Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

Inicjacja apoptozy odbywa się za pośrednictwem aktywacji kaspaz na platformach molekularnych markerów. Przedstawiamy detekcję kluczowego kompleksu inicjacji śmierci komórki DISC, który służy jako platforma do aktywacji kaspazy-8. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wykrycie złożenia i składu kompleksu DISC wraz z dostarczeniem informacji na temat przetwarzania kaspazy-8 w tym kompleksie.

Rozpocznij eksperyment od komórek, które w 80% do 90% zlewają się i przylegają do naczynia. Wyrzuć pożywkę i dodaj świeżą pożywkę do przylegających komórek. Następnie stymuluj komórki wybranym stężeniem CD95L, trzymając płytkę pod kątem i pipetując ligand do pożywki bez dotykania przylegających komórek.

Aby zebrać komórki, umieść naczynie na komórki na lodzie. Dodaj 10 mililitrów zimnego PBS do zawiesiny komórek i zeskrob przyczepione komórki z płytki. Zbierz zawiesinę komórek w probówce o pojemności 50 mililitrów.

Umyj naczynie komórkowe dwukrotnie 10 mililitrami zimnego PBS i dodaj roztwór myjący do tej samej 50-mililitrowej probówki. Następnie odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze zimnego PBS.

Następnie przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę komórkową i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze zimnego PBS. Powtórz wirowanie jeszcze raz, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy i inkubuj go przez 30 minut na lodzie.

Po inkubacji odwirować lizat z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przenieść supernatant do czystej probówki. Wyrzuć osad i zbierz 50 mikrolitrów próbkę lizatu w innej probówce w celu określenia stężenia białka. W celu immunoprecypitacji dodaj do lizatu dwa mikrolitry przeciwciała anty-APO1 i 10 mikrolitrów przygotowanych kulek sefarozy białka A.

Dodaj 10 mikrolitrów samych kulek do oddzielnej probówki zawierającej lizat, aby służyła jako kontrola kulek. Mieszaninę zawierającą lizat, przeciwciała i kulki białka A Sepharose inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Następnego dnia odwirować mieszaninę w temperaturze 500 razy G przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu umyć kulki, dodając jeden mililitr zimnego PBS i odrzucając supernatant po odwirowaniu. Powtórz ten krok co najmniej trzy razy. Po wyrzuceniu ostatniego prania PBS odessać kulki najlepiej za pomocą 50 mikrolitrowej strzykawki Hamiltona.

Aby wykonać Western blot, dodaj 20 mikrolitrów buforu ładującego 4X do kulek i podgrzewaj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Jednocześnie podgrzewaj kontrole lizatu w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Załaduj lizaty, immunoprecypitanty i wzorzec białkowy na 12,5% żel SDS i pracuj ze stałym napięciem 80 woltów.

Po zakończeniu przebiegu żelu przenieś białka z żelu SDS do membrany nitrocelulozowej. Po zakończeniu przenoszenia umieścić osuszoną błonę w pudełku i inkubować ją przez godzinę w roztworze blokującym pod delikatnym mieszaniem, a następnie przemyć membranę trzy razy przez pięć minut PBST. Aby wykryć białka, dodaj pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe we wskazanym rozcieńczeniu do błony i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.

Następnego dnia przemyj membranę trzema pięciominutowymi płukaniami PBST, a następnie inkubuj membranę z 20 mililitrami przeciwciała drugorzędowego, delikatnie wstrząsając przez godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj membranę trzykrotnie PBST. Po odrzuceniu ostatniego płukania PBST dodaj około jednego mililitra substratu peroksydazy chrzanowej do membrany i wykryj sygnał chemoluminescencji.

Stymulacja komórek HeLa-CD95 raka szyjki macicy za pomocą CD95L spowodowała wysoki poziom tworzenia CD95 DISC monitorowany za pomocą immunoprecypitacji CD95. CD95, FADD, prokaspaza-8, prokaspaza-10 i c-FLIPS obserwowano w tych immunoprecypitacjach CD95, co wskazuje na efektywne tworzenie DISC. Produkty rozszczepienia p43-FLIP i p22-FLIP wykryto w immunoprecypitacjach, co wskazuje na aktywację kaspazy-8.

Komórki HeLa-CD95, które nadmiernie eksprymują c-FLIP long, wykorzystano do analizy tworzenia CD95 DISC. Podobnie jak w przypadku rodzicielskich komórek HeLa-CD95, w immunoprecypitacjach z tych komórek bez leczenia CD95L nie wykryto rekrutacji FADD, prokaspazy-9, prokaspazy-10, białek c-FLIP i PARP1. Aktywowane pierwotne limfocyty T charakteryzowały się wysokimi poziomami CD95, FADD, prokaspazy-8, prokaspazy-10 i c-FLIPS w immunoprecypitacjach anty-CD95.

Technika ta pozwala na analizę powstawania molekularnego DISC, w tym przetwarzanie kaspazy-8 w DISC. Wszystkie etapy prania są bardzo ważne. Ponadto należy poważnie potraktować punkty stymulacji i czasy inkubacji.

Jest to jedyny sposób na zmierzenie montażu na kompleksie DISC. Jednak do pomiaru aktywacji kaspazy-8 można również zastosować testy aktywności kaspazy-8. Takie podejście pozwoliło nam uzyskać nowe informacje na temat inicjacji apoptozy.