Name: Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę klasyfikacji stanu aktywacji komórek macierzystych mózgu myszy przy użyciu autofluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia analizę żywych komórek bez znakowania oraz wzbogacanie populacji komórek w stanie spoczynku i aktywacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy głównemu instytutowi cytometrii przepływowej UW-Madison (P30 CA014520 i 1S10RR025483-01) oraz członkom społeczności Moore lab i UW-Madison za ich wkład. Dziękujemy naszym źródłom finansowania: NIH T32 T32GM008688 (do C.S.M.), Diana Jacobs Kalman Fellowship od AFAR (do CSM), Wisconsin Graduate Fellowship (do CSM), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, do D.L.M.), Vallee Scholar Award (do D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (do D.L.M.) i MCS.), R01 CA185747 (do M.C.S.), R01 CA205101 (do M.C.S.), R01 CA211082 (do M.C.S.) oraz grant National Science Foundation nr. CBET-1642287 (do MCS).

<ol><li>Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+hippocampus%3A+From+stem+cells+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior.</a> Cell. 167 (4), 897-914 (2016).</li>
<li>Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+niche+signals+from+the+choroid+plexus+regulate+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).</li>
<li>Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+of+adult+mammalian+neural+stem+cells%3A+A+highly+regulated+rest%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest.</a> Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).</li>
<li>Urban, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+quiescence+of+mouse+neural+stem+cells+by+degradation+of+a+proactivation+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein.</a> Science. 353 (6296), 292-295 (2016).</li>
<li>Kalamakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+modulates+stem+cell+maintenance+and+regenerative+capacity+in+the+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain.</a> Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).</li>
<li>Walsh, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+T-cell+activation+via+autofluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging.</a> Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).</li>
<li>Sagar, M. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+activation+visualization+via+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+of+intrinsically+fluorescent+metabolic+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors.</a> Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).</li>
<li>Knobloch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+adult+neural+stem+cell+activity+by+Fasn-dependent+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis.</a> Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).</li>
<li>Knobloch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fatty+acid+oxidation-dependent+metabolic+shift+regulates+adult+neural+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity.</a> Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).</li>
<li>Knobloch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOT14-positive+neural+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+hippocampus+respond+dynamically+to+neurogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).</li>
<li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-Seq+with+waterfall+reveals+molecular+cascades+underlying+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li>
<li>Leeman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+activation+clears+aggregates+and+enhances+quiescent+neural+stem+cell+activation+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging.</a> Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).</li>
<li>Beckervordersandforth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism-mediated+regulation+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Plast%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis.</a> Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).</li>
<li>Morrow, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+is+a+biomarker+of+neural+stem+cell+activation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state.</a> Cell Stem Cell. , (2024).</li>
<li>Kolenc, O. I., Quinn, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell+metabolism+through+autofluorescence+imaging+of+NAD%28P%29H+and+FAD%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD.</a> Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).</li>
<li>Mira, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+BMPR-IA+regulates+quiescence+and+long-term+activity+of+neural+stem+cells+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).</li>
<li>Morrow, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+coordinates+protein+turnover+at+the+aggresome+during+neural+stem+cell+quiescence+exit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).</li>
<li>Martynoga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+enhancer+annotation+reveals+a+key+role+for+NFIX+in+neural+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence.</a> Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).</li>
<li>Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+hippocampal+neural+stem+cells+for+fluorescence+loss+in+photobleaching+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).</li>
<li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).</li>
<li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+of+free+and+protein-bound+NADH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).</li>
<li>Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+state+using+NADH+and+NADPH+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence.</a> Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).</li>
<li>Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+fundamentals+and+advances+in+instrumentation%2C+analysis%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications.</a> J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).</li>
<li>ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/</a> (2021).</li>
<li>Becker & Hichl Handbooks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/</a> (2024).</li>
<li>GitHub Materials. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/">https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/</a> (2024).</li>
<li>Codega, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+purification+of+quiescent+adult+neural+stem+cells+from+their+in+vivo+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche.</a> Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).</li>
<li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+a+population+of+dormant+neural+stem+cells+that+become+activated+upon+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół ten opisuje żywą, wolną od znaczników, nieniszczącą technikę rozpoznawania pojedynczych komórek, która pozwala na klasyfikację stanu komórki NSC in vitro poprzez obrazowanie sygnałów autofluorescencyjnych w NSC. Podejście to wykrywa zmiany metaboliczne, które zachodzą podczas wychodzenia w stanie spoczynku NSC, które wpływają na właściwości optyczne kofaktorów metabolicznych, takich jak NAD(P)H, i oferuje wiele zalet w porównaniu z istniejącymi technologiami do badania spoczynku NSC. Na przykład wiele konwencjonalnych technik badania qNSC i aNSC, takich jak znakowanie markerami cyklu komórkowego, takimi jak EdU, wymaga utrwalenia próbek. Obecnie istniejące metody, które są w stanie badać żywe NSC, są dodatkowo ograniczone przez wymóg wprowadzenia egzogennych znaczników, zazwyczaj poprzez generowanie transgenów kodujących białka fluorescencyjne. Narzędzia te są ograniczone zarówno pod względem zasobów wymaganych do ich wygenerowania, jak i wielu zastrzeżeń technicznych. Na przykład pośrednie białka włókien nestyna i kwaśne białko fibrylarne glejowe (GFAP) są powszechnie stosowane jako markery qNSC i aNSC 12,13,18,28,29. Wiadomo jednak, że nestyna i GFAP ulegają zróżnicowanej ekspresji między qNSC i aNSCs 12,13,18,28,29. Co więcej, obrazowanie autofluorescencyjne dostarcza danych o pojedynczych komórkach o wysokiej rozdzielczości, które mogą rozwikłać niejednorodność pojedynczych komórek, która jest zagubiona lub skomplikowana do interpretacji w eksperymentach, których kulminacją jest masowa analiza populacji komórek.
Jednak obrazowanie autofluorescencyjne ma również kilka ograniczeń. Wiele sygnałów autofluorescencyjnych zostaje utraconych po utrwaleniu komórki. Tak więc obrazowanie autofluorescencyjne jest w dużej mierze ograniczone do badania żywych komórek. Obrazowanie autofluorescencyjne opiera się również na braku egzogennie wprowadzonych fluoroforów, które mogą przenikać do kanałów autofluorescencyjnych. Chociaż wiele fluoroforów może być kompatybilnych z obrazowaniem autofluorescencyjnym w określonych sytuacjach, sparowanie obrazowania autofluorescencyjnego z wieloma istniejącymi narzędziami nie zawsze jest możliwe. Obrazowanie żywych komórek może również wywoływać fototoksyczność. Jedna iteracja obrazowania przy użyciu tego protokołu nie indukuje wystarczającej fototoksyczności, aby zmniejszyć żywotność NSC. Jednak wielokrotne obrazowanie komórek w czasie w częstszych odstępach czasu, wiele razy dziennie, może generować znaczną fototoksyczność, a zatem nie jest realną strategią badania spoczynku NSC. Wreszcie, chociaż obrazowanie autofluorescencyjne może być wykorzystane do badania NSC od 6-tygodniowych samców myszy z hipokampa lub komór bocznych, nie jest jasne, jak szeroko ta technika może być stosowana do badania NSC z innych źródeł, wieku lub innych typów komórek macierzystych.
Opisany tutaj protokół zakłada również dokładne wytwarzanie qNSC i aNSC in vitro przy użyciu wcześniej ustalonych protokołów 10,13,17,18,19. Jeśli odtworzenie wyników tego protokołu jest trudne, upewnij się, że qNSC i aNSC są prawidłowo generowane, sondując obecność lub brak różnych markerów qNSC i aNSC, jak opisano wcześniej 10,13,17,18,19. Podsumowując, obrazowanie autofluorescencyjne zapewnia nowatorskie podejście techniczne do identyfikacji qNSC i aNSC oraz badania wyjść spoczynkowych NSC.

NSC tworzą nowo narodzone neurony przez całe życie w wielu organizmach w procesie określanym jako neurogeneza dorosłych1,2. Aby wytworzyć nowo narodzone neurony, qNSC musi się najpierw aktywować, wchodząc w cykl komórkowy, aby rozszerzyć populację i wytworzyć neuronalne komórki progenitorowe3,4,5,6. Chociaż wiele wiadomo na temat spoczynku NSC, nasza zdolność do pełnej identyfikacji czynników powodujących i regulatorów stanu spoczynku NSC jest ograniczona przez ograniczenia techniczne, które istnieją w celu wyizolowania i zidentyfikowania qNSC oraz ich przejścia do aktywacji. Obrazowanie autofluorescencyjne było wcześniej skuteczne w badaniu zmian stanu komórek w wielu różnych typach komórek, takich jak mikroglej i limfocyty T, rozwiązując problem przebudowy metabolicznej, która wpływa na właściwości optyczne autofluorescencyjnych kofaktorów metabolicznych, takich jak fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD(P)H) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)7,8. NSC znacznie przebudowują swoje sieci metaboliczne, gdy przechodzą przez wyjście w stanie spoczynku9,10,11,12,13,14. Tak więc, aby wykorzystać te różnice, autofluorescencja NSC została niedawno wykorzystana do identyfikacji i wzbogacenia stanu aktywacji NSC poprzez wykrywanie zmian w autofluorescencji przypisywanych przebudowie metabolicznej, która zachodzi, gdy NSC wychodzą ze stanu spoczynku15. Obrazowanie autofluorescencji ma kilka zalet technicznych: i) nie wymaga dodawania egzogennych znaczników, które mogą wpływać na zachowanie komórek; ii) może dostarczać danych jednokomórkowych o wysokiej rozdzielczości na temat stanu aktywacji NSC; oraz iii) nie wymaga zniszczenia komórki7,16. Protokół ten przedstawia trzy strategie wykorzystania autofluorescencji NSC do badania stanów spoczynku i aktywacji komórek NSC15.
Niedawno, NSC wyizolowane od 6-tygodniowych samców myszy ze strefy subziarnistej hipokampa, hodowane i odwracalnie wprowadzane w stan spoczynku in vitro10,13,17,18,19,20,21stwierdzono, że wykazują podwyższone poziomy autofluorescencji punktowej (PAF), która wzbudza w zakresie 400-600 nm i emituje w zakresie 500-700 nm. Ten sygnał był specyficzny dla qNSC w porównaniu z aktywowanymi, cyklicznymi NSCs15. Możliwość wizualnego oddzielenia tych dwóch populacji bez użycia dodatkowych markerów przeciwciał lub reporterów jest przydatna w przypadku wielu pytań eksperymentalnych dotyczących natury qNSC i wyjść spoczynku. Tak więc, po pierwsze, protokół ten opisuje strategie obrazowania PAF w qNSC za pomocą mikroskopu konfokalnego, który może być użyty do identyfikacji stanu aktywacji NSC. Po drugie, protokół ten opisuje strategie wykrywania PAF za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i dalej opisuje, jak sortować na podstawie tego sygnału w celu wzbogacenia qNSC lub aNSC. Strategie te zapewniają jedną miarę, której można użyć do grupowania i oddzielania NSC na podstawie stanu komórki.
Aby opracować metodę separacji NSC o wyższej rozdzielczości nie tylko w różnych stanach, ale także podczas przechodzenia przez wyjście w stanie spoczynku w kierunku pełnej aktywacji, przeprowadzono obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) za pomocą mikroskopu wielofotonowego do zobrazowania autofluorescencji NAD(P)H (określanej jako Kanał 1) i autofluorescencji zielonej (określanej jako Kanał 2; która wykrywa zarówno autofluorescencję FAD, jak i PAF w qNSC) wraz z ich intensywnością. Podejście to wykorzystuje fakt, że właściwości optyczne cząsteczek w komórce zależą od ich właściwości fizycznych16,22. Na przykład NAD(P) (NAD i NADP są optycznie nierozróżnialne, a zatem NAD(P) jest używany w odniesieniu do obu gatunków) nie jest autofluorescencyjny w stanie utlenionym, ale jest autofluorescencyjny w stanie zredukowanym (NAD(P)H)<klasa sup="xref">23. Co więcej, dodatkowe właściwości fizyczne cząsteczek autofluorescencyjnych, takie jak ich status wiązania z enzymami, można ekstrapolować, wykonując obrazowanie czasu życia fluorescencji7,22,24. Na przykład NAD(P)H ma krótszy czas trwania fluorescencji, gdy nie jest związany z enzymem22. Ponieważ cząsteczki autofluorescencyjne, takie jak NAD(P)H, która bierze udział w setkach reakcji metabolicznych, są w różny sposób wykorzystywane przez komórki przechodzące przez różne stany lub zachowania komórek, przesunięcia te można wykryć i określić ilościowo za pomocą mikroskopu wielofotonowego wykrywającego czas życia autofluorescencji23. Wraz z obfitością lub intensywnością autofluorescencji, pomiary te dostarczają wielowymiarowych informacji do rozdzielania NSC na jeden lub drugi stan komórki oraz poprzez dynamiczne przejścia między stanami. Po trzecie, protokół ten opisuje wykonywanie, analizowanie i interpretację pomiarów FLIM i intensywności sygnałów kanału 1 (NAD(P)H) i kanału 2 (PAF) przy użyciu mikroskopu wielofotonowego. Podsumowując, protokół ten opisuje żywy, wolny od znaczników zestaw narzędzi do badania stanu spoczynku NSC, który dostarcza danych o wysokiej rozdzielczości z pojedynczej komórki na temat stanu NSC.

<table><tbody><tr><td>Soczewka obiektywu wodnego 40x</td><td>Nikon</td><td>MRD77410</td><td>Soczewka obiektywowa stosowana w mikroskopie wielofotonowym w części 3</td></tr><tr><td>Kuweta 8-dołkowa</td><td>Ibidi</td><td>80826-90</td><td>Do obrazowania aNSC / qNSC</td></tr><tr><td>Analogowy miernik mocy</td><td>Thorlabs</td><td>PM100A</td><td>Używany w mikroskopie wielofotonowym w części 3</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100X) (PSF)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td>Antybiotyk do pożywek NSC</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>Suplement diety dla pożywek NSC</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Fisher Scientific</td><td>5020BP010</td><td>Czynnik wywołujący spoczynek</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A4919-25G</td><td>Do wytwarzania</td></tr><tr><td>ultraszybkiego lasera BMP4 Chameleon</td><td>Koherentny</td> laser <td>nie dotyczy</td><td>stosowany w mikroskopie wielofotonowym w części 3</td></tr><tr><td>Mikroskop</td> <td>konfokalnyMikroskop Nikon</td><td>C2</td><td>używany do części 1</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (bez GlutaMAX)</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td>Pożywka bazowa dla NSCs</td></tr><tr><td>DNAzy Sigma</td><td></td><td>D5025-15KU</td> Dodano do zestawu testowego <td>EdU inhibitora trypsyny</td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Test proliferacji do hodowli komórkowych</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-500UG</td><td>Czynnik wzrostu dla pożywek NSC</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>Czynnik wzrostu dla pożywek NSC</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny aktywowany sortownik komórek</td><td>BD</td><td>FACSAria</td><td>Fluorescencyjny sortownik komórek używany do części 2</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>Dodatek do pożywki NSC</td></tr><tr><td>L-15</td><td>Invitrogen</td><td>21083027</td><td>Do przygotowania roztworu inhibitora trypsyny</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Do powlekania wyrobów szklanych</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon TiE</td><td>Ramka mikroskopu Nikon</td><td>N/A</td><td>Używany do części 3</td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Do powlekania wyrobów szklanych</td></tr><tr><td>SPC-150 Elektronika licząca pojedyncze fotony</td><td>Becker i Hickl</td><td>N/A</td><td>Stosowany w mikroskopie wielofotonowym w części 3</td></tr><tr><td>Trypsyna (do trypsynizacji granulek aNSC, które rosły jako kulki lub monowarstwy)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Do trypsynizacji neurosfer lub przylegających aNSC</td></tr><tr><td>Trypsyna (do trypsynizacji qNSCs)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Do trypsynizacji adherentnych qNSC</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma</td><td>T6522-100MG</td><td>Do hamowania trypsynizacji aNSC</td></tr><tr><td>Kryształy mocznika</td><td>Sigma</td><td>U5128-5G</td><td>Służy do zbierania IRF</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Thermo Fisher</td><td>15040066</td><td>Do przygotowania trypsyny</td></tr></tbody></table>

klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Classification of Neural Stem Cell Activation State In Vitro Using Autofluorescence

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) dzielą się i wytwarzają nowo narodzone neurony w dorosłym mózgu w procesie zwanym neurogenezą dorosłych. Dorosłe NSC są przede wszystkim w stanie spoczynku, odwracalnym stanie komórkowym, w którym opuściły cykl komórkowy (G0), ale pozostają wrażliwe na środowisko. W pierwszym etapie neurogenezy u dorosłych spoczynkowe NSC (qNSC) odbierają sygnał i aktywują się, wychodząc ze stanu spoczynku i ponownie wchodząc w cykl komórkowy. W związku z tym zrozumienie regulatorów spoczynku NSC i wyjścia w stanie spoczynku ma kluczowe znaczenie dla przyszłych strategii ukierunkowanych na neurogenezę dorosłych. Jednak nasze zrozumienie spoczynku NSC jest ograniczone przez ograniczenia techniczne w identyfikacji spoczynkowych NSC (qNSC) i aktywowanych NSC (aNSC). Protokół ten opisuje nowe podejście do identyfikacji i wzbogacania qNSC i aNSC generowanych w hodowlach in vitro poprzez obrazowanie autofluorescencji NSC. Po pierwsze, protokół ten opisuje, jak używać mikroskopu konfokalnego do identyfikacji markerów autofluorescencyjnych qNSC i aNSC w celu sklasyfikowania stanu aktywacji NSC przy użyciu intensywności autofluorescencji. Po drugie, protokół ten opisuje, jak używać sortera komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) do klasyfikowania stanu aktywacji NSC i wzbogacania próbek pod kątem qNSC lub aNSC przy użyciu intensywności autofluorescencji. Po trzecie, protokół ten opisuje, jak używać mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) w rozdzielczości pojedynczej komórki, klasyfikowania stanu aktywacji NSC i śledzenia dynamiki wyjścia w stanie spoczynku przy użyciu zarówno intensywności autofluorescencji, jak i czasu życia fluorescencji. W związku z tym protokół ten zapewnia zestaw narzędzi do rozpoznawania pojedynczych komórek w żywych komórkach, bez znaczników, do badania stanu spoczynku NSC i wyjścia w stanie spoczynku.

Konfokalne obrazowanie autofluorescencji w celu rozróżnienia stanu komórek NSC (Rysunek 1) 
Aby wykorzystać mikroskopię konfokalną do określenia stanu aktywacji NSC, qNSC i aNSC wygenerowano in vitro z użyciem pożywki aktywującej lub pożywki wprowadzającej w stan spoczynku, zgodnie z wcześniejszym opisem10,13,17,18. W celu wykrycia PAF w komórkach NSC, żywe qNSC i aNSC obrazowano przy tym samym czasie ekspozycji na mikroskopie konfokalnym (Ex: 405 nm, Em: 580-620 nm). qNSC wykazywały większą liczbę PAF w porównaniu z aNSC (Rysunek 1A,B). Wynik ten ilustruje, w jaki sposób właściwości autofluorescencji mogą być wykorzystane jako markery do identyfikacji stanu komórkowego qNSC i aNSC.
Wzbogacanie populacji komórek NSC w określonym stanie za pomocą FACS z wykorzystaniem autofluorescencji (Rysunek 2) 
Aby wyodrębnić komórki w określonym stanie cyklu komórkowego za pomocą FACS, qNSC oraz aNSC wygenerowano in vitro10,13,17,18,19 zgodnie z opisem w niniejszym protokole, a następnie wstępnie znakowano EdU przez 1 h przed trypsynizacją i analizą w cytometrze przepływowym w celu oznaczenia komórek przechodzących przez fazę S. Następnie qNSC i aNSC analizowano za pomocą cytometrii przepływowej osobno lub zmieszanych w stosunku 1 qNSC:1 aNSC (Rysunek 2). Wyznaczono bramki w celu wzbogacenia populacji aNSC lub qNSC z mieszaniny, a następnie posortowano komórki na podstawie tych bramek. Po FACS komórki z każdej próbki wysiano na szklane naczynia powlekane PLO- i lamininą i pozostawiono do przylegania do podłoża przez 3 h przed utrwaleniem, barwieniem i analizą odsetka komórek EdU+. Zgodnie z oczekiwaniami, komórki posortowane z bramki wysokiej autofluorescencji wykazywały mniejszy odsetek EdU+ niż próbka Mix, natomiast próbki posortowane przez bramkę niskiej autofluorescencji były bardziej proliferacyjne niż próbka Mix (Rysunek 2C). Wynik ten potwierdza możliwość wzbogacania stanu aktywacji NSC z heterogenicznej mieszaniny qNSC i aNSC za pomocą FACS.
Wielofotonowe obrazowanie czasu życia fluorescencji w celu klasyfikacji stanu komórek NSCRycina 3) 
Wygenerowano qNSCs oraz aNSCs in vitro a następnie obrazowano przy użyciu mikroskopu wielofotonowego w celu przeprowadzenia FLIM autofluorescencji w kanale 1 (Ex: 750 nm (2P), Em: 360-520 nm) oraz w kanale 2 (Ex: 890 nm (2P), Em: 450-650 nm) (Rysunek 3A, Tabela 2). qNSCs i aNSCs wykazywały profile autofluorescencyjne, które były w dużej mierze istotnie różne. Na przykład qNSCs charakteryzowały się wyższym średnim czasem życia fluorescencji τ w kanale 1m, lecz niższą wartość α1 w porównaniu z aNSCs. Aby ocenić zdolność danych autofluorescencji FLIM komórek NSC do przewidywania stanu aktywacji NSC, opracowano model regresji logistycznej z wykorzystaniem intensywności kanału 1, α1, τ1, τ2 oręz intensywność kanału 2, α1, τ1, τ2. Krzywa ROC (receiver operator characteristic) wykazuje, że dane te są wystarczające do stworzenia niemal idealnego modelu (pole pod krzywą = 0,963), który dokładnie przewiduje stan aktywacji NSC. Wspólnie dane te obrazują możliwość wykorzystania FLIM i autofluorescencji do klasyfikacji stanu komórek NSC.
<img alt="Analiza neuralnych komórek macierzystych; dane z mikroskopii, wzbudzenia i emisji; wizualizacja PAF, wyniki na wykresie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63110/63110fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obrazowanie konfokalne pozwala na rozróżnienie autofluorescencyjnych biomarkerów stanu aktywacji NSC. (A-B) qNSC (fioletowe) i aNSC (czarne) obrazowano przy tym samym czasie ekspozycji na mikroskopie konfokalnym (czerwony; Ex. 405 nm, Em 580-620 nm) i analizowano pod kątem liczby PAF (N = 3, test Manna-Whitneya, średnia ± SD). Białe przerywane linie oznaczają krawędź komórki, a niebieskie przerywane linie oznaczają jądra. (C) Autofluorescencję w tej samej qNSC obrazowano przy różnych warunkach wzbudzenia i emisji, zgodnie z oznaczeniami na rysunku, przy identycznej mocy lasera i wzmocnieniu. Paski skali: 10 µm. **** p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/63110fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Histogramy autofluorescencji dla neuralnych komórek macierzystych; analiza stanów proliferacyjnych; wykres trójczęściowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63110/63110fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: FACS pozwala na wzbogacenie populacji o komórki NSC w stanie aktywacji. (A-C) qNSCs, aNSCs lub mieszaninę qNSCs: aNSCs (1:1) poddano działaniu EdU przez 1 h, trypsynizowano, a następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej (Ex: 405 nm, Em: 580-620 nm). Komórki z mieszaniny (1:1) zostały następnie posortowane metodą FACS pod kątem niskiej lub wysokiej autofluorescencji, wysiane i przeanalizowane pod kątem proliferacji poprzez pomiar odsetka komórek EdU+. Jednostki arbitralne oznaczono skrótem „A.U.” (N = 4, dwuczynnikowa ANOVA z testem post hoc Tukeya, średnia ± SD). **** p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/63110fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres obrazowania czasu życia fluorescencji; Wykresy skrzypcowe; Krzywa ROC; analiza danych aNSC i qNSC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63110/63110fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wielofotonowe obrazowanie czasu życia fluorescencji ujawnia biomarkery stanu aktywacji NSC. (A) Schemat przedstawiający analizę dopasowania krzywej dla uzyskanych danych FLIM. (B) Pomiary FLIM dla kanału 1 i kanału 2, obejmujące wartości natężenia, średniego czasu życia (Tm) oraz udziału frakcyjnego (α1) dla danych qNSC (fioletowy) i aNSC (czarny) (n = 501 komórek, dwustronna regresja logistyczna, uogólniony model liniowy). (C) Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) demonstrująca model regresji logistycznej wygenerowany przy użyciu natężenia kanału 1, α1, τ1, τ2 oraz natężenia kanału 2, α1, τ1, τ2 w celu klasyfikacji NSC jako aNSC lub qNSC. *** p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/63110fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Pożywki i roztwory. Przepisy na wszystkie roztwory użyte w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/Table%201%20-%20Solution%20Recipes.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Przykładowe dane. Reprezentatywne dane FLIM dla qNSC i aNSC dla autofluorescencji w kanale 1 i kanale 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/Table%202%20-%20Example%20Data.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: manual_segmentation.cpproj <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: R_ASCtoTIFF.rmd <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: test_key <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Integrate decay matrices and cytoplasmic masks.rmd <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: autofluorescence FLIM data.rmd <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63110/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje strategie identyfikacji i wzbogacania stanu komórki w pierwotnych hodowlach dorosłych mysich nerwowych komórek macierzystych za pomocą obrazowania autofluorescencyjnego przy użyciu i) mikroskopu konfokalnego, ii) aktywowanego fluorescencyjnie sortera komórek do wykonywania obrazowania intensywności, lub iii) mikroskopu wielofotonowego do wykonywania obrazowania czasu życia fluorescencji.

Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Neural stem cells (NSCs) divide and produce newborn neurons in the adult brain through a process called adult neurogenesis. Adult NSCs are primarily ...

Protokół ten zapewnia nowe podejście do klasyfikacji stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych z kohortą zalet technicznych. Korzystając z tego protokołu, możemy uzyskać analizę stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych bez znaczników pojedynczych komórek. Protokół ten może być wykorzystany do rzucenia światła na mechanizmy regulujące neurogenezę dorosłych.Autofluorescencja jest znacznie ciemniejsza niż wiele fluoroforów, do których przywykli naukowcy. Miej pewność, że do zbierania danych używasz wyższych mocy lasera. Procedurę zademonstruje Chris Morrow, były doktorant z mojego laboratorium.Zacznij od skonfigurowania mikroskopu konfokalnego do obrazowania autofluorescencyjnego. Kliknij opcję 405 Laser (Laser 405) i wpisz tekst w oknie emisji w menu 405 laser (Laser 405). Przejdź do kliknięcia TD, aby zebrać obraz w świetle przechodzącym i ustaw wartość HV, aby zobrazować próbkę.Dostosuj moc lasera na 3.5% i ustaw wzmocnienie na 75. Ustaw powiększenie na dwa. Dla parametrów skanowania konfokalnego ustaw zatrzymanie pikseli na 0,5, a rozdzielczość na 2048 na 2048 pikseli.Używając soczewki obiektywowej 60X zanurzonej w oleju w jasnym polu, ustaw ostrość komórek. Kliknij opcję Port oczu, aby przełączyć się na tryb skanowania konfokalnego. Upewnij się, że ścieżka światła jest skierowana w stronę głowicy skanującej i upewnij się, że żadna kostka filtra nie zasłania ścieżki światła.Kliknij przycisk Skanuj, a następnie ustaw ostrość na obrazie i kliknij przycisk Przechwyć, aby uzyskać obrazy autofluorescencji w spoczynkowych nerwowych komórkach macierzystych i aktywnych nerwowych komórkach macierzystych. Upewnij się, że zbierasz obrazy pojedynczej płaszczyzny z cytoplazmą komórek w ostrości, aby uzyskać reprezentatywny przekrój każdej komórki. Rozpocznij obrazowanie od niskiej mocy lasera i stopniowo zwiększaj moc, aż sygnał autofluorescencji będzie wykrywalny bez powodowania nasycenia.Analizuj spoczynkowe nerwowe komórki macierzyste i aktywne nerwowe komórki macierzyste za pomocą cytometru przepływowego przy użyciu dyszy o średnicy 130 mikrometrów. Zastosuj warunki optyczne zgodnie z możliwościami przyrządu i wykryj punktową autofluorescencję. Zbierz co najmniej 10 000 singletowych qNSC i aNSC w pliku danych.Wykorzystaj te dane do zaprojektowania bramek do zbierania wzbogaconej populacji qNSC lub aNSC. Następnie posortuj komórki singletowe do studzienek pokrytych lamininą PLO wypełnionych pożywką aNSC. Po FACS pozwól neuronalnym komórkom macierzystym inkubować przez trzy godziny.Aby utrwalić komórki, dodaj 4% paraformaldehydu, upewniając się, że wystarczy przykryć dno naczynia i inkubować. Po 15 minutach przepuszczaj komórki za pomocą 0,25% Tritonu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie potraktuj komórki roztworem barwiącym EdU w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie przemyj próbki trzy razy przez 10 minut każda za pomocą PBS. Zacznij od użycia okularów, aby zlokalizować odpowiednie pole widzenia i dostosować ścieżkę światła do próbki pod mikroskopem, aby umożliwić obrazowanie w ciemności za pomocą wielofotonu. Skonfiguruj kolekcję obrazów kanału pierwszego.Przejdź do zakładki wzmocnienia mocy i dostosuj wzmocnienie w PMT do 800. Kliknij zakładkę Laser 2P i wybierz 750 nanometrów jako długość fali lasera i upewnij się, że używana jest właściwa kostka filtrująca. Aby zebrać obraz z pierwszego kanału, kliknij kartę Power Gain (Wzmocnienie mocy) i ustaw Pockels na 30.Następnie przejdź do sekcji skanowania na ekranie i kliknij Live Scan, aby uruchomić tryb podglądu. Stopniowo zwiększaj Pockels, aby uzyskać odpowiednie pole widzenia przy niskiej mocy lasera. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego pola widzenia dostosuj moc lasera do 3.6 miliwata.Następnie przejdź do sekcji skanowania i kliknij pojedyncze skanowanie, aby przechwycić obraz z pierwszego kanału w ciągu 60 sekund. Aby zebrać obraz z kanału drugiego, kliknij zakładkę Laser 2P i wybierz 890 nanometrów dla lasera. Zastąp kostkę filtra kostką emisyjną kanału drugiego.Uruchom tryb podglądu. Zwiększaj Pockels, aż miernik mocy pokaże około siedmiu miliwatów, a liczba CFD będzie mieścić się w przedziale od 10 000 do 100 000. Kliknij pojedynczy skan i przechwyć obraz z kanału drugiego w czasie 60 sekund.Konfokalne obrazowanie autofluorescencyjne zastosowano do różnicowania między spoczynkowymi nerwowymi komórkami macierzystymi a aktywowanymi nerwowymi komórkami macierzystymi. Stwierdzono, że qNSC wykazują większą liczbę PAF niż aNSC, co świadczy o zastosowaniu autofluorescencji jako markera do identyfikacji stanu komórki. Za pomocą FACS stany komórek NSC wzbogacono na podstawie autofluorescencji.Komórki posortowane z bramki o wysokiej autofluorescencji wykazywały niższy współczynnik proliferacji w porównaniu z próbką mieszaną, podczas gdy te z bramki o niskiej autofluorescencji były bardziej proliferacyjne, co potwierdza wzbogacenie stanów aktywacji NSC. Ponadto FLIM wykorzystano do oceny autofluorescencji NSC i rozpoznania stanu aktywacji NSC. Warto zauważyć, że qNSC wykazały wyższy średni czas trwania fluorescencji w kanale pierwszym, ale niższy odsetek składnika fluorescencji alfa jeden w porównaniu z aNSC.Model regresji logistycznej obejmujący dane z obu kanałów pozwolił uzyskać niemal idealną zdolność predykcyjną dla stanów aktywacji NSC, na co wskazuje krzywa charakterystyki operatora odbiornika, podkreślająca potencjał FLIM w klasyfikowaniu stanów NSC. Zgodnie z tą procedurą, dobrze byłoby zweryfikować wyniki przy użyciu innych podejść do pomiaru stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych.

classification-neural-stem-cell-activation-state-vitro-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Źródło: Daynac, M., et. al. Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje obrazowanie poklatkowe nerwowych komórek macierzystych (NSC) z mózgu transgenicznej myszy przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. NSC fluoryzują na czerwono podczas fazy G1 i są niefluorescencyjne w innych fazach cyklu komórkowego. Przylegającą...

Obrazowanie poklatkowe podziału nerwowych komórek macierzystych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Źródło: Sharma, A. D., et.al. Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych w celu dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych. J. Vis. Exp. (2015)Film ten pokazuje proces charakteryzowania transgenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych zaprojektowanych do ekspresji terapeutycznych czynników neurotroficznych. Przedstawiono w nim etapy związane z utrwalaniem, przepuszczalnością i barwieniem komórek za pomocą pierwszorzędowych...

Charakterystyka genetycznie modyfikowanych mezenchymalnych komórek macierzystych do zastosowań neuroterapeutycznych

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) odnoszą się do komórek, które mogą samoodnawiać się i różnicować w trzy linie nerwowe. W tym miejscu opisujemy protokół określania częstości NSC w danej populacji komórek za pomocą tworzenia i różnicowania neurosfery w warunkach klonalnych.

Liczenie nerwowych komórek macierzystych za pomocą testów klonalnych

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj metodę klasyfikacji stanu aktywacji komórek macierzystych mózgu myszy przy użyciu autofluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia analizę żywych komórek bez znakowania oraz wzbogacanie populacji komórek w stanie spoczynku i aktywacji.

Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Przeglądaj więcej filmów