inkubacji próbki przygotować roztwór tiokarbohydrazydu (TCH), rozpuszczając 0,1 g TCH w 10 mlddH2O. Umieścić roztwór w suszarce o temperaturze 60 °C na 1 godzinę. Delikatnie mieszać od czasu do czasu, aby upewnić się, że TCH całkowicie się rozpuścił. Bezpośrednio przed użyciem przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
		<li>Przemyć próbki w temperaturze pokojowej ddH2O, umieszczając je w probówce z ddH2O na 5 minut i lekko wymieszać, potrząsając pojemnikiem. Powtórz ten proces trzy razy.</li>
		<li>Umieść go w przefiltrowanym roztworze TCH na 20 minut w temperaturze pokojowej. Wykonać etap prania trzy razy (po 5 minut każdy) w temperaturze pokojowej ddH2O, jak opisano w kroku 3.1.4.</li>
		<li>Po zakończeniu umieść próbkę w 2% tetratlenku osmu na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj go ponownie, w sumie trzy razy przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej ddH2O.</li>
		<li>Inkubować próbkę w 1% octanie uranylu przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W tym czasie przygotuj roztwór 0,066 g azotanu ołowiu w 10 ml roztworu podstawowego kwasu asparaginowego. Doprowadzić pH do 5,5 za pomocą 1 N KOH. Umieścić roztwór w piekarniku o temperaturze 60 °C, aby rozpuścić azotan ołowiu.</li>
		<li>Po inkubacji przez noc przeprowadzić etap płukania zgodnie z opisem w kroku 3.1.4. Powtórz trzy razy. Następnie inkubować tkankę zastawki serca w roztworze asparaginianu ołowiu z kroku 3.1.8 w piecu o temperaturze 60 °C przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Myj chusteczki przez 5 minut w temperaturze pokojowej z ddH2O. Powtórz trzy razy.</li>
		<li>Przygotować świeże roztwory 20%, 50%, 70%, 90% i 100% etanolu w ddH2O. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
		<li>Aby odwodnić tkankę zastawki serca. Wykonuj kolejne zabiegi etanolu 20%, 50%, 70% i 90% na lodzie przez 5 minut każdy. Następnie wykonaj dwa kolejne zabiegi 100% etanolu na lodzie przez 5 min.</li>
		<li>Przenieś chusteczkę do lodowatego acetonu na 10 minut. Następnie umieść w świeżym acetonie w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę żywicy (patrz tabela materiałów) zgodnie ze specyfikacją producenta: 11,4 g składnika A, 10 g składnika B, 0,3 g składnika C i 0,05-0,1 g składnika D. Początkowo wymieszać składniki A i B, podgrzewając każdy ze składników do temperatury 60 °C przed dodaniem składników C i D. Mieszanina zmieni kolor na bursztynowy po dodaniu składników C i D. Będzie jednolity po odpowiednim wymieszaniu.</li>
		<li>Sporządzać mieszaniny o proporcjach objętościowych 25:75, 50:50 i 75:25 żywica:aceton. Dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Tkanki należy umieszczać w kolejnych zabiegach mieszaniny żywicy i acetonu 25:75, 50:50 i 75:25 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść chusteczki w 100% żywicy na noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Następnego dnia umieść chusteczki w świeżej 100% żywicy na 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieś tkanki zastawki serca do kapsułki do zatapiania, zastąp ją świeżą 100% żywicą i umieść w piekarniku o temperaturze 60 °C na 48 godzin do utwardzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie korelacyjne, jak pokazano poniżej.</li>
</ol>
4. Obrazowanie metodą mikrotomografii komputerowej
<ol>
	<li>Zamontuj blok próbki żywicy na uchwycie próbki μCT za pomocą kleju (dobrze sprawdza się klej lub taśma dwustronna).</li>
	<li>Umieść uchwyt w komorze μCT i zamocuj go na stoliku, przykręcając tuleję zaciskową tak, aby nie było ruchu uchwytu. Ruch próbki podczas skanowania obniży jakość obrazu.</li>
	<li>Otwórz interfejs użytkownika μCT, klikając dwukrotnie ikonę. Dodaj projekt, wybierając znak + obok opcji Projekty i wypełnij niezbędne pola.</li>
	<li>Po utworzeniu znajdź utworzony projekt i wybierz go, klikając go. Spowoduje to otwarcie drugiej kolumny Przejęcia. Wybierz + obok opcji Przejęcia i wypełnij niezbędne pola.</li>
	<li>Zamknij drzwiczki komory i uzbrój system, naciskając przycisk uzbrajania na panelu przednim lub μCT. Rozgrzej promieniowanie rentgenowskie z interfejsu użytkownika, wybierając przycisk wskazujący Rozgrzewka. 
	UWAGA: System automatycznie wyłączy promieniowanie rentgenowskie po udanej procedurze rozgrzewania. Włącz promienie rentgenowskie, wybierając przycisk.</li>
	<li>Dostosuj obrót stolika w taki sposób, aby środek obrotu próbki nie odchylał się od środka monitora (tj. próbka znajdowała się w polu view dla całego skanowania). W przypadku systemu użytego w tym eksperymencie wiąże się to z dostosowaniem etapu obszaru zainteresowania (ROI) na karcie rozwijanej, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Ustaw regulację stopnia zwrotu z inwestycji, ustawiając kąt obrotu na 0° i zaznaczając krawędź próbki. Próbka jest następnie obracana do 180° i ponownie oznaczana jest krawędź próbki.</li>
		<li>Dostosuj położenie osi x etapu ROI w taki sposób, aby krawędź próbki znajdowała się między tymi dwoma skrajnościami. Powtórz ten proces dla kątów obrotu 90° i 270° dla pozycji y.</li>
		<li>W przypadku, gdy obrót próbki powoduje, że krawędzie wychodzą poza pole widzenia, należy zmniejszyć powiększenie potrzebne μCT, aż krawędzie próbki będą widoczne pod powyższymi ustawionymi kątami i będzie można dokonać zgrubnej regulacji stopnia zwrotu z inwestycji.</li>
		<li>Po wyregulowaniu przy dolnym powiększeniu przesuń próbkę lub detektor, aby zwiększyć powiększenie, a pozycje ROI można precyzyjnie regulować. 
		UWAGA: Może być konieczne powtórzenie tego procesu, aby zapewnić wyrównanie. Prawidłowe wyrównanie powoduje, że próbka wykazuje niewielki lub żaden ruch poziomy we wszystkich kątach obrotu próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj μCT do żądanych parametrów skanowania za pomocą oprogramowania producenta. Parametry te obejmują potencjał lampy, prąd lampy, odległość detektora, odległość próbki, czas ekspozycji, trajektorię i liczbę projekcji (patrz tabela S1 dla parametrów akwizycji μCT użytych w tym badaniu). 
	UWAGA: Parametry kalibracji, takie jak skanowanie w czystym i ciemnym polu, powinny być zgodne ze specyfikacjami producenta, chyba że zaznaczono inaczej. Na przykład, jeśli próbka jest zbyt duża i system nie może przesunąć próbki poza pole view, próbka musi zostać usunięta, aby wykonać wyraźne skany kalibracji w terenie.</li>
	<li>Po ustawieniu parametrów przybliżony czas trwania skanowania można zobaczyć, naciskając przycisk Oszacowanie czasu. Wybierz przycisk Start, aby rozpocząć skanowanie.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania upewnij się, że promienie rentgenowskie są wyłączone, odkręć tuleję zaciskową i ostrożnie wyjmij próbkę z komory μCT.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie próbek i korelacja obrazów
<ol>
	<li>Zrekonstruować projekcje μCT przy użyciu algorytmu projekcji wstecznej z filtrem za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wybierz kartę Zwiad u góry ekranu. Wybierz kartę Projekt i nabycie.</li>
		<li>Wybierz szablon zwiadowczy powiązany z filtrowaną projekcją wsteczną. Naciśnij przycisk Rozpocznij zwiad. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj i podziel zastawkę płucną na segmenty za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu. Wymaga to wcześniejszej znajomości anatomii zastawki płucnej17. Przy podwyższonym ciśnieniu tętniczym płatki zatykają się i blokują światło zastawki płucnej.</li>
	<li>Zidentyfikuj orientację krojenia w odniesieniu do kierunku skanowania i próbki. Zmień orientację próbki tak, aby kierunek krojenia był wyrównany z żądaną osią.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszary zainteresowania dla obrazowania w wysokiej rozdzielczości. W tym eksperymencie wybrano brzuch (środek) ulotki i połączenie tętniczo-zastawkowe.</li>
	<li>Usuń nadmiar żywicy i próbkę za pomocą żyletki lub szlifowania w przypadku dużych kawałków materiału lub mikrotomu w przypadku drobniejszych kawałków.</li>
	<li>Po dotarciu do interesującego Cię miejsca porównaj fizyczną próbkę z wirtualnymi wycinkami μCT, aby potwierdzić lokalizację. Dokonano tego poprzez porównanie cech anatomicznych w przekroju poprzecznym.</li>
</ol>
6. Mikroskopia elektronowa ze skanowaniem twarzy bloku szeregowego18
<ol>
	<li>Zmniejsz przekrój próbki, aby pomieścić SBF-SEM, około 2,0 x 1,5 x 1,8 mm.</li>
	<li>Zamontuj przyciętą próbkę na aluminiowym króćcu SBF-SEM za pomocą żywicy epoksydowej.</li>
	<li>Pokryj blok próbki złotem o długości fali 35 nm. Zakręć próbkę na platformie, aby nałożyć równą warstwę powłoki.</li>
	<li>Odwietrz komorę SBF-SEM i dostosuj wysokość ostrza noża do wysokości eucentrycznej mikroskopu.</li>
	<li>Włóż próbkę i wypoziomuj króciec próbki.</li>
	<li>Obraz w warunkach niskiej próżni w celu zapobieżenia ładowaniu i z detektorem rozproszenia wstecznego (patrz tabela S2 dla parametrów akwizycji SBF-SEM).</li>
	<li>Obrazuj i łącz wiele obszarów zainteresowania przy różnych powiększeniach za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li>
<li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li>
<li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+valvulogenic%2C+chondrogenic%2C+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li>
<li>Jiménez-Altayó, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stenosis+coexists+with+compromised+%CE%B11-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889(2020).</li>
<li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Heart+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li>
<li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcAnulty%2C+P+%22The+Minipig+in+Biomedical+Research%22">The Minipig in Biomedical Research</a>. , CRC Press. (2011).</li>
<li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li>
<li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li>
<li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+biomechanics+of+heart+valve+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li>
<li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+function%3A+a+biomechanical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li>
<li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li>
<li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aortic+valve+microstructure%3A+Effects+of+transvalvular+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li>
<li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li>
<li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li>
<li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29%2FLipids+and+Lipid+Metabolism%22%5BJournal%5D)">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li>
<li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li>
<li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+heart+valve+structure+and+function%3A+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li>
<li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li>
<li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis%2C+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Usunięcie komór służy dwóm celom. Po pierwsze, wystawienie strony komorowej na ciśnienie atmosferyczne, dzięki czemu wystarczy zastosować ciśnienie przezzastawkowe od strony tętniczej zastawki płucnej, aby się zamknąć, a po drugie, zapewnienie stabilnej podstawy, aby zapobiec skręceniu pnia płucnego. Podczas zwiększania ciśnienia pień płucny rozszerza się promieniowo i dolnie, co sprawia, że jest podatny na skręcanie, powodując zapadanie się pnia płucnego. Wstępne obciążenie zastawki płucnej roztworem soli fizjologicznej...

Zastawka płucna (PV) służy do zapewnienia jednokierunkowego przepływu krwi między prawą komorą a tętnicą płucną. Malformacje zastawek płucnych są związane z kilkoma postaciami wrodzonych wad serca. Obecne leczenie wrodzonej wady zastawki serca (HVD) polega na naprawie zastawek lub wymianie zastawki, co może wymagać wielu inwazyjnych operacji w ciągu całego życia pacjenta1. Powszechnie przyjmuje się, że funkcja zastawki serca wywodzi się z jej struktury, często określanej jako korelacja struktura-funkcja. Mówiąc dokładniej, właściwości geometryczne i biomechaniczne serca dyktują jego funkcję. Z kolei właściwości mechaniczne zależą od składu i organizacji ECM. Opracowując metodę określania właściwości biomechanicznych mysich zastawek serca, transgeniczne modele zwierzęce mogą być wykorzystane do zbadania roli ECM w funkcji i dysfunkcji zastawki serca2,3,4,5.
Mysi model zwierzęcy od dawna uważany jest za standard w badaniach molekularnych, ponieważ modele transgeniczne są łatwiej dostępne u myszy w porównaniu z innymi gatunkami. Mysie modele transgeniczne stanowią wszechstronną platformę do badań nad chorobami związanymi z zastawkami serca6. Jednak wiedza chirurgiczna i wymagania dotyczące oprzyrządowania w celu scharakteryzowania zarówno geometrii, jak i organizacji ECM były główną przeszkodą w postępie badań nad HVD. Dane histologiczne w literaturze dostarczają obrazu zawartości macierzy zewnątrzkomórkowej mysiej zastawki serca, ale tylko w postaci obrazów 2D i nie są w stanie opisać jej architektury 3D7,8. Ponadto zastawka serca jest niejednorodna zarówno przestrzennie, jak i czasowo, co utrudnia wyciąganie wniosków z eksperymentów dotyczących organizacji ECM, jeśli pobieranie próbek i konformacja nie są ustalone. Konwencjonalne metody charakteryzacji 3D, takie jak rezonans magnetyczny lub echokardiografia 3D, nie zapewniają rozdzielczości niezbędnej do rozpoznania komponentów ECM9,10.
Ta praca szczegółowo opisuje w pełni korelacyjny przepływ pracy, w którym rozwiązano czasową niejednorodność spowodowaną cyklem pracy serca poprzez ustalenie konformacji mysiego PV za pomocą hydrostatycznego ciśnienia przezzastawkowego. Niejednorodność przestrzenna była precyzyjnie kontrolowana poprzez pobieranie próbek z obszarów zainteresowania i rejestrowanie zestawów danych z różnych modalności obrazowania, w szczególności μCT i mikroskopii elektronowej ze skaningiem bloku szeregowego, w różnych skalach długości. Ta metoda rozpoznania za pomocą μCT w celu kierowania dalszym pobieraniem próbek została zaproponowana wcześniej, ale ponieważ zastawka płucna wykazuje zmienność czasową, potrzebny był dodatkowy poziom kontroli na poziomie chirurgicznym11.
Badania in vivo opisujące biomechanikę mysich zastawek serca są rzadkie i zamiast tego opierają się na modelach obliczeniowych podczas opisywania zachowania deformacji. Niezwykle ważne jest, aby lokalne dane zewnątrzkomórkowe w skali długości nanometrowej były powiązane z geometrią i lokalizacją zastawki serca. To z kolei zapewnia policzalne, przestrzennie odwzorowane rozkłady białek ECM współdziałających mechanicznie, które można wykorzystać do wzmocnienia istniejących modeli biomechanicznych zastawek serca12,13,14.

<table><tbody><tr><td>25% aldehyd glutarowy (aq)</td><td>EMS</td><td>16210</td><td>Podstawowy składnik utrwalający</td></tr><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>200 proof etanolu</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Igła 22G</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>3 mL strzykawka</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>3-kierunkowy kran</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td></td><td></td>MX5311L</tr><tr><td>4% tetratlenek osmu</td><td>EMS</td><td>19150</td><td>Składnik barwiący</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd (aq)</td><td>EMS</td><td>157-4-100</td><td>Podstawowy składnik utrwalający</td></tr><tr><td>Wchłanialny hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMS</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>poliamidowy szew monofilamentowy, 10-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td></td><td></td>TI38402</tr><tr><td>szew monofilamentowy poliamidowy, 6-0</td><td>AROSurgical instruments Corporation</td><td>SN-1956</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>Około 1 rok</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz kleszczowy</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z końcówką bawełnianą</td><td>Fisher Naukowy</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz Dumont #5</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5/45</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 kleszcz drobnoziarnisty</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Durcupan ACM</td><td>EMS</td><td>14040</td><td>Do zatapiania</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Heliscan microCT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Micro-CT</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-84-8</td><td>Składnik barwiący</td></tr><tr><td>Azotan ołowiu</td><td>EMS</td><td>17900</td><td>Komponent barwiący</td></tr><tr><td>niskopróżniowy detektor rozproszenia wstecznego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VSDBS</td><td>SEM detektor rozpraszania wstecznego</td></tr><tr><td>Kleszcz do mikroasynów</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Millex-GP, 0,22 um, PES 33mm, niesterylne</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033NS</td><td></td></tr><tr><td>Włókniny</td><td>McKesson Corp.</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodzian heksacyjanożelazianu(II) potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14459-95-1</td><td>Składnik barwiący</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>Linia do pomiaru ciśnienia</td><td>Smiths Medical ASD, Inc.</td><td>MX562</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej (sterylny 0,9% chlorek sodu)</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-0138-22</td><td></td></tr><tr><td>Rozmiar 3 Kapsuła BEEM</td><td>EMS</td><td>69910-01</td><td>Pojemnik do zatapiania</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6131-99-3</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Retraktory Solibri</td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Napylarka do napylania, węgla i wiązki elektronicznej</td><td>Leica</td><td>EM ACE600</td><td>Powłoka do złota</td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd (TCH)</td><td>EMS</td><td>21900</td><td>Składnik barwiący</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę/kleszcze Tish</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Trymer</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Składnik barwiący</td></tr><tr><td>Woltoskopowy skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VOLUMESCOPESEM</td><td>Mikroskop elektronowy ze skanowaniem twarzy z blokiem szeregowym</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór ksylazyny</td><td>Akorn Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Podstawowe przyczyny choroby zastawek serca (HVD) są nieuchwytne. Mysie modele zwierzęce stanowią doskonałe narzędzie do badania HVD, jednak wiedza chirurgiczna i instrumentalna wymagana do dokładnego ilościowego określenia struktury i organizacji w wielu skalach długości zahamowała jego postęp. Praca ta zawiera szczegółowy opis sekcji myszy, barwienia en bloc, przetwarzania próbek i procedur obrazowania korelacyjnego w celu zobrazowania zastawki serca w różnych skalach długości. Hydrostatyczne ciśnienie przezzastawkowe zastosowano do kontrolowania niejednorodności czasowej poprzez chemiczne utrwalenie konformacji zastawki serca. Mikrotomografia komputerowa (μCT) została wykorzystana do potwierdzenia geometrii zastawki serca i zapewnienia odniesienia dla dalszego przetwarzania próbki potrzebnej do mikroskopii elektronowej ze skaningiem szeregowym (SBF-SEM). Wykonano i zrekonstruowano seryjne obrazy SEM macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) o wysokiej rozdzielczości, aby zapewnić lokalną reprezentację 3D jej organizacji. Metody obrazowania μCT i SBF-SEM zostały następnie skorelowane, aby przezwyciężyć zmienność przestrzenną w zastawce płucnej. Chociaż zaprezentowana praca dotyczy wyłącznie zastawki płucnej, metodologia ta może zostać przyjęta do opisu hierarchicznej organizacji w systemach biologicznych i ma kluczowe znaczenie dla charakterystyki strukturalnej w wielu skalach długości.

Anastomozę tętnicy płucnej z przewodami do ciśnieniowania przedstawiono na Ryc. 1A. Po przyłożeniu ciśnienia hydrostatycznego pień płucny rozszerza się promieniście (Ryc. 1B), co wskazuje, że płatki zastawki płucnej znajdują się w konfiguracji zamkniętej. Konformacja zastawki płucnej została potwierdzona za pomocą µCT. W tym przypadku płatki były koaptowane (zamknięte), a pierścień miał kształt kolisty (Ryc. 2A). <strong class="xfig...

Tutaj opisujemy korelacyjny przebieg pracy dla wycinania, zwiększania ciśnienia, utrwalania i obrazowania mysiej zastawki płucnej, aby określić konformację ogólną i lokalne struktury macierzy zewnątrzkomórkowej.

Chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ ma na celu udzielenie odpowiedzi na pytania dotyczące korelatu funkcji struktury mysiej zastawki płucnej, która jest na ogół trudna ze względu na jej nieodłączną niejednorodność. Kontrolowana fiksacja i obrazowanie korelacyjne zostały wykorzystane do uchwycenia struktury w wielu skalach długości. Lokalne obrazy o wysokiej rozdzielczości mogą być następnie odwzorowane z powrotem do dokładnej lokalizacji anatomicznej na zastawce płucnej.Procedurę zademonstruje dr Tai Yi, dyrektor ds. mikrochirurgii w Centrum Medycyny Regeneracyjnej w Nationwide Children's Hospital. Zacznij od autoklawowania narzędzi potrzebnych do sekcji myszy, w tym cienkich nożyczek, mikrokleszczy, zacisków mikronaczyniowych, kleszczyków zaciskowych, uchwytów do mikroigieł, nożyczek sprężynowych i retraktorów. Po eutanazji dorosłej myszy C57BL/6 umieść ją w grzbietowej pozycji leżącej na tacy, zabezpiecz jej kończyny taśmą i wykonaj torakotomię.Odsłoń serce, usuwając nadmiar tkanki tłuszczowej i powięzi, a następnie usuń prawy przedsionek i przelej lewą komorę roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej. Usuń całe serce, przecinając żyłę główną górną, żyłę główną dolną, tętnicę płucną i aortę, a następnie przeciąć około dwóch milimetrów powyżej połączenia komorowo-przedsionkowego, które będzie służyć jako kanał do zwiększania ciśnienia. Usuń lewą i prawą komorę, aby wystawić komory na ciśnienie atmosferyczne, upewniając się, że struktura pnia płucnego nie została naruszona przez usunięcie komór.Rurka do pomiaru ciśnienia w zespoleniu z tętnicą płucną, pozostawiając około jednego milimetra odległości między połączeniem sinotubularnym a końcem rurki, aby dostosować się do dużych ruchów płatków i pnia płucnego. Podnieś zbiornik do analogicznego ciśnienia fizjologicznego i napełnij go roztworem soli fizjologicznej. Przetestuj system przepływowy, aby upewnić się, że nie ma zatorów ani pęcherzyków powietrza.Podłączyć kran do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić odpowiedni przepływ przez rurkę poprzez przełączenie przewodu odpływowego. Gdy przepływ jest wystarczający, przełączyć odpływ na zespolenie zastawki płucnej i zapewnić ciśnienie w pniu płucnym identyfikowane przez rozdęcie tułowia. Po potwierdzeniu ciśnienia w pniu płucnym, stopniowo wprowadzaj pierwotny roztwór utrwalający, aż 25% pojemności zbiornika roztworu soli zostanie usunięte.Umieść gazę nasączoną utrwalaczem na próbce tkanki, aby zapobiec wysuszeniu. Utrwalacz utrwalacz przez trzy godziny, ponownie napełniając zbiornik, aby utrzymać stałe ciśnienie. Po perfuzji przechowuj zastawkę serca w roztworze utrwalającym w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia przez okres do jednego tygodnia.W celu barwienia należy trzykrotnie przemyć stałą próbkę zastawki serca zimnym 0,15-molowym buforem kakodylowym przez pięć minut i całkowicie zanurzyć zastawkę serca w roztworze 1,5 żelazocyjanku potasu, 0,15 molowego kakodylanu, dwóch milimolowych chlorków wapnia i 2% tetratlenku osmu na lodzie na jedną godzinę. Umyć próbki podwójnie destylowaną wodą o temperaturze pokojowej, umieszczając je w probówce na pięć minut z lekkim mieszaniem. Po trzech kolejnych przepłukaniach umieścić próbkę w przefiltrowanym roztworze tiokarbohydrazydu o temperaturze pokojowej.Po 20 minutach przemyć próbkę trzykrotnie wodą, jak pokazano wcześniej. Następnie umieść próbkę w 2% tetratlenku osmu w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach przemyj ją wodą trzy razy przez pięć minut każdy i inkubuj próbkę w 1% octanie uranylu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W międzyczasie przygotuj roztwór azotanu ołowiu. Następnego dnia wykonaj etap płukania trzy razy, jak pokazano wcześniej, a następnie inkubuj tkankę zastawki serca w roztworze asparaginianu ołowiu w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Umyj próbki jeszcze trzy razy, a następnie wykonaj seryjne odwodnienie tkanek zastawki serca świeżo przygotowanym 20, 50, 70 i 90% etanolem na lodzie przez pięć minut każde, a następnie wykonaj dwie kolejne zabiegi ze 100% etanolem.Po odwodnieniu przenieś tkanki do lodowatego acetonu, a następnie umieść go w świeżym acetonie w temperaturze pokojowej na 10 minut. Do zatapiania należy przygotować mieszaninę żywic zgodnie ze specyfikacją producenta. Umieść tkanki w kolejnych zabiegach mieszaniny żywicy do acetonu od 25 do 75, 50 do 50 i 75 do 25 na dwie godziny każda.Na koniec umieść chusteczki na noc w 100% żywicy. Następnego dnia umieść chusteczki w świeżej 100% żywicy. Po dwóch godzinach przenieś chusteczki do kapsułki do zatapiania, dodaj świeżą 100% żywicę i umieść ją w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza na 48 godzin do utwardzenia.Poniżej przedstawiono wyciętą tętnicę płucną z zespoleniem przed i po zastosowaniu ciśnienia hydrostatycznego. Tułów płucny rozszerza się promieniście, co wskazuje, że płatki zastawki płucnej są w konfiguracji zamkniętej. Tomografia mikrokomputerowa potwierdziła potwierdzenie zastawki płucnej.Płatki były zamknięte, a pierścień był okrągły, podczas gdy obserwowano różne stopnie niewystarczającego ciśnienia w zastawce płucnej przez stabilizację lub zapadnięcie się tętnicy. Wirtualne przekroje poprzeczne renderujące objętość mikro CT skorelowano z obrazami optycznymi, aby potwierdzić kierunek i lokalizację krojenia. Obrazy SBF SEM o wysokiej rozdzielczości zostały wykonane w lokalnym regionie w ulotce, gdy blok próbki znajdował się w pożądanym miejscu i orientacji.W tym miejscu pokazano skorelowane obrazy między wirtualnym przekrojem renderującym objętość mikro CT, obrazy SBF SEM o niskiej i wysokiej rozdzielczości. W reprezentacji 3D segmentowanego obszaru zastawki płucnej można zidentyfikować elementy zewnątrzkomórkowe, takie jak komórki śródbłonka, zastawkowe komórki śródmiąższowe i włókna zewnątrzkomórkowe. Wypróbowując ten protokół, należy pamiętać, że zwiększenie ciśnienia ma kluczowe znaczenie i zapewni jak najwyższą wydajność.

surgery-sample-processing-for-correlative-imaging-murine-pulmonary

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Wysokoczęstotliwościowe ultradźwięki Dopplera to nowatorska technologia służąca do oceny regionalnej funkcji mięśnia sercowego. Niniejsza praca przedstawia pierwsze dowody wykazujące przydatność tej wszechstronnej platformy obrazowania do wielokrotnego pomiaru odkształcenia mięśnia sercowego, dp/dt oraz niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji (IR) serca mysiego.

Wysokoczęstotliwościowa echokardiografia o wysokiej rozdzielczości: pierwsze dowody na nieinwazyjny, powtarzalny pomiar odkształcenia mięśnia sercowego, kurczliwości i niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji serca myszy

W tym filmie opisujemy procedurę izolacji i chemicznego ustalania wartości płucnej myszy w zamkniętej konformacji poprzez zwiększanie ciśnienia perfuzji.

Utrwalanie ciśnieniowe izolowanej mysiej zastawki płucnej: procedura izolacji i chemicznego mocowania mysiej zastawki płucnej w zamkniętej konformacji

Dysfunkcja prawej komory (RV) jest kluczowa dla patogenezy chorób sercowo-naczyniowych, jednak dostępne są ograniczone metodologie jej oceny. Ostatnie postępy w obrazowaniu ultrasonograficznym zapewniają nieinwazyjną i dokładną opcję podłużnego badania RV. W tym artykule szczegółowo opisujemy krok po kroku metodę echokardiograficzną wykorzystującą mysi model przeciążenia ciśnienia RV.

Ocena struktury i funkcji prawej komory serca w mysim modelu zwężenia tętnicy płucnej za pomocą echokardiografii przezklatkowej

Aby zrozumieć komórkowe i molekularne mechanizmy leżące u podstaw powstawania nowotworów i rozwoju zwężeń w zastawkach serca z inżynierii tkankowej, opracowano mysi model heterotopowego przeszczepu zastawki serca. Zastawkę płucną serca przeszczepiono biorcy przy użyciu techniki heterotopowego przeszczepiania serca.

Przeszczepienie zastawki płucnej z wykorzystaniem mysiego modelu heterotopowego przeszczepienia serca

Ten protokół zawiera szczegółowy opis podejścia echokardiograficznego do kompleksowego fenotypowania funkcji serca i zastawki serca u myszy.

Podejścia echokardiograficzne i protokoły do kompleksowej charakterystyki fenotypowej choroby zastawkowej serca u myszy

Tutaj oferujemy użyteczne podejście do badania mechanizmu niewydolności prawej komory. Wygodniejsze i skuteczniejsze podejście do zwężenia tętnicy płucnej ustala się za pomocą narzędzi chirurgicznych wykonanych we własnym zakresie. Ponadto przedstawiono metody oceny jakości tego podejścia za pomocą echokardiografii i cewnikowania.

Indukcja niewydolności prawej komory przez zwężenie tętnicy płucnej i ocena funkcji prawej komory u myszy

Zgłaszany jest model gryzoni z przeciążeniem objętości lewego serca spowodowanym niedomykalnością zastawki mitralnej. Niedomykalność zastawki mitralnej o kontrolowanym nasileniu jest indukowana przez wprowadzenie igły o określonych wymiarach do przedniego płatka zastawki mitralnej, w bijącym sercu, pod kontrolą ultrasonograficzną.

Model nakłucia ulotki zastawki mitralnej pod kontrolą obrazu kontrolowanego przeciążenia objętości z powodu niedomykalności zastawki mitralnej u szczura

Przedstawiony tutaj jest protokół zachowania kurczliwości naczyniowej mysiej tkanki płucnej PCLS, co daje wyrafinowany trójwymiarowy obraz układu oddechowego i dróg oddechowych, który może być zachowany przez okres do 10 dni, który jest podatny na liczne zabiegi.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Opisujemy mysi model przeciążenia ciśnienia w prawej komorze wywołanego przez opaski na pniu płucnym. Szczegółowe protokoły intubacji, chirurgii i fenotypowania za pomocą echokardiografii znajdują się w artykule. Do intubacji i chirurgii wykorzystywane są instrumenty wykonane na zamówienie, co pozwala na szybkie i niedrogie odtworzenie modelu.

Mysi model przerostu prawej komory serca wywołanego przeciążeniem ciśnieniowym i niewydolności przez opaski pnia płucnego

Poznaj protokół chirurgii i przetwarzania próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej. Metoda obejmuje hydrostatyczną presuryzację, barwienie en bloc oraz korelację μCT z SBF-SEM dla wieloskalowej analizy strukturalnej.

Chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej

Przeglądaj więcej filmów