Przygotowanie próbki i względna ocena ilościowa przy użyciu redukcyjnej metylacji amin do badań peptydomicznych

Tutaj opisujemy metodę instruktażową opartą na szybkiej inaktywacji termicznej proteazy w celu zachowania naturalnych peptydów wewnątrzkomórkowych, uniknięcia degradacji w komórkach i tkankach, a następnie względnej kwantyfikacji peptydów za pomocą znakowania izotopowego. Ta metoda etykietowania ma tak wiele zalet. Odczynniki są dostępne na rynku, niedrogie, stabilne chemicznie i umożliwiają analizę do pięciu próbek w jednej surowicy.

Zacznij od hodowli ludzkich komórek neuroblastoma w 15-centymetrowym naczyniu w DMEM zawierającym 15% FBS i 1% streptomycyny penicyliny. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla. Umyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj 10 mililitrów PBS, zeskrob komórki i zbierz je do 15-mililitrowej probówki.

Odwirować komórki w temperaturze 800 razy G przez pięć minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulkę w jednym mililitrze ultra oczyszczonej wody dejonizowanej w temperaturze 80 stopni Celsjusza, a następnie przenieść zawartość probówki do dwumililitrowej probówki do mikrofuge. Po inaktywacji cieplnej danio pręgowanego zbierz cały mózg do dwumililitrowej probówki z mikrofugą i zamroź go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy.

Ponownie zawiesić próbkę tkanki w jednym mililitrze ultra oczyszczonej wody dejonizowanej w temperaturze 80 stopni Celsjusza i poddać sonikę za pomocą sondy za pomocą 30 impulsów trwających jedną sekundę. Inkubować lizat komórkowy lub homogenację tkanki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut, a następnie schłodzić na lodzie przez 10 do 30 minut. Dodać 10 mikrolitrów jednego molowego roztworu podstawowego kwasu solnego na każdy mililitr objętości próbki.

Mieszaj przez wirowanie przez 20 sekund i inkubuj na lodzie przez 15 minut. Odwirować lizat komórkowy lub jednorodną tkankę w temperaturze 12 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Zebrać supernatant w probówkach do mikrowirówek o niskim stopniu wiązania białka i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Oczyść urządzenia ultrafiltracyjne wodą i odwiruj w temperaturze 2 300 razy G przez trzy minuty, a następnie wylej wodę z urządzenia do ultrafiltracji. Odpipetować supernatant do wstępnie umytego filtra odcinającego o mocy 10 kilodaltonów i odwirować w wirówce z chłodzeniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sprawdź pH próbki.

Zrównoważyć kolumnę jednym mililitrem 100% acetonitrylu, a następnie przemyć ją jednym mililitrem 5% acetonitrylu z 0,1% kwasem trifluorooctowym. Załadować całą objętość próbki do kolumny i przemyć kolumnę jednym mililitrem 5% acetonitrylu z 0,1% kwasem trifluorooctowym. Eluować peptydy z kolumny za pomocą 1,8 mililitra 1% acetonitrylu z 0,15% kwasem trifluorooctowym do mikroprobówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania białek.

Wysuszyć próbkę w całości w wirówce próżniowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza i monitorować czas koncentracji na wyświetlaczu. Przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić próbki peptydów w 100 do 200 mikrolitrach ultra oczyszczonej wody i odpipetować 2,5 mikrolitra standardowych stężeń peptydów i próbek na białą 96-dołkową płytkę.

Dodać 25 mikrolitrów 0,2-molowego buforu fosforanowego i 12,5 mikrolitrów fluoreskaminy. Homogenizować delikatnie przez jedną minutę na rotatorze orbitalnym. Następnie dodaj 110 mikrolitrów wody, aby zatrzymać reakcję.

Dostosuj ustawienia spektrofluorometru, a następnie odczytaj płytkę. Dodać 1/10 objętości jednego molowego bromku trimetyloamonu do każdej próbki peptydu z maksymalnie 25 mikrogramami peptydu. Upewnij się, że pH wynosi od pięciu do ośmiu, w razie potrzeby dostosowując je kwasem solnym lub wodorotlenkiem sodu.

Dodaj cztery mikrolitry niedeuterowanego, deuterowanego formaldehydu lub formaldehydu deuterowanego węgla-13. Mieszaj przez pięć sekund, wirując. Dodać cztery mikrolitry cyjanoborowodorku sodu lub deuterowanego cyjanoborowodorku sodu do próbki peptydu.

Następnie mieszaj próbkę przez pięć sekund przez wirowanie. Próbkę peptydu inkubować w dygestorium przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, wirując co 30 minut. Powtórz dodawanie formaldehydu niedeuterowanego, deuterowanego lub deuterowanego węglem-13 i cyjanoborowodorku sodu lub deuterowanego cyjanoborowodorku sodu, wirując po każdym dodaniu.

Próbki należy inkubować w dygestorium przez noc w temperaturze pokojowej. Dodaj 16 mikrolitrów wodorowęglanu amonu i wymieszaj przez wirowanie. Umieścić próbkę na lodzie.

Dodaj osiem mikrolitrów 5% kwasu mrówkowego i wiruj przez kolejne pięć sekund. Połączyć próbki peptydów, dostosować pH między dwoma a czterema, a następnie odsolić połączone próbki na kolumnach czyszczących z odwróconymi fazami przy użyciu acetonitrylu i kwasu trifluorooctowego, jak opisano wcześniej. Wysuszyć próbkę w całości w wirówce próżniowej w temperaturze 30 stopni Celsjusza, a następnie przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Znakowane peptydy obserwuje się za pomocą widm masowych. Czerwone strzałki wskazują na obecność par pików różnych peptydów znakowanych dwiema formami izotopowymi, L1 i L5, w celu porównania dwóch różnych próbek odpowiednio S1 i S2. Widmo masowe peptydu obecnego w trzech różnych próbkach, S1, S2 i S3, oznaczonych odpowiednio znacznikami L1, L3 i L5, pokazano tutaj.

Wykonano znakowanie poczwórne. Próbki kontrolne S1 i S3 znakowano odpowiednio L1 i L3 i porównano z dwiema próbkami eksperymentalnymi, S2 i S4 znakowanymi L2 i zaobserwowano L4.No istotną różnicę. Znakowanie izotopowe wykorzystano do pokazania substratów w produktach in vitro dla danej proteazy lub peptydazy.

Pokazano tutaj peptyd, który nie zmienia się w obecności enzymu neurolizyny. Peptydy, które znikają lub zmniejszają się w obecności enzymu, są substratami, podczas gdy te, które rosną, są uważane za produkty. Rysunek jest przykładem identyfikacji sekwencji peptydowej przez wyszukiwarkę baz danych oznaczonych trzema różnymi formami znaczników.

Zanim zostanie zdefiniowany, upewnij się, że próbka jest całkowicie chłodna, aby uniknąć zerwania wiązań peptydowych spowodowanych twardym zakwaszeniem. Ponadto niezbędne jest czyszczenie urządzeń ultrafiltracyjnych. Spektrometria mas jest doskonałą metodą do ilościowego oznaczania peptydów w różnych warunkach eksperymentalnych oraz do badań analitycznych poprzez identyfikację substratów peptydazy.