Name: Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę wykrywania kompleksu DISC i przetwarzania prokaspazy-8 w badaniach apoptozy. Technika ta umożliwia analizę składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Fundacji Wilhelma Sandera (2017.008.02), Centrum Systemów Dynamicznych (CDS), finansowanemu przez program UE EFRR (Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego) i DFG (LA 2386) za wsparcie naszej pracy. Dziękujemy Karinie Guttek za wsparcie naszych eksperymentów. Dziękujemy prof. Dirkowi Reinholdowi (OvGU, Magdeburg) za dostarczenie nam pierwotnych limfocytów T.

Eksperymenty z komórkami T zostały przeprowadzone zgodnie z umową etyczną 42502-2-1273 Uni MD.
1. Przygotowanie komórek do eksperymentu
UWAGA: Średnia liczba komórek dla tej immunoprecypitacji wynosi 1 × 107. Komórki przylegające muszą zostać wysiane na jeden dzień przed eksperymentem, tak aby w dniu eksperymentu było 1 ×10 7 komórek.
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek adherentnych do eksperymentu
	<ol>
		<li>Wysiew 5-8 × 106 przylegających komórek w 20 ml pożywki (patrz Tabela materiałów dla składu) dla każdego stanu w 14,5 cm szalkach na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
		<li>W dniu eksperymentu upewnij się, że komórki zlewają się w 80-90% i przylegają do naczynia. Wyrzuć pożywkę i dodaj świeżą pożywkę do przylegających komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek zawiesinowych do eksperymentu
	<ol>
		<li>Ostrożnie umieść 1 × 107 komórek zawiesinowych w 10 ml pożywki hodowlanej (patrz tabela materiałów dla składu) na warunki w 14,5 cm szalkach bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
		<li>Jeśli używasz komórek pierwotnych, wyizoluj pierwotne limfocyty T zgodnie z wcześniej opisaną procedurą21. Traktuj pierwotne limfocyty T 1 μg / ml fitohemaglutyniny przez 24 godziny, a następnie 25 U / ml IL2 przez 6 dni.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić 1 × 108 pierwszorzędowych limfocytów T w 10 ml pożywki hodowlanej (patrz Tabela materiałów dla składu) w każdym stanie na 14,5 cm szalkach bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu. 
		UWAGA: Ta większa liczba pierwotnych limfocytów T jest zalecana, ponieważ komórki te są mniejsze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Stymulacja CD95L
<ol>
	<li>Stymuluj komórki za pomocą CD95L (produkowanego zgodnie z wcześniejszym opisem20 lub dostępnego w handlu (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Stężenie CD95L i czas stymulacji są zależne od typu komórki13,15,22,23,24,25. Przygotuj jeden warunek stymulacji dwukrotnie, aby równolegle wygenerować próbkę "kontroli kulek".
	<ol>
		<li>Stymuluj przylegające komórki wybranym stężeniem CD95L. Trzymać płytkę pod kątem i odpipetować ligand do pożywki, nie dotykając przylegających komórek.</li>
		<li>Stymuluj komórki zawiesinowe za pomocą CD95L, pipetując roztwór liganda do zawiesiny komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie i liza komórek
<ol>
	<li>Umieść naczynia komórkowe na lodzie. 
	UWAGA: Nie wyrzucaj nośnika. Umierające komórki unoszą się w pożywce i są ważne dla analizy.</li>
	<li>Dodać 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zawiesiny komórek i zeskrobać przyłączone komórki z płytki. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj naczynie z komórkami dwukrotnie 10 ml zimnego PBS i umieść roztwór myjący w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 500 × g przez 5 minut, 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml zimnego PBS. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu do lizy (zawierającego 4% koktajlu inhibitorów proteazy). Inkubuj go przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Odwirować lizat z maksymalną prędkością (~17 000 × g) przez 15 minut, 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (lizat) do czystej probówki. Wyrzuć granulkę. Weź 50 μl lizatu do innej probówki. Przeanalizować stężenie białka za pomocą testu Bradforda i pobrać ilość lizatu odpowiadającą 25 μg białka w fiolce. Dodać bufor ładujący (patrz Tabela Materiałów dla składu) do fiolki. Przechowywać w temperaturze -20 °C jako kontrolę lizatu.</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja (IP)
<ol>
	<li>Do lizatu dodać 2 μl przeciwciał anty-APO-1 i 10 μl kulek sefarozy białka A (przygotowanych zgodnie z zaleceniami producenta). Dodać tylko 10 μl kulek do oddzielnej probówki zawierającej lizat (próbka stymulowana), aby wytworzyć "kontrolę kulek". 
	UWAGA: Używaj końcówek do pipet z szerokimi otworami, przecinając końcówki lub kupując specjalne końcówki do IP podczas obchodzenia się z kulkami sefarozy białkowej A.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę lizatu z przeciwciałami/kulkami sefarozy A z delikatnym mieszaniem przez noc w temperaturze 4 °C. Odwirować lizaty z przeciwciałami/białkiem A sefarozy w kulkach 500 × g przez 4 minuty, 4 °C. Wyrzucić supernatant, dodać 1 ml zimnego PBS do kulek i powtórzyć ten etap co najmniej trzy razy.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Zassać kulki, najlepiej za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl.</li>
</ol>
5. Western blot
<ol>
	<li>Dodać 20 μl 4x buforu ładującego (patrz Tabela Materiałów dla składu) do kulek i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 10 min. Podgrzewać kontrole lizatu w temperaturze 95 °C przez 5 min.</li>
	<li>Załaduj lizaty, IP i wzorzec białka do 12,5% żelu z dodecylosiarczanu sodu (SDS) (patrz Tabela materiałów dla preparatu żelu) i pracuj ze stałym napięciem 80 V.</li>
	<li>Przenieść białka z żelu SDS do membrany nitrocelulozowej. 
	UWAGA: W tym przypadku zastosowano technikę półsuchą, zoptymalizowaną pod kątem interesujących białek, do transferu w ciągu 12 minut (25 V; 2,5 A = stała). Namocz membranę nitrocelulozową i dwa mini-size stosy transferowe w buforze do elektroforezy (patrz Tabela materiałów dla składu, przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta) na kilka minut przed western blot.</li>
	<li>Umieść osuszoną błonę w pudełku i zablokuj ją na 1 godzinę w roztworze blokującym (0,1% Tween-20 w PBS (PBST) + 5% mleka). Inkubować błonę z roztworem blokującym pod delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.</li>
</ol>
6. Wykrywanie Western blot
<ol>
	<li>Dodać pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe we wskazanym rozcieńczeniu (patrz tabela materiałów) do błony i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.</li>
	<li>Inkubować błonę z 20 ml przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w PBST + 5% mleka) delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.</li>
	<li>Odrzucić PBST i dodać około 1 ml substratu peroksydazy chrzanowej do membrany.</li>
	<li>Wykryj sygnał chemoluminescencyjny (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Czas ekspozycji i liczba przechwyconych obrazów zależą od ilości białka w komórce i swoistości zastosowanych przeciwciał. Należy ją ustalić empirycznie dla każdego przeciwciała użytego do wykrywania.</li>
</ol>

<ol><li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD95%2FFas+signaling+at+the+DISC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li>
<li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+and+death+in+peripheral+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li>
<li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li>
<li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms%2C+caspase-8%2Fa+and+caspase-8%2Fb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li>
<li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD%3ACaspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex%3A+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li>
<li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li>
<li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+%5B2%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li>
<li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8%2C+p30%2C+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li>
<li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling%3A+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li>
<li>Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+%28c-FLIPs%29%3A+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li>
<li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-FLIPR%2C+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li>
<li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8%3A+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li>
<li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li>
<li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li>
<li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li>
<li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li>
<li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8%2Fc-FLIPL+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li>
<li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li>
<li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li>
<li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC%3A+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li>
<li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD95+threshold+signaling%3A+Triggering+of+CD95+%28FAS%2FAPO-1%29+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li>
<li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li>
<li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).</li>
<li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity-dependent+APO-1+%28Fas%2FCD95%29-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+%28DISC%29+with+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li>
<li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis%3A+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li>
<li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podejście to zostało po raz pierwszy opisane przez Kischkela i wsp.27 i od tego czasu z powodzeniem rozwijane przez kilka grup. Należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii w celu skutecznego immunoprecypitacji DISC i monitorowania przetwarzania kaspazy-8 w tym kompleksie.
Po pierwsze, konieczne jest przestrzeganie wszystkich etapów mycia podczas immunoprecypitacji. Szczególnie ważne są końcowe etapy mycia kulek sefarozy i suszenia kulek sefarozy. Musi to być wykonane p...

Jednym z najlepiej zbadanych receptorów śmierci (DR) jest CD95 (Fas, APO-1). Zewnętrzny szlak apoptotyczny rozpoczyna się od interakcji DR z pokrewnym ligandem, tj. CD95L oddziałuje z CD95 lub TRAIL wiąże się z TRAIL-Rs. Powoduje to powstanie DISC w odpowiednim DR. DISC składa się z białek CD95, FADD, prokaspazy-8/-10 i c-FLIP1,2. Ponadto DISC jest składany w wyniku interakcji między białkami zawierającymi domenę śmierci (DD), takimi jak CD95 i FADD, a białkami zawierającymi DED, takimi jak FADD, prokaspaza-8/-10 i c-FLIP (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Prokaspaza-8 ulega oligomeryzacji poprzez asocjację jej SED, w wyniku czego powstają włókna DD, a następnie aktywacja i przetwarzanie prokaspazy-8. To uruchamia kaskadę kaspazy, która prowadzi do śmierci komórki (Rysunek 1)3,4. Tak więc prokaspaza-8 jest centralną kaspazą inicjującą zewnętrzny szlak apoptozy, w którym pośredniczy CD95 lub TRAIL-R, aktywowany na odpowiedniej platformie makromolekularnej, DISC.
Wiadomo, że dwie izoformy prokaspazy-8, a mianowicie prokaspaza-8a (p55) i -8b (p53), są rekrutowane do klasy DISC<sup="xref">5. Obie izoformy składają się z dwóch DEDów. DED1 i DED2 znajdują się w N-końcowej części prokaspazy-8a/b, a następnie w katalitycznych domenach p18 i p10. Szczegółowa analiza DED prokaspazy-8 za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) ujawniła składanie się białek prokaspazy-8 w nitkowate struktury zwane włóknami DED4,6. Co ciekawe, początkowo sugerowano, że liniowe łańcuchy prokaspazy-8 są zaangażowane w dimeryzację, po której następuje aktywacja prokaspazy-8 w DISC. Teraz wiadomo, że te łańcuchy są tylko podstrukturą włókna DED prokaspazy-8, przy czym ten ostatni składa się z trzech łańcuchów połączonych w potrójną helisę3,4,6,7.
Po dimeryzacji na włóknie DED, zmiany konformacyjne w prokaspazie-8a/b prowadzą do powstania aktywnego centrum prokaspazy-8 i jego aktywacji3,8. Następnie następuje przetwarzanie prokaspazy-8, w którym pośredniczą dwie ścieżki: pierwsza przebiega przez wytwarzanie produktu rozszczepienia p43 / p41, a druga przez początkową generację produktu rozszczepienia p30. Szlak p43 / p41 jest inicjowany przez rozszczepienie prokaspazy-8a / b w Asp374, w wyniku czego powstają produkty rozszczepienia p43 / p41 i p12 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Ponadto fragmenty te są automatycznie katalitycznie rozszczepiane w Asp384 i Asp210/216, co powoduje powstanie aktywnego heterotetrameru kaspazy-8, p102/p1829,10,11. Ponadto wykazano, że równolegle do szlaku przetwarzania p43/p41, prokaspaza-8a/b jest również rozszczepiana w Asp216, co prowadzi do powstania C-końcowego produktu rozszczepienia p30, a następnie jego proteolizy do p10 i p1810 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
Aktywacja prokaspazy-8a/b w filamentu DED jest ściśle regulowana przez białka o nazwie c-FLIPs12. Białka c-FLIP występują w trzech izoformach: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) i c-FLIPRaji (c-FLIPR). Wszystkie trzy izoformy zawierają dwa DED w swoim N-końcowym regionie. c-FLIPL ma również C-końcową, katalitycznie nieaktywną domenę podobną do kaspazy12,13. Obie krótkie izoformy c-FLIP-c-FLIPS i c-FLIPR-działają w sposób antyapoptozowy, zakłócając tworzenie się włókien DED w klasie DISC<sup="xref">6,14,15. Ponadto c-FLIPL może regulować aktywację kaspazy-8 w sposób zależny od stężenia. Może to skutkować zarówno efektami pro-, jak i antyapoptozą16,17,18. Tworząc katalitycznie aktywny heterodimer prokaspazy-8/c-FLIPL, c-FLIPL prowadzi do stabilizacji aktywnego centrum prokaspazy-8 i jego aktywacji. Pro- lub antyapoptotyczna funkcja c-FLIPL jest bezpośrednio zależna od jego ilości w włóknach DED i późniejszej ilości złożonych heterodimerów prokaspazy-8/c-FLIPL19. Niskie lub pośrednie stężenia c-FLIPL w DISC powodują wystarczającą ilość heterodimerów prokaspazy-8 / c-FLIPL na włóknie DET, co wspomaga aktywację kaspazy-8. W przeciwieństwie do tego, zwiększone ilości c-FLIPL bezpośrednio prowadzą do jego działania antyapoptotycznego w klasie DISC<sup="xref">20.
Razem wzięte, aktywacja i przetwarzanie prokaspazy-8a/b w DISC to wysoce regulowany proces, składający się z kilku etapów. W pracy omówiono pomiar przetwarzania prokaspazy-8 bezpośrednio w DISC, a także analizę składu tego kompleksu. Zostanie to zaprezentowane przy użyciu CD95 DISC jako przykładowego kompleksu DR.

<table><tbody><tr><td>12,5% SDS żel</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td>dla dwóch żeli separujących: 3,28 ml destylowany H2O 2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 ml akrylamid 100 &mikro; L 10% SDS 100 i mikro; L 10% APS 7,5 i mikro; L TEMED dla dwóch żeli zbiorczych: 3,1 ml destylowany H2O 1,25 mL Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 ml akryloamidu 50 &mikro; L 10% SDS 25 i mikro; L 10% APS 7,5 i mikro; L TEMED</td></tr><tr><td>14,5 cm naczynia komórkowe</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>akryloamid</td><td>Carl Roth</td><td>A124.1</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z filtrem aerozolowym z filtrem o wysokim odzysku i szerokim otworem</td><td>VWR</td><td>46620-664 (Ameryka Północna) lub 732-0559 (Europa)</td><td>Służy do pipetowania kulek do</td></tr><tr><td>antyaktyny</td> lizatu Ab <td>Sigma Aldrich</td><td>A2103</td><td>rozcieńczenie: 1:4000 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anty-APO-1 Ab</td><td>dostarczony w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub może być zakupiony przez Enzo</td><td>ALX-805-038-C100</td><td>stosowany wyłącznie do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>anty-kaspazy-10 Ab</td><td>Biozol</td><td>MBL-M059-3</td><td>rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>antykaspaza-3</td><td>Sygnalizacja</td><td>komórkowa Ab 9662</td><td>Rozcieńczenie S: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anty-kaspaza-8 Ab C15</td><td>dostarczony w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub może być zakupiony przez ENZO</td><td>ALX-804-242-C100</td><td>rozcieńczenie: 1:20 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anty-CD95 Ab</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-715</td><td>rozcieńczenie: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td><td>dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZO</td><td>ALX-804-961-0100</td><td>rozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anti-FADD 1C4 Ab</td><td>dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub można je kupić przez ENZO</td><td>ADI-AAM-212-E</td><td>rozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anty-PARP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> Ab <td>9542</td><td>rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>APS</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Carl Roth</td><td>4227.2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Bradforda Test białkowy Koncentrat odczynnika barwnikowego 450ml</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td>stosowany zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>CD95L</td><td>dostarczonymi w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub można go kupić przez ENZO</td><td>ALX-522-020-C005</td><td></td></tr><tr><td>detektor chemoluminescencji Chem Doc XRS+</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail ()</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11 836 145 001</td><td>przygotowany zgodnie z instrukcją producenta</td></tr><tr><td>DPBS (10x) bez Ca, Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>rozcieńczenie 1:10 z H2O, przechowywanie w lodówce</td></tr><tr><td>bufor eletroforezy</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td>10x bufor do elektroforezy: 60,6 g Tris 288 g glicyny 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 rozcieńczenie przed użyciem</td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anty-Mysia IgG1 HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-05</td><td>rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleko</td></tr><tr><td>Koza Anti-Mouse IgG2b HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-05</td><td>rozcieńczenie 1:10.000 in PBST + 5% mleko</td></tr><tr><td>kozie Anti-Rabbit IgG-HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>4030-05</td><td>rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleka</td></tr><tr><td>Interleukina-2 Human(hIL-2)</td><td>Merckgroup/ Roche</td><td>11011456001</td><td>do aktywacji limfocytów T</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Bufor załadowczy 4x Laemmli Bufor do próbek, 10 ml</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td>przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP</td><td>substrate Millipore</td><td>WBLUFO500</td><td></td></tr><tr><td>liza bufor</td> własnej <td>produkcji</td><td></td><td>13,3 ml Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 ml NaCl; 5 M 10 ml EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 dodać 960 ml H2O</td></tr><tr><td>podłoże dla komórek adhaerentowych DMEM F12 (1:1) w stabilnej glutaminy,&nbsp; 2,438 g/L</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-41154</td><td>dodając 10% FCS, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,0001% Puromycyny do pożywki</td></tr><tr><td>dla pierwotnych limfocytów T</td><td>gibco firmy Life Technologie</td><td>21875034</td><td>dodanie 10% FCS i 1% penicyliny-streptomycyny do podłoża</td></tr><tr><td>mleka w proszku</td><td>Carl Roth</td><td>T145.4</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Carl Roth</td><td>P030.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td>własnej roboty</td><td></td><td>20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 ml Tween-20 ad 2 L H2O rozcieńczenie 1:20 przed użyciem</td></tr><tr><td>PBST + 5% mleko</td><td>własnej produkcji</td><td></td><td>50 g mleka w proszku + 1 L PBST</td></tr><tr><td>PHA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td>do aktywacji limfocytów T</td></tr><tr><td>Power Pac HC</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td><td>Bio Rad</td><td>161-0373</td><td>stosować od 3-5 do mikro; L</td></tr><tr><td>Białko A Sefaroza Koraliki CL-4B</td><td>Novodirect/ Th.Geyer</td><td>GE 17-0780-01</td><td>kulki z żywicy powinowactwa przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>skrobak</td><td>VWR</td><td>734-2602</td><td></td></tr><tr><td>SDS Carl</td><td>Roth</td><td>4360.2</td><td></td></tr><tr><td>wytrząsarka</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>azydek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>Mini-size stosy transferowe Trans Blot Turbo</td><td>Bio Rad</td><td>170-4270</td><td>używane zgodnie z instrukcją producenta</td></tr><tr><td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>10026938</td><td>przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>TransBlot Turbo Membrana niktrocelulozowa w rozmiarze mini</td><td>Bio Rad</td><td>170-4270</td><td>używany zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>Trans-Blot-Turbo</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Chem Solute</td><td>8,08,51,000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Pan Reac Appli</td><td>Chem A4974,1000</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć cd95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Zewnętrzna apoptoza jest pośredniczona przez aktywację receptorów śmierci (DR), takich jak CD95/Fas/APO-1 lub ligand indukujący apoptozę związany z czynnikiem martwicy nowotworu (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stymulacja tych receptorów za pomocą pokrewnych ligandów prowadzi do powstania kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć (DISC). DISC zawiera DR, białko adaptorowe białka związanego z Fas z domeną śmierci (FADD), prokaspazy-8/-10 i komórkowe białka hamujące konwertazy interleukiny (IL)-1β podobne do FADD (c-FLIPs). DISC służy jako platforma do przetwarzania i aktywacji prokaspazy-8. Ta ostatnia zachodzi poprzez jego dimeryzację/oligomeryzację we włóknach domeny efektora śmierci (DED) zmontowanych na DISC. 
Aktywacja prokaspazy-8 następuje po jej przetwarzaniu, które odbywa się w kilku krokach. W niniejszej pracy opisano ustalony eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia pomiar powstawania DISC i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie. Przebieg pracy opiera się na technikach immunoprecypitacji wspieranych przez analizę western blot. Ten przepływ pracy pozwala na dokładne monitorowanie różnych etapów rekrutacji prokaspazy-8 do DISC i jej przetwarzania oraz jest bardzo istotny dla badania molekularnych mechanizmów apoptozy zewnętrznej.

Aby przeanalizować rekrutację kaspazy-8 do kompleksu DISC oraz jej procesowanie w obrębie DISC CD95, w niniejszej pracy opisano klasyczny schemat postępowania, który łączy immunoprecypitację (IP) kompleksu DISC CD95 z analizą western blot. Pozwala to na wykrycie kilku kluczowych cech aktywacji kaspazy-8 w DISC: montaż makromolekularnej platformy aktywującej kaspazę-8, rekrutację prokaspazy-8 do DISC oraz procesowanie tej kaspazy inicjującej (Rysunek 1 oraz Rysunek 2</str...

Tutaj prezentowany jest eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia wykrywanie przetwarzania kaspazy-8 bezpośrednio w wywołującym śmierć kompleksie sygnalizacyjnym (DISC) i określa skład tego kompleksu. Metodologia ta ma szerokie zastosowanie, od odkrywania mechanizmów molekularnych szlaków śmierci komórkowej po dynamiczne modelowanie sieci apoptozy.

Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

Inicjacja apoptozy odbywa się za pośrednictwem aktywacji kaspaz na platformach molekularnych markerów. Przedstawiamy detekcję kluczowego kompleksu inicjacji śmierci komórki DISC, który służy jako platforma do aktywacji kaspazy-8. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wykrycie złożenia i składu kompleksu DISC wraz z dostarczeniem informacji na temat przetwarzania kaspazy-8 w tym kompleksie.Rozpocznij eksperyment od komórek, które w 80% do 90% zlewają się i przylegają do naczynia. Wyrzuć pożywkę i dodaj świeżą pożywkę do przylegających komórek. Następnie stymuluj komórki wybranym stężeniem CD95L, trzymając płytkę pod kątem i pipetując ligand do pożywki bez dotykania przylegających komórek.Aby zebrać komórki, umieść naczynie na komórki na lodzie. Dodaj 10 mililitrów zimnego PBS do zawiesiny komórek i zeskrob przyczepione komórki z płytki. Zbierz zawiesinę komórek w probówce o pojemności 50 mililitrów.Umyj naczynie komórkowe dwukrotnie 10 mililitrami zimnego PBS i dodaj roztwór myjący do tej samej 50-mililitrowej probówki. Następnie odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze zimnego PBS.Następnie przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze zimnego PBS. Powtórz wirowanie jeszcze raz, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy i inkubuj go przez 30 minut na lodzie.Po inkubacji odwirować lizat z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przenieść supernatant do czystej probówki. Wyrzuć osad i zbierz 50 mikrolitrów próbkę lizatu w innej probówce w celu określenia stężenia białka. W celu immunoprecypitacji dodaj do lizatu dwa mikrolitry przeciwciała anty-APO1 i 10 mikrolitrów przygotowanych kulek sefarozy białka A.Dodaj 10 mikrolitrów samych kulek do oddzielnej probówki zawierającej lizat, aby służyła jako kontrola kulek. Mieszaninę zawierającą lizat, przeciwciała i kulki białka A Sepharose inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Następnego dnia odwirować mieszaninę w temperaturze 500 razy G przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu umyć kulki, dodając jeden mililitr zimnego PBS i odrzucając supernatant po odwirowaniu. Powtórz ten krok co najmniej trzy razy. Po wyrzuceniu ostatniego prania PBS odessać kulki najlepiej za pomocą 50 mikrolitrowej strzykawki Hamiltona.Aby wykonać Western blot, dodaj 20 mikrolitrów buforu ładującego 4X do kulek i podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Jednocześnie podgrzewaj kontrole lizatu w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Załaduj lizaty, immunoprecypitanty i wzorzec białkowy na 12,5% żel SDS i pracuj ze stałym napięciem 80 woltów.Po zakończeniu przebiegu żelu przenieś białka z żelu SDS do membrany nitrocelulozowej. Po zakończeniu przenoszenia umieścić osuszoną błonę w pudełku i inkubować ją przez godzinę w roztworze blokującym pod delikatnym mieszaniem, a następnie przemyć membranę trzy razy przez pięć minut PBST. Aby wykryć białka, dodaj pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe we wskazanym rozcieńczeniu do błony i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.Następnego dnia przemyj membranę trzema pięciominutowymi płukaniami PBST, a następnie inkubuj membranę z 20 mililitrami przeciwciała drugorzędowego, delikatnie wstrząsając przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj membranę trzykrotnie PBST. Po odrzuceniu ostatniego płukania PBST dodaj około jednego mililitra substratu peroksydazy chrzanowej do membrany i wykryj sygnał chemoluminescencji.Stymulacja komórek HeLa-CD95 raka szyjki macicy za pomocą CD95L spowodowała wysoki poziom tworzenia CD95 DISC monitorowany za pomocą immunoprecypitacji CD95. CD95, FADD, prokaspaza-8, prokaspaza-10 i c-FLIPS obserwowano w tych immunoprecypitacjach CD95, co wskazuje na efektywne tworzenie DISC. Produkty rozszczepienia p43-FLIP i p22-FLIP wykryto w immunoprecypitacjach, co wskazuje na aktywację kaspazy-8.Komórki HeLa-CD95, które nadmiernie eksprymują c-FLIP long, wykorzystano do analizy tworzenia CD95 DISC. Podobnie jak w przypadku rodzicielskich komórek HeLa-CD95, w immunoprecypitacjach z tych komórek bez leczenia CD95L nie wykryto rekrutacji FADD, prokaspazy-9, prokaspazy-10, białek c-FLIP i PARP1. Aktywowane pierwotne limfocyty T charakteryzowały się wysokimi poziomami CD95, FADD, prokaspazy-8, prokaspazy-10 i c-FLIPS w immunoprecypitacjach anty-CD95.Technika ta pozwala na analizę powstawania molekularnego DISC, w tym przetwarzanie kaspazy-8 w DISC. Wszystkie etapy prania są bardzo ważne. Ponadto należy poważnie potraktować punkty stymulacji i czasy inkubacji.Jest to jedyny sposób na zmierzenie montażu na kompleksie DISC. Jednak do pomiaru aktywacji kaspazy-8 można również zastosować testy aktywności kaspazy-8. Takie podejście pozwoliło nam uzyskać nowe informacje na temat inicjacji apoptozy.

measuring-composition-cd95-death-inducing-signaling-complex

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje oparte na chemiluminescencji western blot immunoprecypitowanych lizatów. Technika ta pomaga określić przetwarzanie i aktywację białek. Wykryty sygnał chemiluminescencyjny jest proporcjonalny do poziomu przetworzenia białka podczas jego aktywacji.

Chemiluminescencyjny test Western Blot do przetwarzania białek

Testy multipleksowe mogą dostarczyć korzystnych informacji dla podstawowych mechanizmów komórkowych i wyeliminować marnotrawstwo odczynników oraz niepotrzebne powtarzalne eksperymenty. Opisujemy tutaj multipleksowy test aktywności kaspazy-3/7, przy użyciu metod fluorescencyjnych i luminescencyjnych, w celu określenia żywotności komórek w modelu podwzgórza in vitro po prowokacji oksydacyjnej kwasem palmitynowym.

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Poznaj metodę wykrywania kompleksu DISC i przetwarzania prokaspazy-8 w badaniach apoptozy. Technika ta umożliwia analizę składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć komórkową.

Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

Przeglądaj więcej filmów