Name: Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Poznaj szybką technikę przejściowej transdukcji Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Ta metoda umożliwia badania genetyczne pasożyta i zrozumienie patogenezy echinokokowozy torbielowatej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Elite Researcher Grant Committee pod numerem 958680 od National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.

To badanie zostało zatwierdzone przez National Institute for Medical Research Development oraz Research Ethics Review Committee, nr 958680. Lentiwirusy są klasyfikowane jako organizmy BSL-2; w związku z tym wszystkie procedury hodowli laboratoryjnej w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu sterylnych praktyk laboratoryjnych i przeprowadzone pod okapem z przepływem laminarnym zgodnie z wytycznymi NIH. Rysunek 1 przedstawia schematyczną prezentację protokołu badania dla różnych stadiów E. granulosus.
1. Zbieranie torbieli bąblowcowych
<ol>
	<li>Zbieraj torbiele bąblowców wątroby od naturalnie zakażonych owiec rutynowo zabijanych w rzeźni.</li>
	<li>Całkowicie wysterylizuj powierzchnię torbieli za pomocą sterylnej gazy i 70% alkoholu przed odessaniem protoskopecji (PSC).</li>
	<li>Odessać 20-50 ml płynu bąblowcowego do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Po odsączeniu zetrzyj torbiel ostrym ostrzem, przenieś warstwę rozrodczą do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i potrząsaj nią przez krótki czas (~2 min), aby zwiększyć zbieranie PSC. Przenieś warstwę rozrodczą do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu charakterystyki molekularnej.</li>
	<li>Przemyć PSC 3-5x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Obserwuj PSC w 0,1% eozynie przez 5 minut, aby określić żywotność PSC pod mikroskopem świetlnym. Używaj PSC o co najmniej 95% żywotności dla hodowli.</li>
	<li>Osad PSC należy traktować 2 ml pepsyny (2 mg/ml, pH 2) przez 15-20 minut.</li>
	<li>Aby wyizolować poszczególne PSC, należy ponownie zawiesić osad PSC w PBS i przepuścić go przez dwie warstwy sterylnej gazy do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Oblicz średnią z trzech zliczeń na 50 μl osadów PSC za pomocą mikroskopu świetlnego. W przypadku kolejnych prób należy użyć wartości szacunkowej do określenia PSC/μl. Każdy izolat torbieli bąblowcowej powinien być scharakteryzowany na podstawie polimorfizmów nukleotydów metodami molekularnymi, takimi jak sekwencjonowanie PCR17 lub analiza krzywej topnienia w wysokiej rozdzielczości18.</li>
</ol>
2. Dwufazowa hodowla PSC E. granulosus w celu uzyskania dorosłych robaków
UWAGA: Izolowane PSC powinny być hodowane w sterylnych warunkach w komorze laminarnej klasy II. Przygotuj oddzielnie fazę stałą i ciekłą dwufazowej pożywki hodowlanej przed przejściem do kolejnych kroków19.
<ol>
	<li>Przygotuj dwufazową pożywkę hodowlaną, która będzie składać się z dwóch faz.
	<ol>
		<li>W przypadku fazy stałej dodać 10 ml surowicy bydlęcej do kolby o pojemności 25 ml i pozostawić do koagulacji w temperaturze 76 °C na 20-30 minut.</li>
		<li>W fazie ciekłej (zmodyfikowany CMRL) wymieszaj 100 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS), 36 ml 5% ekstraktu drożdżowego, 5,6 ml 30% glukozy (w wodzie destylowanej), 1,4 ml 5% żółci psa w PBS, 20 mM buforze HEPES i 10 mM NaHCO3 w 260 ml pożywki CMRL-1066. Na koniec dodać do mieszaniny penicylinę (100 j.m./ml) i streptomycynę (100 mg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki w fazie ciekłej do każdej kolby hodowlanejo długości 25 cm2.</li>
	<li>Dodać ~ 5 000 PSC do kolby hodowlanej i przenieść kolbę do inkubatora CO2 (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Po 24-48 godzinach przenieść PSC do nowej kolby z fazą stałą (surowicą bydlęcą) i dodać 1 ml tej samej świeżej pożywki fazy ciekłej na kolbę. Przenieść kolby do inkubatora CO2 (37 °C, 5 % CO2 ).</li>
	<li>Co 5-7 dni zastępować pożywkę świeżą pożywką w fazie ciekłej w oparciu o zmiany koloru pożywki hodowlanej i szacowaną proporcję zróżnicowanych PSCs. 
	UWAGA: Protoskopety szybko reagują na zmiany środowiskowe po hodowli, a większość z nich ulega różnicowaniu w ciągu 2-3 tygodni. Ze względu na zużycie składników odżywczych oraz wzrost i rozwój protoskopecji zmienia się pH pożywki hodowlanej, a jej kolor zmienia się w kierunku pomarańczowego i żółtego.</li>
</ol>
3. Monofazowa hodowla PSC E. granulosus
<ol>
	<li>Upewnij się, że uprawa jednofazowa jest wykonywana 24-48 godzin przed transdukcją.
	<ol>
		<li>Posiew ~ 5,000 PSC w kolbie hodowlanej o średnicy 25 cm2 z RPMI i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
		<li>Przenieść kolby do inkubatora CO2 (37 °C, 5 % CO2 ) do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa do produkcji i przygotowania wirusa
UWAGA: Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T (HEK293T) zostały pozyskane do produkcji wektorów z Centrum Badań nad Patologią i Komórkami Macierzystymi Uniwersytetu Medycznego w Kerman.
<ol>
	<li>Przenieś 5 × 105 HEK293T komórek do kolby o średnicy 25cm2 zawierającej 5 ml DMEM z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Inkubować HEK293T komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i co 48 godzin przechodzić do kompletnej pożywki hodowlanej. Na koniec użyj komórek HEK293T o niskim przejściu do transdukcji20.</li>
</ol>
5. Produkcja i przygotowanie wirusa z wektorami lentiwirusowymi trzeciej generacji
UWAGA: Wektor lentiwirusa pCDH513b (wektor transferowy) oraz PLPII, PLPI i PMD2G (wektory pomocnicze) zostały użyte do ekspresji genu reporterowego GFP. Patrz tabela materiałów i rysunek uzupełniający S1.
<ol>
	<li>Dzień 1:
	<ol>
		<li>Po trypsynizacji HEK293T komórek21 na 6-dołkowych płytkach hodowlanych, wysiewaj 7 ×10 4 komórek na studzienkę świeżym DMEM bez antybiotyków zawierającym 10% FBS.</li>
		<li>Użyj komórek o konfluencji 50%-60% do transdukcji metodą fosforanu wapnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2:
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej na 2-3 godziny przed eksperymentem na świeży, wolny od antybiotyków DMEM zawierający 2% FBS.</li>
		<li>W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj plazmidy lentiwirusowe trzeciej generacji, w tym 7 μg/μL pCDH513b (wektor przenoszenia), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI i 2 μg/μL PMD2G (wektory pomocnicze).</li>
		<li>Dodać bufor HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES i 1,5 mM Na2HPO4; optymalny zakres pH, 7,00-7,28) do mieszaniny do objętości 422 μL.</li>
		<li>Do mieszaniny dodać 16 μl 1% buforu Tris-EDTA (TE).</li>
		<li>Dodać 62 μl 2,5 mM chlorku wapnia do probówek i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Dodaj 500 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej przez HEPS (HBS) do mieszaniny, kropla po kropli, w ciągu 1-2 minut za pomocą pipety Pasteura. Delikatnie mieszać, aż do uzyskania półprzezroczystego roztworu i inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i po 4-6 godzinach zastąpić pożywkę DMEM bez antybiotyków zawierającą 10% FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3:
	<ol>
		<li>Potwierdź udaną transdukcję przejściową i żywotność komórki za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4:
	<ol>
		<li>Pobrać wirusy z pożywki hodowlanej, zbierając supernatant z każdej studzienki i przechowywać je w temperaturze -70 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Zebrane lentiwirusy mogą być zagęszczane i miareczkowane w celu precyzyjnej transfekcji22.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przejściowa transdukcja różnych etapów E. granulosus z wirusem
<ol>
	<li>Dzień 1:
	<ol>
		<li>Użyj 12-dołkowej płytki hodowlanej do transferu genów. Kultura 5 × 103-5 ×10 4 HEK293T komórek w trzech egzemplarzach, z kompletną pożywką DMEM jako wewnętrznym odniesieniem.</li>
		<li>Hodowla 150 świeżych PSC w trzech egzemplarzach w RPMI i 10% FBS.</li>
		<li>Hodowla 30 strobilowanych robaków w trzech egzemplarzach w DMEM zawierających 10% inaktywowanych termicznie FBS. 
		UWAGA: Wszystkie media transdukcyjne muszą być wolne od antybiotyków. Utrzymuj w tym procesie trzy nieleczone studzienki kontrolne dla komórek HEK293T, PSC i robaków strobilowanych.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę 1 × 106 wirusów z odczynnikiem do transfekcji 4 μg/ml (patrz tabela materiałów) w celu transdukcji komórek HEK293T i różnych stadiów rozwoju robaka.</li>
		<li>Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami. Inkubować płytki przez 4-6 godzin w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 ). Zastąp pożywkę dla każdej próbki tą samą kompletną pożywką hodowlaną, aby zminimalizować toksyczne skutki odczynnika do transfekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2:
	<ol>
		<li>Powtórz kroki 6.1.4-6.1.5, aby zwiększyć skuteczność transdukcji przejściowej dla komórek HEK293T, PSC i ślimaków.</li>
		<li>Inkubować wszystkie płytki przez 24-48 godzin w inkubatorze CO2 w tych samych warunkach hodowli w zależności od rodzaju pożywki komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3:
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy transdukcja się powiodła, korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej. 
		UWAGA: Rozważ użycie dalszych testów potwierdzających, takich jak techniki PCR/qPCR20,23 lub Western blotting24 w procedurze transferu genów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95, 315(2017).</li>
<li>Borhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcoses+in+Iran%2C+Turkey%2C+and+Pakistan%3A+Old+diseases+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium.</a> Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).</li>
<li>Eckert, J., Thompson, R. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+aspects+of+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Historical aspects of echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).</li>
<li>Romig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+life+cycle+patterns+of+Echinococcus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species.</a> Advances in Parasitology. 95, 213(2017).</li>
<li>Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcosis%3A+control+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcosis: control and prevention.</a> Advances in Parasitology. 95, 55(2016).</li>
<li>Deplazes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+alveolar+and+cystic+echinococcosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis.</a> Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).</li>
<li>Tsai, I. I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomes+of+four+tapeworm+species+reveal+adaptations+to+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism.</a> Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).</li>
<li>Koziol, U., Brehm, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Echinococcus+genomics+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research.</a> Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+hydatid+tapeworm+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).</li>
<li>Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+transporters+in+the+protozoan+parasite+Leishmania%5BTitle%5D)+AND+%22International+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania.</a> International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).</li>
<li>Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transfection+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+invadens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).</li>
<li>Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Platyhelminthes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Transfection of Platyhelminthes.</a> BioMed Research International. 2015, 206161(2015).</li>
<li>Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lentiviral+vector+production+using+polyethylenimine-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection.</a> Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).</li>
<li>Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+transgenic+schistosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Establishing transgenic schistosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230(2011).</li>
<li>Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of microglial cells.</a> Glia. 50 (1), 48-55 (2005).</li>
<li>Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titering+lentiviral+vectors%3A+comparison+of+DNA%2C+RNA+and+marker+expression+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods.</a> Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).</li>
<li>Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variants+within+the+genus+Echinococcus+identified+by+mitochondrial+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).</li>
<li>Rostami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+technique+for+molecular+epidemiological+studies+of+cystic+echinococcosis%3A+differentiating+G1%2C+G3%2C+and+G6+genotypes+of+Echinococcus+granulosus+sensu+lato%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato.</a> Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).</li>
<li>Mousavi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+morphological+consequences+of+dsRNA-induced+suppression+of+tetraspanin+mRNA+in+developmental+stages+of+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+and+Vectors%22%5BJournal%5D)">Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus.</a> Parasites and Vectors. 13 (1), 190(2020).</li>
<li>Afgar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-339+and+especially+miR-766+reactivate+the+expression+of+tumor+suppressor+genes+in+colorectal+cancer+cell+lines+through+DNA+methyltransferase+3B+gene+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition.</a> Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsinizing+and+subculturing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Trypsinizing and subculturing mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755(2008).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499(2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031(2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Dezaki, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ex+vivo+harvested+and+in+vitro+cultured+materials+from+Echinococcus+granulosus+by+measuring+expression+levels+of+five+genes+putatively+involved+in+the+development+and+maturation+of+adult+worms%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms.</a> Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).</li>
<li>Mousavi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-specific+small+interfering+RNA+induces+consistent+expression+suppression+and+morphological+changes+in+Echinococcus+granulosus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+for+parasitic+nematodes+and+platyhelminths%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths.</a> Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).</li>
<li>Elegheert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+mammalian+cells+for+fast%2C+scalable+and+high-level+production+of+soluble+and+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2991(2018).</li>
<li>Mizukami, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Echinococcus+multilocularis+protoscoleces+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+International%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference.</a> Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).</li>
<li>Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcus+as+a+model+system%3A+biology+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcus as a model system: biology and epidemiology.</a> International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).</li>
<li>Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThompson%2C+RCA+%22Advances+in+Parasitology%22">Advances in Parasitology</a>. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).</li>
<li>Brehm, K., Koziol, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinococcus-host+interactions+at+cellular+and+molecular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels.</a> Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).</li>
<li>Moguel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transgenesis+of+the+tapeworm+Taenia+crassiceps%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps.</a> SpringerPlus. 4, 496(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zrozumienie molekularnych podstaw nicieni i biologii Platyhelminthes ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogeniczności pasożytów odzwierzęcych27. Brak skutecznego systemu oceny genów jest główną przeszkodą w bezpośredniej interpretacji genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemców, w tym gatunków Echinococcus 12,27. Niniejsze badania wskazują na doskonały potencjał lentiwirusa w transdukcji przejściowej E. granulosus.</p...

Pęcherzyk torbielowaty (CE) jest jedną z najważniejszych chorób robaków wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca z rodziny Taeniidae1,2. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad immunodiagnostyką i opracowaniem szczepionki przeciwko E. granulosus. Jednak niewystarczająca wiedza na temat molekularnych podstaw biologii pasożytów stwarza poważne ograniczenia w diagnozowaniu, leczeniu i zapobieganiu chorobie bąblowcowej3,4,5,6.
W ostatnich latach, dzięki rozwojowi metod sekwencjonowania genomu i metod transkryptomicznych, kilka grup badawczych przeprowadziło szeroki zakres badań molekularnych na płazińcach7,8,9. Jednak w świecie pasożytów postęp w technologii transferu genów u pasożytniczych płazińców jest nadal ograniczony w porównaniu z wysoce powtarzalnymi metodami transdukcji przejściowej opracowanymi dla niektórych pierwotniaków10,11,12.
Wykorzystanie systemów dostarczania wirusów stało się podstawowym narzędziem do dostarczania transgenów i badań nad genami/białkami w ciągu ostatnich dwóch dekad13. Lentiwirus infekuje zarówno komórki dzielące się, jak i niedzielące się, umożliwiając w ten sposób infekowanie komórek postmitotycznych14,15,16. Najnowsze dowody wskazują, że zastosowanie systemu transdukcji opartego na lentiwirusie w komórkach ssaków daje możliwość przezwyciężenia większości ograniczeń poprzednich technik knock-in/knock-down. Projektowanie i budowa wektorów lentiwirusowych ekspresji z odpowiednimi markerami molekularnymi, takimi jak ekspresja GFP, zostały opisane wcześniej16. Dlatego oceniamy przejściową transdukcję lentiwirusową genu reporterowego GFP w protoskopiach i starobalowanych robakach E. granulosus.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowe płytki hodowlane</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30012</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 kolba</td><td>hodowlana SPL Life Sciences</td><td>70325</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30006</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-500G</td><td>Stężenie robocze: 2,5&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CMRL 1066 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>inkubator CO2</td><td>memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technology</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Żółć psa</td><td></td><td></td><td>Wyizolowana od psa poddanego eutanazji i wysterylizowana przez 0,2 &mu; m filtr strzykawkowy</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td>przygotować 0,1% Eozyny do testu wykluczenia pracy</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9723-100ml</td><td>Inaktywacja termiczna&nbsp; z&nbsp; FBS (30 min w 40 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9724-100ml</td><td>Inaktywacja termiczna&nbsp; z&nbsp; SKO (30 min w 40 stopniach; C)</td></tr><tr><td>HEK293T komórek</td><td>BONbiotech</td><td>BN_0012.1.14</td><td>Ludzka nerka embrionalna 293T</td></tr><tr><td>HEPES buforowana sól fizjologiczna (HBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558-50ML</td><td>2x</td></tr><tr><td>koncentrat Mikroskop fluorescencyjny z odwróconą fluorescencją</td><td>OLYMPUS</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-10MU</td><td>Stężenie robocze: 100 IU / ml</td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Roche</td><td>10108057001</td><td>Stężenie robocze: 2 mg/mL, pH 2</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB0011</td><td>Ten odczynnik rozpuszcza się w mniej niż 1 minutę w DW</td></tr><tr><td>Polybrene (odczynnik do transfekcji)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>BioIdea</td><td>BI-1006-05</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137-25G</td><td>Stężenie robocze: 100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pCDH513b)</td><td>SBI System Biosciences (BioCat GmbH)</td><td>CD513B-1-SBI</td><td>Wektor transferowy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)</td></tr><tr><td>Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pLPI i pLPII)</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>K4975-00</td><td>Wektor pomocniczy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)</td></tr><tr><td>Plazmid lentiwirusowy trzeciej generacji (pMD2G)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12259</td><td>Wektor pomocniczy (uzyskany komercyjnie z Wydziału Badań Medycyny Molekularnej Irańskiego Akademickiego Centrum Edukacji, Kultury i Badań (ACECR), Meszhed, Iran)</td></tr><tr><td>Bufor Tris/EDTA (TE)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9713-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935-50MG</td><td>1x roztwory robocze (pH 7,4&ndash; 7.6)</td></tr></tbody></table>

przejściowa transdukcja strobilowanych form echinococcus granulosus

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Pęcherzyk torbielowaty lub choroba bąblowców jest jedną z najważniejszych chorób pasożytniczych wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca występującego w jelicie psów. Istnieje pilna potrzeba stosowania badań genetycznych w celu zrozumienia mechanizmów patogenezy oraz kontroli i zapobiegania chorobom. Jednak brak skutecznego systemu oceny genów utrudnia bezpośrednią interpretację genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemca, w tym gatunku Echinococcus. Niniejsze badanie pokazuje potencjał przejściowej transdukcji genu lentiwirusa w metacestodach i strobilowanych formach E. granulosus. Protoskopety (PSC) wyizolowano z torbieli bąblowcowych i przeniesiono do określonych dwufazowych pożywek hodowlanych, aby przekształcić się w robaletki strobilacyjne. Robaki zostały przetransfekowane pobranym lentiwirusem trzeciej generacji wraz z komórkami HEK293T w celu kontroli procesu transdukcji. U ustroboskopowych robaków wykryto wyraźną fluorescencję w ciągu 24 godzin i 48 godzin, co wskazuje na przejściową transdukcję lentiwirusową w E. granulosus. Niniejsza praca przedstawia pierwszą próbę transdukcji przejściowej opartej na lentiwirusie u tasiemców i demonstruje obiecujące wyniki z potencjalnymi implikacjami w badaniach eksperymentalnych nad biologią płazińców.

W niniejszej pracy opisujemy szybką i wydajną technikę przejściowej transdukcji E. granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Hodowaliśmy PSC w dwufazowym medium hodowlanym w celu uzyskania robaków strobilowanych, zgodnie z wcześniejszym opisem25,26. Protoskoleksy rozwijają się w robaki strobilowane po 6 tygodniach in vitro. W dwufazowym medium hodowlanym zaobserwowano różne stadia rozwoju E. granulosus, w tym w...

Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji.

Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Przejściowa transakcja strobilowanych form Echinococcus granulosus. Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Bąblowica torbielowata lub choroba bąblowców jest jedną z najważniejszych odzwierzęcych chorób pasożytniczych wywoływanych przez Echinococcus granulosus, małego tasiemca przenoszonego w jelicie psów.Istnieje pilna potrzeba prowadzenia stosowanych badań genetycznych w celu zrozumienia mechanizmów patogenezy oraz kontroli i zapobiegania chorobom. Jednak brak skutecznego systemu oceny genów utrudnia bezpośrednią interpretację genetyki funkcjonalnej pasożytów tasiemca, w tym gatunków Echinococcus. Postępy w przenoszeniu genów u pasożytniczych płazińców są nadal ograniczone w porównaniu z pasożytami pierwotniaków.Wykorzystanie systemu dostarczania wirusa stało się podstawowym narzędziem do dostarczania transgenów i badania genów/białek w ciągu ostatnich dwóch dekad. Oceniliśmy więc przejściową transdukcję lentiwirusową genu reporterowego GFP do protoskopecji i strobilowanych robaków Echinococcus granulosus. Rycina 1 przedstawia schematyczną prezentację protokołu badania dla stadiów Echinococcus granulosus.Jeden, zbieranie torbieli bąblowcowych. Zbieraj torbiele bąblowców wątroby od naturalnie zakażonych owiec rutynowo zabijanych w rzeźni. Całkowicie wysterylizuj powierzchnię torbieli za pomocą sterylnej gazy i 70% alkoholu przed aspiracją protoskopecji.Odessać od 20 do 50 ml płynu bąblowcowego do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Po odsączeniu zetrzyj torbiel ostrym ostrzem, przenieś listek rozrodczy do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i potrząsaj nią przez krótki czas, aby zwiększyć zbiór protoskopecji. Przemyć protoskopety buforem PBS trzy do pięciu razy.Obserwuj protoskopety w 0,1% eozynie przez pięć minut, aby określić żywotność protoskopów pod mikroskopem świetlnym. Używaj protoskopecji o co najmniej 95% żywotności dla hodowli. Osad protoskopecji należy traktować dwoma ml pepsyny przez 15 do 20 minut.Aby wyizolować poszczególne protoskopety, ponownie zawieś osad protoskopecji w PBS i przepuść go przez dwie warstwy sterylnej gazy do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po drugie, dwufazowa hodowla protoskopecji Echinococcus granulosus w celu uzyskania dorosłych robaków. Dodać 10 ml pożywki w fazie ciekłej do każdej kolby hodowlanej o średnicy 25 centymetrów kwadratowych.Dodać około 5 000 protoskopecji do kolby hodowlanej i przenieść ją do inkubatora CO2. Po 24-48 godzinach przenieść protoskopolety do nowej kolby z fazą stałą i dodać jeden ml tej samej świeżej pożywki fazy ciekłej na kolbę. Przenieść kolby do inkubatora, 37 stopni Celsjusza, 5% CO2.Co pięć do siedmiu dni zastępować pożywkę świeżą pożywką w fazie ciekłej. Trzy, jednofazowa uprawa protoskopecji Echinococcus granulosus. Upewnij się, że uprawa jednofazowa jest wykonywana na 24 do 48 godzin przed transdukcją.Posadź około 5 000 protoskopów w kolbie hodowlanej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych z RPMI i 10% FBS. Przenieść kolby do inkubatora CO2 do czasu użycia. Po czwarte, hodowla komórkowa do produkcji i przygotowania wirusa.Przenieś 500 000 komórek HEK do kolby o średnicy 25 centymetrów kwadratowych zawierającej 5 ml DMEM z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mikrogramów/ml streptomycyny. Inkubować komórki HEK2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 i pasować je w kompletnej pożywce hodowlanej co 48 godzin. Na koniec użyj niskoprzelotowych komórek HEK do transdukcji.Po piąte, produkcja i przygotowanie wirusa z wektorami lentiwirusowymi trzeciej generacji. Pierwszego dnia, po trypsynizacji komórek HEK na 6-dołkowych płytkach hodowlanych, wysiewaj 70 000 komórek na studzienkę świeżym, wolnym od antybiotyków DMEM zawierającym 10% FBS. Użyj komórek o konfluencji od 50 do 60% do transdukcji metodą fosforanu wapnia.Dzień drugi zastąp pożywkę do hodowli komórkowej na dwie do trzech godzin przed eksperymentem na świeży, wolny od antybiotyków DMEM zawierający 2% FBS. W probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj plazmidy lentiwirusowe trzeciej generacji, w tym wektor przenoszenia pCDH513b o stężeniu 7 mikrogramów/mikrolitr, PLPII o stężeniu 4 mikrogramów/mikrolitr, PLPI o sile 4 mikrogramów/mikrolitr i wektory pomocnicze PMD2G o stężeniu 2 mikrogramów/mikrolitr. Dodaj bufor HEPES do mieszaniny, aby osiągnąć objętość 422 mikrolitrów.Do mieszaniny dodać 16 mikrolitrów buforu 1%TE. Dodaj 62 mikrolitry 2,5 ml chlorku wapnia do probówek i dobrze wymieszaj. Dodaj 500 mikrolitrów 2x buforu HBS do mieszaniny, kropla po kropli w ciągu jednej do dwóch minut za pomocą pipety Pasteura.Delikatnie mieszaj, aż do uzyskania półprzezroczystego roztworu i inkubuj mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i po czterech do sześciu godzinach zastąpić pożywkę wolnym od antybiotyków DMEM zawierającym 10% FBS.Dzień trzeci, potwierdź udaną transdukcję przejściową i żywotność komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Czwartego dnia zbierz wirusy z pożywki hodowlanej, zbierając supernatant z każdej studzienki i przechowuj je w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza do czasu użycia. Sześć, przejściowa transdukcja różnych stadiów Echinococcus granulosus z wirusem.Pierwszego dnia użyj 12-dołkowej płytki hodowlanej do transferu genów. Hodowla 5 000 do 50 000 komórek HEK w trzech egzemplarzach z kompletnym podłożem DMEM jako wewnętrznym odniesieniem. Zahoduj 150 świeżych protoskopecji w trzech egzemplarzach w RPMI i 10% FBS.Posadź 30 strobilowanych robaków w trzech egzemplarzach do DMEM i 10% inaktywowanego termicznie FBS. Przygotuj mieszaninę 1 miliona wirusów z czterema mikrogramami/ml odczynnikiem do transfekcji w celu transdukcji komórek HEK i różnych stadiów robaka. Powoli dodawaj mieszaninę do każdej płytki i rozprowadzaj ją powolnymi okrężnymi ruchami.Inkubować płytki przez cztery do sześciu godzin w inkubatorze CO2, 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Zastąp pożywkę dla każdej próbki tą samą kompletną pożywką hodowlaną, aby zminimalizować toksyczne działanie odczynników do transfekcji. Dzień drugi powtórz dwa poprzednie kroki, aby zwiększyć wydajność transdukcji przejściowej dla komórek HEK, protoskopecji i robaków strobilowanych.Inkubować wszystkie płytki przez 24 do 48 godzin w inkubatorze CO2 w tych samych warunkach hodowli w zależności od rodzaju pożywki komórkowej. Dzień trzeci, upewnij się, że transdukcja się powiodła za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Reprezentatywne wyniki.W tym miejscu opisujemy szybką i wydajną technikę transdukcji przejściowej u Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Hodowaliśmy protoskopety w dwufazowych pożywkach hodowlanych, aby uzyskać strobilowane robaki zgodnie z naszymi wcześniejszymi badaniami. Protoskopety przekształcają się w strobilowane robaki po sześciotygodniowej hodowli in vitro.W dwufazowej pożywce hodowlanej zaobserwowano różne stadia Echinococcus granulosus, w tym wniknięte protoskopele, Figura 2A, evaginated protoscoleces, Figure 2B i brobilowane robaki z pierwszą i trzecią formacją proglottydową, Figure 2C do E.Protoscoleces i strobilated worms uzyskane odpowiednio z upraw jednofazowych i dwufazowych były transfekowane lentiwirusami eksprymującymi GFP, Figura 3. Komórki HEK wyraźnie wyrażały GFP jako kontrolę procesu transjentów przejściowych. Dorosłe robaki najwyraźniej wyrażały GFP w warstwie nakrywki.Jednak protoskopety wykazały nieco niższy poziom ekspresji GFP po 48 godzinach. Niektóre pozostałości płynu torbielowego i/lub szczątki warstwy rozrodczej wokół protoskopecji spowodowały pewne tło fluorescencyjne w transfekowanych próbkach. Intensywność fluorescencji w komórkach HEK i ustrobilowanych robakach wzrosła po 24 i 48 godzinach.Zrozumienie molekularnych podstaw nicieni i biologii Platyhelminthes jest jedną z najważniejszych granic patogenności pasożytów odzwierzęcych. Brak skutecznego systemu oceny genów jest główną przeszkodą w bezpośredniej interpretacji genetyki funkcjonalnej tasiemców, w tym gatunków Echinococcus. Głównym celem tej pracy było zilustrowanie procesu transdukcji wektora lentiwirusowego, który będzie miał kluczowe znaczenie w przyszłych badaniach nad bąblowicą.Wyniki pokazują, że robale strobilizowane są bardziej wrażliwe na przejściową transdukcję genu niż protoskopeleki, co może być wynikiem rozległej struktury nakrywkowej w formach stroboskopowych. Jednak ze względu na charakter transdukcji lentiwirusowej, intensywność fluorescencji w wielokomórkowych protoskopekach i strobilowanych robakach jest zwykle znacznie niższa niż w przypadku jednowarstwowych komórek HEK. Istnieje pilna potrzeba przeprowadzenia stosowanych badań genetycznych na poziomie genomicznym i transkryptomicznym dla Echinococcus, a także szerokiej gamy pasożytniczych i wolno żyjących systemów modelowych płazińców.W związku z tym opracowanie procesu transferu genów do tasiemców toruje drogę do potencjalnego wykorzystania nowych technik, takich jak mapowanie genów na podstawie wirusów lub edycja genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Praca ta przedstawia transdukcję lentiwirusa w modelu tasiemca i pokazuje obiecujące wyniki, które mogą mieć wpływ na biologię płazińców. Potrzebne są jednak bardziej dogłębne badania, aby udoskonalić metody i rozwinąć możliwość zastosowania tych technik w przyszłych eksperymentach.

transient-transduction-strobilated-forms-echinococcus

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

W tym filmie opisujemy nukleofekcję, procedurę transfekcji opartą na elektroporacji, polegającą na dostarczeniu fluorescencyjnego plazmidowego DNA kodującego białko reporterowe do sporozoitowej formy pasożyta Eimeria kurczaka.

Nukleofekcja form pasożytniczych: metoda transfekcji oparta na elektroporacji polegająca na dostarczaniu plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do jądra sporozoitu

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Elektroporacja to szybka, szeroko stosowana metoda wprowadzania egzogennego DNA do rodzaju Rickettsia. Protokół ten zapewnia użyteczną metodę elektroporacji do transformacji obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych w rodzaju Rickettsia.

Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Ten protokół opisuje metodologię transfekcji trofozoitów Naegleria gruberi za pomocą konstruktu, który jest utrzymywany przez cały okres pasowania trofozoitów in vitro, jak również poprzez torbienie i ekscystację.

Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj szybką technikę przejściowej transdukcji Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji. Ta metoda umożliwia badania genetyczne pasożyta i zrozumienie patogenezy echinokokowozy torbielowatej.

Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

Przeglądaj więcej filmów