Selektywna ablacja laserowa pojedynczego neuronu u larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego

Weź podgrzany roztwór agarozy zawierający znieczuloną transgeniczną larwę danio pręgowanego wyrażającą białko fluorescencyjne w neuronach ruchowych rdzenia.

Przenieś larwę do szklanego naczynia z pierścieniem agarozowym.

Za pomocą mikroskopu obróć larwę na bok. Następnie pozwól agarozie zestalić się, unieruchamiając larwę.

Dodaj bufor zawierający środek znieczulający, aby utrzymać znieczulenie.

Umieść czaszę na stoliku mikroskopu konfokalnego i użyj obrazowania w jasnym polu, aby zlokalizować grzbietowy obszar rdzenia kręgowego.

Przełącz się w tryb fluorescencji, aby uwidocznić fluorescencyjne neurony ruchowe.

Określ centralną płaszczyznę Z somy komórkowej w celu precyzyjnego ukierunkowania ablacji.

Skonfiguruj parametry obrazowania w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości, jednocześnie minimalizując fotouszkodzenia.

Gdy pożądana płaszczyzna z jest już ostra, wykonaj ablację w docelowym obszarze neuronu za pomocą skupionego lasera ultrafioletowego.

Energia lasera zaburza struktury komórkowe, powodując utratę fluorescencji i śmierć komórki. Nieodwracalna utrata fluorescencji potwierdza precyzyjną ablację bez wpływu na otaczające komórki.

Użyj regulowanej pipety, aby wyciągnąć larwę i pozwól jej opaść na dno końcówki. Wrzuć larwę w minimalnej objętości płynu do podgrzanej agarozy, a następnie narysuj rybę agarozą i szybko przelej ją do wcześniej przygotowanego naczynia o średnicy 35 milimetrów ze szklanym dnem. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj standardowego pędzla, aby ustawić zwierzę lub wiele zwierząt w agarozie na bokach, tak aby ciało i ogon były płaskie.

Pozostaw osadzoną rybę na 10 do 15 minut, aż agaroza mocno się zetnie. Następnie użyj około dwóch mililitrów wody jajecznej z trikanem, aby ostrożnie uzupełnić 35-milimetrową szalkę Petriego. Umieść szalkę Petriego z osadzoną larwą na stoliku mikroskopu konfokalnego i używając oświetlenia jasnego pola i 40-krotnego powiększenia, skup się na grzbietowej stronie rdzenia kręgowego zwierzęcia. Przełącz się na odpowiednie ustawienie fluorescencyjne i zwizualizuj strukturę będącą przedmiotem zainteresowania, aby potwierdzić, że wszystkie parametry obrazowania są zgodne z potrzebami do późniejszej ablacji.

Aby określić grubość struktury do ablacji laserem UV, użyj napędu Z, aby zweryfikować górną i dolną część interesującej Cię struktury poprzez ręczne ogniskowanie w górę iw dół. Ręcznie nagraj płaszczyznę Z, która zostanie usunięta, na przykład środek komórki. Aby przeprowadzić ablację laserową, uruchom kreatora FRAP, klikając menu rozwijane u góry menu oprogramowania.

W nowym oknie określ parametry obrazu dla metody ablacji, wybierając format, szybkość skanowania i uśrednianie. Jeśli płaszczyzna Z do ablacji nie została jeszcze wybrana, naciśnij przycisk na żywo i ustaw ostrość na próbce, aż struktura fluorescencyjna lub żądana płaszczyzna Z do ablacji będzie ostra. Po ustawieniu ogólnych parametrów obrazu uzyskaj dostęp do kroku wybielacza, aby kontrolować określone składniki ablacji, a następnie włącz laser 405 nm, aktywując go w celu przeprowadzenia procedury wybielania.

Następnie użyj opcji powiększenia, aby zmaksymalizować intensywność wybielania przy wybranym ROI, zmniejszając pole skanowania, maksymalizując w ten sposób czas przebywania. Wybierz jeden lub więcej ROI dla ablacji za pomocą dowolnego narzędzia do rysowania w oknie akwizycji obrazu. Celuj na przykład w wzgórek aksonu za pomocą okrągłego narzędzia do rysowania o długości około 4 do 8 mikrometrów.

Po ustaleniu zwrotu z inwestycji wybierz przycisk przebiegu czasu i potwierdź liczbę cykli, w których zwroty akcji zostaną zeskanowane i ablowane. Wybierz odpowiednio klatki przed wybielaniem i po wybielaniu, aby umożliwić przegląd całego obrazu tuż przed i bezpośrednio po procesie wybielania.

Te ustawienia umożliwiają badaczom wiele warstw udoskonalenia. Dzięki regulacji mocy lasera, prędkości skanowania, uśredniania linii, wielkości obszaru zainteresowania i powtórzeń, technika ta oferuje wysoki stopień swobody w wywoływaniu stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach.

Po ustaleniu wszystkich niezbędnych parametrów ablacji naciśnij Uruchom eksperyment i monitoruj skuteczność ablacji. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje.