Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym
July 15th, 2021
Rozwój embrionalny wymaga koordynacji ruchu komórek na dużą skalę. Ablacja laserowa za pośrednictwem wzbudzenia dwufotonowego umożliwia przestrzennie kontrolowaną 3-wymiarową ablację dużych grup głębokich komórek. Ponadto technika ta może badać reakcję kolektywnie migrujących komórek in vivo na zakłócenia w ich środowisku mechanicznym.
W zarodkach komórki oddziałują na siebie, wymieniając informacje chemiczne i mechaniczne. Jednym ze skutecznych sposobów badania tych interakcji jest zabicie niektórych komórek i monitorowanie konsekwencji dla sąsiednich komórek. Opisana przez nas metoda pozwala na dokładną ablację komórek, nawet w obrębie zarodka, bez uszkadzania sąsiednich tkanek.
Przygotuj mikroskop dwufotonowy, ustawiając pierwszy laser na długość fali ablacji 820 nanometrów, a drugi laser na długość fali obrazowania mCherry 1, 160 nanometrów. Korzystając z ruchomych luster na ścieżce optycznej, ustaw dwie wiązki laserowe przy wejściu i wyjściu głowic skanujących, a następnie zmierz maksymalną moc pierwszego lasera na 820 nanometrach. Umieść miernik mocy pod obiektywem, zamknij czarną komorę i ustaw moc pierwszego lasera na 100%Rozpocznij zbieranie danych na mierniku mocy, otwórz migawkę lasera, a następnie zmierz moc wyjściową i oblicz procent mocy lasera potrzebnej do osiągnięcia 300 miliwatów.
Ustaw pierwszy laser na długość fali wzbudzenia GFP 920 nanometrów i moc na 7%Dostosuj moc drugiego lasera na 15%Aktywuj detektory PMT dla linii zielonej i czerwonej i ustaw czułość PMT na zieloną i czerwoną linię na 65. Dostosuj pole widzenia do 400 na 400 mikrometrów, rozdzielczość obrazu do 512 na 512 pikseli, a częstotliwość skanowania do 800 herców. Wybierz tryb obrazowania poklatkowego 3D, a następnie utwórz folder i aktywuj Autozapis, aby zapisywać dane po każdym pobraniu.
Zamontuj komorę grzewczą i ustaw ją na 28 stopni Celsjusza. Odczekaj co najmniej 10 minut, aż komora i obiektyw się nagrzeją. Pod stereomikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj zarodki w 70% epibolii, które wykazują ekspresję GFP.
Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś trzy do czterech wybranych zarodków do naczynia pokrytego agarozą i ostrożnie usuń je drobnymi kleszkami. Do małej szklanej fiolki dodać jeden mililitr roztworu pożywki zarodkowej penicyliny-streptomycyny zawierającej 2% agarozy i umieścić fiolkę w podgrzanym, suchym podgrzewaczu blokowym o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo przenieś zdekorionowany zarodek do fiolki, uważając, aby nie dodać zbyt dużo pożywki dla zarodków do agarozy.
Pozostałą pożywkę z zarodków należy wyrzucić z pipety. Odessać zarodek z powrotem wraz z wystarczającą ilością agarozy, aby przykryć szkiełko naczynia ze szklanym dnem. Przedmuchaj agarozę wraz z zarodkiem na szklane szkiełko naczynia, upewniając się, że zarodek nie dotyka powietrza ani plastikowej strony naczynia.
Następnie napełnij komorę wokół szkiełka agarozą. Za pomocą rzęsy ustaw zarodek tak, aby docelowy obszar znajdował się na górze. Po pięciu minutach, gdy agaroza jest całkowicie zastygła, dodać kilka kropli pożywki zarodkowej penicyliny-streptomycyny do szkiełka
podstawowego.Umieść naczynie ze szklanym dnem pod obiektywem w podgrzewanej komorze. Zanurzyć obiektyw w pożywce zarodkowej penicyliny i streptomycyny przed zamknięciem komory. Przesuń suwak, aby ustawić ścieżkę światła na okulary.
Włącz lampę fluorescencyjną. Znajdź zarodek i skup się na jego powierzchni. Wyłącz lampę fluorescencyjną i ustaw ścieżkę światła na PMT przed zamknięciem czarnej komory.
Rozpocznij obrazowanie na żywo i zlokalizuj osiową mezodermę. Aby mieć dobry sygnał, dostosuj moce lasera. Użyj czerwonego kanału, aby przesunąć etap na sam szczyt zarodka i przypisz tę pozycję, ponieważ Z jest równe zero.
Wybierz krok czasowy wynoszący jedną minutę i krok Z wynoszący dwa mikrometry. Umieść pierwszy plasterek na wysokości 15 mikrometrów powyżej mezodermy osiowej, a ostatni plasterek na wysokości 15 mikrometrów poniżej mezodermy osiowej. Nagraj od 10 do 15 minut filmu przed ablacją.
Podczas obrazowania na żywo zlokalizuj kontur polstera, a następnie, korzystając z obszaru zainteresowania modulatora elektrooptycznego lub narzędzia EOM-ROI, narysuj prostokąt o rozmiarze 20 pikseli, który rozciąga się na szerokość polstera, i umieść prostokąt na środku polstera. Zwróć uwagę na położenie osiowe najwyższej i najniższej płaszczyzny, która ma zostać poddana ablacji, upewniając się, że ROI do nie zachodzi na komórkę żółtka na żadnej z płaszczyzn. Umieść stolik w najniższej pozycji Z, która ma zostać poddana ablacji.
Ustaw pierwszą długość fali lasera na 820 nanometrów i wprowadź procent mocy zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami, aby uzyskać moc wyjściową 300 miliwatów. Ustaw częstotliwość obrazowania na 200 Hz, a pierwsze obrazowanie laserowe EOM na zero. Po wybraniu trybu ROI Treat wyłącz EOM i ustaw leczenie tak, aby rozpoczynało się natychmiast po zerowej klatce.
Przełącz tryb obrazowania na Timelapse i wyłącz Autozapis. Po wybraniu trybu Fast w kroku czasowym dostosuj liczbę klatek zabiegowych oraz liczbę klatek do wartości odpowiadającej docelowej głębokości. Rozpocznij obrazowanie.
Akwizycja powinna być, ponieważ migawka do PMT zamyka się podczas leczenia EOM. Następnie przejdź w górę stolika do następnej pozycji Z i podobnie wykonaj ablację. Powtarzaj dla każdej pozycji Z, aż dojdziesz do górnej części polstera.
Po zakończeniu procesu ablacji ustaw pierwszy laser na 920 nanometrów i dostosuj do wcześniej wybranej mocy obrazowania. Ustaw pierwsze obrazowanie laserowe EOM na 100 i wybierz tryb pełnego pola. Częstotliwość obrazowania powinna wynosić 800 Hz, a EOM powinien być wyłączony przed badaniem całego stosu w trybie na żywo, aby sprawdzić, czy każda płaszczyzna została poddana ablacji.
Po potwierdzeniu ablacji wybierz Upływ czasu 3D jako tryb obrazowania. Ponownie włącz funkcję Autozapis i rozpocznij nagrywanie filmu po ablacji przez 40 do 60 minut. Na filmie po ablacji sprawdź, czy docelowe komórki zostały skutecznie poddane ablacji.
Ponieważ ablacje w poprzek zarodków nie powinny uszkadzać zarodków, normalną morfologię zarodków, którym poddano ablację, można zaobserwować do 24 godzin po zapłodnieniu. W pomyślnym wyniku ablacji laserowych ablacja leżących pod nimi struktur nie miała wpływu na nakładające się tkanki. Zbyt intensywne leczenie lub zbyt małe leczenie skutkowało niepowodzeniami w ablacji laserowej.
Przykładem nieudanej ablacji jest ablacja komórek nad polsterem, co było widoczne po autofluorescencyjnym szczątku w płaszczyźnie ogniskowej nad polsterem. W innej nieskutecznej próbie komórki zostały wybielone, ale nie poddane ablacji, a sygnały o niskiej fluorescencji nadal ujawniają nienaruszone kontury komórek. Wreszcie, niektóre komórki nie zostały nawet wybielone z powodu niewystarczającego leczenia laserowego.
Powstawanie pęcherzyków jest spowodowane kawitacją wywołaną zbyt intensywnym leczeniem laserowym. Stosy Z były wychwytywane co minutę przez 40 minut podczas udanej ablacji, rejestrując zarówno cytoplazmatyczne GFP, jak i jądrowe sygnały mCherry. Ponadto jądra należące do przedniej połowy polstera są oznaczone karmazynową kropką i śledzone w czasie, przed i po ablacji.
Jako miarę trwałości migracji badano kierunek autokorelacji komórek przed i po ablacji. Komórki należące do przedniej części polstera wykazywały stały ruch przed ablacją, który drastycznie zmniejsza się po ablacji, co wskazuje na utratę migracji zorientowanej kolektywnie. Prawidłowe ustawienie laserów i pomiar mocy lasera mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników.
Kluczowe jest również sprawdzenie skuteczności ablacji na pierwszych obrazach po ablacji. Używamy ablacji laserowych, aby zakwestionować rolę interakcji komórka-komórka w kierowaniu migracją komórek w zarodku. Procedurę tę można jednak łatwo dostosować do wielu innych kwestii, w których komórki lub tkanki muszą być precyzyjnie ablowane, potencjalnie głęboko w organizmie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie bada zastosowanie laserowej ablacji pośredniczonej ekscytacją dwufotonową do zbadania interakcji komórkowych podczas rozwoju embrionalnego. Poprzez ablacje określonych komórek, naukowcy mogą obserwować wpływ na sąsiednie komórki, co dostarcza wglądu w zbiorową migrację komórek i interakcje mechaniczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Rozwój embrionalny
Tło
- Komórki wewnątrz zarodków komunikują się za pomocą sygnałów chemicznych i mechanicznych.
- Techniki ablacji mogą pomóc w badaniu tych interakcji poprzez obserwację efektów śmierci komórkowej.
- Mikroskopia dwufotonowa pozwala na precyzyjne ukierunkowanie na komórki bez uszkadzania otaczających tkanek.
- Ta metoda zwiększa nasze zrozumienie dynamiki komórek in vivo.
Cel badania
- Zbadanie wpływu ablacji komórek na sąsiednie komórki w środowisku embrionalnym.
- Ocenienie reakcji mechanicznych komórek migrujących zbiorowo.
- Udoskonalenie technik przestrzennej kontroli ablacji komórek.
Stosowane metody
- Przygotowanie mikroskopu dwufotonowego z określonymi długościami fal lasera do ablacji i obrazowania.
- Wyrównanie wiązek laserowych za pomocą ruchomych luster.
- Pomiar mocy lasera w celu zapewnienia skutecznej ablacji.
- Zbieranie danych w celu analizy wpływu ablacji na zachowanie komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna ablacja docelowych komórek bez uszkodzenia sąsiednich tkanek.
- Obserwacja zmienionego zachowania w sąsiednich komórkach po ablacji.
- Wgląd w interakcje mechaniczne, które kierują migracją komórek.
- Demonstracja skuteczności laserowej ablacji dwufotonowej w biologii rozwojowej.
Konkluzje
- Laserowa ablacja dwufotonowa jest cennym narzędziem do badania interakcji komórkowych w zarodkach.
- Technika ta pozwala na szczegółową obserwację zbiorowej dynamiki komórek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia procesów rozwoju embrionalnego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise spatial control in cellular ablation enables mechanistic interrogation of tissue-level processes in complex biological systems. This approach supports target validation by isolating specific cellular contributions to morphogenetic movements, reducing ambiguity in pathway interpretation. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking subcellular perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selectively ablating defined cell populations to assess functional consequences.
- Operational Value: Provides spatially controlled perturbation to clarify causal relationships in cellular interactions without confounding damage to adjacent tissues.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by validating target roles in developmental processes relevant to congenital disorders or regenerative medicine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible readouts of cellular behavior changes post-ablation, enabling assay standardization.
- Operational Value: Facilitates preparation of validated biological systems for compound screening by establishing baseline dynamic responses to targeted perturbations.
- Scalability Value: Adaptable across scales (microns to >100 microns) and developmental stages, supporting reuse in diverse assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent perturbation strategies in disease-relevant zebrafish models.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing clear phenotypic readouts following target modulation.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by demonstrating that ablation of specific tissues recapitulates expected migratory or signaling defects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven ablation to validate targets before lead identification, with outputs informing go/no-go decisions based on phenotypic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating axial mesendoderm function in gastrulation models.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable ablation parameters and reproducible cellular response tracking.
- Analytics: Provides directional persistence and migration tracking readouts that allow comparative analysis of cellular behavior pre- and post-perturbation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use in transgenic zebrafish lines expressing GFP and mCherry, enabling longitudinal imaging.
- Enterprise Reuse: Framed as a reusable capability for deep tissue ablation across cell types and scales, not limited to a single experimental endpoint.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through spatially resolved ablation that isolates mechanistic contributors to collective cell migration.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser power calibration, EOM-ROI targeting, and Z-stack validation across ablation depths.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in target validation through direct functional interrogation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by linking ablation phenotypes to developmental defects with translational relevance.
Implementation Considerations
- Required expertise in two-photon microscopy alignment, laser power calibration, and EOM-ROI configuration for precise ablation targeting.
- Instrumentation needs include tunable lasers (820 nm ablation, 920 nm and 1,160 nm imaging), PMT detectors, and stage control for Z-stack acquisition.
- Cross-team standardization requires shared protocols for laser power measurement (300 mW exit power), imaging frequency settings (200 Hz ablation, 800 Hz imaging), and ROI dimensions (20-pixel rectangle).
- Adaptation considerations include adjusting ablation depth, laser power percentage, and Z-step size for different tissue types, developmental stages, or target volumes.
- Practical limitations include dependence on precise laser alignment and power measurement to avoid off-target effects such as bleaching, cavitation bubbles, or incomplete ablation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Preparation of the Two-photon Microscope
2:19
Mounting the Embryo
3:46
Locating the Embryo and Pre-Ablation Imaging
4:53
Target Location, Laser Ablation and Post-ablation Verification
7:20
Results: Analysis of the Zebrafish Embryo Before and Post Ablation
9:07
Conclusion
