Techniki przygotowania tkanek do obrazowania mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym modeli serca dużych ssaków z chorobami przewlekłymi
February 8th, 2022
Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania wysokiej rozdzielczości obrazów mikrotomografii komputerowej zdrowych i patologicznych całych serc dużych ssaków z selektywnym wzmocnieniem kontrastu.
Protokół ten zapewnia wgląd mikrostrukturalny w strukturalne choroby patologiczne w skali całego narządu za pomocą tomografii mikrokomputerowej. W tym protokole zaimplementowano specjalistyczną metodę przygotowania tkanek w celu optymalizacji obrazowania w wysokiej rozdzielczości próbek całego serca z translacyjnych modeli dużych ssaków u ludzi z selektywnym kontrastowym wzmocnieniem chorób strukturalnych. Mikrostruktura serca, taka jak rozmieszczenie zwłóknienia i organizacja pobudliwego mięśnia sercowego, leży u podstaw szerokiego spektrum chorób serca i tworzy scenę dla zagrażającej życiu arytmii.
Procedurę zademonstruje Nestor Pallares-Lupon, doktor habilitowany i doktorant w moim laboratorium. Na początek przygotuj roztwór kardioplegiczny zawierający heparynę sodową i przechowuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj PBS / EDTA, najpierw dodając EDTA do jednego litra wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów.
Następnie zwiększyć i utrzymać pH roztworu na poziomie 12 za pomocą wodorotlenku sodu w celu rozpuszczenia EDTA. Gdy EDTA całkowicie się rozpuści, obniż pH do 7,4 za pomocą kwasu solnego. Następnie dodaj jedną torebkę foliową PBS, aby uzyskać roztwór 0,01 molowy o pH 7,4.
Przygotowany roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Na koniec przygotuj 1% roztwór środka kontrastowego PMA etanolu, dodając 10 gramów PMA do jednego litra absolutnego etanolu. Przygotowany roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
Przygotuj jednolitrowy zbiornik wsparty 80 centymetrów nad naczyniem preparacyjnym i podłącz rurkę termoplastyczną do portu spustowego zbiornika. Przymocuj kran trójdrożny do rurki odpływowej i podłącz dalsze rurki termoplastyczne do każdego wolnego portu na kranie trójdrożnym. Przymocuj krany dwukierunkowe do wolnych końców rurki.
Następnie napełnij zbiornik roztworem kardioplegicznym uzupełnionym heparyną. Otwórz krany, aby roztwór kardioplegiczny spłynął, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Następnie zamknij krany dwukierunkowe.
Po pobraniu serca od zwierzęcia poddanego eutanazji umieść je w zimnym roztworze kardioplegicznym przechowywanym na lodzie, aż będzie gotowe do sekcji. Następnie przygotuj kaniulę dla lewej i prawej kości wieńcowej, przecinając pięć centymetrów rurki PTFE i podgrzewając jeden koniec, umieszczając końcówkę obok otwartego ognia. Gdy jeden milimetr końcówki zacznie się topić i stanie się półprzezroczysty, dociśnij końcówkę do twardej, odpornej na ciepło powierzchni, aby ukształtować grzbiet na końcówce kaniuli, aby zapobiec wyślizgiwaniu się kaniuli z naczyń, a następnie włóż jeden centymetr nieogrzewanego końca każdej kaniuli do dwóch końców rurki drenażowej zbiornika odpływowego.
Następnie usuń kaniulę aorty i zlokalizuj lewą i prawą kość tętnic wieńcowych pod zimnym roztworem kardioplegicznym. Za pomocą spiczastych nożyczek ostrożnie oddziel korzeń aorty od otaczającej tkanki powyżej i poniżej kości wieńcowej, aby umożliwić nawlekanie jedwabnego szwu o zerowej grubości pod naczyniem wieńcowym. Następnie otwórz krany dwukierunkowe i włóż końcówki kaniuli do kości wieńcowej.
Gdy końcówki kaniuli wystają od jednego do dwóch centymetrów w głąb kości i poza miejsce założenia szwu, zawiąż kaniulę. Następnie opłucz serce, delikatnie masując komory przez 15 minut, aż serce zostanie oczyszczone z krwi. Po spłukaniu zamknij krany dwukierunkowe, odłącz je od kranu trójdrożnego i przenieś serce do litrowego plastikowego pojemnika odpornego na chemikalia zawierającego 500 mililitrów roztworu PBS/EDTA.
Recyrkulacja roztworu PBS/EDTA w rurkach termoplastycznych pod wyciągiem za pomocą pompy perystaltycznej z dwoma kanałami. Zalać rurkę pompy, aż w rurce nie będzie pęcherzyków powietrza. Następnie przejrzyj każdą kaniulę tętnicy wieńcowej przez recyrkulację w temperaturze pokojowej przez dwie godziny z prędkością 80 mililitrów na minutę.
Po upewnieniu się, że wyciąg jest sprawny, zatrzymaj pompę, spuść roztwór ze zbiornika i zastąp go 10% formaliną do utrwalenia na godzinę w ilości 80 mililitrów na minutę. Przeglądaj serce, stosując serię zwiększających się stężeń etanolu, zaczynając od 20% etanolu przez co najmniej trzy godziny. Następnie zastąp 20% etanol 30% etanolem i perfuj przez dwie godziny.
Kontynuować perfuzję, zwiększając stężenie etanolu w każdej iteracji, z minimalną perfuzją wynoszącą jedną godzinę przy każdym stężeniu. Aby wzmocnić tkankę serca przed suszeniem powietrzem, recyrkuluj równą mieszankę etanolu i HMDS przez 10 minut, a następnie 100% HMDS przez kolejne dwie godziny. Zatrzymaj pompę perfuzyjną, a następnie odłącz kaniulę od rurki i zawieś serce na szwie aortalnym wewnątrz dygestorium.
Ostrożnie nasuń worek z zamkiem błyskawicznym na serce i zamknij uszczelkę worka na szwie, aby zmniejszyć narażenie serca na krążące powietrze. Pozwól sercu wyschnąć przez odparowanie przez tydzień. W przypadku dyfuzyjnych środków kontrastowych należy zdjąć worek.
Umyj serce w 100% etanolu przez 15 minut z mieszaniem przed zanurzeniem go w 100% etanolu uzupełnionym 1% PMA na 48 godzin pod próżnią, a następnie przykryj serce torbą z zamkiem błyskawicznym, jak pokazano wcześniej, i pozostaw do wyschnięcia. Zamontuj wysuszone powietrzem serce na odpowiednim uchwycie na próbkę. Aby zapobiec wszelkim ruchom podczas pomiarów rentgenowskich mikrotomografii komputerowej, użyj zacisku zakotwiczonego w uchwycie próbki i zabezpiecz serce za pomocą wysuszonej i sztywnej aorty.
Zamontuj uchwyt na próbkę w mikrotomografie komputerowym. Następnie otwórz oprogramowanie i zainicjuj system mikro tomografii rentgenowskiej. Następnie ustaw aluminiowy filtr rentgenowski na jeden milimetr.
Napięcie źródła promieniowania rentgenowskiego do 60 kilowoltów i prąd do 120 mikroamperów. Dodatkowo ustaw wymiary obrazu na 2, 016 na 1, 344 piksele, a rozmiar piksela na 20 mikrometrów. Zbadaj obrazy transmisji promieniowania rentgenowskiego wzdłuż długości podpory, aby określić ogólne pole obrazowania w dostępie podłużnym serca.
Do skanowania należy użyć kroku obrotu wynoszącego 0,18 stopnia, uśrednienia klatek wynoszącego pięć stopni i obrotu próbki o 180 stopni, usuwając zaznaczenie opcji akwizycji 360 stopni. Wybierz tryb skanowania offsetowego, aby zobrazować całą szerokość podpory próbki. Po zeskanowaniu należy skorzystać z oprogramowania do tomograficznej rekonstrukcji izotropowej objętości obrazu trójwymiarowego.
W końcowym oprogramowaniu zwiadowczym użyj korekcji artefaktów związanych z akwizycją, w tym efektów wzmocnienia wiązki o 10% i redukcji artefaktów pierścieniowych o osiem. Następnie, za pomocą oprogramowania Data Viewer, zwizualizuj zrekonstruowany stos danych. Cyfrowo zorientuj próbkę w granicach obrazu, aby wyrównać długą i krótką oś próbek z trzema zasadami: oś objętości obrazu.
Na koniec przytnij objętość obrazu we wszystkich trzech osiach, aby usunąć zewnętrzne warstwy tła obrazu i maksymalnie zmniejszyć całkowity rozmiar obrazu. Obrazowanie rentgenowskie wysuszonych powietrzem serc świń pokazuje główne anatomiczne punkty orientacyjne, w tym jamy komorowe i ścianę mięśniową. Tomograficzne rekonstrukcje trójwymiarowych objętości obrazu wykazały wyraźną separację między tkanką a tłem na granicach nasierdzia i wsierdzia.
Barwienie trichromem Masona wykazało zabarwienie kolagenem dodatnim w warstwach nabłonka i śródbłonka przynaczyniowo w tkance podnasierdziowej. Jasne oświetlenie pola wykazało ciemniejsze zabarwienie w strukturach kolagenowych po barwieniu PMA, co potwierdza preferencyjną akumulację PMA. Fluorescencyjne obrazy skrawków tkanki komorowej barwione PMA miały wywołaną PMA utratę fluorescencji w miejscach kolagenu.
Tam, gdzie próbka serca została wybarwiona środkiem kontrastowym za pomocą perfuzji przed suszeniem powietrzem, rekonstrukcja obrazu ujawniła bardzo niejednolite zabarwienie w obrębie przedziału mięśnia sercowego. Co więcej, tkanka o niskim kontraście wykazywała słabą separację od intensywności tła. Obrazowanie mikrotomografią komputerową części owczej cierpiącej na przewlekły zawał mięśnia sercowego ujawniło centralną, gęstą zmianę zwłóknieniową otoczoną luźną i niejednorodną strefą graniczną.
Pokazano tu największe natężenia sygnału zrekonstruowanych objętości obrazu na granicach tkanek i obszarach bliznowatych. Środki kontrastowe słabo zabarwiały zdrowy mięsień sercowy, ale kontrast mikrostrukturalny został zachowany. W strefie przygranicznej tkanka bliznowata była przeplatana ocalałym mięśniem sercowym.
Gęste zwłóknienie wyglądało na przezścienne, ale teksturowane, co wskazuje na różnice w składzie. Przezścienny obszar lewej komory preparatu tkanki barwionej PMA wykazał selektywne barwienie kolagenu i brak barwienia w obszarach mięśnia sercowego, które przeżyły. Zaleca się dłuższe czasy perfuzji przy użyciu etanolu, aby zapewnić całkowitą wymianę zawartości wody w sercu z etanolem.
Interakcje między HMDS a wodą wytwarzają ciepło, które może uszkodzić próbkę. Dużą zaletą tej procedury jest możliwość walidacji obrazowania mikro CT za pomocą histologii. Próbki suszone powietrzem mogą być bezpośrednio zanurzane w parafinie w celu cięcia, barwienia i obrazowania mikroskopowego.
Przegląd
Ten protokół zapewnia wysokiej rozdzielczości mikroskopowe obrazowanie tomografii komputerowej zdrowych i patologicznych dużych serc ssaków. Obejmuje selektywne kontrastowe wzmocnienie kolagenu w celu wizualizacji mikrostruktury serca i związanych z nią chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wizualizowanie serca
- Mikroskopowa tomografia komputerowa
- Analiza patologiczna
Tło
- Rozumienie mikrostruktury serca jest kluczowe dla diagnozowania chorób serca.
- Stany patologiczne mogą prowadzić do zagrażających życiu zaburzeń rytmu serca.
- Wysokiej rozdzielczości techniki obrazowania są niezbędne do szczegółowej analizy.
- Ten protokół wykorzystuje duże modele ssaków do badań translacyjnych.
Cel badania
- Optymalizacja technik obrazowania dla całych próbek serca.
- Poprawa wizualizacji chorób strukturalnych z użyciem środków kontrastowych.
- Dostarczenie wglądu w rozmieszczenie stwardnienia włóknistego w sercu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu kardioplegicznego i PBS/EDTA.
- Zastosowanie środka kontrastowego PMA dla ulepszonych obrazów.
- Skanowanie mikro CT z określonymi parametrami obrazowania.
- Sekwencyjna perfuzyjna alkoholem w celu zachowania tkanki.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja mikrostruktury serca w dużych sercach ssaków.
- Zadokumentowano skuteczność selektywnego kontrastowego wzmocnienia kolagenu.
- Dostarczono szczegółową wizualizację stwardnienia włóknistego i organizacji mięśnia sercowego.
Wnioski
- Protokół pozwala na wysokiej rozdzielczości obrazowanie tkanek serca.
- Poprawia zrozumienie zmian strukturalnych w chorobach serca.
- Ta metoda może pomóc w rozwijaniu strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution, non-destructive imaging of large mammalian hearts to visualize disease-related structural remodeling at microscale resolution. By selectively enhancing collagen-rich fibrotic tissue, it supports target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. The approach bridges preclinical imaging with histopathological confirmation, improving predictive confidence in disease model relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing fibrosis distribution and myocardial organization in disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, spatially resolved structural data to clarify pathophysiological pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target engagement with disease-modified tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized tissue conformation for reproducible downstream imaging workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization via air-dried, rigid heart samples suitable for longitudinal micro-CT monitoring.
- Scalability: Enables platform reuse across disease models (infarction, fibrillation) and species (pig, sheep) for comparative screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving endogenous collagen distribution for biomarker-aligned structural analysis.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery through preclinical validation via correlative histology compatibility.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling serial, non-destructive monitoring of structural disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, enabling iterative evaluation of structural disease modifiers in large mammalian models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping fibrosis-surviving myocardium interfaces in chronic disease models.
- Screening: Delivers assay readiness through ethanol fixation and HMDS reinforcement, ensuring dimensional stability for high-resolution imaging.
- Analytics: Generates quantitative 3D volumetric readouts of contrast agent deposition, enabling objective comparison of fibrotic burden across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via direct correlation with histological staining (e.g., Mason’s trichrome) of the same air-dried samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for longitudinal studies across multiple cardiac disease models and compound testing cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in structure-function relationships underlying arrhythmogenic substrates.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through fixed tissue preparation and invariant imaging parameters (20.7 µm isotropic resolution).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translatable structural biomarkers of disease severity and regression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through objective, imaging-based fibrosis quantification in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, perfusion techniques, and contrast agent handling.
- Depends on access to micro-CT scanners capable of sub-25 µm resolution and vacuum-compatible contrast loading.
- Necessitates cross-team standardization between imaging, histology, and pathology teams for correlative analysis.
- Involves adaptation considerations for varying heart sizes and disease-induced tissue fragility across models.
- Limited by perfusion duration requirements for complete ethanol exchange and contrast agent diffusion in large tissues.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Solution Preparation
2:05
Tissue Preparation
5:21
Tissue Dehydration and Drying
6:57
MicroCT
9:20
Results: Contrast-Enhanced Air-Dried Tissue Preparations Enabled Microscale Imaging of Intact Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease
11:36
Conclusion
