Opracowanie mobilnego laboratorium fizjologii mitochondriów do pomiaru energetyki mitochondriów w terenie

Opracowanie mobilnego laboratorium mitochondrialnego pozwala fizjologom przenieść swoją pracę w teren, a w rezultacie mogą ocenić fascynującą różnorodność wyzwań energetycznych, jakie stawiają zwierzęta. Niewola jest stresująca dla wielu zwierząt, więc dzięki mobilnemu laboratorium możemy teraz zabrać laboratorium do zwierząt, zamiast sprowadzać je z powrotem do laboratorium. Dzięki możliwości izolowania i mierzenia oddychania mitochondrialnego w terenie, techniki, które były głównie wykorzystywane przez biomedycynę, mogą być teraz wykorzystywane w kontekście ekologicznym i ewolucyjnym.

Zacznij od zaparkowania mobilnego laboratorium na płaskim terenie, a następnie włącz generator i wypoziomuj pojazd. Wysuń suwak przed ustawieniem sprzętu. Przystąp do konfiguracji i kalibracji mitochondrialnych komór oddechowych do żądanej temperatury eksperymentów i aktualnego ciśnienia atmosferycznego zgodnie z instrukcjami producenta.

Użyj przeciętej pięciomililitrowej końcówki pipety, aby przenieść zmieloną tkankę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i homogenizować tkankę za pomocą ostrza o mocy 50% przez pięć sekund. Aby strawić tkankę, dodaj pięć miligramów proteazy na gram mokrego mięśnia przez siedem minut, mieszając roztwór co 30 sekund. Zakończyć reakcję, dodając równą objętość buforu izolacyjnego zawierającego BSA.

Następnie odwirować homogenat w stężeniu 500 G przez 10 minut, a następnie przenieść supernatant za pomocą przeciętej pięciomililitrowej końcówki pipety przez dwuwarstwową gazę do czystej 50-mililitrowej probówki wirówkowej, a następnie odwirować przefiltrowany supernatant przy 3,500 G przez 10 minut, aby wytrącić brązowy osad mitochondrialny. Po odrzuceniu supernatantu dodać taką samą objętość buforu izolacyjnego zawierającego BSA do probówki wirówkowej i ponownie zawiesić osad mitochondrialny za pomocą elastycznego skrobaka, delikatnie odsuwając osad mitochondrialny od ścianek probówki wirówkowej, a następnie odwirować probówkę o stężeniu 3,500 G przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w buforze izolacyjnym bez BSA, aby powtórzyć etap wirowania, jak opisano wcześniej.

Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić osad mitochondrialny w buforze do resuspensji za pomocą czystego, elastycznego skrobaka i przenieść zawieszone mitochondria do homogenizatora Dounce z naciętą końcówką pipety o pojemności jednego mililitra. Za pomocą homogenizatora ostrożnie homogenizuj zawiesinę mitochondrialną za pomocą czterech do pięciu przejść. Użyj świeżo pokrojonej końcówki pipety o pojemności jednego mililitra, aby przenieść homogenizowaną zawiesinę mitochondrialną w oznakowanej dwumililitrowej probówce do mikrowirówki.

W celu pomiarów oddychania mitochondrialnego substratów złożonych, dodaj 945 mikrolitrów buforu oddechowego do komory oddychania mitochondrialnego. Upewnij się, że mieszadło obraca się, gdy temperatura bufora jest utrzymywana na poziomie 37 stopni Celsjusza. Uszczelnij komorę górą, a następnie rozpocznij rejestrację zbierania danych.

Po ustabilizowaniu się stężenia tlenu dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny mitochondrialnej do komory i umieść pokrywkę. W oprogramowaniu oznaczają, że mitochondria zostały dodane do komory. Dodaj po 10 mikrolitrów po jednym glutaminianu molowym, 200 milimolowym jabłczanie i 200 milimolowym pirogronianie do komory z poszczególnymi strzykawkami i poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje, zanim wskażesz dodane substraty w oprogramowaniu.

Użyj oddzielnej strzykawki, aby dodać pięć mikrolitrów difosforanu adenozyny lub ADP do komory. Oznacz dodany ADP w oprogramowaniu i obserwuj szybkie zużycie tlenu w stanie trzecim. Po tym, jak oddychanie w stanie trzecim i zużycie tlenu w mitochondriach zwolni na cztery minuty, aby wskazać stan oddychania czwartego, zakończ nagrywanie i zapisz plik danych.

W przypadku złożonych dwóch substratów powtórz procedurę, dodając 963 mikrolitry buforu oddechowego do komory. Po dodaniu 20 mikrolitrów zawiesiny mitochondrialnej, kolejno dodaj dwa mikrolitry po cztery mikrogramy na mikrolitr rotenonu i 10 mikrolitrów 500 milimolowego bursztynianu do komory za pomocą oddzielnych strzykawek. Gdy sygnał się ustabilizuje, oznacz dodanie substratu w oprogramowaniu.

Po dodaniu pięciu mikrolitrów ADP obserwuj szybkie zużycie tlenu w stanie trzecim i wskaż dodanie ADP w oprogramowaniu. Po tym, jak oddychanie w stanie trzecim i zużycie tlenu w mitochondriach zwolni na cztery minuty, aby wskazać stan oddychania czwartego, zakończ nagrywanie i zapisz plik danych. Reprezentatywne wyniki wskazują na surowe dane dotyczące oddychania mitochondrialnego.

Strome nachylenie kroku trzeciego w złożonych substratach reprezentuje wysoką maksymalną szybkość oddychania. Pomyślne wyizolowanie mitochondriów od mięśni szkieletowych kończyn tylnych zaobserwowano dzięki ostremu zakrętowi i ustabilizowaniu się nowego nachylenia stanu czwartego. Podobny wzorzec można zaobserwować w przypadku złożonego oddychania mitochondrialnego sterowanego przez dwa.

Słabe funkcjonowanie mitochondriów spowodowało sprzężenie mitochondriów w złożonym oddychaniu mitochondrialnym napędzanym przez jeden. Jednak inny typowy przykład złego funkcjonowania mitochondriów pokazał niesprzężone oddychanie mitochondrialne kompleksu dwóch z płaską linią po dodaniu ADP i bez zwrotu w celu wytworzenia danych o stanie czwartym. Wartości liczbowe stanu trzeciego, stanu czwartego i współczynnika kontroli oddechowej (RCR) zarówno dla kompleksu pierwszego, jak i kompleksu drugiego zostały określone na podstawie danych z pomiarów oddychania Podczas pobierania dodatkowe tkanki mogą zostać błyskawicznie zamrożone w celu wykorzystania ich w przyszłości do pomiaru gęstości mitochondriów lub uszkodzeń oksydacyjnych.

Ponadto po zabiegu można również zamrozić izolowane mitochondria w celu pomiaru aktywności transportu elektronów i kompleksów łańcuchowych. Zdolność do izolowania i mierzenia oddychania mitochondrialnego w terenie utoruje drogę do lepszego zrozumienia roli mitochondriów w ewolucji złożonego życia.