Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji
April 12th, 2024
Ten protokół opisuje strategie identyfikacji i wzbogacania stanu komórki w pierwotnych hodowlach dorosłych mysich nerwowych komórek macierzystych za pomocą obrazowania autofluorescencyjnego przy użyciu i) mikroskopu konfokalnego, ii) aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek do wykonywania obrazowania intensywności, lub iii) mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji.
Protokół ten zapewnia nowe podejście do klasyfikacji stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych z kohortą zalet technicznych. Korzystając z tego protokołu, możemy uzyskać analizę stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych bez znaczników pojedynczych komórek. Protokół ten może być wykorzystany do rzucenia światła na mechanizmy regulujące neurogenezę dorosłych.
Autofluorescencja jest znacznie ciemniejsza niż wiele fluoroforów, do których przywykli naukowcy. Miej pewność, że do zbierania danych używasz wyższych mocy lasera. Procedurę zademonstruje Chris Morrow, były doktorant z mojego laboratorium.
Zacznij od skonfigurowania mikroskopu konfokalnego do obrazowania autofluorescencyjnego. Kliknij opcję 405 Laser (Laser 405) i wpisz tekst w oknie emisji w menu 405 laser (Laser 405). Przejdź do kliknięcia TD, aby zebrać obraz w świetle przechodzącym i ustaw wartość HV, aby zobrazować próbkę.
Dostosuj moc lasera na 3.5% i ustaw wzmocnienie na 75. Ustaw powiększenie na dwa. Dla parametrów skanowania konfokalnego ustaw zatrzymanie pikseli na 0,5, a rozdzielczość na 2048 na 2048 pikseli.
Używając soczewki obiektywowej 60X zanurzonej w oleju w jasnym polu, ustaw ostrość komórek. Kliknij opcję Port oczu, aby przełączyć się na tryb skanowania konfokalnego. Upewnij się, że ścieżka światła jest skierowana w stronę głowicy skanującej i upewnij się, że żadna kostka filtra nie zasłania ścieżki światła.
Kliknij przycisk Skanuj, a następnie ustaw ostrość na obrazie i kliknij przycisk Przechwyć, aby uzyskać obrazy autofluorescencji w spoczynkowych nerwowych komórkach macierzystych i aktywnych nerwowych komórkach macierzystych. Upewnij się, że zbierasz obrazy pojedynczej płaszczyzny z cytoplazmą komórek w ostrości, aby uzyskać reprezentatywny przekrój każdej komórki. Rozpocznij obrazowanie od niskiej mocy lasera i stopniowo zwiększaj moc, aż sygnał autofluorescencji będzie wykrywalny bez powodowania nasycenia.
Analizuj spoczynkowe nerwowe komórki macierzyste i aktywne nerwowe komórki macierzyste za pomocą cytometru przepływowego przy użyciu dyszy o średnicy 130 mikrometrów. Zastosuj warunki optyczne zgodnie z możliwościami przyrządu i wykryj punktową autofluorescencję. Zbierz co najmniej 10 000 singletowych qNSC i aNSC w pliku danych.
Wykorzystaj te dane do zaprojektowania bramek do zbierania wzbogaconej populacji qNSC lub aNSC. Następnie posortuj komórki singletowe do studzienek pokrytych lamininą PLO wypełnionych pożywką aNSC. Po FACS pozwól neuronalnym komórkom macierzystym inkubować przez trzy godziny.
Aby utrwalić komórki, dodaj 4% paraformaldehydu, upewniając się, że wystarczy przykryć dno naczynia i inkubować. Po 15 minutach przepuszczaj komórki za pomocą 0,25% Tritonu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie potraktuj komórki roztworem barwiącym EdU w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Następnie przemyj próbki trzy razy przez 10 minut każda za pomocą PBS. Zacznij od użycia okularów, aby zlokalizować odpowiednie pole widzenia i dostosować ścieżkę światła do próbki pod mikroskopem, aby umożliwić obrazowanie w ciemności za pomocą wielofotonu. Skonfiguruj kolekcję obrazów kanału pierwszego.
Przejdź do zakładki wzmocnienia mocy i dostosuj wzmocnienie w PMT do 800. Kliknij zakładkę Laser 2P i wybierz 750 nanometrów jako długość fali lasera i upewnij się, że używana jest właściwa kostka filtrująca. Aby zebrać obraz z pierwszego kanału, kliknij kartę Power Gain (Wzmocnienie mocy) i ustaw Pockels na 30.
Następnie przejdź do sekcji skanowania na ekranie i kliknij Live Scan, aby uruchomić tryb podglądu. Stopniowo zwiększaj Pockels, aby uzyskać odpowiednie pole widzenia przy niskiej mocy lasera. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego pola widzenia dostosuj moc lasera do 3.6 miliwata.
Następnie przejdź do sekcji skanowania i kliknij pojedyncze skanowanie, aby przechwycić obraz z pierwszego kanału w ciągu 60 sekund. Aby zebrać obraz z kanału drugiego, kliknij zakładkę Laser 2P i wybierz 890 nanometrów dla lasera. Zastąp kostkę filtra kostką emisyjną kanału drugiego.
Uruchom tryb podglądu. Zwiększaj Pockels, aż miernik mocy pokaże około siedmiu miliwatów, a liczba CFD będzie mieścić się w przedziale od 10 000 do 100 000. Kliknij pojedynczy skan i przechwyć obraz z kanału drugiego w czasie 60 sekund.
Konfokalne obrazowanie autofluorescencyjne zastosowano do różnicowania między spoczynkowymi nerwowymi komórkami macierzystymi a aktywowanymi nerwowymi komórkami macierzystymi. Stwierdzono, że qNSC wykazują większą liczbę PAF niż aNSC, co świadczy o zastosowaniu autofluorescencji jako markera do identyfikacji stanu komórki. Za pomocą FACS stany komórek NSC wzbogacono na podstawie autofluorescencji.
Komórki posortowane z bramki o wysokiej autofluorescencji wykazywały niższy współczynnik proliferacji w porównaniu z próbką mieszaną, podczas gdy te z bramki o niskiej autofluorescencji były bardziej proliferacyjne, co potwierdza wzbogacenie stanów aktywacji NSC. Ponadto FLIM wykorzystano do oceny autofluorescencji NSC i rozpoznania stanu aktywacji NSC. Warto zauważyć, że qNSC wykazały wyższy średni czas trwania fluorescencji w kanale pierwszym, ale niższy odsetek składnika fluorescencji alfa jeden w porównaniu z aNSC.
Model regresji logistycznej obejmujący dane z obu kanałów pozwolił uzyskać niemal idealną zdolność predykcyjną dla stanów aktywacji NSC, na co wskazuje krzywa charakterystyki operatora odbiornika, podkreślająca potencjał FLIM w klasyfikowaniu stanów NSC. Zgodnie z tą procedurą, dobrze byłoby zweryfikować wyniki przy użyciu innych podejść do pomiaru stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych.
Przegląd
Ten protokół przedstawia techniki identyfikacji i wzbogacania stanów komórek w pierwotnych kulturach komórek macierzystych nerwowo-glejowych myszy dorosłych za pomocą obrazowania autofluorescencji. Badanie wykorzystuje mikroskopię konfokalną, fluorescencyjną sortację komórek (FACS) oraz mikroskopię multifotonową do analizy stanów aktywacji komórek macierzystych nerwowych, poprawiając rozumienie neurogenezy u dorosłych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Technologia obrazowania
Tło
- Komórki macierzyste nerwowe (NSCs) odgrywają kluczową rolę w neurogenezie i naprawie mózgu.
- Zrozumienie stanów aktywacji NSC może dostarczyć wglądu w ich role w funkcjonowaniu mózgu.
- Obecne metody brakowały precyzyjnych technik do oceny stanów NSC w rozdzielczości pojedynczych komórek.
- Autofluorescencyjne obrazowanie oferuje nowatorskie podejście do analizy żywych komórek bez oznaczania.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do wolnej analizy aktywacji komórek macierzystych nerwowych w żywych komórkach bez oznaczania.
- Wzbogacanie uśpionych i aktywowanych komórek macierzystych nerwowych za pomocą autofluorescencji jako markera.
- Zbadanie mechanizmów regulujących neurogenezę u dorosłych za pomocą ulepszonych technik obrazowania.
Zastosowanie metod
- Obrazowanie zostało wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego i mikroskopu multifotonowego.
- Pierwotne kultury komórek macierzystych nerwowych myszy dorosłych zostały użyte jako model biologiczny.
- Nieobecność multiomiki ani analiz metabolicznych w tym badaniu.
- Protokół obejmował kroki dotyczące ustawienia konfokalnego, FACS do sortowania komórek i analizy autofluorescencji.
- Krytyczne kroki obejmowały optymalizację ustawień mocy lasera i sortowanie populacji komórek na podstawie intensywności autofluorescencji.
Główne wyniki
- Autofluorescencyjne obrazowanie pomyślnie zróżnicowało uśpione i aktywne NSC na podstawie intensywności sygnału.
- FACS umożliwiło wzbogacanie NSC, wykazując różnice w wskaźnikach proliferacji między sortowanymi populacjami.
- Fluorescencyjne obrazowanie czasu życia (FLIM) ujawniło znaczne różnice w czasie życia fluorescencji i składnikach między qNSC a aNSC.
- Model regresji logistycznej wskazał silną zdolność predykcyjną do identyfikacji stanów aktywacji NSC.
Wnioski
- To badanie umożliwia zaawansowaną identyfikację i analizę stanów aktywacji komórek macierzystych nerwowych, co jest kluczowe dla zrozumienia neurogenezy.
- Zastosowanie autofluorescencji i FACS obiecuje dla przyszłych badań w dziedzinie plastyczności nerwowej i biologii komórek macierzystych.
- Uzyskane wglądy mogą wpłynąć na strategie terapeutyczne w chorobach neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol provides a label-free, single-cell resolution method to classify neural stem cell activation states using autofluorescence, enabling mechanistic de-risking in target validation for neurogenesis-related pathways. By distinguishing quiescent and activated states without exogenous labels, it supports predictive confidence in early discovery and reduces biological ambiguity in stem cell-based therapeutic strategies. The approach enhances translational continuity from discovery through preclinical research by offering a reusable, scalable tool for assessing cell state dynamics in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by classifying NSC activation states based on endogenous autofluorescence markers.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, live-cell analysis that preserves native cell function during state discrimination.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying differences in proliferation and fluorescence lifetime between qNSCs and aNSCs using FACS and FLIM.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching qNSC or aNSC populations via FACS gating on autofluorescence intensity.
- Reproducibility: Standardizes activation state assessment through quantitative autofluorescence intensity and fluorescence lifetime measurements.
- Scalability: Enables platform reuse across studies by establishing a label-free method compatible with confocal, FACS, and multiphoton imaging.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with adult neurogenesis mechanisms, offering a translational biomarker-compatible system for studying NSC quiescence exit in preclinical models.
- Predictive De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking autofluorescence signatures to functional outcomes like proliferation rate and cell cycle re-entry.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a consistent, label-free readout across imaging and sorting modalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting assay development and analytics with quantitative, label-free outputs that inform go/no-go decisions in stem cell-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time classification of NSC activation states without perturbing native signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through FACS-based enrichment of pure qNSC or aNSC populations for compound screening applications.
- Analytics: Provides quantitative readouts including autofluorescence intensity, fluorescence lifetime, and component analysis to compare activation states across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing longitudinal tracking of quiescent exit dynamics using FLIM in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects due to its label-free nature and compatibility with standard microscopy and flow cytometry infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in NSC state transitions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through instrument-agnostic autofluorescence metrics applicable across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ineffective modulators of NSC activation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that reliably modulate qNSC-to-aNSC transition with measurable fluorescence signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, flow cytometry, and multiphoton FLIM for accurate signal detection and interpretation.
- Dependent on laser tuning and detector sensitivity due to the inherently low signal strength of endogenous autofluorescence.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters (laser power, gain, wavelength) to ensure reproducible activation state classification.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different NSC sources or culture conditions affecting autofluorescence background.
- Limited by the need for careful optimization to avoid photodamage while achieving sufficient signal-to-noise ratio for state discrimination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Imaging Autofluorescence in Live qNSCs and aNSCs Using Confocal Microscope
2:13
Autofluorescence Based FACS Enrichment for NSC Activation State in Cultured NSCs
3:36
Using Multiphoton Microscope to Perform Fluorescence Lifetime Imaging on NSCs In Vitro
5:20
Results: Deciphering Neural Stem Cell Activation States Through Advanced Fluorescence Imaging Techniques
6:45
Conclusion
