Pirosekwencjonowanie: prosta metoda dokładnego genotypowania

Badania genetyczne odniosły ogromne korzyści z uwolnienia sekwencji ludzkiego genomu. Sekwencjonowanie pirologiczne to unikalny system, który umożliwia analizę zmienności genetycznej, a także nierównowagi alleli RNA, DNA, stanu metylacji i liczby kopii genów. W tym filmie pokazujemy podstawową reakcję sekwencjonowania pirotechnicznego do analizy genetycznej.

Cześć, nazywam się Kristy King i pracuję w laboratorium dr Charlesa Eby'ego i dr Briana Gage'a na Wydziale Chorób Wewnętrznych w Washington University School of Medicine. Dzisiaj pokażemy Wam procedurę sekwencjonowania pirotechniki. Ta procedura jest przydatna, ponieważ jest to jedna z najdokładniejszych, a jednocześnie najprostszych metod stosowanych do analizy SNP.

Sekwencjonowanie pirologiczne opiera się na sekwencjonowaniu przez syntezę, wykorzystując uwalnianie pirofosforanu za każdym razem, gdy nukleotyd jest włączony do otwartej nici trzech pierwszych DNA. Po załadowaniu płytki nukleotydy są włączane w oparciu o sekwencję dostarczoną przez oprogramowanie Po uwolnieniu pirofosforan jest wykorzystywany w reakcji, która powoduje uwolnienie TP, który jest używany przez lucyferazy do konwersji Lucyfera w oksy Lucyfer, co powoduje emisję światła. Wpuszczone światło jest zbierane przez kamerę CCD i rejestrowane jako szczyty, znane również jako pyro.

Wszelkie nukleotydy, które nie są włączone do nici DNA, są degradowane przez AP pyra, aby zapobiec szumom tła. Ta procedura obejmuje następujące kroki. Projekt testu, elektroforeza żelowa PCR do kontroli jakości i sekwencjonowania pirotechnicznego.

Zacznijmy więc od sekwencjonowania pirotechniki. Aby przeprowadzić sekwencjonowanie pirologiczne, należy najpierw przygotować produkt PCR. PCR do sekwencjonowania pirologicznego wymaga więcej cykli niż większość PCR, aby zapewnić, że cała starter zostanie zużyta przez około 50 cykli.

Sekwencjonowanie pirologiczne wymaga również, aby jeden ze starterów PCR był biotynylowany. Na koniec należy zauważyć, że wymagany jest również wewnętrzny podkład. Wydajny projekt testu można przeprowadzić za pomocą oprogramowania dostarczonego za pomocą sekwencjonowania pirotechnicznego, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia.

Aby potwierdzić obecność produktu PCR, należy przeprowadzić żel na kilku próbkach, a także kontrolę negatywną. Aby przygotować płytkę do sekwencjonowania pirotechnicznego, dodaj 12 mikrolitrów mieszanki starterów do sekwencjonowania pirologicznego do 96-dołkowej płytki do sekwencjonowania pirotechniki. Wymaga to mieszaniny 43,2 mikrolitrów wewnętrznego startera wraz z 1396,8 mikrolitrami bufora klęczącego, aby pokryć płytkę sekwencjonowania pirologicznego folią samoprzylepną.

Jeśli konfiguracja ma zająć więcej niż 50 minut do każdego dołka 96-dołkowego produktu PCR, dodaj 70 mikrolitrów mieszanki SRO speed, która zawiera 240 mikrolitrów prędkości sero pokrytych streptawidyną. 4, 560 mikrolitrów buforu wiążącego, który jest wykonany z chlorku sodu triss, EDTA i tween 20 i 3, 600 mikrolitrów wody i bezpiecznie załóż pokrywkę. Umieścić 96-dołkową płytkę produktu PCR z mieszanką kulek w wytrząsarce do płytek na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że pokrywa jest zabezpieczona, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między studzienkami. Ten krok pozwoli na dokładne przyklęknięcie paciorkowcowych ENC, pokrytych kulek sferoszowych do znacznika biotyny, który znajduje się na starterze PCR. Skonfiguruj stację roboczą do przygotowania płyt.

Obejmuje to koryta z odczynnikami, tackę na produkt PCR i mieszankę kulek oraz tackę na starter do sekwencjonowania pirotechnicznego. Upewnij się, że produkt PCR i płytka do mieszania kulek, a także taca na starter do sekwencjonowania pirologicznego są prawidłowo wyrównane, tak aby negatywy były w tej samej orientacji. Przed przeniesieniem próbek potrząśnij narzędziem próżniowym, które jest wyłączane w czystej wodzie, aby uwolnić wszelkie koraliki lub zanieczyszczenia, które mogą się na nim znajdować.

Wylej pozostałą wodę, napełnij koryto i włącz odkurzacz. Pozostaw narzędzie próżniowe w korycie, aż cała woda zostanie usunięta, czyli około 30 sekund. Umieść końcówki filtra narzędzia próżniowego w dołkach płytki do mieszania kulek PCR i pozostaw ją, aż cały płyn zostanie usunięty z płytki.

Delikatne kołysanie może być stosowane w celu zapobiegania napięciu powierzchniowemu. Umieść próżnię w korycie z 70% etanolem, gdy ciecz zacznie przepływać przez rurkę. Pozwól, aby końcówki filtra zassały etanol przez pięć sekund.

Powtórzyć te czynności dla 0,2 molowego wodorotlenku sodu, który denaturuje DNA do jednoniciowego PCR i dla buforu myjącego. Do oczyszczania i neutralizacji produktu PCR. Odłączyć wąż podciśnieniowy od narzędzia próżniowego i umieścić narzędzie próżniowe na płytce do sekwencjonowania pirologicznego zawierającej starter do sekwencjonowania pirologicznego w klęczącej mieszance buforowej.

Jeśli wąż podciśnieniowy jest nadal podłączony, po umieszczeniu na płytce sekwencjonowania pirologicznego mieszanina startera zostanie zassana. Wskazówki powodujące utratę produktu PCR. Delikatnie potrząśnij lub rozkołysz końcówki próżni w dołkach płytki do sekwencjonowania pirologicznego, aby rozproszyć produkt PCR.

Wyjmij narzędzie próżniowe z płytki sekwencjonowania pirologicznego po zakończeniu potrząsania lub kołysania, a następnie ponownie podłącz narzędzie próżniowe do węża i umieść narzędzie w czystej wodzie, aby oczyścić je przed następną płytą. Umieść płytkę do sekwencjonowania pirotechniki na bloku grzewczym na dwie minuty w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po dwóch minutach wyjmij płytkę z bloku grzewczego i umieść na chłodnej powierzchni.

Po schłodzeniu i przykryciu płytki można użyć folii samoprzylepnej, chyba że płyta zostanie uruchomiona w ciągu 15 minut, aby zapobiec parowaniu. A teraz nadszedł czas, aby rozpocząć sekwencjonowanie pirotechniki. Pierwszym krokiem sekwencjonowania pirologicznego jest wprowadzenie szczegółów testu do komputera.

W obszarze wpisu jednostronnego wybierz nowy wpis i wprowadź informacje o teście, w tym nazwę identyfikatora i sekwencję do analizy, które są dostarczane przez oprogramowanie do projektowania testu i umożliwiają kontrolę jakości wyboru kolejności dozowania, która zapewnia sekwencję wokół SNP plus bazy kontrolne. Na koniec wybierz histogramy, aby uzyskać wizualizację tego, jak powinien wyglądać Twój pigram. Teraz nadszedł czas, aby wejść w bieg z wycinkami.

Na karcie wycinków i ogólnych wprowadź nazwę przebiegu i wybierz parametry instrumentu dla przebiegu. Na karcie ustawień wybierz wpis testu, a następnie kliknij i przeciągnij nad płytą. Aby wprowadzić wybrany test na płytkę, ważne jest, aby pamiętać, że nie trzeba używać całej płytki, w której można dezaktywować różne studzienki do analizy, a także można przeprowadzić wiele różnych testów na tej samej płytce.

Kliknij kartę widoku, a następnie wybierz opcję. Biegać. Na tej stronie znajduje się lista odpowiednich ilości nukleotydów, enzymów i substratów potrzebnych do uruchomienia. Przed użyciem wyczyść zarówno końcówki nukleotydu lub kapilary, jak i odczynników.

Napełnij końcówki wodą i dociśnij górną część końcówki, aby sprawdzić, czy końcówka nie jest zablokowana. Jeśli woda nie tryska z dna końcówki, opróżnij ją i napełnij kilka razy, aby spróbować przepchnąć wodę. Możesz też poddać końcówki sonifikacji, jeśli końcówka pozostaje zablokowana.

Odrzuć i zdobądź nowe wskazówki. Enzym i substrat należy ponownie zawiesić w wodzie przed użyciem. Jeśli potrząsane pęcherzyki powietrza mogą spowodować zablokowanie końcówki lub niespójne dozowanie, niewykorzystany ponownie zawieszony enzym i substrat można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Do wykorzystania w przyszłości do końcówek dozujących kapilary w mikroprobówce fuge, należy rozcieńczyć jeden do jednego nukleotydami i buforem P osiem. Dobrze wymieszaj przed użyciem. Napełnij końcówki nukleotydów i odczynników odpowiednimi objętościami zgodnie z ilościami sugerowanymi przez oprogramowanie.

Delikatnie dozuj płyn po bokach końcówek, aby zapobiec pipetowaniu pęcherzyków powietrza i powodowaniu zatorów. Pamiętaj, aby sprawdzić, czy w końcówkach dozujących nukleotydy nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, po prostu postukaj w boki końcówek, aż pęcherzyki powietrza wypłyną na powierzchnię lub usuń je czystą końcówką do pipety.

Po napełnieniu wkładu uruchom płytkę testową. Umieść nabój w przyrządzie do sekwencjonowania pirotechnicznego, a płytkę testową na platformie z 96 dołkami. Umieszczenie folii samoprzylepnej na płytce pozwala na łatwe dozowanie odczynnika i nukleotydów.

Wybierz kartę instrumentu po lewej stronie ekranu, a następnie kliknij przycisk zarządzaj. Wybierz instrument z menu rozwijanego. Kliknij test, a pojawi się ostrzeżenie.

Prośba o sprawdzenie, czy płytka testowa została umieszczona w instrumencie. Kliknij w porządku. Po zakończeniu wyjmij płytkę testową, a na środku płytki powinny znajdować się płynne kropki nad sześcioma dołkami reprezentującymi cztery nukleotydy, enzym i substrat.

Jeśli jest mniej niż sześć małych kropek, wystąpiła blokada i końcówki należy sprawdzić i usunąć wszelkie blokady. Umieść płytkę na platformie 96-dołkowej do sekwencjonowania pirotechnicznego. Zamknij wszystkie dźwignie i kliknij bieg na pojedynczej płycie.

Uruchom konfigurację substratu enzymatycznego, a nukleotydy będą dozowane w ustalonej kolejności. Po przeanalizowaniu przebiegu przez sekwencer pirotechniczny, nadszedł czas na jego zbadanie. Niebieskie studnie reprezentują przechodzący genotyp i pirotechnikę.

Pomarańczowe studnie wymagają interwencji człowieka i mogą być edytowane, klikając na interesującą nas studnię i otwierając przewidywany histogram. Genotyp może zostać zaliczony, niezaliczony lub sprawdzony, a sam genotyp może zostać odpowiednio zmieniony. Po edycji studni na mapie płytowej pojawi się ciemne kółko.

Kontrole ujemne powinny być oceniane jako negatywne. W dołkach ujemnych mogą występować niespecyficzne szczyty, jednak zwykle jest to spowodowane zapętleniem wewnętrznego startera. Właśnie pokazaliśmy, jak sekwencjonować polimorfizm w ludzkim genomie.

Sekwencjonowanie DNA Pyro jest przydatne w porównaniu z innymi procedurami sekwencjonowania, ponieważ można je dostosować do szerokiego zakresu zastosowań. Jest również wystarczająco wytrzymały, aby poradzić sobie z DNA z dowolnego źródła, w tym z DNA o niskim stężeniu i zdegradowanym. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, aby zacząć od dobrego, czystego produktu PCR.

Uwzględnij kontrolę ujemną dla każdego testu i upewnij się, że wszystkie odczynniki są dobre. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.