Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek
September 2nd, 2021
Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.
Metoda ta została opracowana w celu ilościowego określenia konkurencji zależnej od kontaktu za pośrednictwem systemu wydzielania typu VI między szczepami bakteryjnymi na poziomie pojedynczej komórki. Technika ta wykorzystuje całkowitą powierzchnię komórek, a nie liczbę komórek, do ilościowego określenia konkurencji bakterii, co ułatwia badaczom bez dostępu do zastrzeżonego oprogramowania do analizy obrazu. Metodę tę można łatwo zmodyfikować w celu ilościowego określenia konkurencji między różnymi drobnoustrojami zdolnymi do hodowli.
Dodatkowo, zestaw eksperymentalny może być zoptymalizowany do użytku zarówno na mikroskopach pionowych, jak i odwróconych. Na początek przygotuj roztwór pastylki agarozowej, rozpuszczając 2% niskotopliwą agarozę w morskim PBS. Podgrzej roztwór krótko przez około 30 sekund w kuchence mikrofalowej i wiruj, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
Roztwór ten należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Następnie owiń kawałek taśmy laboratoryjnej wokół szklanego szkiełka pięć razy. Powtórz owijanie taśmy na tym samym szkiełku, tak aby odległość między dwoma kawałkami taśmy była nieco mniejsza niż szerokość szkiełka nakrywkowego.
Aby zapewnić płaską powierzchnię padu agarozowego, odpipetuj ciepły roztwór agarozy między dwoma kawałkami taśmy i natychmiast nałóż szkiełko nakrywkowe na wierzch, tak aby szkiełko nakrywkowe zetknęło się z płynem i wypchnęło wszelkie pęcherzyki w roztworze agarozy. Pozwól wacie agarozy zestalić się w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę. Następnie pokrój tę podkładkę agarozową żyletką na cztery podkładki o powierzchni 5 milimetrów kwadratowych, które będą używane do obrazowania.
Aby przygotować szczepy do wspólnej inkubacji, należy wyrzucić każdy szczep z zamrożonych wywarów na płytki agarowe LBS uzupełnione odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez noc w temperaturze 24 stopni Celsjusza. Następnego dnia wybierz dwie kolonie z każdego szczepu i ponownie zawieś je w pożywce LBS uzupełnionej antybiotykiem. Inkubuj zawieszone kolonie przez noc w temperaturze 24 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 200 obrotów na minutę.
Następnego ranka subkultura biologiczna replikuje się po jednym na 1000 razy świeżej pożywki LBS bez antybiotyków i inkubuje, aż komórki osiągną gęstość optyczną około 1,5 przy 600 nanometrach. Zmierz i zapisz gęstość optyczną przy 600 nanometrach dla wszystkich próbek. Znormalizować każdą próbkę do gęstości optycznej wynoszącej jeden, rozcieńczając kulturę pożywką LBS.
Wymieszaj dwa konkurujące ze sobą szczepy w równych proporcjach, dodając 30 mikrolitrów każdego znormalizowanego szczepu do oznaczonej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wiruj kulturę szczepu mieszanego przez jedną do dwóch sekund. Wymieszaj konkurujące ze sobą szczepy dla każdej kontrpróby biologicznej i poddania działaniu substancji, aby uzyskać w sumie cztery probówki z mieszanymi szczepami.
Każdą mieszaną kulturę należy zagęścić trzykrotnie przez odwirowanie, aby zapewnić wystarczająco gęste konkurujące ze sobą komórki do zabijania zależnego od kontaktu podczas jednoczesnej inkubacji. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić każdą osadkę w 20 mikrolitrach pożywki LBS i przeprowadzić procedury zatężania dla każdej próbki. W przypadku obrazowania pod mikroskopem odwróconym, należy rozpocząć od narysowania dwóch mikrolitrów mieszanej kultury na dnie szkiełka nakrywkowego o średnicy 1,5 na szalce Petriego o średnicy 35 milimetrów i umieścić podkładkę z agarozy nad miejscem wspólnej inkubacji.
Umieść 12-milimetrowe okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe na wacie agarozowym. Powtórz wykrywanie i umieszczanie szkiełka nakrywkowego dla pozostałych trzech mieszanych kultur, co spowoduje, że cztery szalki zostaną zobrazowane. Zanim przejdziesz dalej, pozostaw szkiełka na blacie stołu na około pięć minut, aby komórki mogły osiąść na podkładce agarowej, aby uniknąć ruchu podczas procesu obrazowania.
Zacznij od skupienia się na komórkach za pomocą DIC, aby zminimalizować efekty fotowybielania. Opierając się na średniej wielkości pojedynczej komórki bakteryjnej, użyj obiektywu olejowego 100X. Dostosuj czas ekspozycji i ustawienia akwizycji dla każdego kanału przy minimalnym wykrywaniu tła.
Wybierz co najmniej pięć pól widzenia i uzyskaj obrazy w każdym odpowiednim kanale. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i zaimportuj pliki obrazów do analizy. Przekonwertuj obraz na skalę szarości, oddziel kanały i zacznij od progowania i utworzenia maski binarnej wstępnie przetworzonego obrazu.
Wybierz opcję Analizuj, a następnie z menu rozwijanego wybierz opcję Ustaw skalę i wprowadź odpowiednie wartości dla konfiguracji mikroskopii. Następnie przejdź do ustaw wymiary i wybierz Obszar. Na karcie Analizuj wybierz opcję Analizuj cząstki przy użyciu ustawień domyślnych.
Jeśli w próbce znajdują się zanieczyszczenia, rozmiar lub okrągłość można dostosować, aby odfiltrować cząstki niekomórkowe. Wybierz opcję Pokaż, a następnie Kontury, aby dane wyjściowe analizy odfiltrowywania zawierały ponumerowany kontur wszystkich analizowanych cząstek. Eksportuj pomiary do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy i tworzenia wykresów.
Pokazane są reprezentatywne obrazy fluorescencyjne każdego eksperymentalnego zabiegu. Koncentracja mieszanej kultury przed plamieniem spowodowała zaokrąglone lub zaniknięte komórki docelowe w ciągu dwóch godzin, co wskazuje na skuteczne hamowanie. Gdy mieszana kultura nie jest zagęszczona, komórki pozostają rozproszone na szkiełku.
Bez wystarczającego kontaktu między komórkami szczep docelowy nie jest hamowany przez szczep letalny. Komórki docelowe ani nie zniknęły, ani nie zostały zaokrąglone podczas jednoczesnej inkubacji z mutantem T6SS w warunkach zatłoczenia lub rozproszenia. W ten sposób cel był niehamowany w żadnym z zabiegów.
Wyniki analizy cząstek zostały przedstawione na wykresie i przeanalizowane zarówno dla szczepu docelowego, jak i szczepu inhibitora. Większa niż 100 % początkowego obszaru docelowego w końcowym punkcie czasowym oznacza wzrost netto wartości docelowej, a mniejsza niż 100 % początkowego obszaru docelowego wskazuje na spadek netto wartości docelowej. Wzrost netto szczepu inhibitora obserwowano we wszystkich terapiach.
Jednak procent początkowego obszaru dla szczepu inhibitora był znacznie wyższy, gdy inhibitor typu dzikiego był inkubowany jednocześnie z celem w zatłoczonych warunkach w porównaniu ze wszystkimi innymi zabiegami. Aby uzyskać wyraźne obrazy, podkładka agarozowa musi być tak płaska, jak to tylko możliwe. Wytnij kawałki taśmy przed owinięciem ich wokół prowadnicy, aby upewnić się, że mają tę samą długość.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę wykorzystującą mikroskopię fluorescencyjną pojedynczych komórek do badania konkurencji bakterii w kokulturze, skupiając się na konkurencji zależnej od kontaktu, pośredniczonej przez układ wydzielania typu VI. Protokół umożliwia ilościową ocenę na podstawie całkowitej powierzchni komórek, co sprawia, że jest dostępny dla badaczy, którzy nie mają specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Konkurencja mikrobiologiczna
- Interakcje komórkowe
- Techniki mikroskopii fluorescencyjnej
Tło
- Konkurencja zależna od kontaktu wśród bakterii jest kluczowa dla zrozumienia ekologii mikrobiologicznej.
- Układ wydzielania typu VI odgrywa istotną rolę w interakcjach między bakteriami.
- Istniejące metody mogą wymagać specjalistycznego oprogramowania, co ogranicza dostępność dla wielu badaczy.
Zastosowane metody
- Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych komórek
- Ilościowa ocena konkurencji bakterii na podstawie całkowitej powierzchni komórek
- Krokowa przygotowanie poduszek agarozowych i szczepów bakterii do wykonania obrazów
Główne wyniki
- Stężenie kultur miksowanych skutecznie zwiększyło hamowanie komórek docelowych.
- Wykazano, że wzrost netto szczepów inhibitorów różni się w różnych warunkach.
- Podkreślono znaczenie kontaktu komórka-komórka w skuteczności hamowania.
Wnioski
- Badanie przedstawia prostą i przystosowaną metodę ilościowej oceny konkurencji bakterii.
- Praca pomaga w zrozumieniu interakcji mikrobiologicznych i może być zastosowana do różnorodnych mikrobów hodowanych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative single-cell fluorescence imaging of interbacterial competition enables precise interrogation of microbial interactions that shape microbiome structure and function. This approach provides reproducible, accessible measurement of competitive dynamics, supporting mechanistic de-risking and target validation in microbiome-focused discovery. The method's adaptability and quantitative outputs position it as a reusable capability for early-stage R&D and translational microbiome research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of contact-dependent bacterial antagonism at single-cell resolution.
- Supports functional validation of microbial effectors such as the type VI secretion system in competitive contexts.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between contact-dependent and independent effects.
- Provides quantitative metrics for hypothesis-driven interrogation of microbial interactions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible imaging workflows for evaluating competitive phenotypes across bacterial strains.
- Generates quantitative area-based outputs suitable for comparative analysis and downstream screening.
- Enables assay scalability and platform reuse across diverse culturable isolates and microbiome models.
- Supports robust evaluation of candidate strains or effectors in competitive environments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant microbiome models by enabling quantification of interbacterial dynamics.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of microbial interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of microbiome-targeted therapeutics based on quantitative competition data.
- Facilitates translational biomarker development by linking competitive outcomes to functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbiome-targeted R&D, supporting both hypothesis testing and quantitative screening.
- Discovery Biology: Quantifies competitive interactions to clarify microbial pathways and validate effector function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative area measurements for robust comparison of strain phenotypes.
- Analytics: Enables statistical analysis of competitive outcomes using open-source image analysis tools.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by supporting disease-relevant competition assays.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports broad application across microbiome research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces biological risk in microbiome therapeutic pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to upright or inverted epifluorescence microscopes and open-source analysis software (FIJI/ImageJ).
- Demands cross-team standardization of slide preparation and imaging parameters for reproducibility.
- Adaptable to various culturable bacterial systems with protocol optimization for growth and imaging conditions.
- Dependent on high-quality agarose pad preparation and careful experimental setup for optimal imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Agarose Pad Preparation
1:47
Co-Incubation Strain Preparation
2:37
Bacterial Strains Coincubation
3:35
Slide Setup
4:17
Fluorescence Microscopy
4:46
Image Analysis
5:50
Results: Fluorescence Image Analysis to Assess Target Strain Inhibition in Coincubation Assay
7:08
Conclusion
