Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Ten test umożliwia studentowi przyjrzenie się konkretnym cząsteczkom w wielu procesach rozwojowych, takich jak różnicowanie i morfogeneza komórek, poprzez wszczepienie kulek w różne regiony zarodka. Protokół ten można zastosować do dowolnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych, hodowli komórkowych, modeli organotypowych, w tym organoidów. Ponadto jest to pomocne narzędzie edukacyjne do nauczania uczniów podstawowej biologii rozwojowej.

Procedurę zademonstruje Alexandra Gonzales-Gonzales, studentka studiów licencjackich z laboratorium. Na początek wysiaduj zapłodnione białe jaja kurze Leghorn pionowo spiczastą stroną do dołu w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 70%. Gdy dotrą do 28. etapu, według Hamburgera i Hamiltona, wyjmij jaja z inkubatora, zamień je na 70% etanol i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Następnie zdezynfekuj obszar roboczy, mikroskopy i instrumenty 70% etanolem. Następnie zapal jaja, aby zidentyfikować naczynia krwionośne i zlokalizować zarodek. Wyrzuć jaja, które nie mają zarodka.

Używając końca kleszczy bez zębów, otwórz okno, stukając końcem jajka i usuń jednocentymetrowy fragment skorupy. Następnie przenieś jajko do kartonu lub plastikowego uchwytu i umieść je pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych usuń wszelkie małe kawałki skorupki jaja, które mogłyby zetknąć się z zarodkiem i usuń błonę powietrzną, nakłuwając ją i wyciągając.

Następnie za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych lekko rozerwij worek owodniowy, uważając, aby nie uszkodzić układu krwionośnego błony kosmówkowej. Etapuj zarodki in ovo, aby określić, czy są w pożądanym stadium. W celu przygotowania kulek heparyny Affi-gel wytnij kwadratowy fragment parafilmu, aby zmieścił się w 45-milimetrowej szalce Petriego.

Po umieszczeniu parafilmu na dnie szalki Petriego, za pomocą końcówki kleszczy niezębatych, popchnij każdy wierzchołek i przymocuj go do dna szalki. Następnie, za pomocą pipety lub szpatułki, przenieś kulki do probówki z mikrowirówką i umyj je dwukrotnie PBS, pozwalając im osiąść i odpipetować supernatant. Następnie, za pomocą mikropipety, przenieś od 40 do 50 kulek na środek pokrytej parafilmem szalki Petriego.

Pod mikroskopem wybierz 30 kulek Affi-gel lub heparyny o średnicy 100 mikrometrów. Zmierz rozmiar koralików, używając trzeciego palca zarodka w 28 stadium jako odniesienia. Koralik musi być mniejszy niż interdigen.

Po dokładnym usunięciu nadmiaru PBS otaczającego wybrane kulki, namocz je w dwóch do pięciu mikrolitrach roztworu zabiegowego. Inkubuj kulki w roztworze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji, aby zapobiec wysychaniu kulek, odpipetuj kilka kropel PBS lub wody wokół kulek, aby nawilżyć lokalną atmosferę i przykryj naczynie parafilmem, aby spowolnić parowanie.

Wlać preparat do kulek AG1X2. Za pomocą szpatułki przenieś kulki do mikroprobówki wirówkowej i dodaj 50 mikrolitrów roztworu zabiegowego o pożądanym stężeniu końcowym. Po owinięciu probówek folią, aby chronić je przed światłem, inkubuj koraliki przez 20 minut przy powolnym potrząsaniu.

Po inkubacji, za pomocą pipety, usunąć jak najwięcej roztworu leczniczego w barwie z 0,2% czerwienią fenolową rozpuszczoną w wodzie przez dwie minuty, lekko mieszając w wirze. Po zabarwieniu usuń barwnik, a następnie umyj koraliki dwukrotnie w PBS, aby usunąć resztki barwnika. Następnie, za pomocą końcówki do mikropipet, przenieś od 40 do 50 kulek AG1X2 na środek pokrytej paraformą szalki Petriego i namocz kulki w pięciu mikrolitrach PBS.

Następnie pod mikroskopem wybierz około 30 koralików o średnicy 100 mikrometrów. Zanurz wybrane koraliki w roztworze eksperymentalnym z kilkoma kroplami PBS lub wody wokół kulek, aby nawilżyć lokalną atmosferę. Przykryj naczynie parafilmem, aby spowolnić parowanie.

Przed manipulowaniem zarodkami ustaw dwa mikroskopy stereoskopowe obok siebie na blacie stołu. Następnie za pomocą kleszczy nieząbkowanych utwórz okienko w pozostałych jajach. Następnie pod mikroskopem rozerwać błonę owodniową w pobliżu prawej kończyny tylnej za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych.

Za pomocą cienkich kleszczy przytrzymaj zarodek za błonę owodniową, aby odsłonić prawą tylną kończynę. Następnie za pomocą cienkiej igły wolframowej wykonaj otwór wyśrodkowany w odległości trzeciego palca tylnej kończyny. Nie uwalniając zarodka i odsłoniętej kończyny tylnej, weź jeden leczony koralik z drugiego mikroskopu za pomocą jednej z końcówek kleszczy.

Kleszcze muszą być otwarte, aby jeden koralik przylegał do jego końcówki. Przenieś koralik do zarodka pisklęcia w pobliżu tylnej kończyny, umieszczając go na górze otworu międzypalcowego. Wywieraj nacisk na koralik, zamykając kleszcze, aż wejdzie do otworu.

Następnie uwolnij zarodek, uszczelnij okienko skorupki jajka taśmą i włóż jaja z powrotem do inkubatora, aż osiągną wymagany etap. Aby zapewnić skuteczność testu, stopka musi być umieszczona konsekwentnie i precyzyjnie we właściwym miejscu. W tym badaniu nasączony koralik umieszczono w rozkroku trzeciego palca poniżej wierzchołkowego grzbietu ektodermalnego.

Zarodki można barwić błękitem oceanicznym i czerwienią alizarynową, aby udowodnić tworzenie się elementów szkieletowych i ocenić wpływ na różnicowanie komórek. Ten test dobrze nadaje się również do oceny śmierci komórki z neutralną czerwienią i regulacją genów, kupując hybrydyzację C2. Główną zaletą tego eksperymentalnego narzędzia jest kontrolowanie czasu i lokalizacji namoczonych koralików.

Połączenie pozycjonowania rdzenia z precyzyjnym wyczuciem czasu rozwoju daje ogromne możliwości badania procesów różnicowania komórek.