Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych

Technika peel-blot pozwala na rozdzielenie wielowarstwowych i skoncentrowanych biologicznych próbek krio-EM na pojedyncze warstwy w celu zmniejszenia grubości, zwiększenia koncentracji i ułatwienia przetwarzania obrazu. Stężenia próbek można zwiększyć przed przygotowaniem siatki, a obieranie plamy można dostosować, aby uzyskać gęsty rozkład próbek jednowarstwowych w celu bardzo wydajnego gromadzenia danych. Na początek ułóż dwa kawałki bibuły filtracyjnej o porach o wielkości 20-25 mikrometrów i umieść obok niej długą folię parafinową papierem skierowanym do góry.

Umieść kawałek submikronowej bibuły filtracyjnej na dwóch dodatkowych kawałkach bibuły filtracyjnej. Ustaw kleszczyki antykapilarne ze zgiętą nogą skierowaną do góry, a prostą nogą skierowaną w dół i wybierz siatkę o siatce 600 gładką lub błyszczącą stroną do góry. Umieść kleszcze na szalce Petriego lub innej podniesionej powierzchni, aby uniknąć kontaktu czystej siatki z innymi przedmiotami.

Usuń papier z folii parafinowej i pociągnij boki, aby utworzyć małą obwódkę. Odpipetuj dwie krople o pojemności 150 mikrolitrów, czyli 4% roztwór trehalozy w odległości około jednego do dwóch centymetrów od jednego krótszego boku folii parafinowej. Dwie krople powinny być oddalone od siebie o około jeden centymetr.

Następnie na osobnej ławce lub na podłodze wlej ciekły azot do małego pojemnika z pianki polistyrenowej i umieść mały pojemnik z siatką krio-EM w ciekłym azocie. Przykryj pojemnik z pianki polistyrenowej niestrzępiącymi się chusteczkami. Aby usunąć film węglowy z miki, użyj kleszczy Dumont 5 i dotknij jednej strony miki pod niewielkim kątem w dół na jednej z kropli roztworu trehalozy.

Przesuń mikę w dół, aby napięcie wody powoli ustąpiło z filmu węglowego. Uwolnij mikę, gdy film węglowy unosi się na powierzchni kropli. Sprawdź wzrokowo film węglowy, aby uniknąć użycia węgla z uszkodzeniami w postaci pęknięć.

Włóż siatkę przytrzymywaną przez kleszcze antykapilarne pod kątem 20-30 stopni do kropli trehalozy w pozycji sąsiedniej, a następnie wyśrodkuj siatkę pod folią węglową. Podnieś folię węglową, utrzymuj siatkę w tej samej orientacji i powoli opuść siatkę na powierzchnię drugiej kropli trehalozy, nie naruszając napięcia powierzchniowego kropli. Usunie to niepotrzebną folię węglową, która mogła owinąć się wokół krawędzi siatki po szorstkiej stronie.

Obróć kleszczyki antykapilarne i umieść je na szalce Petriego stroną siatki z węglem skierowaną w dół. Pobrać pipetą 1,3 mikrolitra próbki do lekkiego menisku trehalozy na górze siatki. Następnie odpipetować roztwór około 8-10 razy, aby wymieszać i rozprowadzić trehalozę i próbkę po obu stronach siatki.

Odpipetować jedną lub więcej kropli roztworu trehalozy o pojemności 1,7 mikrolitra na folię parafinową, inkubując próbkę roztworu trehalozy na siatce przez jedną minutę. Obróć siatkę z powrotem do pierwotnej pozycji z folią węglową skierowaną do góry i dociśnij siatkę do submikronowej bibuły filtracyjnej za pomocą kleszczyków antykapilarnych. Gdy roztwór zostanie wchłonięty przez bibułę filtracyjną, a film węglowy leży płasko, odczekaj trzy sekundy przed podniesieniem siatki i przesunięciem jej pionowo na 1,7 mikrolitra kropli roztworu trehalozy.

Kroki te można powtarzać od jednej do trzech powtórzeń lub więcej, w zależności od próbki. Osusz siatkę na dwóch kawałkach bibuły filtracyjnej, a następnie wyjmij siatkę z bibuły filtracyjnej. Po około 13 sekundach, w zależności od wilgotności i bufora próbki, zanurz siatkę w ciekłym azocie w małym styropianowym pojemniku i umieść ją w pojemniku z siatką cryo-EM lub przenieś bezpośrednio w celu przesiewania krio-EM lub zbierania danych.

Pokazano tutaj krystaliczną próbkę 2D ludzkiej syntazy leukotrienu C4 poddanej metodzie peel-blot. Obszar na lewo od strzałki został w dużej mierze zredukowany do jednowarstwowych kryształów 2D w obszarze kontaktu między folią węglową a prętem siatki, który został osuszony, a następnie przesunięty. Obszar po prawej stronie strzałki nie został dotknięty kleksem.

Dolna połowa obrazu przedstawia obszary z dużymi, w większości jednowarstwowymi dwuwarstwami fosfolipidowymi powstałymi w wyniku zastosowania peel-blot. Górna połowa nie znajdowała się w strefie kontaktu między prętem siatki a folią węglową, a zatem zawierała kompletne liposomy z dwiema dwuwarstwami fosfolipidowymi. Kwadrat siatki siatki 400 pokazuje ślad paska siatki i wynikowe obszary z plamami odklejanymi, a także obszary, które nie stykały się z paskiem siatki lub były poddawane mniejszej liczbie iteracji odklejania.

Obrazy te pokazywały plamienie siatki EM przygotowanej przez wtrysk wsteczny na submikronową bibułę filtracyjną przy użyciu bardzo cienkiej folii węglowej. Obrazy są pojedynczymi klatkami przy pierwszym kontakcie z membraną, 1 000 milisekund po kontakcie i 2 000 milisekund po kontakcie. Strzałka wskazuje kwadraty siatki, w których ciśnienie kapilarne rozerwało film węglowy.

Unikanie pęknięć w folii węglowej i łączenie submikronowej bibuły filtracyjnej z kroplą trehalozy o pojemności 1,7 mikrolitra w celu zassania, a następnie oddzielenia warstw to kluczowe kroki. Próbki z oklebinami są wykorzystywane do zbierania danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości, a następnie do przetwarzania obrazu w celu określenia struktury. Peel-blot pozwala na strukturalne oznaczanie jednowarstwowych kryształów białka 2D, które wcześniej były zbyt grube dla cryo-EM.

Ponadto może koncentrować różne próbki w pojedynczych warstwach na folii węglowej.