Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi

Protokół ten zapewnia wgląd mikrostrukturalny w strukturalne choroby patologiczne w skali całego narządu za pomocą tomografii mikrokomputerowej. W tym protokole zaimplementowano specjalistyczną metodę przygotowania tkanek w celu optymalizacji obrazowania w wysokiej rozdzielczości próbek całego serca z translacyjnych modeli dużych ssaków u ludzi z selektywnym kontrastowym wzmocnieniem chorób strukturalnych. Mikrostruktura serca, taka jak rozmieszczenie zwłóknienia i organizacja pobudliwego mięśnia sercowego, leży u podstaw szerokiego spektrum chorób serca i tworzy scenę dla zagrażającej życiu arytmii.

Procedurę zademonstruje Nestor Pallares-Lupon, doktor habilitowany i doktorant w moim laboratorium. Na początek przygotuj roztwór kardioplegiczny zawierający heparynę sodową i przechowuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj PBS / EDTA, najpierw dodając EDTA do jednego litra wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów.

Następnie zwiększyć i utrzymać pH roztworu na poziomie 12 za pomocą wodorotlenku sodu w celu rozpuszczenia EDTA. Gdy EDTA całkowicie się rozpuści, obniż pH do 7,4 za pomocą kwasu solnego. Następnie dodaj jedną torebkę foliową PBS, aby uzyskać roztwór 0,01 molowy o pH 7,4.

Przygotowany roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Na koniec przygotuj 1% roztwór środka kontrastowego PMA etanolu, dodając 10 gramów PMA do jednego litra absolutnego etanolu. Przygotowany roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

Przygotuj jednolitrowy zbiornik wsparty 80 centymetrów nad naczyniem preparacyjnym i podłącz rurkę termoplastyczną do portu spustowego zbiornika. Przymocuj kran trójdrożny do rurki odpływowej i podłącz dalsze rurki termoplastyczne do każdego wolnego portu na kranie trójdrożnym. Przymocuj krany dwukierunkowe do wolnych końców rurki.

Następnie napełnij zbiornik roztworem kardioplegicznym uzupełnionym heparyną. Otwórz krany, aby roztwór kardioplegiczny spłynął, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Następnie zamknij krany dwukierunkowe.

Po pobraniu serca od zwierzęcia poddanego eutanazji umieść je w zimnym roztworze kardioplegicznym przechowywanym na lodzie, aż będzie gotowe do sekcji. Następnie przygotuj kaniulę dla lewej i prawej kości wieńcowej, przecinając pięć centymetrów rurki PTFE i podgrzewając jeden koniec, umieszczając końcówkę obok otwartego ognia. Gdy jeden milimetr końcówki zacznie się topić i stanie się półprzezroczysty, dociśnij końcówkę do twardej, odpornej na ciepło powierzchni, aby ukształtować grzbiet na końcówce kaniuli, aby zapobiec wyślizgiwaniu się kaniuli z naczyń, a następnie włóż jeden centymetr nieogrzewanego końca każdej kaniuli do dwóch końców rurki drenażowej zbiornika odpływowego.

Następnie usuń kaniulę aorty i zlokalizuj lewą i prawą kość tętnic wieńcowych pod zimnym roztworem kardioplegicznym. Za pomocą spiczastych nożyczek ostrożnie oddziel korzeń aorty od otaczającej tkanki powyżej i poniżej kości wieńcowej, aby umożliwić nawlekanie jedwabnego szwu o zerowej grubości pod naczyniem wieńcowym. Następnie otwórz krany dwukierunkowe i włóż końcówki kaniuli do kości wieńcowej.

Gdy końcówki kaniuli wystają od jednego do dwóch centymetrów w głąb kości i poza miejsce założenia szwu, zawiąż kaniulę. Następnie opłucz serce, delikatnie masując komory przez 15 minut, aż serce zostanie oczyszczone z krwi. Po spłukaniu zamknij krany dwukierunkowe, odłącz je od kranu trójdrożnego i przenieś serce do litrowego plastikowego pojemnika odpornego na chemikalia zawierającego 500 mililitrów roztworu PBS/EDTA.

Recyrkulacja roztworu PBS/EDTA w rurkach termoplastycznych pod wyciągiem za pomocą pompy perystaltycznej z dwoma kanałami. Zalać rurkę pompy, aż w rurce nie będzie pęcherzyków powietrza. Następnie przejrzyj każdą kaniulę tętnicy wieńcowej przez recyrkulację w temperaturze pokojowej przez dwie godziny z prędkością 80 mililitrów na minutę.

Po upewnieniu się, że wyciąg jest sprawny, zatrzymaj pompę, spuść roztwór ze zbiornika i zastąp go 10% formaliną do utrwalenia na godzinę w ilości 80 mililitrów na minutę. Przeglądaj serce, stosując serię zwiększających się stężeń etanolu, zaczynając od 20% etanolu przez co najmniej trzy godziny. Następnie zastąp 20% etanol 30% etanolem i perfuj przez dwie godziny.

Kontynuować perfuzję, zwiększając stężenie etanolu w każdej iteracji, z minimalną perfuzją wynoszącą jedną godzinę przy każdym stężeniu. Aby wzmocnić tkankę serca przed suszeniem powietrzem, recyrkuluj równą mieszankę etanolu i HMDS przez 10 minut, a następnie 100% HMDS przez kolejne dwie godziny. Zatrzymaj pompę perfuzyjną, a następnie odłącz kaniulę od rurki i zawieś serce na szwie aortalnym wewnątrz dygestorium.

Ostrożnie nasuń worek z zamkiem błyskawicznym na serce i zamknij uszczelkę worka na szwie, aby zmniejszyć narażenie serca na krążące powietrze. Pozwól sercu wyschnąć przez odparowanie przez tydzień. W przypadku dyfuzyjnych środków kontrastowych należy zdjąć worek.

Umyj serce w 100% etanolu przez 15 minut z mieszaniem przed zanurzeniem go w 100% etanolu uzupełnionym 1% PMA na 48 godzin pod próżnią, a następnie przykryj serce torbą z zamkiem błyskawicznym, jak pokazano wcześniej, i pozostaw do wyschnięcia. Zamontuj wysuszone powietrzem serce na odpowiednim uchwycie na próbkę. Aby zapobiec wszelkim ruchom podczas pomiarów rentgenowskich mikrotomografii komputerowej, użyj zacisku zakotwiczonego w uchwycie próbki i zabezpiecz serce za pomocą wysuszonej i sztywnej aorty.

Zamontuj uchwyt na próbkę w mikrotomografie komputerowym. Następnie otwórz oprogramowanie i zainicjuj system mikro tomografii rentgenowskiej. Następnie ustaw aluminiowy filtr rentgenowski na jeden milimetr.

Napięcie źródła promieniowania rentgenowskiego do 60 kilowoltów i prąd do 120 mikroamperów. Dodatkowo ustaw wymiary obrazu na 2, 016 na 1, 344 piksele, a rozmiar piksela na 20 mikrometrów. Zbadaj obrazy transmisji promieniowania rentgenowskiego wzdłuż długości podpory, aby określić ogólne pole obrazowania w dostępie podłużnym serca.

Do skanowania należy użyć kroku obrotu wynoszącego 0,18 stopnia, uśrednienia klatek wynoszącego pięć stopni i obrotu próbki o 180 stopni, usuwając zaznaczenie opcji akwizycji 360 stopni. Wybierz tryb skanowania offsetowego, aby zobrazować całą szerokość podpory próbki. Po zeskanowaniu należy skorzystać z oprogramowania do tomograficznej rekonstrukcji izotropowej objętości obrazu trójwymiarowego.

W końcowym oprogramowaniu zwiadowczym użyj korekcji artefaktów związanych z akwizycją, w tym efektów wzmocnienia wiązki o 10% i redukcji artefaktów pierścieniowych o osiem. Następnie, za pomocą oprogramowania Data Viewer, zwizualizuj zrekonstruowany stos danych. Cyfrowo zorientuj próbkę w granicach obrazu, aby wyrównać długą i krótką oś próbek z trzema zasadami: oś objętości obrazu.

Na koniec przytnij objętość obrazu we wszystkich trzech osiach, aby usunąć zewnętrzne warstwy tła obrazu i maksymalnie zmniejszyć całkowity rozmiar obrazu. Obrazowanie rentgenowskie wysuszonych powietrzem serc świń pokazuje główne anatomiczne punkty orientacyjne, w tym jamy komorowe i ścianę mięśniową. Tomograficzne rekonstrukcje trójwymiarowych objętości obrazu wykazały wyraźną separację między tkanką a tłem na granicach nasierdzia i wsierdzia.

Barwienie trichromem Masona wykazało zabarwienie kolagenem dodatnim w warstwach nabłonka i śródbłonka przynaczyniowo w tkance podnasierdziowej. Jasne oświetlenie pola wykazało ciemniejsze zabarwienie w strukturach kolagenowych po barwieniu PMA, co potwierdza preferencyjną akumulację PMA. Fluorescencyjne obrazy skrawków tkanki komorowej barwione PMA miały wywołaną PMA utratę fluorescencji w miejscach kolagenu.

Tam, gdzie próbka serca została wybarwiona środkiem kontrastowym za pomocą perfuzji przed suszeniem powietrzem, rekonstrukcja obrazu ujawniła bardzo niejednolite zabarwienie w obrębie przedziału mięśnia sercowego. Co więcej, tkanka o niskim kontraście wykazywała słabą separację od intensywności tła. Obrazowanie mikrotomografią komputerową części owczej cierpiącej na przewlekły zawał mięśnia sercowego ujawniło centralną, gęstą zmianę zwłóknieniową otoczoną luźną i niejednorodną strefą graniczną.

Pokazano tu największe natężenia sygnału zrekonstruowanych objętości obrazu na granicach tkanek i obszarach bliznowatych. Środki kontrastowe słabo zabarwiały zdrowy mięsień sercowy, ale kontrast mikrostrukturalny został zachowany. W strefie przygranicznej tkanka bliznowata była przeplatana ocalałym mięśniem sercowym.

Gęste zwłóknienie wyglądało na przezścienne, ale teksturowane, co wskazuje na różnice w składzie. Przezścienny obszar lewej komory preparatu tkanki barwionej PMA wykazał selektywne barwienie kolagenu i brak barwienia w obszarach mięśnia sercowego, które przeżyły. Zaleca się dłuższe czasy perfuzji przy użyciu etanolu, aby zapewnić całkowitą wymianę zawartości wody w sercu z etanolem.

Interakcje między HMDS a wodą wytwarzają ciepło, które może uszkodzić próbkę. Dużą zaletą tej procedury jest możliwość walidacji obrazowania mikro CT za pomocą histologii. Próbki suszone powietrzem mogą być bezpośrednio zanurzane w parafinie w celu cięcia, barwienia i obrazowania mikroskopowego.