Klasyfikacja stanu aktywacji neuronalnych komórek macierzystych in vitro za pomocą autofluorescencji

Protokół ten zapewnia nowe podejście do klasyfikacji stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych z kohortą zalet technicznych. Korzystając z tego protokołu, możemy uzyskać analizę stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych bez znaczników pojedynczych komórek. Protokół ten może być wykorzystany do rzucenia światła na mechanizmy regulujące neurogenezę dorosłych.

Autofluorescencja jest znacznie ciemniejsza niż wiele fluoroforów, do których przywykli naukowcy. Miej pewność, że do zbierania danych używasz wyższych mocy lasera. Procedurę zademonstruje Chris Morrow, były doktorant z mojego laboratorium.

Zacznij od skonfigurowania mikroskopu konfokalnego do obrazowania autofluorescencyjnego. Kliknij opcję 405 Laser (Laser 405) i wpisz tekst w oknie emisji w menu 405 laser (Laser 405). Przejdź do kliknięcia TD, aby zebrać obraz w świetle przechodzącym i ustaw wartość HV, aby zobrazować próbkę.

Dostosuj moc lasera na 3.5% i ustaw wzmocnienie na 75. Ustaw powiększenie na dwa. Dla parametrów skanowania konfokalnego ustaw zatrzymanie pikseli na 0,5, a rozdzielczość na 2048 na 2048 pikseli.

Używając soczewki obiektywowej 60X zanurzonej w oleju w jasnym polu, ustaw ostrość komórek. Kliknij opcję Port oczu, aby przełączyć się na tryb skanowania konfokalnego. Upewnij się, że ścieżka światła jest skierowana w stronę głowicy skanującej i upewnij się, że żadna kostka filtra nie zasłania ścieżki światła.

Kliknij przycisk Skanuj, a następnie ustaw ostrość na obrazie i kliknij przycisk Przechwyć, aby uzyskać obrazy autofluorescencji w spoczynkowych nerwowych komórkach macierzystych i aktywnych nerwowych komórkach macierzystych. Upewnij się, że zbierasz obrazy pojedynczej płaszczyzny z cytoplazmą komórek w ostrości, aby uzyskać reprezentatywny przekrój każdej komórki. Rozpocznij obrazowanie od niskiej mocy lasera i stopniowo zwiększaj moc, aż sygnał autofluorescencji będzie wykrywalny bez powodowania nasycenia.

Analizuj spoczynkowe nerwowe komórki macierzyste i aktywne nerwowe komórki macierzyste za pomocą cytometru przepływowego przy użyciu dyszy o średnicy 130 mikrometrów. Zastosuj warunki optyczne zgodnie z możliwościami przyrządu i wykryj punktową autofluorescencję. Zbierz co najmniej 10 000 singletowych qNSC i aNSC w pliku danych.

Wykorzystaj te dane do zaprojektowania bramek do zbierania wzbogaconej populacji qNSC lub aNSC. Następnie posortuj komórki singletowe do studzienek pokrytych lamininą PLO wypełnionych pożywką aNSC. Po FACS pozwól neuronalnym komórkom macierzystym inkubować przez trzy godziny.

Aby utrwalić komórki, dodaj 4% paraformaldehydu, upewniając się, że wystarczy przykryć dno naczynia i inkubować. Po 15 minutach przepuszczaj komórki za pomocą 0,25% Tritonu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie potraktuj komórki roztworem barwiącym EdU w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie przemyj próbki trzy razy przez 10 minut każda za pomocą PBS. Zacznij od użycia okularów, aby zlokalizować odpowiednie pole widzenia i dostosować ścieżkę światła do próbki pod mikroskopem, aby umożliwić obrazowanie w ciemności za pomocą wielofotonu. Skonfiguruj kolekcję obrazów kanału pierwszego.

Przejdź do zakładki wzmocnienia mocy i dostosuj wzmocnienie w PMT do 800. Kliknij zakładkę Laser 2P i wybierz 750 nanometrów jako długość fali lasera i upewnij się, że używana jest właściwa kostka filtrująca. Aby zebrać obraz z pierwszego kanału, kliknij kartę Power Gain (Wzmocnienie mocy) i ustaw Pockels na 30.

Następnie przejdź do sekcji skanowania na ekranie i kliknij Live Scan, aby uruchomić tryb podglądu. Stopniowo zwiększaj Pockels, aby uzyskać odpowiednie pole widzenia przy niskiej mocy lasera. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego pola widzenia dostosuj moc lasera do 3.6 miliwata.

Następnie przejdź do sekcji skanowania i kliknij pojedyncze skanowanie, aby przechwycić obraz z pierwszego kanału w ciągu 60 sekund. Aby zebrać obraz z kanału drugiego, kliknij zakładkę Laser 2P i wybierz 890 nanometrów dla lasera. Zastąp kostkę filtra kostką emisyjną kanału drugiego.

Uruchom tryb podglądu. Zwiększaj Pockels, aż miernik mocy pokaże około siedmiu miliwatów, a liczba CFD będzie mieścić się w przedziale od 10 000 do 100 000. Kliknij pojedynczy skan i przechwyć obraz z kanału drugiego w czasie 60 sekund.

Konfokalne obrazowanie autofluorescencyjne zastosowano do różnicowania między spoczynkowymi nerwowymi komórkami macierzystymi a aktywowanymi nerwowymi komórkami macierzystymi. Stwierdzono, że qNSC wykazują większą liczbę PAF niż aNSC, co świadczy o zastosowaniu autofluorescencji jako markera do identyfikacji stanu komórki. Za pomocą FACS stany komórek NSC wzbogacono na podstawie autofluorescencji.

Komórki posortowane z bramki o wysokiej autofluorescencji wykazywały niższy współczynnik proliferacji w porównaniu z próbką mieszaną, podczas gdy te z bramki o niskiej autofluorescencji były bardziej proliferacyjne, co potwierdza wzbogacenie stanów aktywacji NSC. Ponadto FLIM wykorzystano do oceny autofluorescencji NSC i rozpoznania stanu aktywacji NSC. Warto zauważyć, że qNSC wykazały wyższy średni czas trwania fluorescencji w kanale pierwszym, ale niższy odsetek składnika fluorescencji alfa jeden w porównaniu z aNSC.

Model regresji logistycznej obejmujący dane z obu kanałów pozwolił uzyskać niemal idealną zdolność predykcyjną dla stanów aktywacji NSC, na co wskazuje krzywa charakterystyki operatora odbiornika, podkreślająca potencjał FLIM w klasyfikowaniu stanów NSC. Zgodnie z tą procedurą, dobrze byłoby zweryfikować wyniki przy użyciu innych podejść do pomiaru stanu aktywacji nerwowych komórek macierzystych.