Name: Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj techniki przygotowania tkanek serca dużych ssaków do mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym kolagenu. Ta metoda umożliwia szczegółowe obrazowanie mikrostruktury i fibrozy mięśnia sercowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie otrzymało wsparcie finansowe od rządu francuskiego w ramach programu "Inwestycje przyszłości" zarządzanego przez Narodową Agencję Badawczą (ANR), numer grantu ANR-10-IAHU-04 i Fundacji Leducq (sieć RHYTHM), a także numer grantu ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], finansowanie z Europejskiej Przestrzeni Badawczej w Chorobach Sercowo-Naczyniowych (ERA-CVD), numer grantu H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] oraz finansowanie z francuskiego Region Nouvelle Akwitania, numery referencyjne dotacji 2016 - 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 i ANR-19-ECVD-0006-01.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi z Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Protokoły na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (CEEA50) na Uniwersytecie w Bordeaux. Serca pochodziły od trzech dużych modeli ssaków, w tym (i) zdrowych dużych białych świń (N = 2, 2 miesiące); (ii) Owce (N = 1, 2 lata) z indukowanym zawałem mięśnia sercowego13 oraz (iii) Owce (N = 1,7 lat) z indukowanym migotaniem przedsionków30.
1. Przygotowanie roztworu:
<ol>
	<li>Roztwór kardioplegyczny: Przygotować 3 l wody destylowanej i dodać chlorek sodu (110 mM), chlorek potasu (16 mM), wodorowęglan sodu (10 mM), D-(+)-glukozę (9 mM), roztwór chlorku wapnia (1,2 mM) i roztwór chlorku magnezu (16 mM). Na koniec dodaj 500 μl/l heparyny sodu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - roztwór EDTA (PBS-EDTA).
	<ol>
		<li>Najpierw dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do 1 l wody destylowanej do końcowego stężenia 10 mM. Zwiększyć i utrzymać pH roztworu na poziomie 12 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (1 M) w celu rozpuszczenia EDTA.</li>
		<li>Gdy EDTA całkowicie się rozpuści, obniż pH do 7,4 za pomocą kwasu solnego. Dodać jedną torebkę foliową z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby otrzymać roztwór o stężeniu 0,01 M (chlorek sodu 0,138 M; chlorek potasu 0,0027 M) i pH 7,4. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etanol - roztwór środka kontrastowego kwasu fosfomolibdynowego (PMA): Przygotować 1 l absolutnego etanolu i dodać PMA do uzyskania roztworu o stężeniu 1%. Zaoszczędź to rozwiązanie w RT.</li>
</ol>
2. Źródło tkanki
<ol>
	<li>Poddaj zwierzę eutanazji i wydobądź mu serce zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi. Szybko zanurz serce w zimnym roztworze kardioplegicznym i delikatnie masuj komory w celu wstępnego spłukania.</li>
	<li>Upewnij się, że przeciąłeś aortę poniżej łuku aorty i zacisnąłeś dwie strony ściany tętnicy za pomocą uchwytów na igły.</li>
	<li>Zawieszając serce za uchwyty igieł, włóż kaniulę aortalną do korzenia aorty, uważając, aby nie stykać się z zastawkami aortalnymi ani przez nie nie wystawać. Owiń szew o rozmiarze 0 wokół łuku aorty na poziomie kaniuli i mocno zawiąż kaniulę na miejscu.</li>
	<li>Za pomocą strzykawek o pojemności 50 ml wstrzyknąć 200 ml zimnego (4 °C) roztworu kardioplegicznego. Usuń nadmiar krwi gromadzącej się w jamach, przechylając serce na tylną stronę, aby drenować przez żyły płucne.</li>
	<li>Zanurz opłukane serce i trzymaj w zimnym roztworze kardioplegicznym przechowywanym na lodzie, aż będzie gotowy do sekcji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek:
<ol>
	<li>Przygotuj zbiornik o pojemności 1 litra umieszczony 80 cm nad naczyniem preparacyjnym. Podłącz rurkę termoplastyczną o długości 80 cm i średnicy wewnętrznej 3.2 mm oraz średnicy zewnętrznej 4.8 mm do króćca spustowego zbiornika.</li>
	<li>Przymocuj kran trójdrożny do rurki odpływowej i podłącz kolejne rurki termoplastyczne (20 cm, średnica wewnętrzna 1.6 mm i średnica zewnętrzna 3.2 mm) do każdego wolnego portu na kranie trójdrożnym. Przymocuj krany dwukierunkowe do płatnych końców rurki.</li>
	<li>Napełnij zbiornik roztworem kardioplegicznym uzupełnionym heparyną (2500 jednostek). Otwórz krany, aby umożliwić odpływ roztworu kardioplegicznego i usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie zamknij krany dwukierunkowe.</li>
	<li>Przygotuj kaniule na lewą i prawą ujścia wieńca za pomocą rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica wewnętrzna 1 mm i średnica zewnętrzna 2 mm).
	<ol>
		<li>Odetnij 5 cm rurki i podgrzej jeden koniec, umieszczając końcówkę obok otwartego ognia. Gdy 1 mm końcówki zacznie się topić i stanie się półprzezroczysta, dociśnij końcówkę do twardej, odpornej na ciepło powierzchni, aby uformować grzbiet na końcówce kaniuli, aby zapobiec wyślizgiwaniu się kaniul z naczyń.</li>
		<li>Włóż 1 cm nieogrzewanego końca każdej kaniuli do dwóch końców rurki drenażowej zbiornika odpływowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń kaniulę aortalną. W zimnym roztworze kardioplegicznym zlokalizuj lewą i prawą ujściówkę tętnic wieńcowych.</li>
	<li>Za pomocą spiczastych nożyczek ostrożnie oddziel korzeń aorty od otaczającej tkanki powyżej i poniżej ujścia wieńcowego, aby umożliwić nawlekanie jedwabnego szwu 0 G pod naczyniem wieńcowym.</li>
	<li>Otwórz krany dwukierunkowe i włóż końcówki kaniul do ujścia wieńcowego. Gdy końcówki kaniul wystają 1-2 cm w głąb ujścia i poza założenie szwu, zwiąż kaniule.</li>
	<li>Opłucz serce, delikatnie masując komory przez 15 minut, aż serce zostanie oczyszczone z krwi.</li>
	<li>Po spłukaniu zamknij kurki dwukierunkowe i odłącz je od kranu trójdrożnego. Przenieś serce do 1 litra plastikowego, odpornego na chemikalia pojemnika zawierającego 500 ml roztworu PBS-EDTA.</li>
	<li>Recyrkulacja roztworu PBS-EDTA w rurkach termoplastycznych pod wyciągiem za pomocą pompy perystaltycznej z dwoma kanałami. Zalać rurkę pompy, aż w rurce nie będzie pęcherzyków powietrza, a następnie perfundować każdą kaniulę tętnicy wieńcowej przez recyrkulację w temperaturze pokojowej przez 2 godziny przy 80 ml / min.</li>
	<li>Upewnij się, że wyciąg jest sprawny. Zatrzymać pompę, spuścić roztwór z pojemnika i zastąpić go formaliną (10%) do utrwalenia przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej 80 ml/min.</li>
	<li>Zastąp roztwór formaliny PBS, aby przepłukać utrwalacz trzy razy przez 15 minut każdy z prędkością 80 ml/min.</li>
</ol>
4. Odwodnienie i wysuszenie tkanek:
UWAGA: Użyj tej samej szybkości perfuzji (80 ml/min) i pozwól, aby tkanka pozostała w RT przez cały czas.
<ol>
	<li>Zastąp roztwór PBS etanolem w stężeniu 20%, rozcieńczonym w ultraczystej wodzie i perfuzuj przez co najmniej 3 godziny.</li>
	<li>Perfuzja serca za pomocą serii zwiększających się stężeń etanolu.
	<ol>
		<li>Zacznij od zastąpienia 20% roztworu etanolu etanolem rozcieńczonym do 30% i perfuzuj przez 2 godziny.</li>
		<li>Powtórz perfuzję, zwiększając stężenie etanolu w każdej iteracji o 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 99% i 100% przez minimalny czas 1 godziny na każdym etapie (stężenie). 
		UWAGA: Próbki serca mogą spoczywać bez przepływu perfuzji przez noc przy dowolnym rozcieńczeniu etanolu, jeśli dla tego stężenia miała miejsce minimalna perfuzja wynosząca 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>OPCJONALNIE: W przypadku stosowania środków kontrastowych metodą perfuzji należy perfekować serce 100% etanolem uzupełnionym środkiem kontrastowym PMA, 1% przez 48 godzin. Płukać środek kontrastowy przez perfuzję 100% etanolem przez 2 godziny.</li>
	<li>Aby wzmocnić tkankę serca przed suszeniem powietrzem, należy recyrkulować mieszaninę etanolu i heksametylodylazanu (HMDS) w proporcji 50:50 przez 10 minut. Następnie przez 100% HMDS przez kolejne 2 godziny 
	UWAGA: HMDS jest substancją wysoce toksyczną i szkodliwą. W kontakcie z powietrzem uwalnia się silny zapach amoniaku. Co więcej, płynna forma HMDS jest wysoce lotna i katalizowana przez czynniki zawierające jod.</li>
	<li>Odłącz kaniule od rurki i zawieś serce na szwie aortalnym wewnątrz dygestoria.</li>
	<li>Ostrożnie nasuń worek z zamkiem błyskawicznym na serce i zamknij uszczelkę worka na szwie, aby zmniejszyć narażenie serca na krążące powietrze. Pozostaw serce do wyschnięcia przez odparowanie przez 1 tydzień.</li>
	<li>OPCJONALNIE: W przypadku środków kontrastowych nasycających dyfuzję myj serce w 100% etanolu przez 15 minut podczas mieszania. Zanurz serce w 100% etanolu uzupełnionym PMA, 1%, na 48 godzin w próżni. Powtórz krok 4.6.</li>
</ol>
5. Mikrotomografia komputerowa:
UWAGA: Do obrazowania serc świń użyto stacjonarnego systemu rentgenowskiego do mikrotomografii komputerowej.
<ol>
	<li>Zamontuj wysuszone na powietrzu serce na odpowiednim uchwycie na próbkę. Zapobiegaj wszelkim ruchom podczas pomiarów rentgenowskich mikrotomografii komputerowej za pomocą zacisku zakotwiczonego w uchwycie próbki i zabezpiecz serce za pomocą wysuszonej i sztywnej aorty.</li>
	<li>Skrupulatnie wyrównaj środek próbki serca wzdłuż jej osi podłużnej ze środkiem pola widzenia obrazowania dla kątów obrotu 0° i 90°. Aby to osiągnąć we wszystkich orientacjach, zawieś serce w powietrzu za pomocą zacisku aortalnego przymocowanego do wspornika próbki.</li>
	<li>Po uruchomieniu oprogramowania i uruchomieniu systemu rentgenowskiego microCT należy zastosować filtr rentgenowski aluminiowy, 1 mm, źródło promieniowania rentgenowskiego o napięciu do 60 kV i prądzie na 120 μA. Ustaw wymiary obrazu na 2016 x 1344 pikseli, a rozmiar piksela na 20 μm.</li>
	<li>Wycofaj uchwyt próbki poza pole widzenia i skalibruj obraz tła oraz czas ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie, uzyskując korekcję płaskiego pola. Upewnij się, że średnia transmisja promieniowania rentgenowskiego w tle jest większa niż 80%.</li>
	<li>Zbadaj obrazy transmisji promieniowania rentgenowskiego wzdłuż długości podpory, aby określić ogólne pole obrazowania w osi podłużnej serca. Do skanowania należy użyć kroku obrotu 0,18°, uśrednienia klatek 5° i obrotu próbki 180°. Wybierz tryb skanowania offsetowego, aby zobrazować pełną szerokość podpory próbki. 
	UWAGA: Parametry akwizycji wskazane w tym rozdziale zostały dobrane w celu optymalizacji jakości obrazu kompozycji zespołowej serca.</li>
	<li>Po zeskanowaniu należy skorzystać z oprogramowania do tomograficznej rekonstrukcji izotropowej objętości obrazu trójwymiarowego. Do zastosowania oprogramowania NRecon należy użyć korekcji artefaktów związanych z akwizycją, w tym efektów utwardzania wiązki o 10% i redukcji artefaktów pierścieniowych o 8.</li>
	<li>Aby zoptymalizować ograniczenia przechowywania danych, zastosuj minimalny prostokątny obszar zainteresowania, który obejmuje woksele obrazu specyficzne dla serca. Eksportuj obrazy w 8-bitowym formacie bitmapowym jako stos obrazów.</li>
	<li>Wizualizacja zrekonstruowanego stosu danych za pomocą oprogramowania DataViewer. Cyfrowo zorientuj próbkę w granicach obrazu, aby wyrównać długą i krótką oś próbki z trzema głównymi osiami objętości obrazu.</li>
	<li>Przytnij objętość obrazu we wszystkich trzech osiach, aby usunąć zewnętrzne warstwy tła obrazu, aby maksymalnie zmniejszyć całkowity rozmiar obrazu.</li>
</ol>

Opracowano szczegółowy protokół dla preparatów dużych tkanek, w którym wykorzystuje się całe serca dużych ssaków do późniejszego obrazowania strukturalnego w wysokiej rozdzielczości. Podejście polegające na suszeniu powietrzem usunęło wpływ tłumienia promieniowania rentgenowskiego tła i maksymalnie optymalizowało tkankę: kontrast tła29. Dzięki temu podejściu uzyskano rozdzielczość izotropową w zakresie 20 μm do obrazowania wolumetrycznego w próbkach o średnicy do 7,2 cm. Mikrotomografia komputerowa tkanek miękkich zazwyczaj opiera się jednak na zastosowaniu niespecyficznych środków kontrastowych w celu poprawy absorpcji promieniowania rentgenowskiego i czułości systemów mikrotomografii komputerowej34. Chociaż rentgenowskie środki kontrastowe poprawiają ogólne tłumienie promieniowania rentgenowskiego i poprawiają obrazowanie tkanek miękkich, oddzielenie składników tkanek na podstawie składu biochemicznego pozostaje wyzwaniem. Zaobserwowano jednak, że przy użyciu suszonych na powietrzu serc w połączeniu z popularnym rentgenowskim środkiem kontrastowym w warunkach laboratoryjnych, PMA, selektywnie barwiono składniki zewnątrzkomórkowe. Wzmocniono tkankę łączną związaną ze zdrowym mięśniem sercowym i patologiczną przebudową strukturalną w chorobach przewlekłych.
Proces suszenia tkanki biologicznej na powietrzu wymaga interwencji, aby zapobiec deformacji próbki. Przygotowanie próbek do mikroskopii elektronowej wiąże się z podobnymi wymaganiami. Zazwyczaj stosuje się metodę suszenia w punkcie krytycznym, która wykorzystuje równowagę medium zanurzeniowego w tkance, temperatury i ciśnienia w celu wyeliminowania napięcia powierzchniowego płynnej zawartości tkanki, co powoduje deformację na poziomie molekularnym po odparowaniu35. Takie podejście wymaga równomiernego zastąpienia zawartości wody w próbce ciekłym dwutlenkiem węgla, który jest bardziej niezawodny w małych i łatwo dyfuzyjnych próbkach. Alternatywnie, integralność strukturalna tkanki może zostać poprawiona, a suszenie powietrzem, tj. faza parowania może być stosowana przez dłuższy czas w celu zmniejszenia ogólnej deformacji. Cząsteczka HMDS ulega sililowaniu w celu utworzenia rusztowania na bazie silikonu w celu wzmocnienia i ustabilizowania organizacji molekularnej próbki tkanki36. Parowanie jest dodatkowo wydłużane poprzez ograniczanie krążących prądów powietrza z otoczenia, również w celu uniknięcia niejednorodnego parowania, szczególnie między powierzchnią próbki a warstwami wewnętrznymi.
Liczne środki kontrastowe były już wcześniej stosowane w obrazowaniu mikrotomografii komputerowej tkanek miękkich. Najczęściej spotykane są jod, kwas fosfowolframowy (PTA) i PMA. Jod został szczególnie zastosowany ze względu na wyższą szybkość dyfuzji 34,37,38. Niemniej jednak jod działa jako katalizator sililowania odczynnika HMDS36. Katalizowana reakcja jest agresywna i egzotermiczna, co wiąże się z wysokim ryzykiem zniszczenia próbki i ryzykiem bezpieczeństwa, jeśli resztki HMDS pozostaną z powodu niepełnego wysuszenia próbki. Zarówno PTA, jak i PMA rozpuszczone w etanolu mogą być bezpiecznie stosowane w połączeniu z HMDS. Wykazano, że PTA i PMA zapewniają większą zdolność rozdzielczą drobnych struktur w niezmineralizowanych krążkach międzykręgowych w porównaniu z barwieniem jodem38. W obrazowaniu mikrotomograficznym próbek ssaków, PTA i PMA zastosowano do barwienia zarodków myszy39, układu sercowo-naczyniowego myszy37, mięśni i mózgu królika40 oraz żył świń41. PTA ma większą masę cząsteczkową i gęstość w roztworze niż PMA. Wynika to częściowo z większej masy atomowej wolframu (liczba atomowa wynosi 74 g/mol), głównego pierwiastka tłumiącego w PTA. Dla porównania, najcięższy pierwiastek w PMA, molibden, ma liczbę atomową 42 g/mol. Zarówno masa atomowa, jak i gęstość próbki leżą u podstaw tłumienia promieniowania rentgenowskiego, oprócz grubości próbki42. Zwiększając długość ścieżki promieniowania rentgenowskiego poprzez zwiększanie rozmiarów próbek, tłumienie promieniowania rentgenowskiego staje się bardziej wrażliwe na zwiększoną gęstość próbki. W związku z tym wybrano środek kontrastowy PMA o mniejszej gęstości, aby zmniejszyć ryzyko nadmiernego tłumienia i zoptymalizować zakres dynamiczny kontrastu obrazu dla serc o skali zbliżonej do ludzkiej. Dalsze dowody wykazały, że obciążenie dyfuzyjne PMA daje bardziej jednorodne barwienie niż w przypadku większej cząsteczki PTA w tkance serca43.
Sposób dostarczania środka kontrastowego wpływa na równomierność dystrybucji środka kontrastowego w tkance serca (ryc. 3). Perfuzja środków kontrastowych w sercu odwodnionym etanolem wykazała niejednolite poziomy barwienia tła PMA z powodu zmiennego oporu naczyniowego. W wysuszonym na powietrzu sercu struktura laminarna mięśni jest podkreślona przez proces wysuszania próbki, zwiększając separację mięśni laminarnych. To ostatecznie poprawiło ogólną przepuszczalność tkanki dla obciążenia środkiem kontrastowym na podstawie dyfuzji. W związku z tym suszenie powietrzem ułatwiało tkankom: kontrast powietrza na poziomie laminarnym i wewnątrzlaminarnym (ryc. 4). Co więcej, ładowanie dyfuzyjne może być dodatkowo ułatwione przez aplikację w próżni. Wykazano ponadto, że kurczenie się tkanek w próbkach niewysuszonych zależy od stężenia środka kontrastowego40. Jednak wcześniejsza stabilizacja morfologiczna próbki poprzez suszenie powietrzem hamuje efekt kurczenia się tkanek29.
Obrazy mikrotomografii komputerowej całych narządów o wysokiej rozdzielczości z natury rzeczy generują duże ilości danych. Charakter technik obrazowania tomograficznego umożliwia wizualizację i przetwarzanie obrazu na zasadzie slice po slice, co zmniejsza obciążenie przetwarzania komputerowego i pamięci. Jednak, aby zwizualizować trójwymiarowe stosy obrazów, na przykład w celu renderowania objętości próbek w reprezentacjach trójwymiarowych, zalecane minimalne specyfikacje komputera to 128 GB pamięci RAM i szybkość procesora 3 GHz. Półprzewodnikowe dyski twarde również znacznie poprawiły transfer danych.
Pojawienie się obrazowania mikrotomografii komputerowej w dziedzinie serca zapewnia wiele korzyści w badaniach translacyjnych i walidacji klinicznej. Zalety obrazowania trójwymiarowego i mikrometrycznego wykazały już zastosowanie w określaniu obciążenia zakrzepowego u pacjentów z niedokrwieniem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST44,45. Mapowanie potencjalnych źródeł arytmii u pacjentów ze strukturalnymi chorobami serca jest w dużej mierze zależne od określenia rozmieszczenia zwłóknieniowej tkanki bliznowatej i zlokalizowania przeplatających się ścieżek mięśnia sercowego, który przeżył. Podejścia drugiego rzutu do diagnostyki komorowych zaburzeń rytmu serca wykorzystują obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego46. Może solidnie lokalizować gęste zwłóknienie, ale ogranicza się do charakterystyki morfologicznej o niskiej rozdzielczości i oferuje ograniczony wgląd w przebudowę mikrostrukturalną i rozproszone rozkłady zmian zwłóknieniowych47. Badanie rozkładu i charakterystyki blizn w wysokiej rozdzielczości ma ogromny potencjał w zakresie poprawy naszej wiedzy na temat przebudowy strukturalnej serca i ryzyka rozwoju niewydolności serca. W szczególności badania podstawowe lub badania pośmiertne skorzystają z potwierdzających obrazów strukturalnych do mapowania elektrycznego arytmii serca.
Podsumowując, serca wzmocnione leczeniem HMDS i suszeniem powietrzem mogą być następnie barwione rentgenowskim środkiem kontrastowym, aby zwiększyć tłumienie promieniowania rentgenowskiego składników zewnątrzkomórkowych. W szczególności w zdrowym mięśniu sercowym akumulacja PMA występuje w nabłonku, tkance zastawkowej i przedziałach układu przewodnictwa komorowego osłoniętych tkanką łączną, co spowodowało zwiększone tłumienie promieniowania rentgenowskiego. Co więcej, w strukturalnie chorym mięśniu sercowym zwiększony kontrast był dodatkowo selektywny w kierunku zwłóknienia.

Strukturalne choroby serca odpowiadają za większość zgonów związanych z sercem na całym świecie1. Przemodelowanie struktury serca wpływa na środowisko mięśnia sercowego i przestrzeń śródmiąższową. Ponieważ zarówno funkcja elektryczna, jak i mechaniczna serca zależy od organizacji miocytów, zakłócenia mogą prowadzić do nietolerowanej arytmii serca, upośledzenia pompowania krwi i niewydolności serca2,3,4,5,6,7,8,9. Rozwój terapii leczniczych strukturalnych chorób serca jest znacznie większy niż rozpowszechnienie choroby2,5. W związku z tym pojawia się coraz więcej przedklinicznych modeli strukturalnych chorób serca, aby lepiej zrozumieć profile anatomiczno-morfologiczne i wynikającą z nich patogenezę zaburzeń rytmu serca10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. W całym spektrum chorób strukturalnych obserwuje się regulację w górę zwłóknienia śródmiąższowego i, częściej w przypadkach związanych z niedokrwieniem, zastąpienie mięśnia sercowego przez zwłóknienie i tkankę tłuszczową18. Zrozumienie morfologiczne patologicznych komponentów zewnątrzkomórkowych może umożliwić identyfikację potencjalnych substratów arytmii. Rozmieszczenie i rozległość choroby dostarczają silnych wskaźników ryzyka arytmogennego. Nadal jednak wyzwaniem jest kompleksowe zobrazowanie profili chorób poprzez integrację makro- i mikroskali w nienaruszonym sercu.
Mikrotomografia komputerowa (mikroCT), oparta na promieniach rentgenowskich, staje się potężnym narzędziem do badania mikrostruktury miękkich tkanek biologicznych za pomocą środków kontrastowych. Uzyskano bardzo szczegółowe mapy anatomiczne dla serc małych gryzoni24,25,26 oraz małych wypreparowanych próbek z serc dużych ssaków27,28. Jednak obrazowanie na poziomie całych narządów sercowych dużych ssaków wykazuje nadmierne długości ścieżek, na których fotony promieniowania rentgenowskiego są tłumione przy użyciu konwencjonalnych technik przygotowania tkanek. Polega to na obciążeniu tkanki kontrastem i zanurzeniu próbki w rozpuszczalniku środka kontrastowego podczas pobierania. Zwiększenie wielkości próby i rozdzielczości powoduje wydłużenie całkowitego czasu akwizycji. Dlatego stabilność tkanek staje się kluczowa dla użytecznej rekonstrukcji obrazu, co oznacza, że należy zapobiegać deformacji tkanek wynikającej z wysuszenia. Stosowanie płynu immersyjnego ma jednak wady: (i) ogólna intensywność sygnału tła staje się niebagatelna i (ii) sprzyja rozcieńczeniu cząsteczek kontrastu związanych z tkankami. Oba te czynniki przyczyniają się do obniżenia kontrastu obrazu.
To badanie szczegółowo opisuje nowy proces przetwarzania tkanek w celu zmniejszenia tłumienia fotonów tła i optymalizacji zakresu dynamicznego zapewnianego przez środki wzmacniające kontrast. Sugeruje się stosowanie podejścia polegającego na suszeniu tkanek powietrzem z chemicznym wzmocnieniem tkanek w celu ograniczenia deformacji tkanek29. W związku z tym próbki tkanek mogą pozostawać stabilne w powietrzu przez długi czas i pomijać wpływ tła z płynów zanurzeniowych. Ta metodologia zapewnia: (i) kompleksowy protokół przetwarzania i obrazowania tkanek zoptymalizowany przy użyciu całych serc świń; (ii) ocenę stężenia kontrastu i technik ładowania oraz (iii) zastosowanie tego procesu w dwóch odrębnych modelach chorób przewlekłych: migotaniu przedsionków i zawału mięśnia sercowego w sercach owiec. Rozwój modeli chorób przewlekłych został opisany w innym miejscu dla każdego modelu przewlekłej choroby serca, zawału mięśnia sercowego wywołanego przezskórną embolizacją tętnic wieńcowych13 i samopodtrzymującego się migotania przedsionków30.

<table><tbody><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Diapath</td><td>F0043</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia</td><td>Honeywell</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kaulacyjna PTFE</td><td>VWR</td><td>DENE3400102</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik o stałej wysokości podnoszenia 1L Aparat</td><td>Harvard</td><td>50-0496</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>796881</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa (5000 U/ml)</td><td>Panpharma</td><td>3400891287301.</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>440191-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, odczynnik ACS, 37%</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>roztwór chlorku magnezu</td><td>Honeywell</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat kwasu fosfomolibdynowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>417895000</td><td></td></tr><tr><td>Przewody pompy chlorku potasu</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>, 3-stopniowe</td><td>Ismatec</td><td>FV-96328-48</td><td></td></tr><tr><td>SkyScan, 1276</td><td>Bruker</td><td></td><td>micro CT</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu 50% w H2O</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestawy łączników rurowych</td> 415413 <td>Harvard Apparatus</td><td>72-1407</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do węży</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1089</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Tygon R-3603 1,6 mm 3,2 mm 0,8 mm</td><td>VWR</td><td>228-1279</td><td></td></tr><tr><td>Przewody Tygon R-3603 3,2 mm 4,8 mm 0,8 mm</td><td>VWR</td><td>228-1283</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki jednorazowe dwuczęściowe 50 ml</td><td>Norm-Ject</td><td>4850001000</td><td>Nie zawiera pirogenów, nie zawiera PCW</td></tr></tbody></table>

techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Przebudowa strukturalna jest częstą konsekwencją przewlekłych stresów patologicznych nałożonych na serce. Zrozumienie właściwości architektonicznych i składowych chorej tkanki ma kluczowe znaczenie dla określenia ich interakcji z zachowaniem arytmicznym. Przebudowa tkanek w mikroskali, poniżej rozdzielczości klinicznej, staje się ważnym źródłem śmiertelnej arytmii, z dużą częstością występowania u młodych dorosłych. Nadal wyzwaniem jest uzyskanie wysokiego kontrastu obrazowania przy wystarczającej rozdzielczości mikroskali dla modeli przedklinicznych, takich jak całe serca dużych ssaków. Co więcej, nadal brakuje selektywnego wzmocnienia kontrastu składu tkankowego dla trójwymiarowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie nieniszczące z wykorzystaniem mikrotomografii komputerowej daje nadzieję na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Celem było złagodzenie dolegliwości związanych z nadmiernym tłumieniem promieniowania rentgenowskiego w dużych próbkach biologicznych. Serca pobrano od zdrowych świń (N = 2) i owiec (N = 2) z indukowanym przewlekłym zawałem mięśnia sercowego i powstawaniem blizn zwłóknieniowych lub indukowanym przewlekłym migotaniem przedsionków. Wycięte serca perfuzjono: roztworem soli fizjologicznej uzupełnionym środkiem gaszącym jony wapnia i środkiem rozszerzającym naczynia krwionośne, etanolem w seryjnym odwadnianiu i heksametylodicylodizyzanem w próżni. Ten ostatni wzmocnił strukturę serca podczas suszenia na powietrzu przez 1 tydzień. Tkanka z dominacją kolagenu była selektywnie wiązana przez rentgenowski środek wzmacniający kontrast, kwas fosfomolibdynowy. Konformacja tkanek była stabilna w powietrzu, co pozwoliło na długotrwałe akwizycje mikrotomografii komputerowej w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości (izotropowej 20,7 μm). Optymalne ładowanie środkiem kontrastowym przez dyfuzję wykazało selektywne wzmocnienie kontrastowe warstwy nabłonkowej i podwsierdziowych włókien Purkinjego w zdrowych komorach świni. Serca z migotaniem przedsionków (AF) wykazywały zwiększoną akumulację kontrastu w tylnych ścianach i przydatkach przedsionków, co przypisuje się większej zawartości kolagenu. Serca po zawale mięśnia sercowego wykazywały selektywnie zwiększony kontrast w obszarach zwłóknienia serca, co umożliwiło identyfikację przeplatających się włókien mięśnia sercowego, które przeżyły. Preparaty tkanek suszonych powietrzem ze wzmocnieniem kontrastowym umożliwiły obrazowanie w mikroskali nienaruszonego serca dużych ssaków i selektywne wzmocnienie kontrastowe składników choroby.

Przygotowanie dużych serc ssaków z wykorzystaniem metody odwodnienia i suszenia powietrznego usuwa całą zawartość wody z próbki. Dowody na niewystarczające zastąpienie wody etanolem można zaobserwować podczas wprowadzania HMDS (patrz Protokół, krok 4.4). Obecność wody w HMDS spowoduje powstawanie pęcherzyków powietrza unoszących się z tkanki. W przypadku zbyt wysokiego poziomu wody może dojść do wzrostu temperatury cieczy imersyjnej. Utrzymywanie komory imersyjnej w lodzie podczas początkowego wprowadzania HMDS może ograniczyć niekorzystne skutki nagrzewania tkanki. Po wysuszeniu serc powietrzem wobec braku środków kontrastowych próbka będzie miała biały kolor (patrz Protokół, krok 4.6). Powierzchnia zewnętrzna często wysychała i stawała się stabilna strukturalnie szybciej niż warstwy śródścienne. Płukanie w etanolu przed wprowadzeniem środka kontrastowego usunęło biały osad (patrz Protokół, krok 4.7). Przecięcie tkanki ostrym ostrzem ujawnia makroskopowo poszczególne włókna mięśniowe z wyraźnym oddzieleniem. Kontrastowanie poprzez zanurzenie próbek serca w medium z czynnikiem kontrastowym wiązało się z artefaktami wynikającymi z limitów dyfuzji w grubych i silnie umięśnionych obszarach próbki. Kontrastowanie dyfuzyjne w próżni zapewniło bardziej jednorodne zabarwienie mięśni (próbka serca nr 1, patrz Tabela 1 w celu sprawdzenia czasów wprowadzania środka kontrastowego). Makroskopowo rozkład środka kontrastowego na powierzchni wykazał niejednorodne barwienie między mięśniem sercowym a obszarami składającymi się głównie z komponentów pozakomórkowych, zwłaszcza tłuszczu i tkanki łącznej. Próbki tkanek suszone powietrzem, zarówno przed, jak i po wprowadzeniu środka kontrastowego, zachowały stabilną integralność strukturalną.
Czas niezbędny do przeskanowania pełnej szerokości próbki z rozdzielczością 20 µm przy użyciu mikroCT, stosując wyżej wymienione parametry skanowania oraz czas ekspozycji 1700 ms, wyniósł 6 h 34 min. W zależności od rozmiaru próbki w osi gantry skanera, czas ten został pomnożony przez liczbę pozycji niezbędnych do uchwycenia pełnej długości preparatu. W przypadku serc świń i owiec w niniejszym badaniu zastosowano od trzech do czterech pozycji. Oprogramowanie NRecon połączyło skany z wielu pozycji oraz skany przesunięte, tworząc pojedynczy obraz projekcji promieni rentgenowskich dla każdego kroku obrotu źródła promieniowania i detektora. Łącznie zapisano 1000 projekcji jako obrazy 16-bitowe, co wygenerowało od 30-40 GB danych. Zrekonstruowane obrazy wolumetryczne miały rozmiar 52-70 GB.
Główne punkty orientacyjne anatomiczne, w tym jamy komór, przegrodę oraz wolne ściany komór, można było łatwo zidentyfikować na obrazach transmisyjnych promieni rentgenowskich wysuszonych serc świń, barwionych środkiem kontrastowym metodą dyfuzyjnego ładowania (Rysunek 1A). Ponadto, dzięki czułemu tłumieniu/transmisji promieni rentgenowskich, zaobserwowano regiony o wyraźnej teksturze wskazujące na organizację mikrostrukturalną, taką jak orientacja włókien mięśnia sercowego (Rysunek 1B). Rekonstrukcje tomograficzne trójwymiarowych wolumenów obrazów wykazały wyraźną separację między tkanką a tłem zarówno na granicach epikardialnych, jak i endotelialnych (Rysunek 1D). W obrębie ściany mięśnia sercowego w grubych regionach transmuralnych tkanki zaobserwowano niski kontrast oraz gradient dyfuzji intensywności wokseli. Mimo to naczynia krwionośne i włókna mięśnia sercowego rozdzielone płaszczyznami rozszczepienia były nadal łatwo identyfikowalne. Drugi, wyższy pas intensywności kontrastu zaobserwowano w najbardziej zewnętrznej warstwie epikardialnej oraz w punktowych obszarach podendokardialnych. Wzmocnienie kontrastu było największe w miejscach gromadzenia się składników pozakomórkowych, w szczególności w tkance łącznej epikardium, tłuszczu epikardialnym oraz w pochewce tkanki łącznej sieci włókien Purkinjego. Rozkłady intensywności sygnału wokseli wykazały wysoką separację od tła o zerowej intensywności (powietrza) oraz dwie dominujące populacje tkanki o niskim i wysokim kontraście (Rysunek 1D).
Aby zwalidować wzmocnienie kontrastu w rekonstrukcjach obrazów mikro-CT oraz selektywność względem komponentów kolagenowych próbek serca, zastosowano histologię, mikroskopię w świetle przechodzącym oraz mikroskopię fluorescencyjną (Rysunek 2). Blok tkanki komory serca z wysuszonego na powietrzu serca, bez uprzedniego nasycenia środkiem kontrastowym, przygotowano do zatopienia w parafinie i krojenia. Sąsiednie skrawki tkanki umieszczone na szkiełkach mikroskopowych poddano barwieniu trichromem Massona, pozostawiono bez obróbki lub inkubowano przez 48 h z PMA (1%). Immersja skrawków tkanki na szkiełkach wyeliminowała efekty gradientu dyfuzyjnego procesu barwienia, które obserwowano w całych próbkach serca. Barwienie trichromem Massona wykazało obecność kolagenu w warstwach nabłonkowych i śródbłonkowych, okołonaczyniowo w tkance podosierdziowej oraz w osłonce tkanki łącznej otaczającej wolno przebiegające włókno Purkinjego wysunięte do jamy lewej komory (Rysunek 2A). Oświetlenie w świetle przechodzącym wykazało ciemniejsze zabarwienie struktur kolagenowych po barwieniu PMA, co potwierdza preferencyjną akumulację PMA (Rysunki 2B,C). Co więcej, wcześniej wykazano, że traktowanie PMA wygasza autofluorescencję makromolekularnych kompleksów kolagenu31. Obrazy fluorescencyjne skrawków tkanki komory wykazały indukowaną przez PMA utratę fluorescencji w miejscach występowania kolagenu (Rysunek 2D vs. 2E, Rysunek 2D' vs. 2E' oraz Rysunek 2D'' vs. 2E''). Zarówno w obrazowaniu w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym, komponenty komórkowe nie uległy zmianom pod wpływem PMA, natomiast kolagen wykazał selektywną akumulację barwienia PMA oraz wygaszanie autofluorescencji.
Próbkę serca nr 2 barwiono środkiem kontrastowym poprzez perfuzję przed suszeniem na powietrzu. Rekonstrukcja obrazu ujawniła bardzo niejednorodne barwienie w obrębie komory mięśnia sercowego (Ryc. 3A). Wzmocnienie kontrastu wydawało się nieselektywne względem składu tkanki, bez dalszego wzrostu intensywności sygnału w obszarach epikardialnych lub podwsierdziowych. Co więcej, tkanki o niskim kontraście wykazywały słabą separację od intensywności tła (Ryc. 3B).
Włóknienie komór wywołano poprzez zawał mięśnia sercowego i przewlekłą niedokrwienność (próbka serca nr 3). Blizna przednio-otczepowa powstała w wyniku zastąpienia miocytów złogami włóknisto-tłuszczowymi w tkance poniżej miejsca embolizacji naczyniowej. Próbkę serca nr 3 przygotowano i zobrazowano z wyciętego klina komorowego obejmującego przednią ścianę lewej komory, przegrodę oraz wolną ścianę prawej komory. Sposób przygotowania takiej konfiguracji klina komorowego został opisany wcześniej32, a zastosowanie klinów w obrazowaniu serca zostało szczegółowo omówione33. Morfologia blizny była transmuralna, lecz niejednorodna (Rysunek 4). Centralna gęsta zmiana włóknista była otoczona luźną i niejednorodną strefą przejściową (Rysunek 4A). Preparat komorowy barwiono metodą ładowania dyfuzyjnego po suszeniu powietrznym w próżni. Rysunek 4B-E przedstawia najwyższe intensywności sygnału zrekonstruowanych wolumenów obrazów mikroCT na granicach tkanek i w obszarach blizny. Środki kontrastowe słabo barwiły zdrowe mięsień sercowy, jednak zachowano kontrast mikrostrukturalny (Rysunek 4C'). W strefie przejściowej tkanka bliznowata była przeplatana z zachowanym mięśniem sercowym (Rysunek 4D'). Gęste włóknienie miało charakter transmuralny, lecz teksturowany, co wskazuje na różnice w składzie (Rysunek 4E'). Przekroje tkankowe transmuralnego obszaru lewej komory z preparatu suszonego powietrzem i barwionego PMA wykorzystano do walidacji selektywności PMA względem kolagenu w tkance patologicznej poprzez porównanie z barwieniem trichromem Massona (Rysunek 4F). Barwienie PMA było selektywne dla kolagenu (podwsierdzie i podwsierdzie) i nie występowało w obszarach zachowanego mięśnia sercowego (Rysunek 4G).
Próbkę serca nr 4 z indukowanym utrwalonym migotaniem przedsionków wysuszono na powietrzu, zachowując naturalny kształt jamy przedsionka. Nie zaobserwowano zapadnięcia się wyrostka przedsionka. Główne punkty orientacyjne anatomiczne można było zidentyfikować morfologicznie na obrazach zrekonstruowanych (przegrodę przedsionkową, mięśnie grzebieniaste, zatokę wieńcową, ujścia żył płucnych, żyłę główną i grzebień końcowy). Barwienie dyfuzyjne pod próżnią spowodowało zwiększenie kontrastu w pierścieniu aorty, zastawkach przedsionkowo-komorowych oraz w określonych obszarach czynnego mięśnia sercowego. Zwiększenie intensywności barwienia mięśni ograniczyło się do wyrostków przedsionków oraz tylnych ścian lewego i prawego przedsionka (Rycina 5).
<img alt="Anatomia serca i pomiar intensywności; obraz w skali szarości, przekroje LV i RV, wykres intensywności, histogram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obrazowanie MicroCT wysuszonego na powietrzu serca świni, poddanego działaniu środka kontrastowego PMA poprzez dyfuzję w próżni. (A) Obraz projekcyjny promieni rentgenowskich. (B) Profil transmisji wyekstrahowany z czerwonej linii w A. (C) Przekrój krótkiej osi komór serca z tomograficznie zrekonstruowanej objętości trójwymiarowej. Żółte strzałki wskazują punktowe obszary kontrastu przypisane do podwsiernykowych włókien Purkinjego. Niebieskie strzałki wskazują naczynia krwionośne. (D) Rozkład intensywności sygnału zrekonstruowanego przekroju obrazu przedstawionego w C. LV: lewa komora i RV: prawa komora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie tkanki serca; mikroskopia fluorescencyjna, przekroje od podwsierdziowej warstwy epikardium do podwsierdziowej warstwy endokardium, rozkład białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Walidacja selektywności PMA względem kolagenu. (A) Barwienie trichromem Massona przekroju transmuralnego tkanki z komór serca suszonego na powietrzu. Mięsień sercowy jest zabarwiony na czerwono, a kolagen widoczny jest w kolorze zielonym. Sąsiednie przekroje tkanki (B) bez barwienia lub (C) zabarwione PMA (1%) obrazowano przy użyciu oświetlenia w polu jasnym w celu oceny jednorodności zabarwienia. (D) Przekroje tkanki bez barwienia lub (E) zabarwione PMA obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Panele D' (pełna czerwona ramka) i E' (przerywana czerwona ramka) przedstawiają powiększone widoki obszaru podwsierdziowego dla przekrojów niebarwionych i zabarwionych PMA. Panele D'' (pełna niebieska ramka) i E'' (przerywana niebieska ramka) przedstawiają odpowiednie powiększone widoki podwsierdziowej warstwy endokardium oraz wolno przebiegającego włókna Purkinjego. Strzałki wskazują miejsca występowania kolagenu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Przekrój MRI, wykres histogramu; struktura LV, RV; analiza rozkładu intensywności; skala 1 cm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Perfuzja PMA przed suszeniem powietrznym i obrazowaniem MicroCT. (A) Przekrój w osi krótkiej zrekonstruowanej objętości obrazu komór serca świni. Niebieskie strzałki wskazują naczynia krwionośne. (B) Rozkład intensywności sygnału przekroju obrazu z panelu A. LV: lewa komora i RV: prawa komora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat anatomii serca z zaznaczeniem LV, RV i lokalizacji blizn; płaszczyzny przekrojów MRI, renderowanie wolumetryczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazowanie microCT serca owcy po przewlekłym zawale mięśnia sercowego. (A) W obszarze wierzchołka utworzyła się gęsta blizna (patrz zdjęcie wstawkowe). Renderowanie wolumetryczne obszaru wierzchołka z perspektywy endokardialnej zostało pokolorowane na podstawie intensywności obrazu (kolor czerwony odpowiada tkance bliznowatej, a zielony mięśniowi sercowemu). Ortogonalne przekroje intensywności w skali szarości pokazują rozkład gęstej blizny i graniczące z nią przeżyły mięsień sercowy. Rozdział między tkanką włóknistą a mięśniem sercowym odpowiada obszarom tkanki tłuszczowej. (B) Zdjęcie preparatu klinowego komór, suszonego na powietrzu, pochodzącego od owcy z blizną wierzchołkową po zawale mięśnia sercowego. Skośne przekroje zrekonstruowanej wolumetrycznie obrazu microCT przechodzą przez komory na poziomie pośrednim między podstawą a wierzchołkiem, proksymalnie względem miejsca (C) okluzji naczyniowej (C – czerwona linia na panelu B), (D) obszaru okozawałowego graniczącego z gęstą blizną i zdrowym mięśniem sercowym (D – niebieska linia na panelu B) oraz (E) obszaru gęstej włóknistości (E – zielona linia na panelu B). (C') Powiększony widok obszaru przegrody zaznaczonego czerwoną przerywaną ramką w C. (D') Powiększony widok obszaru zawału w wierzchołku prawej komory (niebieska przerywana ramka na panelu D). (E') Powiększony widok obszaru zawału w wierzchołku lewej komory (zielona przerywana ramka na panelu E). LV: jama lewej komory; RV: jama prawej komory; MB: pas moderatorowy; Pap: mięsień papilarny. Żółta strzałka wskazuje lewą tętnicę zstępującą. (F) Barwienie trichromem Massona przekroju histologicznego wyciętego z suszonej na powietrzu lewej komory barwionej PMA. Kolagen zabarwiony jest na niebiesko, a mięsień sercowy na różowo/fioletowo. (G) Odpowiadający temu przekrój tkanki pokazujący rozkład barwienia PMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza anatomii serca; rekonstrukcja 3D, przekroje MRI, wizualizacja struktury serca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Obraz microCT serca owcy po indukowanym przewlekłym migotaniu przedsionków. (A) Rendering objętościowy przedsionków z kolorystyką przypisaną jak na Rysunku 4A. (B) Przekrój obrazu microCT obu przedsionków wzdłuż osi długiej serca. Przekroje w osi krótkiej wykonano na poziomie (C) zastawek przedsionkowo-komorowych (C- czerwona linia na panelu B), (D) pierścienia aorty (D- niebieska linia na panelu B) oraz (E) sklepienia lewego przedsionka (E- zielona linia na panelu B). LA: lewy przedsionek; RA: prawy przedsionek; LAA: uszko lewego przedsionka; RAA: uszko prawego przedsionka; LV: lewa komora; RV: prawa komora; LVOT: drogi odpływu lewej komory; RVOT: drogi odpływu prawej komory oraz PA: tętnica płucna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka nr</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatunki</td>
			<td>Świnia</td>
			<td>Świnia</td>
			<td>Owce</td>
			<td>Owce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa ciała (kg)</td>
			<td>32.4</td>
			<td>31.2</td>
			<td>47.2</td>
			<td>53.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa serca (g)</td>
			<td>191.2</td>
			<td>186.2</td>
			<td>202.4</td>
			<td>207.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patologia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Przewlekły zawał mięśnia sercowego</td>
			<td>Przewlekłe migotanie przedsionków</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przygotowanie próbek</td>
			<td>Całe serce</td>
			<td>Całe serce</td>
			<td>Klin przedniej części serca</td>
			<td>Całe serce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sposób podania kontrastu</td>
			<td>Dyfuzja</td>
			<td>Perfuzja</td>
			<td>Dyfuzja</td>
			<td>Dyfuzja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekspozycja na środek kontrastowy (h)</td>
			<td>48</td>
			<td>24</td>
			<td>48</td>
			<td>48</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Próbki serca i podanie środka kontrastowego.

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania wysokiej rozdzielczości obrazów mikrotomografii komputerowej zdrowych i patologicznych całych serc dużych ssaków z selektywnym wzmocnieniem kontrastu.

Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Protokół ten zapewnia wgląd mikrostrukturalny w strukturalne choroby patologiczne w skali całego narządu za pomocą tomografii mikrokomputerowej. W tym protokole zaimplementowano specjalistyczną metodę przygotowania tkanek w celu optymalizacji obrazowania w wysokiej rozdzielczości próbek całego serca z translacyjnych modeli dużych ssaków u ludzi z selektywnym kontrastowym wzmocnieniem chorób strukturalnych. Mikrostruktura serca, taka jak rozmieszczenie zwłóknienia i organizacja pobudliwego mięśnia sercowego, leży u podstaw szerokiego spektrum chorób serca i tworzy scenę dla zagrażającej życiu arytmii.Procedurę zademonstruje Nestor Pallares-Lupon, doktor habilitowany i doktorant w moim laboratorium. Na początek przygotuj roztwór kardioplegiczny zawierający heparynę sodową i przechowuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj PBS / EDTA, najpierw dodając EDTA do jednego litra wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów.Następnie zwiększyć i utrzymać pH roztworu na poziomie 12 za pomocą wodorotlenku sodu w celu rozpuszczenia EDTA. Gdy EDTA całkowicie się rozpuści, obniż pH do 7,4 za pomocą kwasu solnego. Następnie dodaj jedną torebkę foliową PBS, aby uzyskać roztwór 0,01 molowy o pH 7,4.Przygotowany roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Na koniec przygotuj 1% roztwór środka kontrastowego PMA etanolu, dodając 10 gramów PMA do jednego litra absolutnego etanolu. Przygotowany roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.Przygotuj jednolitrowy zbiornik wsparty 80 centymetrów nad naczyniem preparacyjnym i podłącz rurkę termoplastyczną do portu spustowego zbiornika. Przymocuj kran trójdrożny do rurki odpływowej i podłącz dalsze rurki termoplastyczne do każdego wolnego portu na kranie trójdrożnym. Przymocuj krany dwukierunkowe do wolnych końców rurki.Następnie napełnij zbiornik roztworem kardioplegicznym uzupełnionym heparyną. Otwórz krany, aby roztwór kardioplegiczny spłynął, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Następnie zamknij krany dwukierunkowe.Po pobraniu serca od zwierzęcia poddanego eutanazji umieść je w zimnym roztworze kardioplegicznym przechowywanym na lodzie, aż będzie gotowe do sekcji. Następnie przygotuj kaniulę dla lewej i prawej kości wieńcowej, przecinając pięć centymetrów rurki PTFE i podgrzewając jeden koniec, umieszczając końcówkę obok otwartego ognia. Gdy jeden milimetr końcówki zacznie się topić i stanie się półprzezroczysty, dociśnij końcówkę do twardej, odpornej na ciepło powierzchni, aby ukształtować grzbiet na końcówce kaniuli, aby zapobiec wyślizgiwaniu się kaniuli z naczyń, a następnie włóż jeden centymetr nieogrzewanego końca każdej kaniuli do dwóch końców rurki drenażowej zbiornika odpływowego.Następnie usuń kaniulę aorty i zlokalizuj lewą i prawą kość tętnic wieńcowych pod zimnym roztworem kardioplegicznym. Za pomocą spiczastych nożyczek ostrożnie oddziel korzeń aorty od otaczającej tkanki powyżej i poniżej kości wieńcowej, aby umożliwić nawlekanie jedwabnego szwu o zerowej grubości pod naczyniem wieńcowym. Następnie otwórz krany dwukierunkowe i włóż końcówki kaniuli do kości wieńcowej.Gdy końcówki kaniuli wystają od jednego do dwóch centymetrów w głąb kości i poza miejsce założenia szwu, zawiąż kaniulę. Następnie opłucz serce, delikatnie masując komory przez 15 minut, aż serce zostanie oczyszczone z krwi. Po spłukaniu zamknij krany dwukierunkowe, odłącz je od kranu trójdrożnego i przenieś serce do litrowego plastikowego pojemnika odpornego na chemikalia zawierającego 500 mililitrów roztworu PBS/EDTA.Recyrkulacja roztworu PBS/EDTA w rurkach termoplastycznych pod wyciągiem za pomocą pompy perystaltycznej z dwoma kanałami. Zalać rurkę pompy, aż w rurce nie będzie pęcherzyków powietrza. Następnie przejrzyj każdą kaniulę tętnicy wieńcowej przez recyrkulację w temperaturze pokojowej przez dwie godziny z prędkością 80 mililitrów na minutę.Po upewnieniu się, że wyciąg jest sprawny, zatrzymaj pompę, spuść roztwór ze zbiornika i zastąp go 10% formaliną do utrwalenia na godzinę w ilości 80 mililitrów na minutę. Przeglądaj serce, stosując serię zwiększających się stężeń etanolu, zaczynając od 20% etanolu przez co najmniej trzy godziny. Następnie zastąp 20% etanol 30% etanolem i perfuj przez dwie godziny.Kontynuować perfuzję, zwiększając stężenie etanolu w każdej iteracji, z minimalną perfuzją wynoszącą jedną godzinę przy każdym stężeniu. Aby wzmocnić tkankę serca przed suszeniem powietrzem, recyrkuluj równą mieszankę etanolu i HMDS przez 10 minut, a następnie 100% HMDS przez kolejne dwie godziny. Zatrzymaj pompę perfuzyjną, a następnie odłącz kaniulę od rurki i zawieś serce na szwie aortalnym wewnątrz dygestorium.Ostrożnie nasuń worek z zamkiem błyskawicznym na serce i zamknij uszczelkę worka na szwie, aby zmniejszyć narażenie serca na krążące powietrze. Pozwól sercu wyschnąć przez odparowanie przez tydzień. W przypadku dyfuzyjnych środków kontrastowych należy zdjąć worek.Umyj serce w 100% etanolu przez 15 minut z mieszaniem przed zanurzeniem go w 100% etanolu uzupełnionym 1% PMA na 48 godzin pod próżnią, a następnie przykryj serce torbą z zamkiem błyskawicznym, jak pokazano wcześniej, i pozostaw do wyschnięcia. Zamontuj wysuszone powietrzem serce na odpowiednim uchwycie na próbkę. Aby zapobiec wszelkim ruchom podczas pomiarów rentgenowskich mikrotomografii komputerowej, użyj zacisku zakotwiczonego w uchwycie próbki i zabezpiecz serce za pomocą wysuszonej i sztywnej aorty.Zamontuj uchwyt na próbkę w mikrotomografie komputerowym. Następnie otwórz oprogramowanie i zainicjuj system mikro tomografii rentgenowskiej. Następnie ustaw aluminiowy filtr rentgenowski na jeden milimetr.Napięcie źródła promieniowania rentgenowskiego do 60 kilowoltów i prąd do 120 mikroamperów. Dodatkowo ustaw wymiary obrazu na 2, 016 na 1, 344 piksele, a rozmiar piksela na 20 mikrometrów. Zbadaj obrazy transmisji promieniowania rentgenowskiego wzdłuż długości podpory, aby określić ogólne pole obrazowania w dostępie podłużnym serca.Do skanowania należy użyć kroku obrotu wynoszącego 0,18 stopnia, uśrednienia klatek wynoszącego pięć stopni i obrotu próbki o 180 stopni, usuwając zaznaczenie opcji akwizycji 360 stopni. Wybierz tryb skanowania offsetowego, aby zobrazować całą szerokość podpory próbki. Po zeskanowaniu należy skorzystać z oprogramowania do tomograficznej rekonstrukcji izotropowej objętości obrazu trójwymiarowego.W końcowym oprogramowaniu zwiadowczym użyj korekcji artefaktów związanych z akwizycją, w tym efektów wzmocnienia wiązki o 10% i redukcji artefaktów pierścieniowych o osiem. Następnie, za pomocą oprogramowania Data Viewer, zwizualizuj zrekonstruowany stos danych. Cyfrowo zorientuj próbkę w granicach obrazu, aby wyrównać długą i krótką oś próbek z trzema zasadami: oś objętości obrazu.Na koniec przytnij objętość obrazu we wszystkich trzech osiach, aby usunąć zewnętrzne warstwy tła obrazu i maksymalnie zmniejszyć całkowity rozmiar obrazu. Obrazowanie rentgenowskie wysuszonych powietrzem serc świń pokazuje główne anatomiczne punkty orientacyjne, w tym jamy komorowe i ścianę mięśniową. Tomograficzne rekonstrukcje trójwymiarowych objętości obrazu wykazały wyraźną separację między tkanką a tłem na granicach nasierdzia i wsierdzia.Barwienie trichromem Masona wykazało zabarwienie kolagenem dodatnim w warstwach nabłonka i śródbłonka przynaczyniowo w tkance podnasierdziowej. Jasne oświetlenie pola wykazało ciemniejsze zabarwienie w strukturach kolagenowych po barwieniu PMA, co potwierdza preferencyjną akumulację PMA. Fluorescencyjne obrazy skrawków tkanki komorowej barwione PMA miały wywołaną PMA utratę fluorescencji w miejscach kolagenu.Tam, gdzie próbka serca została wybarwiona środkiem kontrastowym za pomocą perfuzji przed suszeniem powietrzem, rekonstrukcja obrazu ujawniła bardzo niejednolite zabarwienie w obrębie przedziału mięśnia sercowego. Co więcej, tkanka o niskim kontraście wykazywała słabą separację od intensywności tła. Obrazowanie mikrotomografią komputerową części owczej cierpiącej na przewlekły zawał mięśnia sercowego ujawniło centralną, gęstą zmianę zwłóknieniową otoczoną luźną i niejednorodną strefą graniczną.Pokazano tu największe natężenia sygnału zrekonstruowanych objętości obrazu na granicach tkanek i obszarach bliznowatych. Środki kontrastowe słabo zabarwiały zdrowy mięsień sercowy, ale kontrast mikrostrukturalny został zachowany. W strefie przygranicznej tkanka bliznowata była przeplatana ocalałym mięśniem sercowym.Gęste zwłóknienie wyglądało na przezścienne, ale teksturowane, co wskazuje na różnice w składzie. Przezścienny obszar lewej komory preparatu tkanki barwionej PMA wykazał selektywne barwienie kolagenu i brak barwienia w obszarach mięśnia sercowego, które przeżyły. Zaleca się dłuższe czasy perfuzji przy użyciu etanolu, aby zapewnić całkowitą wymianę zawartości wody w sercu z etanolem.Interakcje między HMDS a wodą wytwarzają ciepło, które może uszkodzić próbkę. Dużą zaletą tej procedury jest możliwość walidacji obrazowania mikro CT za pomocą histologii. Próbki suszone powietrzem mogą być bezpośrednio zanurzane w parafinie w celu cięcia, barwienia i obrazowania mikroskopowego.

tissue-preparation-techniques-for-contrast-enhanced-micro-computed

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

Wizualizacja naczyń wieńcowych ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat chorób układu sercowo-naczyniowego. Opisujemy tutaj metodę perfuzji naczyń wieńcowych myszy radiologicznym silikonem (Microfil) w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową (μCT).

Wsteczna perfuzja i wypełnianie naczyń wieńcowych myszy w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową

Celem tych badań jest odtworzenie, a następnie dostęp do anatomii ludzkiego układu żylnego serca za pomocą rekonstrukcji 3D wygenerowanych na podstawie tomografii komputerowej z kontrastem.

Rekonstrukcje anatomiczne układu żylnego serca człowieka z wykorzystaniem kontrastowej tomografii komputerowej próbek z utrwaloną perfuzją

Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.

In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię użycia nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich kauczuku silikonowego na bazie ołowiu do perfuzji mysiego układu krwionośnego do ilościowego określenia średnicy aorty w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty.

Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Celem tej techniki jest wizualizacja ex vivo sieci tętnic płucnych u myszy wcześnie urodzonych i dorosłych poprzez napompowanie płuc i wstrzyknięcie przez tętnicę płucną nieprzezroczystego związku na bazie polimeru radiologicznego. Omówiono również potencjalne zastosowania tkanek odlewanych.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji i kwantyfikacji naczyń mysich kończyn tylnych za pomocą mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej.

Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową

Ze względu na skomplikowaną anatomię, konsekwentnie powtarzalny protokół sekcji i pobierania próbek sercowych może być trudny do wdrożenia. W niniejszym manuskrypcji przedstawiono kluczowe elementy niektórych standardowych protokołów rozwarstwiania serca, podkreślając zarówno ogólne podejścia do badania, jak i miejsca pobierania próbek powszechnie stosowane w badaniu histopatologicznym.

Techniki preparacji i histologiczne pobieranie próbek serca w dużych modelach zwierzęcych pod kątem chorób sercowo-naczyniowych

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół obrazowania do ilościowego oznaczania funkcji i morfologii serca za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości dla małych zwierząt. Pod uwagę brane są zarówno myszy, jak i szczury, omawiając różne wymagania dotyczące środków kontrastowych w tomografii komputerowej dla tych dwóch gatunków.

Pozytonowa tomografia emisyjna serca o wysokiej rozdzielczości/tomografia komputerowa dla małych zwierząt

Poznaj techniki przygotowania tkanek serca dużych ssaków do mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym kolagenu. Ta metoda umożliwia szczegółowe obrazowanie mikrostruktury i fibrozy mięśnia sercowego.

Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi (Wideo) | JoVE Journal

Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Przeglądaj więcej filmów