Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym

W zarodkach komórki oddziałują na siebie, wymieniając informacje chemiczne i mechaniczne. Jednym ze skutecznych sposobów badania tych interakcji jest zabicie niektórych komórek i monitorowanie konsekwencji dla sąsiednich komórek. Opisana przez nas metoda pozwala na dokładną ablację komórek, nawet w obrębie zarodka, bez uszkadzania sąsiednich tkanek.

Przygotuj mikroskop dwufotonowy, ustawiając pierwszy laser na długość fali ablacji 820 nanometrów, a drugi laser na długość fali obrazowania mCherry 1, 160 nanometrów. Korzystając z ruchomych luster na ścieżce optycznej, ustaw dwie wiązki laserowe przy wejściu i wyjściu głowic skanujących, a następnie zmierz maksymalną moc pierwszego lasera na 820 nanometrach. Umieść miernik mocy pod obiektywem, zamknij czarną komorę i ustaw moc pierwszego lasera na 100%Rozpocznij zbieranie danych na mierniku mocy, otwórz migawkę lasera, a następnie zmierz moc wyjściową i oblicz procent mocy lasera potrzebnej do osiągnięcia 300 miliwatów.

Ustaw pierwszy laser na długość fali wzbudzenia GFP 920 nanometrów i moc na 7%Dostosuj moc drugiego lasera na 15%Aktywuj detektory PMT dla linii zielonej i czerwonej i ustaw czułość PMT na zieloną i czerwoną linię na 65. Dostosuj pole widzenia do 400 na 400 mikrometrów, rozdzielczość obrazu do 512 na 512 pikseli, a częstotliwość skanowania do 800 herców. Wybierz tryb obrazowania poklatkowego 3D, a następnie utwórz folder i aktywuj Autozapis, aby zapisywać dane po każdym pobraniu.

Zamontuj komorę grzewczą i ustaw ją na 28 stopni Celsjusza. Odczekaj co najmniej 10 minut, aż komora i obiektyw się nagrzeją. Pod stereomikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj zarodki w 70% epibolii, które wykazują ekspresję GFP.

Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś trzy do czterech wybranych zarodków do naczynia pokrytego agarozą i ostrożnie usuń je drobnymi kleszkami. Do małej szklanej fiolki dodać jeden mililitr roztworu pożywki zarodkowej penicyliny-streptomycyny zawierającej 2% agarozy i umieścić fiolkę w podgrzanym, suchym podgrzewaczu blokowym o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo przenieś zdekorionowany zarodek do fiolki, uważając, aby nie dodać zbyt dużo pożywki dla zarodków do agarozy.

Pozostałą pożywkę z zarodków należy wyrzucić z pipety. Odessać zarodek z powrotem wraz z wystarczającą ilością agarozy, aby przykryć szkiełko naczynia ze szklanym dnem. Przedmuchaj agarozę wraz z zarodkiem na szklane szkiełko naczynia, upewniając się, że zarodek nie dotyka powietrza ani plastikowej strony naczynia.

Następnie napełnij komorę wokół szkiełka agarozą. Za pomocą rzęsy ustaw zarodek tak, aby docelowy obszar znajdował się na górze. Po pięciu minutach, gdy agaroza jest całkowicie zastygła, dodać kilka kropli pożywki zarodkowej penicyliny-streptomycyny do szkiełka

Umieść naczynie ze szklanym dnem pod obiektywem w podgrzewanej komorze. Zanurzyć obiektyw w pożywce zarodkowej penicyliny i streptomycyny przed zamknięciem komory. Przesuń suwak, aby ustawić ścieżkę światła na okulary.

Włącz lampę fluorescencyjną. Znajdź zarodek i skup się na jego powierzchni. Wyłącz lampę fluorescencyjną i ustaw ścieżkę światła na PMT przed zamknięciem czarnej komory.

Rozpocznij obrazowanie na żywo i zlokalizuj osiową mezodermę. Aby mieć dobry sygnał, dostosuj moce lasera. Użyj czerwonego kanału, aby przesunąć etap na sam szczyt zarodka i przypisz tę pozycję, ponieważ Z jest równe zero.

Wybierz krok czasowy wynoszący jedną minutę i krok Z wynoszący dwa mikrometry. Umieść pierwszy plasterek na wysokości 15 mikrometrów powyżej mezodermy osiowej, a ostatni plasterek na wysokości 15 mikrometrów poniżej mezodermy osiowej. Nagraj od 10 do 15 minut filmu przed ablacją.

Podczas obrazowania na żywo zlokalizuj kontur polstera, a następnie, korzystając z obszaru zainteresowania modulatora elektrooptycznego lub narzędzia EOM-ROI, narysuj prostokąt o rozmiarze 20 pikseli, który rozciąga się na szerokość polstera, i umieść prostokąt na środku polstera. Zwróć uwagę na położenie osiowe najwyższej i najniższej płaszczyzny, która ma zostać poddana ablacji, upewniając się, że ROI do nie zachodzi na komórkę żółtka na żadnej z płaszczyzn. Umieść stolik w najniższej pozycji Z, która ma zostać poddana ablacji.

Ustaw pierwszą długość fali lasera na 820 nanometrów i wprowadź procent mocy zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami, aby uzyskać moc wyjściową 300 miliwatów. Ustaw częstotliwość obrazowania na 200 Hz, a pierwsze obrazowanie laserowe EOM na zero. Po wybraniu trybu ROI Treat wyłącz EOM i ustaw leczenie tak, aby rozpoczynało się natychmiast po zerowej klatce.

Przełącz tryb obrazowania na Timelapse i wyłącz Autozapis. Po wybraniu trybu Fast w kroku czasowym dostosuj liczbę klatek zabiegowych oraz liczbę klatek do wartości odpowiadającej docelowej głębokości. Rozpocznij obrazowanie.

Akwizycja powinna być, ponieważ migawka do PMT zamyka się podczas leczenia EOM. Następnie przejdź w górę stolika do następnej pozycji Z i podobnie wykonaj ablację. Powtarzaj dla każdej pozycji Z, aż dojdziesz do górnej części polstera.

Po zakończeniu procesu ablacji ustaw pierwszy laser na 920 nanometrów i dostosuj do wcześniej wybranej mocy obrazowania. Ustaw pierwsze obrazowanie laserowe EOM na 100 i wybierz tryb pełnego pola. Częstotliwość obrazowania powinna wynosić 800 Hz, a EOM powinien być wyłączony przed badaniem całego stosu w trybie na żywo, aby sprawdzić, czy każda płaszczyzna została poddana ablacji.

Po potwierdzeniu ablacji wybierz Upływ czasu 3D jako tryb obrazowania. Ponownie włącz funkcję Autozapis i rozpocznij nagrywanie filmu po ablacji przez 40 do 60 minut. Na filmie po ablacji sprawdź, czy docelowe komórki zostały skutecznie poddane ablacji.

Ponieważ ablacje w poprzek zarodków nie powinny uszkadzać zarodków, normalną morfologię zarodków, którym poddano ablację, można zaobserwować do 24 godzin po zapłodnieniu. W pomyślnym wyniku ablacji laserowych ablacja leżących pod nimi struktur nie miała wpływu na nakładające się tkanki. Zbyt intensywne leczenie lub zbyt małe leczenie skutkowało niepowodzeniami w ablacji laserowej.

Przykładem nieudanej ablacji jest ablacja komórek nad polsterem, co było widoczne po autofluorescencyjnym szczątku w płaszczyźnie ogniskowej nad polsterem. W innej nieskutecznej próbie komórki zostały wybielone, ale nie poddane ablacji, a sygnały o niskiej fluorescencji nadal ujawniają nienaruszone kontury komórek. Wreszcie, niektóre komórki nie zostały nawet wybielone z powodu niewystarczającego leczenia laserowego.

Powstawanie pęcherzyków jest spowodowane kawitacją wywołaną zbyt intensywnym leczeniem laserowym. Stosy Z były wychwytywane co minutę przez 40 minut podczas udanej ablacji, rejestrując zarówno cytoplazmatyczne GFP, jak i jądrowe sygnały mCherry. Ponadto jądra należące do przedniej połowy polstera są oznaczone karmazynową kropką i śledzone w czasie, przed i po ablacji.

Jako miarę trwałości migracji badano kierunek autokorelacji komórek przed i po ablacji. Komórki należące do przedniej części polstera wykazywały stały ruch przed ablacją, który drastycznie zmniejsza się po ablacji, co wskazuje na utratę migracji zorientowanej kolektywnie. Prawidłowe ustawienie laserów i pomiar mocy lasera mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników.

Kluczowe jest również sprawdzenie skuteczności ablacji na pierwszych obrazach po ablacji. Używamy ablacji laserowych, aby zakwestionować rolę interakcji komórka-komórka w kierowaniu migracją komórek w zarodku. Procedurę tę można jednak łatwo dostosować do wielu innych kwestii, w których komórki lub tkanki muszą być precyzyjnie ablowane, potencjalnie głęboko w organizmie.