Name: Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę ablacji laserowej z użyciem mikroskopii dwufotonowej w badaniach embriogenezy Danio rerio. Technika umożliwia precyzyjne niszczenie komórek bez uszkadzania tkanek sąsiednich, dostarczając wglądu w mechanizmy migracji komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Emilie Menant za opiekę nad rybami, Polytechnique Bioimaging Facility, a w szczególności Pierre Mahou, za pomoc w obrazowaniu na żywo na ich sprzęcie, częściowo wspieranym przez Région Ile-de-France (interDIM) i Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging). Prace te były wspierane przez granty ANR 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 oraz program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji nr 840201 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie", Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche oraz Centre National de la Recherche Scientifique.

<ol><li>Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction.</a> Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).</li>
<li>Fernandez-Sanchez, M. -E., Brunet, T., Röper, J. -C., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%27s+impact+on+animal+development%2C+evolution%2C+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction's impact on animal development, evolution, and tumorigenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).</li>
<li>Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+zebrafish+organizer%3A+microsurgical+analysis+at+the+early-shield+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.</a> Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).</li>
<li>Selleck, M. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+microsurgical+manipulation+of+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).</li>
<li>Bulina, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photosensitizer.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+diffraction+limited+nanosurgery+of+live+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues.</a> Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).</li>
<li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, Clifton, N.J. 219-235 (2015).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+state%2C+material+properties+and+continuous+description+of+an+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).</li>
<li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiemz%2C+MH+%22Laser-Tissue+Interactions.+Encyclopedia+of+Biomaterials+and+Biomedical+Engineering%2C+Second+Edition+-+Four+Volume+Set%22">Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition - Four Volume Set</a>. , Springer International Publishing. Cham. (2019).</li>
<li>Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioimaging%3A+second+window+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioimaging: second window for in vivo imaging.</a> Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+forces+in+cell+shape+changes+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).</li>
<li>Theveneau, E., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrations+cellulaires+collectives%5BTitle%5D)+AND+%22Medecine%2FSciences%22%5BJournal%5D)">Migrations cellulaires collectives.</a> Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).</li>
<li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+things%3A+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li>
<li>Montero, J. -A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+3-kinase+is+required+for+process+outgrowth+and+cell+polarization+of+gastrulating+mesendodermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells.</a> Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).</li>
<li>Ulrich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slb%2FWnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li>
<li>Kai, M., Heisenberg, C. -P., Tada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+individual+cell+behaviours+underlying+the+directed+migration+of+prechordal+plate+progenitor+cells+during+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation.</a> Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).</li>
<li>Smutny, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction+forces+position+the+neural+anlage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Friction forces position the neural anlage.</a> Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).</li>
<li>Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dkk1+controls+cell-cell+interaction+through+regulation+of+non-nuclear+%CE%B2-Catenin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools.</a> Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).</li>
<li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li>
<li>Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+active+force+generators+controls+mitotic+spindle+position%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The distribution of active force generators controls mitotic spindle position.</a> Science. 301 (5632), New York, N.Y. 518-521 (2003).</li>
<li>Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+deformation+modulates+twist+expression+to+determine+anterior+midgut+differentiation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos.</a> Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).</li>
<li>Farhadifar, R., Röper, J. -C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li>
<li>Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillier%2C+BH+%22Foundations+of+Experimental+Embryology%22">Foundations of Experimental Embryology</a>. , Prentice-Hall. Englewood Cliffs. (1964).</li>
<li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+from+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li>
<li>Bosze, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pcdh18a+regulates+endocytosis+of+E-cadherin+during+axial+mesoderm+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish.</a> Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje optykę nieliniową do wykonywania głębokich i przestrzennie dobrze zdefiniowanych ablacji objętościowych. Najważniejszym krokiem protokołu jest znalezienie warunków leczenia, które zapewniają wystarczającą ilość energii, aby umożliwić ablację, ale nie za dużo energii, aby uniknąć nadmiernych zanieczyszczeń lub kawitacji. Ilość energii dostarczanej w miejscu docelowym zależy głównie od: (1) mocy wyjściowej lasera, (2) jakości ustawienia lasera, (3) charakteru tkanki, prz...

Interakcje komórka-komórka odgrywają istotną rolę w rozwoju. Komórki dostarczają sygnałów, które mogą dostrzec ich bezpośredni sąsiedzi lub komórki znajdujące się dalej, wpływając w ten sposób na ich los i/lub zachowanie. Wiele z tych sygnałów ma charakter chemiczny. Na przykład, w dobrze scharakteryzowanych zdarzeniach indukcji, jedna grupa komórek wytwarza dyfuzyjne cząsteczki wpływające na los innej populacji komórek1. Inne sygnały są jednak mechaniczne; Komórki wywierają siły i ograniczenia na swoich sąsiadów, które sąsiedzi dostrzegają i na które reagują2.
Jednym ze sposobów badania znaczenia tych interakcji komórka-komórka in vivo jest eliminacja niektórych komórek i obserwacja ich dalszego rozwoju. Niestety, dostępne techniki usuwania lub niszczenia komórek są ograniczone. Komórki można usunąć chirurgicznie3,4, za pomocą igieł lub małych drutów, ale takie zabiegi są inwazyjne, mało precyzyjne i zwykle wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym, co uniemożliwia natychmiastowe obrazowanie pod mikroskopem. Co więcej, celowanie w głębokie komórki oznacza przebijanie w leżących nad nimi tkankach, powodując niepożądane zakłócenia. Genetycznie kodowane fotosensybilizatory, takie jak KillerRed, zostały użyte do wywołania śmierci komórki poprzez oświetlenie światłem5. Fotouczulacze to chromofory, które pod wpływem promieniowania świetlnego wytwarzają reaktywne formy tlenu. Ich głównym ograniczeniem jest to, że wymagają długiego oświetlenia światłem (około 15 minut), co może być trudne do osiągnięcia, jeśli komórki się poruszają, oraz że wywołują śmierć komórki poprzez apoptozę, która nie jest natychmiastowa.
Wreszcie, w ciągu ostatnich 15 lat opracowano i szeroko stosowano ablacje laserowe6,7,8,9,10,11,12. Wiązka lasera jest skupiana na docelowej komórce/tkance. Indukuje jego ablację poprzez ogrzewanie, fotoablację lub ablację indukowaną plazmą; Związany z tym proces zależy od gęstości mocy i czasu ekspozycji13. Większość protokołów ablacji wykorzystuje lasery UV ze względu na ich wysoką energię. Jednak światło UV jest zarówno pochłaniane, jak i rozpraszane przez tkanki biologiczne. Tak więc celowanie w głębokie komórki wymaga dużej mocy lasera, który następnie indukuje uszkodzenia w bardziej powierzchownych, poza płaszczyzną tkankach. Ogranicza to stosowanie laserów UV do struktur powierzchniowych i tłumaczy ich stosunkowo niską rozdzielczość osiową. Optyka nieliniowa (tzw. mikroskopia dwufotonowa) wykorzystuje nieliniowe właściwości światła do wzbudzenia fluoroforu z dwoma fotonami o około połowie energii w domenie podczerwieni. W przypadku ablacji ma to trzy główne zalety. Po pierwsze, światło podczerwone jest mniej rozproszone i mniej absorbowane niż światło UV przez tkanki biologiczne14, co pozwala dotrzeć do głębszych struktur bez zwiększania wymaganej mocy lasera. Po drugie, zastosowanie femtosekundowego lasera impulsowego zapewnia bardzo duże gęstości mocy, tworząc ablację poprzez indukcję plazmy, która w przeciwieństwie do ogrzewania nie dyfunduje przestrzennie15. Po trzecie, gęstość mocy indukująca powstawanie plazmy jest osiągana tylko w punkcie ogniskowym. Dzięki tym właściwościom dwufotonowe ablacje laserowe mogą być stosowane do precyzyjnego celowania w głębokie komórki bez wpływu na otaczające środowisko tkankowe.
Migracje zbiorowe są doskonałym przykładem procesów rozwojowych, w których interakcje komórka-komórka są fundamentalne. Migracje zbiorowe są definiowane jako migracje komórek, w których sąsiednie komórki wpływają na zachowanie jednej komórki16. Charakter tych interakcji (chemicznych lub mechanicznych) i sposób, w jaki wpływają one na migrację komórek, może się znacznie różnić i często nie jest w pełni zrozumiały. Zdolność do usuwania komórek i obserwowania, jak wpływa to na pozostałe, ma kluczowe znaczenie dla dalszego odkrywania tych zbiorowych procesów. Kilka lat temu ustaliliśmy — stosując metody chirurgiczne — że migracja polstera podczas gastrulacji danio pręgowanego jest zbiorową migracją17. Polster to grupa komórek, która stanowi pierwsze komórki internalizujące po grzbietowej stronie zarodka18. Komórki te, oznaczone na zielono w linii transgenicznej Tg(gsc:GFP), znajdują się głęboko w zarodku, poniżej kilku warstw komórek epiblastów. Podczas gastrulacji grupa ta prowadzi przedłużenie mezodermy osiowej, migrując od organizatora embrionalnego do bieguna zwierzęcego19,20,21,22,23 (Rysunek 1A). Ustaliliśmy, że komórki wymagają kontaktu z sąsiadami, aby ukierunkować swoją migrację w kierunku bieguna zwierzęcego. Jednak lepsze zrozumienie komórkowych i molekularnych podstaw tej zbiorowej migracji wymaga usunięcia niektórych komórek, aby zobaczyć, jak wpływa to na pozostałe. W związku z tym opracowaliśmy ablacje dużych i głębokich objętości przy użyciu zestawu mikroskopii dwufotonowej. Tutaj pokazujemy użycie tego protokołu do przecięcia polstera w jego środku i obserwujemy konsekwencje dla migracji komórek poprzez śledzenie jąder znakowanych Histone2B-mCherry.

<table><tbody><tr><td>25-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych: Matlab</td><td>Math Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulator elektrooptyczny (EOM)</td><td>ConOptics</td><td>350-80LA</td><td></td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td> do<td>pożywki zarodkowej (EM)</td><td>Westerfield, M. Książka o danio pręgowanym. Przewodnik po laboratoryjnym wykorzystaniu danio pręgowanego (Danio rerio), wydanie 5. University of Oregon Press, Eugene (książka). (2000).</td></tr><tr><td>Komora środowiskowa</td><td>Okolab</td><td>H201-T-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik EOM</td><td>ConOptics</td><td>302RM</td><td></td></tr><tr><td>Źródło fluorescencji</td><td>Lumencor</td><td>SOLA</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Aparat Harvard</td><td>300085</td><td>Średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Końcówka powinna być polerowana ogniowo</td></tr><tr><td>Zielony/laser ablacyjny</td><td>Spectra Physics</td><td>Mai Tai HP DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Histone2B-mCherry mRNA</td><td></td><td></td><td>Syntetyzowany z plazmidu pCS2-H2B-mCherry (Dumortier& al. 2012)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu: IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImSpector oprogramowanie</td><td>Abberior Zespół</td><td></td><td></td>Rozwojowy</tr><tr><td>Instrumenty Forma wtryskowa</td><td>Narzędzia adaptacyjne</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermofisher</td><td>15140-122</td><td>10 000 jednostek penicyliny i 10 mgstreptomycyny na ml</td></tr><tr><td>Probówka fotopowielacza (PMT)</td><td>Hammamatsu</td><td>H7422-40</td><td></td></tr><tr><td>PicoPump (wtryskiwacz powietrza)</td><td>World Precision Instrument</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony laser</td><td>Spectra Physics</td><td>OPO/Insight DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNA do wstrzykiwań</td> Oprogramowanie arkusza kalkulacyjnego <td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>: Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Tg(gsc:GFP) linia</td><td></td><td></td> danio <td>pręgowanego Doitsidou, M. i wsp. Wskazówki dotyczące pierwotnej migracji komórek rozrodczych przez chemokinę SDF-1. Komórka. 111 (5), 647&ndash; 59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).</td></tr><tr><td>Mikroskop TriM Scope II</td><td>La Vision Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym

Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula

Morfogeneza obejmuje wiele ruchów komórek w celu zorganizowania komórek w tkanki i organy. Dla prawidłowego rozwoju wszystkie te ruchy muszą być ściśle skoordynowane, a coraz więcej dowodów sugeruje, że osiąga się to, przynajmniej częściowo, poprzez interakcje mechaniczne. Zbadanie tego na zarodku wymaga bezpośrednich zaburzeń fizycznych. Ablacje laserowe są coraz częściej stosowaną opcją, która pozwala na złagodzenie ograniczeń mechanicznych lub fizyczną izolację dwóch populacji komórek od siebie. Jednak wiele ablacji wykonuje się za pomocą lasera ultrafioletowego (UV), który zapewnia ograniczoną rozdzielczość osiową i penetrację tkanki. Opisano tutaj metodę ablacji głębokich, znaczących i przestrzennie dobrze zdefiniowanych objętości za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Ablacje wykazano w transgenicznej linii danio pręgowanego, która wykazuje ekspresję białka zielonej fluorescencji w osiowej mezendodermie i jest stosowana do przecięcia osiowej mezendodermy bez wpływu na leżącą nad nią ektodermę lub leżącą poniżej komórkę żółtka. Zachowanie komórek jest monitorowane za pomocą obrazowania na żywo przed i po ablacji. Protokół ablacji może być stosowany na różnych etapach rozwoju, na dowolnym typie komórki lub tkance, w skalach od kilku mikronów do ponad stu mikronów.

Aby przeciąć polster w jego środku, zarodek Tg(gsc:GFP), któremu wstrzyknięto mRNA Histone2B-mCherry, został zamontowany w fazie 70% epibolii, jak opisano w kroku 4. Polster został zidentyfikowany za pomocą ekspresji GFP, a zarodek został zamontowany tak, aby płaszczyzna polstera była prostopadła do osi optycznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Odchylenie zarodka od tej pozycji skomplikuje procedurę. Światło będzie musiało przejść przez więcej tkanek, aby dotrzeć do płaszczyzn ablacji, a płaszczyzny...

Rozwój embrionalny wymaga koordynacji ruchu komórek na dużą skalę. Ablacja laserowa za pośrednictwem wzbudzenia dwufotonowego umożliwia przestrzennie kontrolowaną 3-wymiarową ablację dużych grup głębokich komórek. Ponadto technika ta może badać reakcję kolektywnie migrujących komórek in vivo na zakłócenia w ich środowisku mechanicznym.

Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym

Morphogenesis involves many cell movements to organize cells into tissues and organs. For proper development, all these movements need to be tightly ...

W zarodkach komórki oddziałują na siebie, wymieniając informacje chemiczne i mechaniczne. Jednym ze skutecznych sposobów badania tych interakcji jest zabicie niektórych komórek i monitorowanie konsekwencji dla sąsiednich komórek. Opisana przez nas metoda pozwala na dokładną ablację komórek, nawet w obrębie zarodka, bez uszkadzania sąsiednich tkanek.Przygotuj mikroskop dwufotonowy, ustawiając pierwszy laser na długość fali ablacji 820 nanometrów, a drugi laser na długość fali obrazowania mCherry 1, 160 nanometrów. Korzystając z ruchomych luster na ścieżce optycznej, ustaw dwie wiązki laserowe przy wejściu i wyjściu głowic skanujących, a następnie zmierz maksymalną moc pierwszego lasera na 820 nanometrach. Umieść miernik mocy pod obiektywem, zamknij czarną komorę i ustaw moc pierwszego lasera na 100%Rozpocznij zbieranie danych na mierniku mocy, otwórz migawkę lasera, a następnie zmierz moc wyjściową i oblicz procent mocy lasera potrzebnej do osiągnięcia 300 miliwatów.Ustaw pierwszy laser na długość fali wzbudzenia GFP 920 nanometrów i moc na 7%Dostosuj moc drugiego lasera na 15%Aktywuj detektory PMT dla linii zielonej i czerwonej i ustaw czułość PMT na zieloną i czerwoną linię na 65. Dostosuj pole widzenia do 400 na 400 mikrometrów, rozdzielczość obrazu do 512 na 512 pikseli, a częstotliwość skanowania do 800 herców. Wybierz tryb obrazowania poklatkowego 3D, a następnie utwórz folder i aktywuj Autozapis, aby zapisywać dane po każdym pobraniu.Zamontuj komorę grzewczą i ustaw ją na 28 stopni Celsjusza. Odczekaj co najmniej 10 minut, aż komora i obiektyw się nagrzeją. Pod stereomikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj zarodki w 70% epibolii, które wykazują ekspresję GFP.Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś trzy do czterech wybranych zarodków do naczynia pokrytego agarozą i ostrożnie usuń je drobnymi kleszkami. Do małej szklanej fiolki dodać jeden mililitr roztworu pożywki zarodkowej penicyliny-streptomycyny zawierającej 2% agarozy i umieścić fiolkę w podgrzanym, suchym podgrzewaczu blokowym o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo przenieś zdekorionowany zarodek do fiolki, uważając, aby nie dodać zbyt dużo pożywki dla zarodków do agarozy.Pozostałą pożywkę z zarodków należy wyrzucić z pipety. Odessać zarodek z powrotem wraz z wystarczającą ilością agarozy, aby przykryć szkiełko naczynia ze szklanym dnem. Przedmuchaj agarozę wraz z zarodkiem na szklane szkiełko naczynia, upewniając się, że zarodek nie dotyka powietrza ani plastikowej strony naczynia.Następnie napełnij komorę wokół szkiełka agarozą. Za pomocą rzęsy ustaw zarodek tak, aby docelowy obszar znajdował się na górze. Po pięciu minutach, gdy agaroza jest całkowicie zastygła, dodać kilka kropli pożywki zarodkowej penicyliny-streptomycyny do szkiełka podstawowego.Umieść naczynie ze szklanym dnem pod obiektywem w podgrzewanej komorze. Zanurzyć obiektyw w pożywce zarodkowej penicyliny i streptomycyny przed zamknięciem komory. Przesuń suwak, aby ustawić ścieżkę światła na okulary.Włącz lampę fluorescencyjną. Znajdź zarodek i skup się na jego powierzchni. Wyłącz lampę fluorescencyjną i ustaw ścieżkę światła na PMT przed zamknięciem czarnej komory.Rozpocznij obrazowanie na żywo i zlokalizuj osiową mezodermę. Aby mieć dobry sygnał, dostosuj moce lasera. Użyj czerwonego kanału, aby przesunąć etap na sam szczyt zarodka i przypisz tę pozycję, ponieważ Z jest równe zero.Wybierz krok czasowy wynoszący jedną minutę i krok Z wynoszący dwa mikrometry. Umieść pierwszy plasterek na wysokości 15 mikrometrów powyżej mezodermy osiowej, a ostatni plasterek na wysokości 15 mikrometrów poniżej mezodermy osiowej. Nagraj od 10 do 15 minut filmu przed ablacją.Podczas obrazowania na żywo zlokalizuj kontur polstera, a następnie, korzystając z obszaru zainteresowania modulatora elektrooptycznego lub narzędzia EOM-ROI, narysuj prostokąt o rozmiarze 20 pikseli, który rozciąga się na szerokość polstera, i umieść prostokąt na środku polstera. Zwróć uwagę na położenie osiowe najwyższej i najniższej płaszczyzny, która ma zostać poddana ablacji, upewniając się, że ROI do nie zachodzi na komórkę żółtka na żadnej z płaszczyzn. Umieść stolik w najniższej pozycji Z, która ma zostać poddana ablacji.Ustaw pierwszą długość fali lasera na 820 nanometrów i wprowadź procent mocy zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami, aby uzyskać moc wyjściową 300 miliwatów. Ustaw częstotliwość obrazowania na 200 Hz, a pierwsze obrazowanie laserowe EOM na zero. Po wybraniu trybu ROI Treat wyłącz EOM i ustaw leczenie tak, aby rozpoczynało się natychmiast po zerowej klatce.Przełącz tryb obrazowania na Timelapse i wyłącz Autozapis. Po wybraniu trybu Fast w kroku czasowym dostosuj liczbę klatek zabiegowych oraz liczbę klatek do wartości odpowiadającej docelowej głębokości. Rozpocznij obrazowanie.Akwizycja powinna być, ponieważ migawka do PMT zamyka się podczas leczenia EOM. Następnie przejdź w górę stolika do następnej pozycji Z i podobnie wykonaj ablację. Powtarzaj dla każdej pozycji Z, aż dojdziesz do górnej części polstera.Po zakończeniu procesu ablacji ustaw pierwszy laser na 920 nanometrów i dostosuj do wcześniej wybranej mocy obrazowania. Ustaw pierwsze obrazowanie laserowe EOM na 100 i wybierz tryb pełnego pola. Częstotliwość obrazowania powinna wynosić 800 Hz, a EOM powinien być wyłączony przed badaniem całego stosu w trybie na żywo, aby sprawdzić, czy każda płaszczyzna została poddana ablacji.Po potwierdzeniu ablacji wybierz Upływ czasu 3D jako tryb obrazowania. Ponownie włącz funkcję Autozapis i rozpocznij nagrywanie filmu po ablacji przez 40 do 60 minut. Na filmie po ablacji sprawdź, czy docelowe komórki zostały skutecznie poddane ablacji.Ponieważ ablacje w poprzek zarodków nie powinny uszkadzać zarodków, normalną morfologię zarodków, którym poddano ablację, można zaobserwować do 24 godzin po zapłodnieniu. W pomyślnym wyniku ablacji laserowych ablacja leżących pod nimi struktur nie miała wpływu na nakładające się tkanki. Zbyt intensywne leczenie lub zbyt małe leczenie skutkowało niepowodzeniami w ablacji laserowej.Przykładem nieudanej ablacji jest ablacja komórek nad polsterem, co było widoczne po autofluorescencyjnym szczątku w płaszczyźnie ogniskowej nad polsterem. W innej nieskutecznej próbie komórki zostały wybielone, ale nie poddane ablacji, a sygnały o niskiej fluorescencji nadal ujawniają nienaruszone kontury komórek. Wreszcie, niektóre komórki nie zostały nawet wybielone z powodu niewystarczającego leczenia laserowego.Powstawanie pęcherzyków jest spowodowane kawitacją wywołaną zbyt intensywnym leczeniem laserowym. Stosy Z były wychwytywane co minutę przez 40 minut podczas udanej ablacji, rejestrując zarówno cytoplazmatyczne GFP, jak i jądrowe sygnały mCherry. Ponadto jądra należące do przedniej połowy polstera są oznaczone karmazynową kropką i śledzone w czasie, przed i po ablacji.Jako miarę trwałości migracji badano kierunek autokorelacji komórek przed i po ablacji. Komórki należące do przedniej części polstera wykazywały stały ruch przed ablacją, który drastycznie zmniejsza się po ablacji, co wskazuje na utratę migracji zorientowanej kolektywnie. Prawidłowe ustawienie laserów i pomiar mocy lasera mają kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników.Kluczowe jest również sprawdzenie skuteczności ablacji na pierwszych obrazach po ablacji. Używamy ablacji laserowych, aby zakwestionować rolę interakcji komórka-komórka w kierowaniu migracją komórek w zarodku. Procedurę tę można jednak łatwo dostosować do wielu innych kwestii, w których komórki lub tkanki muszą być precyzyjnie ablowane, potencjalnie głęboko w organizmie.

deep-spatially-controlled-volume-ablations-using-two-photon

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Ten film demonstruje metodę badania wizualnego wykrywania zdobyczy u transgenicznych larw danio pręgowanego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego opartego na wskaźniku wapnia z ich neuronami wyrażającymi fluorescencyjne kompleksy wskaźnikowe wapnia.

Analiza aktywności neuronalnej wywołanej przez zdobycz w transgenicznej larwie danio pręgowanego

Źródło: Morsch, M.,  , Wywoływanie stresu i śmierci komórki za pomocą konwencjonalnej laserowej mikroskopii konfokalnej UV. J. Vis. Exp. (2017)...

Selektywna ablacja laserowa pojedynczego neuronu u larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego

Źródło: Muto, A., et al. Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego. J. vis. exp. (2018) W tym filmie  Zademonstrowano procedurę dwufotonowej ablacji laserowej, umożliwiającą selektywne niszczenie neuronów fluorescencyjnych w unieruchomionych agarozą larwach danio pręgowanego. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przed i po zabiegu potwierdza skuteczne uszkodzenie neuronów, co obserwuje...

Celowana ablacja neuronów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej u danio pręgowanego Larava

Ta praca przedstawia nowy model in vivo segmentowego uszkodzenia nerek przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego GFP. Model pozwala na indukcję celowanej ablacji komórek nabłonka nerek w celu ukazania komórkowych mechanizmów uszkodzenia i naprawy nefronów.

Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

Poznaj metodę ablacji laserowej z użyciem mikroskopii dwufotonowej w badaniach embriogenezy Danio rerio. Technika umożliwia precyzyjne niszczenie komórek bez uszkadzania tkanek sąsiednich, dostarczając wglądu w mechanizmy migracji komórkowej.

Głębokie i przestrzennie kontrolowane ablacje objętościowe przy użyciu mikroskopu dwufotonowego w danio pręgowanym

Przeglądaj więcej filmów