Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

Przejściowa transakcja strobilowanych form Echinococcus granulosus. Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Bąblowica torbielowata lub choroba bąblowców jest jedną z najważniejszych odzwierzęcych chorób pasożytniczych wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca przenoszonego w jelicie psów.

Istnieje pilna potrzeba prowadzenia stosowanych badań genetycznych w celu zrozumienia mechanizmów patogenezy oraz kontroli i zapobiegania chorobom. Jednak brak skutecznego systemu oceny genów utrudnia bezpośrednią interpretację genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemca, w tym gatunków Echinococcus. Postępy w przenoszeniu genów u pasożytniczych płazińców są nadal ograniczone w porównaniu z pasożytami pierwotniaków.

Wykorzystanie systemu dostarczania wirusa stało się podstawowym narzędziem do dostarczania transgenów i badania genów/białek w ciągu ostatnich dwóch dekad. Oceniliśmy więc przejściową transdukcję lentiwirusową genu reporterowego GFP do protoskopecji i strobilowanych robaków Echinococcus granulosus. Rycina 1 przedstawia schematyczną prezentację protokołu badania dla stadiów Echinococcus granulosus.

Jeden, zbieranie torbieli bąblowcowych. Zbieraj torbiele bąblowców wątroby od naturalnie zakażonych owiec rutynowo zabijanych w rzeźni. Całkowicie wysterylizuj powierzchnię torbieli za pomocą sterylnej gazy i 70% alkoholu przed aspiracją protoskopecji.

Odessać od 20 do 50 ml płynu bąblowcowego do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Po odsączeniu zetrzyj torbiel ostrym ostrzem, przenieś listek rozrodczy do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i potrząsaj nią przez krótki czas, aby zwiększyć zbiór protoskopecji. Przemyć protoskopety buforem PBS trzy do pięciu razy.

Obserwuj protoskopety w 0,1% eozynie przez pięć minut, aby określić żywotność protoskopów pod mikroskopem świetlnym. Używaj protoskopecji o co najmniej 95% żywotności dla hodowli. Osad protoskopecji należy traktować dwoma ml pepsyny przez 15 do 20 minut.

Aby wyizolować poszczególne protoskopety, ponownie zawieś osad protoskopecji w PBS i przepuść go przez dwie warstwy sterylnej gazy do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po drugie, dwufazowa hodowla protoskopecji Echinococcus granulosus w celu uzyskania dorosłych robaków. Dodać 10 ml pożywki w fazie ciekłej do każdej kolby hodowlanej o średnicy 25 centymetrów kwadratowych.

Dodać około 5 000 protoskopecji do kolby hodowlanej i przenieść ją do inkubatora CO2. Po 24-48 godzinach przenieść protoskopolety do nowej kolby z fazą stałą i dodać jeden ml tej samej świeżej pożywki fazy ciekłej na kolbę. Przenieść kolby do inkubatora, 37 stopni Celsjusza, 5% CO2.

Co pięć do siedmiu dni zastępować pożywkę świeżą pożywką w fazie ciekłej. Trzy, jednofazowa uprawa protoskopecji Echinococcus granulosus. Upewnij się, że uprawa jednofazowa jest wykonywana na 24 do 48 godzin przed transdukcją.

Posadź około 5 000 protoskopów w kolbie hodowlanej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych z RPMI i 10% FBS. Przenieść kolby do inkubatora CO2 do czasu użycia. Po czwarte, hodowla komórkowa do produkcji i przygotowania wirusa.

Przenieś 500 000 komórek HEK do kolby o średnicy 25 centymetrów kwadratowych zawierającej 5 ml DMEM z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mikrogramów/ml streptomycyny. Inkubować komórki HEK2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 i pasować je w kompletnej pożywce hodowlanej co 48 godzin. Na koniec użyj niskoprzelotowych komórek HEK do transdukcji.

Po piąte, produkcja i przygotowanie wirusa z wektorami lentiwirusowymi trzeciej generacji. Pierwszego dnia, po trypsynizacji komórek HEK na 6-dołkowych płytkach hodowlanych, wysiewaj 70 000 komórek na studzienkę świeżym, wolnym od antybiotyków DMEM zawierającym 10% FBS. Użyj komórek o konfluencji od 50 do 60% do transdukcji metodą fosforanu wapnia.

Dzień drugi zastąp pożywkę do hodowli komórkowej na dwie do trzech godzin przed eksperymentem na świeży, wolny od antybiotyków DMEM zawierający 2% FBS. W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj plazmidy lentiwirusowe trzeciej generacji, w tym wektor przenoszenia pCDH513b o stężeniu 7 mikrogramów/mikrolitr, PLPII o stężeniu 4 mikrogramów/mikrolitr, PLPI o sile 4 mikrogramów/mikrolitr i wektory pomocnicze PMD2G o stężeniu 2 mikrogramów/mikrolitr. Dodaj bufor HEPES do mieszaniny, aby osiągnąć objętość 422 mikrolitrów.

Do mieszaniny dodać 16 mikrolitrów buforu 1%TE. Dodaj 62 mikrolitry 2,5 ml chlorku wapnia do probówek i dobrze wymieszaj. Dodaj 500 mikrolitrów 2x buforu HBS do mieszaniny, kropla po kropli w ciągu jednej do dwóch minut za pomocą pipety Pasteura.

Delikatnie mieszaj, aż do uzyskania półprzezroczystego roztworu i inkubuj mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i po czterech do sześciu godzinach zastąpić pożywkę wolnym od antybiotyków DMEM zawierającym 10% FBS.

Dzień trzeci, potwierdź udaną transdukcję przejściową i żywotność komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Czwartego dnia zbierz wirusy z pożywki hodowlanej, zbierając supernatant z każdej studzienki i przechowuj je w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do czasu użycia. Sześć, przejściowa transdukcja różnych stadiów Echinococcus granulosus z wirusem.

Pierwszego dnia użyj 12-dołkowej płytki hodowlanej do transferu genów. Hodowla 5 000 do 50 000 komórek HEK w trzech egzemplarzach z kompletnym podłożem DMEM jako wewnętrznym odniesieniem. Zahoduj 150 świeżych protoskopecji w trzech egzemplarzach w RPMI i 10% FBS.

Posadź 30 strobilowanych robaków w trzech egzemplarzach do DMEM i 10% inaktywowanego termicznie FBS. Przygotuj mieszaninę 1 miliona wirusów z czterema mikrogramami/ml odczynnikiem do transfekcji w celu transdukcji komórek HEK i różnych stadiów robaka. Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami.

Inkubować płytki przez cztery do sześciu godzin w inkubatorze CO2, 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Zastąp pożywkę dla każdej próbki tą samą kompletną pożywką hodowlaną, aby zminimalizować toksyczne działanie odczynników do transfekcji. Dzień drugi powtórz dwa poprzednie kroki, aby zwiększyć wydajność transdukcji przejściowej dla komórek HEK, protoskopecji i robaków strobilowanych.

Inkubować wszystkie płytki przez 24 do 48 godzin w inkubatorze CO2 w tych samych warunkach hodowli w zależności od rodzaju pożywki komórkowej. Dzień trzeci, upewnij się, że transdukcja się powiodła za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Reprezentatywne wyniki.

W tym miejscu opisujemy szybką i wydajną technikę transdukcji przejściowej u Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Hodowaliśmy protoskopety w dwufazowych pożywkach hodowlanych, aby uzyskać strobilowane robaki zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami. Protoskopety przekształcają się w strobilowane robaki po sześciotygodniowej hodowli in vitro.

W dwufazowej pożywce hodowlanej zaobserwowano różne stadia Echinococcus granulosus, w tym wniknięte protoskopele, Figura 2A, evaginated protoscoleces, Figure 2B i brobilowane robaki z pierwszą i trzecią formacją proglottydową, Figure 2C do E.Protoscoleces i strobilated worms uzyskane odpowiednio z upraw jednofazowych i dwufazowych były transfekowane lentiwirusami eksprymującymi GFP, Figura 3. Komórki HEK wyraźnie wyrażały GFP jako kontrolę procesu transjentów przejściowych. Dorosłe robaki najwyraźniej wyrażały GFP w warstwie nakrywki.

Jednak protoskopety wykazały nieco niższy poziom ekspresji GFP po 48 godzinach. Niektóre pozostałości płynu torbielowego i/lub szczątki warstwy rozrodczej wokół protoskopecji spowodowały pewne tło fluorescencyjne w transfekowanych próbkach. Intensywność fluorescencji w komórkach HEK i ustrobilowanych robakach wzrosła po 24 i 48 godzinach.

Zrozumienie molekularnych podstaw nicieni i biologii Platyhelminthes jest jedną z najważniejszych granic patogenności pasożytów odzwierzęcych. Brak skutecznego systemu oceny genów jest główną przeszkodą w bezpośredniej interpretacji genetyki funkcjonalnej tasiemców, w tym gatunków Echinococcus. Głównym celem tej pracy było zilustrowanie procesu transdukcji wektora lentiwirusowego, który będzie miał kluczowe znaczenie w przyszłych badaniach nad bąblowicą.

Wyniki pokazują, że robale strobilizowane są bardziej wrażliwe na przejściową transdukcję genu niż protoskopeleki, co może być wynikiem rozległej struktury nakrywkowej w formach stroboskopowych. Jednak ze względu na charakter transdukcji lentiwirusowej, intensywność fluorescencji w wielokomórkowych protoskopekach i strobilowanych robakach jest zwykle znacznie niższa niż w przypadku jednowarstwowych komórek HEK. Istnieje pilna potrzeba przeprowadzenia stosowanych badań genetycznych na poziomie genomicznym i transkryptomicznym dla Echinococcus, a także szerokiej gamy pasożytniczych i wolno żyjących systemów modelowych płazińców.

W związku z tym opracowanie procesu transferu genów do tasiemców toruje drogę do potencjalnego wykorzystania nowych technik, takich jak mapowanie genów na podstawie wirusów lub edycja genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Praca ta przedstawia transdukcję lentiwirusa w modelu tasiemca i pokazuje obiecujące wyniki, które mogą mieć wpływ na biologię płazińców. Potrzebne są jednak bardziej dogłębne badania, aby udoskonalić metody i rozwinąć możliwość zastosowania tych technik w przyszłych eksperymentach.