Name: Mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji ATP za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji internalizacji ATP przez makropinocytozę w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem. Technika umożliwia badanie mechanizmów pobierania składników odżywczych przez komórki rakowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kriosekcja została przeprowadzona na miejscu w Centrum Histopatologii Uniwersytetu Ohio. Prace te były częściowo wspierane przez fundusze start-upowe (Ohio University College of Arts & Sciences) dla C Nielsena; Grant NIH R15 CA242177-01 i nagroda RSAC dla X Chen.

<ol><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+hallmarks+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emerging hallmarks of cancer metabolism.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).</li>
<li>Pellegatti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+level+of+extracellular+ATP+at+tumor+sites%3A+in+vivo+imaging+with+plasma+membrane+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase.</a> PLoS ONE. 3, 25992008(2008).</li>
<li>Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+adenosine+triphosphate+in+the+pericellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120101(2013).</li>
<li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-dependent+anticancer+immune+responses+induced+by+chemotherapeutic+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice.</a> Science. 334, 1573-1577 (2011).</li>
<li>Wilhelm, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease+is+enhanced+by+extracellular+ATP+activating+P2X7R%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R.</a> Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Warburg+effect%3A+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Science. 324, 1029-1033 (2009).</li>
<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).</li>
<li>Chen, X., Qian, Y., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Warburg+effect%3A+evolving+interpretations+of+an+established+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept.</a> Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP%2C+as+an+energy+and+phosphorylating+molecule%2C+induces+different+types+of+drug+resistances+in+cancer+cells+through+ATP+internalization+and+intracellular+ATP+level+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase.</a> Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).</li>
<li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+as+a+biological+hydrotrope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ATP as a biological hydrotrope.</a> Science. 356, 753-756 (2017).</li>
<li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+is+internalized+by+macropinocytosis+and+induces+intracellular+ATP+increase+and+drug+resistance+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells.</a> Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+a+new+player+in+cancer+metabolism%3A+NSCLC+cells+internalize+ATP+in+vitro+and+in+vivo+using+multiple+endocytic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms.</a> Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+size+of+fluorescent+dextran+on+its+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway.</a> Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).</li>
<li>Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+uptake+via+alpha2+adrenoceptor-mediated+PI3K+activation+following+brief+exposure+to+noradrenaline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline.</a> Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).</li>
<li>Hoppe, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+quinolines+and+artemisinin+inhibit+endocytosis+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+%26+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).</li>
<li>Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+ATP+cross+the+cell+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+Journal+of+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Does ATP cross the cell plasma membrane.</a> Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).</li>
<li>Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+utilization+of+extracellular+%5Bgamma-32P%5DATP+for+the+phosphorylation+of+intracellular+proteins+in+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).</li>
<li>Chaudry, I. H., Baue, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+evidence+for+ATP+uptake+by+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Further evidence for ATP uptake by rat tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).</li>
<li>Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otto+Warburg%27s+contributions+to+current+concepts+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).</li>
<li>Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+metabolism+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Links between metabolism and cancer.</a> Genes & Development. 26, 877-890 (2012).</li>
<li>Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+consumption+promotes+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP consumption promotes cancer metabolism.</a> Cell. 143, 669-671 (2010).</li>
<li>Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+and+insulin+secretion%3A+the+ATP-sensitive+K%2B+channel+%28K+ATP%29+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection.</a> Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).</li>
<li>Szendroedi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+mitochondrial+ATP+synthesis+and+glucose+transport%2Fphosphorylation+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes.</a> PLoS Medicine. 4, 154(2007).</li>
<li>Miyamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+reveals+elevated+glomerular+ATP%2FAMP+in+diabetes%2Fobesity+and+identifies+sphingomyelin+as+a+possible+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator.</a> EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Opracowano metodę przestrzennej, czasowej i ilościowej analizy internalizacji komórkowej niehydrolizowanego ATP. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w różnych systemach biologicznych, w tym w różnych modelach rakotwórczych, dla których zapewniamy instrukcje techniczne i reprezentatywne dane. Aby uzyskać możliwe do interpretacji dane podczas badań internalizacji ATP in vivo (sekcja 4 protokołu), kluczowe znaczenie ma ograniczenie eksperymentalnego czasu, jaki upłynął od wstrzyknięcia dekstranu do krioosadzania. Mo...

Oportunistyczne pobieranie wewnątrznowotworowych składników odżywczych z przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ie) zostało niedawno uznane za kluczową cechę charakterystyczną metabolizmu nowotworowego1. Jednym z tych ważnych składników jest ATP, ponieważ stężenie ieATP jest od 103 do 104 razy wyższe niż w tkankach prawidłowych, mieszcząc się w zakresie od kilkuset µM do niskich wartości mM2,3,4,5. Jako kluczowa cząsteczka energetyczna i sygnałowa, ATP odgrywa centralną rolę w metabolizmie komórkowym w komórkach nowotworowych i zdrowych6,7,8. Zewnątrzkomórkowe ATP jest zaangażowane nie tylko we wzrost komórek nowotworowych, ale promuje również oporność na leki9. Niedawno zidentyfikowano wcześniej nieznane funkcje ATP, takie jak aktywność hydrotropowa, co sugeruje udział ATP w chorobach, takich jak choroba Alzheimera10. W rzeczywistości wydaje się, że nasze zrozumienie ATP i jego funkcji w komórkach nowotworowych, zdrowych oraz innych komórkach chorobowo zmienionych jest dalekie od pełnego. Jednak ze względu na niestabilność ATP i wysoki wskaźnik jego obrotu w komórkach, monitorowanie przemieszczania się ATP przez błonę komórkową do wnętrza komórki jest trudne pod względem technicznym.
Aby rozwiązać ten problem i wypełnić lukę badawczą w tym obszarze, opracowano metodę, w której niehydrolizowalny fluorescencyjny ATP (NHF-ATP) (Rysunek 1) został wykorzystany jako substytut do wizualizacji internalizacji ATP oraz obserwacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji przestrzennej zinternalizowanego ATP, zarówno in vitro, jak i in vivo11,12. Wykazano, że NHF-ATP może zastąpić endogenny ATP w badaniach nad transportem ATP przez błony komórek zwierzęcych, zarówno w liniach komórek nowotworowych, jak i w tkance guza ludzkiego ksenoprzeszczepionej myszom z niedoborem odporności11,12. Ponadto podanie komórkom inhibitorów makropinocytozy zablokowało internalizację eATP, co sugeruje, że wewnątrzkomórkowy pobór eATP odbywa się poprzez mechanizm makropinocytozy9,11,12. Niniejszy protokół umożliwia immunologiczne współoznaczenie białek specyficznych dla danej komórki, a tym samym identyfikację typu komórek internalizujących NHF-ATP. Dzięki zastosowaniu ksenoprzeszczepów guzów in vivo oraz mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, NHF-ATP można wizualizować przestrzennie w całej próbce tkanki, a nawet w obrębie pojedynczej komórki. Metody te pozwalają również na analizę ilościową, taką jak określenie procentowego poboru komórkowego, liczby pęcherzyków makropinocytycznych oraz kinetyki internalizacji. W niniejszej pracy szczegółowo opisano, w jaki sposób NHF-ATP, stosowany samodzielnie lub w połączeniu z fluorescencyjnymi dekstranami jako markerami endocytozy13,14,15,16, może być wykorzystywany w różnych układach eksperymentalnych do badania internalizacji ATP oraz jego lokalizacji wewnątrzkomórkowej po wniknięciu do komórek.
<img alt="Struktury chemiczne NHF-ATP i HMWFD; schemat przedstawiający skład cząsteczkowy i znakowanie TMR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62768/62768fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Struktury niehydrolizowalnego fluorescencyjnego ATP oraz fluorescencyjnego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej znakowanego tetrametylorodaminą. (A) Struktura NHF-ATP. (B) Schematyczne przedstawienie HMWFD. Skróty: ATP = trifosforan adenozyny; NHF-ATP = niehydrolizowalny fluorescencyjny ATP; TMR = tetrametylorodamina; HMWFD = fluorescencyjny dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62768/62768fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Komórki A549, ludzki nabłonek płuc, rak</td><td>National Cancer Institute</td><td>n/a</td><td>Tańsze źródło</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25904</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa, Reynolds</td><td>Grainger</td><td>6CHG6</td><td></td></tr><tr><td>Wodne podłoże montażowe, ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Analog ATP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NK-101</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw, sterylizator</td><td>Grainger</td><td>33ZZ40</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza, kriostat, wysoki profil</td><td>C. L. Sturkey, Inc.</td><td></td><td></td>DT554550</tr><tr><td>Suwmiarki, noniusz</td><td>Grainger</td><td>4KU77</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka komórkowa, mieszanka składników odżywczych szynki F12, bez surowicy</td><td>Millipore Sigma</td><td>51651C-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, chłodzona z wahliwym wirnikiem kubełkowym</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423555000</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa, 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa, 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, szkło, 12 mm</td><td>Kriostat Corning</td><td>2975-245</td><td></td></tr><tr><td>, Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Delikatna chusteczka do zadań, Kim Wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, utrwalana lizyną, o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>MW = 70 000, dekstran tetrametylorodaminy</td></tr><tr><td>, neutralny, o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW)</td><td>Invitrogen</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM), bez surowicy</td><td>Fisher Scientific</td><td>11885076</td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td>Dostawa lokalna</td><td>Zamówienie niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania epifluorescencyjnego, Nikon NiU i Nikon NIS Oprogramowanie do akwizycji elementów</td><td>Nikon</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Kleszcze</td><td>16000044</td><td></td>ThermoFisher</tr><tr><td>, Dumont #7, zakrzywione</td><td>Kleszcze Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>, Dumont #5, proste</td><td>Rękawice Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>(małe, średnie, duże)</td><td>Microflex</td><td>N191, N192, Rękawice N193</td><td></td></tr><tr><td>, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (do pracy z suchym lodem)</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-046-563</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Daigger</td><td>EF16034F EA</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator, hodowla komórkowa</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>Taśma opisowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Pisak do znakowania, Sharpie (ultra-drobny)</td><td>Zszywki</td><td></td><td></td>642736</tr><tr><td>Myszy, z niedoborem odporności (Nu/J)</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>2019</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka, accuSpin Micro17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, probówki Eppendorfa (1,5 ml)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko na szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-751-4983</td><td></td></tr><tr><td>Igła, rozmiar</td> <td>27Becton-Dickinson</td><td>752 0071</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Grainger</td><td>39AL12</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>Zszywki</td><td>33550</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Acros Organics</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka perforowana, średnica 15 mm, długość 135 mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-6162</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (10 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1000 &mu; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-403</td><td></td></tr><tr><td>Pipety, serologiczne (10 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-910</td><td></td></tr><tr><td>Pippetor, Gilson P2</td><td>Daigger</td><td>EF9930A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw startowy pipetora, Gilson (2-10 &mu; L, 20-200 &mu; L, 200-1000 &mu; L)</td><td>Daigger</td><td>EF9931A</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka platformowa - orbitalna, stołowa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-51710-23</td><td></td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe, skalpel Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>, rozmiar 10, Surgical Design, Inc.</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-707</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne - ostre, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14005-12</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu, Nikon Elements</td><td>Nikon Na</td><td>zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu, ImageJ (FIJI)</td><td>National Institutes of Health</td><td>n/a</td><td>Pobierz online (bezpłatnie)</td></tr><tr><td>Tarcza do próbek 30 mm (uchwyt uchwytu), akcesorium do kriostatu</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td></td></tr><tr><td>Taca do barwienia, 245 mm Naczynie do testów biologicznych</td><td></td><td></td> Strzykawka Corning 431111<td></td></tr><tr><td>, 1 cc</td> Taśma <td>Becton-Dickinson</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>, laboratoryjna, szerokość 19 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Timer Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych, średnica</td> <td>100 x 15 mmFisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych, 225 cm2</td><td>ThermoFisher</td><td>159933</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych, 24-dołkowa</td><td>Becton-Dickinson</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania tkanek, stal nierdzewna</td><td>Tissue Tek</td><td>4161</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do zamrażania tkanek, optymalna temperatura cięcia (OCT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna, Precision GP 2S</td><td>ThermoFisher</td><td>TSGP2S</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji atp za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Wykazano, że trifosforan adenozyny (ATP), w tym zewnątrzkomórkowe ATP (eATP), odgrywa znaczącą rolę w różnych aspektach nowotworzenia, takich jak oporność na leki, przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) i przerzuty. Stężenie eATP w obrębie guza jest 103 do 104 razy wyższe niż w normalnych tkankach. Podczas gdy eATP działa jako posłaniec aktywujący sygnalizację purynergiczną w celu indukcji EMT, jest również internalizowany przez komórki rakowe poprzez podwyższoną makropinocytozę, specyficzny rodzaj endocytozy, w celu wykonywania szerokiej gamy funkcji biologicznych. Funkcje te obejmują dostarczanie energii do reakcji biochemicznych wymagających ATP, oddawanie grup fosforanowych podczas transdukcji sygnału oraz ułatwianie lub przyspieszanie ekspresji genów jako kofaktora transkrypcyjnego. ATP jest łatwo dostępne, a jego badania nad rakiem i innymi dziedzinami niewątpliwie wzrosną. Jednak badania nad eATP pozostają na wczesnym etapie, a nierozwiązane pytania pozostają bez odpowiedzi, zanim ważne i wszechstronne działania odgrywane przez eATP i zinternalizowane wewnątrzkomórkowe ATP będą mogły zostać w pełni rozwikłane.
Wkład laboratoriów tych autorów w te wczesne badania eATP obejmuje obrazowanie mikroskopowe niehydrolizowalnego fluorescencyjnego ATP, w połączeniu z wysoko- i niskocząsteczkowymi fluorescencyjnymi dektransami, które służą jako znaczniki makropinocytozy i endocytozy, a także różne inhibitory endocytozy, do monitorowania i charakteryzowania procesu internalizacji eATP. Ta metoda obrazowania została zastosowana do linii komórek nowotworowych i myszy z niedoborem odporności, ksenoprzeszczepowanych z ludzkimi guzami nowotworowymi, w celu zbadania internalizacji eATP in vitro i in vivo. W niniejszym artykule opisano te protokoły in vitro i in vivo, z naciskiem na modyfikację i dostrojenie warunków testu, tak aby testy internalizacji eATP za pośrednictwem makropinocytozy/endocytozy mogły być z powodzeniem przeprowadzane w różnych systemach.

Badanie in vitro 
Wewnątrzkomórkową internalizację NHF-ATP wykazano poprzez kolokalizację NHF-ATP z HMWFD lub LMWFD (Rycina 4). Powodzenie tej procedury zależy przede wszystkim od zastosowania odpowiednich stężeń NHF-ATP oraz dekstranów, a także od dobrania właściwego typu dekstranów (poli-lizyny lub neutralnych). Na przykład, w celu zbadania makropinocytozy wybrano HMWFD, ponieważ jest on internalizowany wyłącznie przez makropinosomy<sup class="...

Opracowaliśmy powtarzalną metodę wizualizacji internalizacji niehydrolizowalnego fluorescencyjnego trifosforanu adenozyny (ATP), substytutu ATP, o wysokiej rozdzielczości komórkowej. Zwalidowaliśmy naszą metodę przy użyciu niezależnych testów in vitro i in vivo - ludzkich linii komórek nowotworowych i myszy z niedoborem odporności ksenoprzeszczepowanych ludzką tkanką nowotworową.

Mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji ATP za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Komórki rakowe mają niezwykłą zdolność do internalizacji składników odżywczych, takich jak ATP, ze środowiska zewnątrzkomórkowego. Nasz protokół pozwala nam zademonstrować internalizację ATP i wizualizować lokalizację ATP w komórkach. To obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zinternalizowanego ATP w makropinozomach jest idealne do zrozumienia szczególnej lokalizacji i zakończenia analizy internalizacji.Protokół opisuje różne eksperymentalne zastosowania do badania internalizacji ATP. Metoda ta może być stosowana do badania różnych mechanizmów internalizacji komórkowej, w tym makropinocytozy i endocytozy za pośrednictwem egzosomów. W przypadku chorób metabolicznych za pomocą tego protokołu można badać internalizację ATP w komórkach nienowotworowych.Na początek zasiej komórki rakowe w kolbie o powierzchni 225 centymetrów kwadratowych, zawierającej DMEM uzupełniony FBS i antybiotykami. Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po osiągnięciu 80% konfluencji odłącz komórki i osadź odłączone komórki przez odwirowanie, a następnie ponownie zawieś komórki w lodowatym PBS, aby osiągnąć gęstość komórek od 5 razy 10 do 6 komórek na 100 mikrolitrów PBS.Przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Oczyść miejsce wstrzyknięcia na boku myszy z niedoborem odporności 75% etanolem i wytrzyj nadmiar etanolu delikatną chusteczką do ćwiczeń. Narysuj komórki do jednomililitrowej strzykawki bez lateksu, wyposażonej w precyzyjną igłę ślizgową o rozmiarze 27.W przypadku wstrzyknięcia podskórnego należy trzymać igłę pod kątem około 10 stopni do skóry i wprowadzić końcówkę igły skosem skierowanym do góry pod skórą, pozostawiając tylko jeden do dwóch milimetrów igły poza skórą. Dozować komórki ze strzykawki powoli przez około 10 sekund. Po wstrzyknięciu całej objętości należy przytrzymać igłę na miejscu przez trzy do pięciu sekund, a następnie wyjąć igłę.Delikatnie ale mocno uciskać palcami miejsce wstrzyknięcia przez trzy do pięciu sekund, aby zapobiec wyciekaniu wstrzykniętej zawartości. Monitoruj i mierz wzrost guza za pomocą suwmiarki, aż guzy osiągną objętość od 200 do 500 milimetrów sześciennych. Rozpuścić 300 mikrolitrów po 16 miligramów na mililitr fluorescencyjnego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej i DMEM bez surowicy i inkubować w łaźni wodnej, hartować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, następnie odwirować roztwór dekstranu i przenieść supernatant do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.Przy 40 mikrolitrach jednomilimolowy, niehydrolizowalny fluorescencyjny analog ATP łączy się ze 160 mikrolitrami DMEM bez surowicy, aby uzyskać 0,2 milimolowego niehydrolizowanego fluorescencyjnego roztworu ATP. Przygotować roztwory do traktowania DMEM lub osiem miligramów na mililitr dekstranu fluorescencyjnego o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej, z lub bez 100 mikromolowych niehydrolizowalnych fluorescencyjnych ATP w DMEM, mieszając przygotowane wcześniej roztwory podstawowe. Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby zebrać 50 mikrolitrów jednego roztworu leczniczego.Wstrzyknąć roztwór bezpośrednio do guza ksenoprzeszczepu i powtórzyć dla czterech powtórzeń biologicznych każdego zabiegu. Po eutanazji myszy i wyizolowaniu tkanki nowotworowej, użyj perforowanej łyżki, aby zebrać wyciętą tkankę nowotworową i natychmiast umieść tkankę w pożywce zamrażającej i zwiń tkankę, upewniając się, że tkanka pozostaje zanurzona w pożywce, kąpie wszystkie powierzchnie tkanki. Ostrożnie umieść chusteczkę w formie do zatapiania zawierającej pożywkę do zamrażania.Umieść odpowiednią etykietę pionowo w podłożu do zamrażania lub formie, upewniając się, że napisana etykieta jest widoczna na zewnątrz podłoża. Gdy pożywka zamrażająca zmieni kolor na nieprzezroczysty biały, wyjmij blok tkanki z formy, umieść blok tkanki na suchym lodzie i powtórz zamrażanie dla każdej sekcji guza. Przechowuj bloki tkanek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy przed zabiegiem kriosekcji.Po wykonaniu szkiełek bloków tkankowych, zamocuj szkiełka sekcji tkanki w 95% etanolu w temperaturze minus 18 stopni Celsjusza przez pięć minut. Myj stałą sekcję PBS przez pięć minut. Dodać od 10 do 50 mikrolitrów wodnego podłoża montażowego z DAPI do skrawków tkanki, zgodnie z rozmiarem skrawków, i umieścić szkiełko nakrywkowe na skrawku tkanki.Po 12 do 24 godzinach od montażu zidentyfikuj obszary zainteresowania stałych odcinków guza i uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano wcześniej. Po dwóch do 24 godzinach od utrwalenia ludzkich komórek nowotworowych i staniu z DAPI, uchwyć obrazy za pomocą systemu obrazowania epifluorescencyjnego i oprogramowania do akwizycji danych. Umieść szkiełko na stoliku pionowego mikroskopu epiflorescencyjnego w trybie lornetkowym.Otwórz program do obrazowania, wybierz obiektyw 10 razy i dostosuj stolik, aby określić ostrość. Zeskanuj slajd od lewej do prawej w serpentynowy, aby zidentyfikować interesujące Cię obszary. Wybierz obiektyw 40-krotny i użyj przełącznika na mikroskopie, aby przełączyć się z trybu lornetki na tryb przechwytywania obrazu.Kliknij ikonę jakości na żywo, aby wyświetlić, a następnie pobrać obrazy. Użyj panelu OC na pasku narzędzi akwizycji, aby zdefiniować parametry ekspozycji dla każdej kostki filtra lub kanału fluorescencyjnego, a następnie użyj paska narzędzi akwizycji wielokanałowej, aby uzyskać obraz z trzema kanałami ze zdefiniowanymi ustawieniami ekspozycji. Alternatywnie, obrazy wielokanałowe można rejestrować ręcznie, przełączając się między kostkami filtrów, ustawiając czas ekspozycji, zamykając lub otwierając migawkę między akwizycją obrazu dla każdego kanału i nakładając każde zdjęcie zrobione dla poszczególnych kanałów.Zapisz obraz jako plik nd2. Zapisz pliki TIF, w tym scalony obraz kanału i obrazy poszczególnych kanałów. Użyj funkcji zliczania obiektów na pasku narzędzi adnotacji i pomiarów, aby policzyć liczbę komórek fluorescencyjnych NHF-ATP, TMR fluorescencyjnych dekstranów o wysokiej masie cząsteczkowej i TMR o niskiej masie cząsteczkowej fluorescencyjnych dodatnich dekstranów w zapisanym pliku obrazu nd2 i wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu do analizy.Protokół ten został opracowany do przestrzennej, czasowej i ilościowej analizy internalizacji komórkowej niehydrolizowanego ATP. Wewnątrzkomórkową internalizację niehydrolizowanego fluorescencyjnego ATP wykazano poprzez kolokalizację niehydrolizowanego fluorescencyjnego ATP z fluorescencyjnym dekstranem o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej in vitro, ex vivo i in vivo. Aby zapewnić, że komórki nowotworowe zachowają zinternalizowane ATP, ograniczono czas eksperymentu dla wszystkich wstrzyknięć doguzowych do krioosadzania.Uwzględnij również zmienność wewnątrznowotworową, obrazując tkankę w całym guzie. Przyszłe iteracje naszej metody mogą obejmować wizualizację procesu internalizacji E-ATP w czasie rzeczywistym, ujawniając informacje o kinetyce makropynocytotycznej i transporcie w określonych tkankach.

fluorescence-microscopy-for-atp-internalization-mediated

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie opisujemy fluorescencyjną tomografię molekularną lub FMT do obrazowania in vivo fluorescencyjnych ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem w modelach mysich. Technika ta jest przydatna do wyjaśnienia efektów terapii przeciwnowotworowych na poziomie molekularnym.

Fluorescencyjna tomografia molekularna: technika obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem fluorescencyjnym w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Poznaj metodę mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji internalizacji ATP przez makropinocytozę w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem. Technika umożliwia badanie mechanizmów pobierania składników odżywczych przez komórki rakowe.

Mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji ATP za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji ATP za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza

Przeglądaj więcej filmów