Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Weźmy nieruchome odcinki mózgu myszy zawierające komórki nerwowe, w tym proliferowane nerwowe komórki macierzyste znakowane EdU, analogiem tymidyny.

Obrysuj sekcje hydrofobowym oznaczeniem, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się roztworu.

Dodaj detergent, aby przepuszczalność tkanki. Umyj, aby usunąć nadmiar detergentu.

Dodaj fluorofor, aby oznaczyć EdU. Usuń nadmiar fluoroforów.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego potwierdź prawidłowe barwienie komórek znakowanych EdU.

Zastosuj bufor blokujący zawierający białka, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał nieswoistych. Usuń nadmiar białek.

Inkubacja z pierwotnymi przeciwciałami, które wiążą się ze specyficznymi białkami w nerwowych komórkach macierzystych. Usunąć niezwiązane przeciwciała.

Dodaj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, aby związać przeciwciała pierwszorzędowe. Zmyć niezwiązane przeciwciała.

Zabarwić jądra barwnikiem i usunąć nadmiar barwnika.

Usuń oznaczenie hydrofobowe, nałóż media montażowe i umieść szkiełko nakrywkowe.

Za pomocą mikroskopu konfokalnego obserwuj sekcje, aby uwidocznić oznakowane nerwowe komórki macierzyste.

Aby zabarwić skrawki tkanki analogiem tymidyny, należy usunąć skrawki tkanki z buforu cytrynianu. Pozwól skrawkom tkanki wyschnąć i całkowicie przylegać do szkiełek przed narysowaniem obramowania za pomocą hydrofobowego pisaka. Następnie przepuszczalność skrawków za pomocą buforu przepuszczalnego przez 20 do 30 minut. Umyj sekcje dwukrotnie za pomocą TBS Triton przez 5 minut za każdym razem. Następnie przygotuj roztwór reakcyjny EdU.

Inkubować skrawki w roztworze reakcyjnym EdU przez 30 minut do godziny. Następnie umyj je trzy razy w TBS Triton przez 5 minut za każdym razem. Na tym etapie należy sprawdzić, czy reakcja EdU przebiega za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Komórki znakowane EdU należy obserwować, jeśli reakcja działa. Teraz zablokuj zamontowane skrawki tkanki za pomocą buforu blokującego wyhodowanego u tego samego zwierzęcia co przeciwciało drugorzędowe przez 30 minut do godziny. Następnie umyj je dwukrotnie w TBS Triton przez 5 minut za każdym razem.

Na etapie blokowania należy przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, mieszając przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym. Następnie dodaj 250 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełko, aby upewnić się, że skrawki tkanki są całkowicie zanurzone, i inkubuj je przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia należy przemyć skrawki tkanek trzy razy w TBS Triton przez 5 minut każda, aby usunąć nadmiar przeciwciał pierwotnych.

Następnie inkubować skrawki tkanki w przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem przygotowanym w blokującym roztworze buforowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Przemyj skrawki tkanek trzy razy w TBS Triton przez 5 minut każdy, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych. Następnie nałóż 300 mikromolowy roztwór DAPI o stężeniu 1 do 100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj skrawki tkanki trzy razy w PBS przez pięć minut każdy, aby usunąć nadmiar DAPI, i usuń krąg pisaka PAP wokół tkanki za pomocą bawełnianego wacika. Pozostaw sekcje do wyschnięcia przed nałożeniem mediów montażowych i przykryciem ich szkiełkami nakrywkowymi.