Name: Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj technikę peel-blot do przygotowania próbek cryo-EM, która oddziela wielowarstwowe próbki biologiczne na pojedyncze warstwy. Metoda zwiększa koncentrację próbki i ułatwia przetwarzanie obrazów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część tej pracy była wspierana przez HL090630 grantowy (ISK).

1. Etapy przygotowania do techniki peel-blot
UWAGA: Przygotowanie wymaga, aby następujące elementy były umieszczone obok siebie.
<ol>
	<li>Ułóż dwa kawałki bibuły filtracyjnej o porach 20-25 μm (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść folię parafinową o długości ~8 cm x 10 cm obok bibuły filtracyjnej papierem do góry.</li>
	<li>Umieść kawałek submikronowej bibuły filtracyjnej na dwóch dodatkowych kawałkach bibuły filtracyjnej #4 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-1).</li>
	<li>Ustaw kleszczyki antykapilarne ze zgiętą nogą skierowaną do góry i wyprostowaną nogą skierowaną w dół. Następnie wybierz siatkę o oczkach 600 gładką/błyszczącą stroną do góry. Umieść kleszcze na szalce Petriego lub innej podniesionej powierzchni, aby uniknąć kontaktu czystej siatki z innymi przedmiotami.</li>
	<li>Usuń papier z folii parafinowej i pociągnij boki (~5 mm), aby utworzyć małą obręcz. Odpipetować dwie krople o pojemności 150 μl 4% roztworu trehalozy ~1-2 cm od jednej krótszej strony folii parafinowej i ~1 cm od siebie na folii parafinowej.</li>
	<li>Na osobnej ławce lub na podłodze wlej ciekły azot do małego pojemnika z pianki polistyrenowej (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Odbyć szkolenie w zakresie prawidłowego obchodzenia się z rękawicami i osłoną twarzy, aby uniknąć odmrożeń.</li>
	<li>Umieść mały pojemnik z siatką cryo-EM w ciekłym azocie i przykryj pojemnik z pianki polistyrenowej niestrzępiącymi się chusteczkami.</li>
</ol>
2. Umieszczanie folii węglowej na siatce
<ol>
	<li>Użyj kleszczyków Dumont #5 (patrz Tabela materiałów), aby unosić film węglowy z miki, dotykając jednej strony miki pod niewielkim kątem w dół (~20°-40°) jednej z kropli roztworu trehalozy i powoli pozwól, aby napięcie wody podniosło się z filmu węglowego, przesuwając mikę w dół. Uwolnij mikę, gdy film węglowy unosi się na powierzchni kropli.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo film węglowy, aby uniknąć użycia węgla z uszkodzeniami w postaci pęknięć.</li>
	<li>Włóż siatkę przytrzymywaną przez kleszcze antykapilarne pod kątem (~20°-30°) do kropli trehalozy w pozycji obok, a następnie wyśrodkowanej pod folią węglową. Podnieś folię węglową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-2).</li>
	<li>Utrzymuj siatkę w tej samej orientacji i powoli opuść ją na powierzchnię drugiej kropli trehalozy, nie przerywając napięcia powierzchniowego kropli, aby usunąć niepotrzebną warstwę węglową, która mogła owinąć się wokół krawędzi siatki na szorstką stronę.</li>
</ol>
3. Rozdzielanie wielowarstwowych kryształów 2D na pojedyncze warstwy
<ol>
	<li>Obróć kleszczyki antykapilarne (patrz Tabela Materiałów) i umieść je na szalce Petriego stroną siatki z węglem skierowaną w dół (<silna klasa="xfig">Rysunek 1-3).</li>
	<li>Pobrać pipetą 1,3 μl próbki do niewielkiej menisku trehalozy znajdującej się na górze siatki. Odpipetować roztwór ~8-10 razy, aby wymieszać i rozprowadzić trehalozę i próbkę po obu stronach siatki.</li>
	<li>Podczas inkubacji roztworu przez 1 minutę odpipetować jedną lub więcej kropli 1,7 μl roztworu trehalozy na folię parafinową.</li>
	<li>Obróć siatkę z powrotem do pierwotnej pozycji, z folią węglową skierowaną do góry.</li>
	<li>Użyj kleszczyków antykapilarnych, aby docisnąć siatkę do submikronowej bibuły filtracyjnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1-4). Gdy roztwór zostanie wchłonięty przez bibułę filtracyjną, a film węglowy leży płasko, odczekaj 3 sekundy przed podniesieniem siatki i przesunięciem jej pionowo na kroplę 1,7 μl roztworu trehalozy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1-5). 
	UWAGA: Powtórz ten krok wiele razy w przypadku mocno ułożonych próbek lub siatka jest przygotowana do witryfikacji w następnych krokach.</li>
	<li>Osusz siatkę na dwóch kawałkach bibuły filtracyjnej, a następnie wyjmij siatkę z bibuły filtracyjnej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1-6). Po około 13 sekundach, w zależności od wilgotności i bufora próbki, zanurz siatkę w ciekłym azocie w małym pojemniku styropianowym i umieść siatkę w pojemniku z siatką cryo-EM lub przenieś ją bezpośrednio w celu przesiewania krio-EM lub zbierania danych. 
	UWAGA: Aby szybko zoptymalizować protokół, na tym etapie należy negatywnie zabarwić siatkę z oklepioną skórką, zamiast zanurzać ją w ciekłym azocie. Ujemnie zabarwić próbkę, nakładając 3 μl 1% octanu uranylu na siatkę, inkubować siatkę przez 30 s i osuszyć ją podartym kawałkiem bibuły filtracyjnej o wielkości porów 20-25 μm. Siatki kryształów 2D zeszklonych trehalozą, taniną lub glukozą są rutynowo ręcznie zanurzane w celu zeszklenia, ponieważ trehaloza, tanina i glukoza zapobiegają tworzeniu się krystalicznego lodu z szybkością używaną do ręcznego zanurzania2.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Peel-blot to potężna metoda radzenia sobie z układaniem się w stosy i grubością wielowarstwowych kryształów 2D i podobnych próbek do zbierania danych krio-EM i przetwarzania obrazów. Decyzja o zastosowaniu peel-blot będzie oparta na parametrach biologicznych próbki i będzie również wymagała oceny, gdy dostępny będzie model 3D cryo-EM. W tej ocenie szczególnie ważne będzie biologiczne znaczenie kontaktów i potencjalna elastyczność regionów kontaktowych.
Liczba kleksów zostanie początkowo ustalo...

Technika peel-blot została opracowana w celu rozdzielenia dwuwymiarowych kryształów białek błonowych na pojedyncze warstwy, aby uzyskać odpowiednio cienkie próbki do zbierania danych krio-EM 2D i 3D oraz ułatwić przetwarzanie obrazów1. Protokół jest również odpowiedni dla innych typów próbek wielopłytkowych, jak również dla osiągania wysokich stężeń każdego rodzaju próbki na siatce bez zwiększania grubości w Z.
Redukcja warstw próbki do jednej warstwy jest osiągana poprzez zastosowanie kombinacji nacisku kapilarnego i sił ścinających w protokole, który znacznie rozszerza i modyfikuje metodę wtrysku wstecznego2. Pierwszy etap blottingu skutkuje ścisłym warstwowaniem i przyleganiem do folii węglowej oraz pręta siatki po obu stronach wielowarstwowej próbki podczas blottingu na submikronie, a nie o wielkości porów bibuły filtracyjnej 20-25 μm w metodzie wtrysku wstecznego. Oddzielenie lub złuszczanie się pojedynczej warstwy następuje po wymuszeniu rozdzielenia warstw warstwowych, gdy siatka jest dociskana pionowo do kropli trehalozy, wypychając warstwę węglową z dala od pręta siatki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zmiana położenia folii węglowej z dala od pierwotnego punktu styku z prętem siatkowym następuje w następnym kroku, gdy siatka jest ponownie osuszana na submikronowej bibule filtracyjnej. Liczba iteracji tych kroków może być zoptymalizowana dla określonych próbek. Ponadto protokół może być stosowany do zwiększania stężeń próbek przy jednoczesnym unikaniu agregacji w Z. Ze względu na zależność od przylegania do pręta siatkowego i folii węglowej, a także wymuszonej separacji, podejście to może nie być odpowiednie dla bardzo delikatnych cząsteczek, takich jak niektóre delikatne i/lub niestabilne białka i kompleksy białkowe.
Technika peel-blot nie wymaga ani specjalistycznego sprzętu, ani drogich materiałów. Możliwość zastosowania do konkretnych próbek będzie jednak wymagała starannego rozważenia parametrów biologicznych. Decyzja jest łatwiejsza w przypadku kryształów 2D, ponieważ do zapewnienia płaskości wymagana jest warstwa węglowa, jednak manipulacja za pomocą techniki peel-blot może wpłynąć na integralność biologiczną próbki lub porządek krystaliczny. Przydatność techniki peel-blot do pojedynczych cząstek jest ograniczona i może być testowana dla tych, które wymagają filmu węglowego i są odporne na manipulację. Próbki z krytycznymi interakcjami biologicznymi między warstwami mogą nie nadawać się do scharakteryzowania za pomocą techniki peel-blot ze względu na zakłócenie takich interakcji.
Technika peel-blot ("peel-blot") jest najszybciej optymalizowana przez testowanie i przesiewanie z negatywnym zabarwieniem lub niebarwionymi próbkami za pomocą TEM w temperaturze pokojowej. Po zidentyfikowaniu optymalnej liczby iteracji peel-blot można określić czas kontroli grubości przed zeszkleniem.

<table><tbody><tr><td>Siatki 600</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki antykapilarne</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel do powlekania miki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM Siatki Cryo-EM</td><td></td><td></td><td>mogą być ekranowane przy napięciu 120 kV lub 200 kV. Dane o wysokiej rozdzielczości zbierane są przy napięciu 300 kV.</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumpont #5</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka siatkowa do przechowywania krio-EM</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mika</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>Mika jest pokryta węglem i pocięta na kwadraty, które są nieco większe niż siatka TEM.&nbsp; Grubość węgla może wymagać optymalizacji, aby uniknąć cienkiego węgla, który łatwo pęka przy wielu plamach skórki.</td></tr><tr><td>Ujemne barwienie</td><td></td><td></td><td>1-2% octan uranylu nadaje się do wielu próbek.&nbsp; Inne plamy, takie jak kwas fosfowolframowy, można zastąpić.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik</td><td></td><td></td> z polistyrenu <td>Służy do zeszklenia siatki peel-blot. Polistyrenowy kontener transportowy można w tym celu poddać recyklingowi i wyłożyć folią aluminiową.</td></tr><tr><td>Submikronowa bibuła filtracyjna</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>Każdy TEM działający przy napięciu przyspieszającym 80-120 kV będzie odpowiedni do przesiewania ujemnie zabarwionych siatek.</td></tr><tr><td>Trehaloza</td><td></td><td></td><td>Przygotuj 4% roztwór trehalozy.</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman #4</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>Odpowiada to 20-25 &mu; bibuła filtracyjna o wielkości porów w protokole.</td></tr></tbody></table>

technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-em w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Technika przygotowania siatki kriogenicznej typu peel-blot jest znacząco zmodyfikowaną metodą wtrysku wstecznego, której celem jest uzyskanie redukcji warstw wielowarstwowych próbek. Usunięcie warstw przed zamrożeniem wgłębnym może pomóc w zmniejszeniu grubości próbki do poziomu odpowiedniego do zbierania danych krioelektromagnetycznych, poprawie płaskości próbki i ułatwieniu przetwarzania obrazu. Technika peel-blot pozwala na rozdzielenie błon wielopłytkowych na pojedyncze warstwy, warstwowych kryształów 2D na pojedyncze kryształy oraz ułożonych, przypominających arkusze struktur rozpuszczalnych białek, które również są rozdzielane na pojedyncze warstwy. Duża grubość tego typu próbek często stwarza problemy nie do pokonania w gromadzeniu danych krio-EM i przetwarzaniu obrazów krio-EM, zwłaszcza gdy stolik mikroskopu musi być przechylony w celu zbierania danych. Co więcej, siatki o wysokich stężeniach każdej z tych próbek mogą być przygotowane do efektywnego gromadzenia danych, ponieważ stężenie próbki przed przygotowaniem siatki można zwiększyć, a technikę peel-blot dostosować tak, aby uzyskać gęsty rozkład próbki jednowarstwowej.

Pomyślnie przeprowadzony eksperyment typu peel-blot pozwoli na uzyskanie pojedynczych warstw próbek, często o wysokich stężeniach. Należy spodziewać się, że w niektórych obszarach większości pól siatki nadal będą występować warstwy wielokrotne, szczególnie przy mniejszej liczbie powtórzeń etapów peel-blot. Większość pól siatki będzie jednak zawierać rozległe obszary z pojedynczymi warstwami, co zaobserwowano w przypadku kryształów 2D ludzkiej syntazy leukotrienu C4 (Rycina 2) oraz...

Technika peel-blot to metoda przygotowania siatki cryo-EM, która pozwala na rozdzielanie wielowarstwowych i skoncentrowanych próbek biologicznych na pojedyncze warstwy w celu zmniejszenia grubości, zwiększenia koncentracji próbki i ułatwienia przetwarzania obrazu.

Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Technika peel-blot pozwala na rozdzielenie wielowarstwowych i skoncentrowanych biologicznych próbek krio-EM na pojedyncze warstwy w celu zmniejszenia grubości, zwiększenia koncentracji i ułatwienia przetwarzania obrazu. Stężenia próbek można zwiększyć przed przygotowaniem siatki, a obieranie plamy można dostosować, aby uzyskać gęsty rozkład próbek jednowarstwowych w celu bardzo wydajnego gromadzenia danych. Na początek ułóż dwa kawałki bibuły filtracyjnej o porach o wielkości 20-25 mikrometrów i umieść obok niej długą folię parafinową papierem skierowanym do góry.Umieść kawałek submikronowej bibuły filtracyjnej na dwóch dodatkowych kawałkach bibuły filtracyjnej. Ustaw kleszczyki antykapilarne ze zgiętą nogą skierowaną do góry, a prostą nogą skierowaną w dół i wybierz siatkę o siatce 600 gładką lub błyszczącą stroną do góry. Umieść kleszcze na szalce Petriego lub innej podniesionej powierzchni, aby uniknąć kontaktu czystej siatki z innymi przedmiotami.Usuń papier z folii parafinowej i pociągnij boki, aby utworzyć małą obwódkę. Odpipetuj dwie krople o pojemności 150 mikrolitrów, czyli 4% roztwór trehalozy w odległości około jednego do dwóch centymetrów od jednego krótszego boku folii parafinowej. Dwie krople powinny być oddalone od siebie o około jeden centymetr.Następnie na osobnej ławce lub na podłodze wlej ciekły azot do małego pojemnika z pianki polistyrenowej i umieść mały pojemnik z siatką krio-EM w ciekłym azocie. Przykryj pojemnik z pianki polistyrenowej niestrzępiącymi się chusteczkami. Aby usunąć film węglowy z miki, użyj kleszczy Dumont 5 i dotknij jednej strony miki pod niewielkim kątem w dół na jednej z kropli roztworu trehalozy.Przesuń mikę w dół, aby napięcie wody powoli ustąpiło z filmu węglowego. Uwolnij mikę, gdy film węglowy unosi się na powierzchni kropli. Sprawdź wzrokowo film węglowy, aby uniknąć użycia węgla z uszkodzeniami w postaci pęknięć.Włóż siatkę przytrzymywaną przez kleszcze antykapilarne pod kątem 20-30 stopni do kropli trehalozy w pozycji sąsiedniej, a następnie wyśrodkuj siatkę pod folią węglową. Podnieś folię węglową, utrzymuj siatkę w tej samej orientacji i powoli opuść siatkę na powierzchnię drugiej kropli trehalozy, nie naruszając napięcia powierzchniowego kropli. Usunie to niepotrzebną folię węglową, która mogła owinąć się wokół krawędzi siatki po szorstkiej stronie.Obróć kleszczyki antykapilarne i umieść je na szalce Petriego stroną siatki z węglem skierowaną w dół. Pobrać pipetą 1,3 mikrolitra próbki do lekkiego menisku trehalozy na górze siatki. Następnie odpipetować roztwór około 8-10 razy, aby wymieszać i rozprowadzić trehalozę i próbkę po obu stronach siatki.Odpipetować jedną lub więcej kropli roztworu trehalozy o pojemności 1,7 mikrolitra na folię parafinową, inkubując próbkę roztworu trehalozy na siatce przez jedną minutę. Obróć siatkę z powrotem do pierwotnej pozycji z folią węglową skierowaną do góry i dociśnij siatkę do submikronowej bibuły filtracyjnej za pomocą kleszczyków antykapilarnych. Gdy roztwór zostanie wchłonięty przez bibułę filtracyjną, a film węglowy leży płasko, odczekaj trzy sekundy przed podniesieniem siatki i przesunięciem jej pionowo na 1,7 mikrolitra kropli roztworu trehalozy.Kroki te można powtarzać od jednej do trzech powtórzeń lub więcej, w zależności od próbki. Osusz siatkę na dwóch kawałkach bibuły filtracyjnej, a następnie wyjmij siatkę z bibuły filtracyjnej. Po około 13 sekundach, w zależności od wilgotności i bufora próbki, zanurz siatkę w ciekłym azocie w małym styropianowym pojemniku i umieść ją w pojemniku z siatką cryo-EM lub przenieś bezpośrednio w celu przesiewania krio-EM lub zbierania danych.Pokazano tutaj krystaliczną próbkę 2D ludzkiej syntazy leukotrienu C4 poddanej metodzie peel-blot. Obszar na lewo od strzałki został w dużej mierze zredukowany do jednowarstwowych kryształów 2D w obszarze kontaktu między folią węglową a prętem siatki, który został osuszony, a następnie przesunięty. Obszar po prawej stronie strzałki nie został dotknięty kleksem.Dolna połowa obrazu przedstawia obszary z dużymi, w większości jednowarstwowymi dwuwarstwami fosfolipidowymi powstałymi w wyniku zastosowania peel-blot. Górna połowa nie znajdowała się w strefie kontaktu między prętem siatki a folią węglową, a zatem zawierała kompletne liposomy z dwiema dwuwarstwami fosfolipidowymi. Kwadrat siatki siatki 400 pokazuje ślad paska siatki i wynikowe obszary z plamami odklejanymi, a także obszary, które nie stykały się z paskiem siatki lub były poddawane mniejszej liczbie iteracji odklejania.Obrazy te pokazywały plamienie siatki EM przygotowanej przez wtrysk wsteczny na submikronową bibułę filtracyjną przy użyciu bardzo cienkiej folii węglowej. Obrazy są pojedynczymi klatkami przy pierwszym kontakcie z membraną, 1 000 milisekund po kontakcie i 2 000 milisekund po kontakcie. Strzałka wskazuje kwadraty siatki, w których ciśnienie kapilarne rozerwało film węglowy.Unikanie pęknięć w folii węglowej i łączenie submikronowej bibuły filtracyjnej z kroplą trehalozy o pojemności 1,7 mikrolitra w celu zassania, a następnie oddzielenia warstw to kluczowe kroki. Próbki z oklebinami są wykorzystywane do zbierania danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości, a następnie do przetwarzania obrazu w celu określenia struktury. Peel-blot pozwala na strukturalne oznaczanie jednowarstwowych kryształów białka 2D, które wcześniej były zbyt grube dla cryo-EM.Ponadto może koncentrować różne próbki w pojedynczych warstwach na folii węglowej.

the-peel-blot-technique-cryo-em-sample-preparation-method-to-separate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Tutaj opisujemy procedurę badania tkanek roślinnych pękniętych przez lók. Wysokociśnieniowe próbki zamrożonych liści są pękane przez zamrażanie i powlekane dwuwarstwowo, co daje dobrze zachowane zamrożone i uwodnione próbki, które są obrazowane za pomocą krioskaningowego mikroskopu elektronowego przy dużych powiększeniach przy minimalnym uszkodzeniu wiązki.

Badanie supramolekularnej organizacji błon fotosyntetycznych w tkankach liści złamanych przez lóznę za pomocą krioskaningowej mikroskopii elektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Poznaj technikę peel-blot do przygotowania próbek cryo-EM, która oddziela wielowarstwowe próbki biologiczne na pojedyncze warstwy. Metoda zwiększa koncentrację próbki i ułatwia przetwarzanie obrazów.

Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych

Przeglądaj więcej filmów