Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Weź szkiełko przepływowe zawierające podpartą dwuwarstwę lipidową lub SLB.

SLB jest sprzężony ze specyficznymi ligandami - cząsteczką adhezji międzykomórkowej 1 lub ICAM-1 i przeciwciałami anty-CD3 - znakowanymi fluoroforami.

Dodaj limfocyty T i znakowany fluoroforem anty-CD107a Fab - fragment przeciwciała wiążącego antygen przeciwko markerowi degranulacji.

Kompleks receptora limfocytów T-CD3 lub TCR-CD3 wiąże się z przeciwciałem anty-CD3, wyzwalając TCR.

Indukowana wyzwalaniem sygnalizacja inside-out aktywuje integryny na powierzchni, które wiążą się z unieruchomionym ICAM-1.

Koniugacja indukuje reorganizację cytoszkieletu - przegrupowanie mikrotubul i polimeryzację aktyny, która prowadzi do bocznego rozprzestrzeniania się komórki na powierzchni SLB.

Rozprzestrzenianie się pozwala na więcej interakcji ligand-receptor w celu utworzenia supramolekularnego klastra aktywacji lub SMAC, tworząc synapsę immunologiczną.

Granulki lityczne limfocytów T poruszają się wzdłuż mikrotubul i łączą się z błoną plazmatyczną, odsłaniając markery degranulacji na powierzchni komórki, które wiążą się z anty-CD107a Fab.

Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego uwidocznij synapsę immunologiczną wzbogaconą w kompleksy TCR-CD3, integryny i markery degranulacji.

Zacznij od użycia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby zanurzyć szklane szkiełka nakrywkowe w świeżo przygotowanym kwaśnym roztworze piranii na 25 do 30 minut. Pod koniec prania opłucz szkiełka nakrywkowe siedem razy w świeżej objętości ultraczystej wody przy każdym myciu i odłóż mokre szkiełka nakrywkowe na bok, aby pozostała woda spłynęła z czystej szklanki.

Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, dokładnie podniec dwa mikrolitry końcowej mieszaniny liposomów w środku samoprzylepnego kanału suwakowego w sterylnym kapturze przepływowym i natychmiast, ale ostrożnie, wyrównaj jedno czyste i suche szkiełko nakrywkowe ze szkiełkiem, aby umożliwić delikatne opuszczenie szkiełka nakrywkowego na lepką stronę szkiełka i użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby delikatnie docisnąć obwodowy kontakt szkiełka Szkiełko nakrywkowe ze szkiełkiem, upewniając się, że szkiełko jest szczelnie przymocowane do szkiełka, aby zapobiec wyciekom. Następnie odwróć slajd i za pomocą markera permanentnego narysuj cztery kropki wokół dwuwarstwy po zewnętrznej stronie zespołu szkiełka.

Przed pierwszym wstrzyknięciem należy wyznaczyć jeden port kanału jako port wejściowy, a drugi jako port wyjściowy, zachowując to oznaczenie przez cały czas trwania eksperymentu. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, włóż końcówkę końcówki pipety bezpośrednio do portu wejściowego, aż poczujesz, że gumowa uszczelka kanału suwaka jest penetrowana końcówką.

Powoli napełnij kanał 50 mikrolitrami ciepłego buforu testowego. Wstrzyknąć 200 mikrolitrów chlorku niklu(II) w roztworze blokującym kazeinę do portu wejściowego i usunąć 50 mikrolitrów buforu z portu wyjściowego. Po 45-minutowej inkubacji usunąć nadmiar roztworu kazeiny z portu wyjściowego.

Wstrzyknąć 100 mikrolitrów roztworu ICAM-1 i streptawidyny do portu wejściowego na 45-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego i przemyć dwuwarstwę dwa razy 100 mikrolitrami buforu do oznaczania na przemycie. Następnie oznacz dwuwarstwy 100 mikrolitrami przeciwciała anty-CD3 sprzężonego z fluoroforem przez 45 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwa przemycia w 100 mikrolitrach buforu testowego na pranie, jak pokazano.

Aby zobrazować interakcje limfocytów T z dwuwarstwą, umieść szkiełko na podgrzewanym pod kątem 37 stopni Celsjusza mikroskopu z fluorescencją całkowitego wewnętrznego odbicia lub TIRF i wyreguluj stolik za pomocą śladów atramentu, aby wyśrodkować dwuwarstwę na obiektywie o mocy 100.

W celu obrazowania uwalniania granulek dodać sprzężone fluorescencyjnie fragmenty Fab przeciwciała anty-CD107a do zawiesiny limfocytów T CD4 i ponownie zawiesić znakowane komórki w 50 mikrolitrach buforu testowego do wstrzyknięcia do portu wejściowego kanału szkiełkowego. Następnie należy wybrać odpowiednią liczbę pól doświadczalnych i rejestrować obrazy każdego pola raz na minutę przez 30 minut po wstrzyknięciu.