Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami
12 stycznia 2022
Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.
Ten test umożliwia studentowi przyjrzenie się konkretnym cząsteczkom w wielu procesach rozwojowych, takich jak różnicowanie i morfogeneza komórek, poprzez wszczepienie kulek w różne regiony zarodka. Protokół ten można zastosować do dowolnych eksperymentalnych modeli zwierzęcych, hodowli komórkowych, modeli organotypowych, w tym organoidów. Ponadto jest to pomocne narzędzie edukacyjne do nauczania uczniów podstawowej biologii rozwojowej.
Procedurę zademonstruje Alexandra Gonzales-Gonzales, studentka studiów licencjackich z laboratorium. Na początek wysiaduj zapłodnione białe jaja kurze Leghorn pionowo spiczastą stroną do dołu w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 38 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 70%. Gdy dotrą do 28. etapu, według Hamburgera i Hamiltona, wyjmij jaja z inkubatora, zamień je na 70% etanol i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
Następnie zdezynfekuj obszar roboczy, mikroskopy i instrumenty 70% etanolem. Następnie zapal jaja, aby zidentyfikować naczynia krwionośne i zlokalizować zarodek. Wyrzuć jaja, które nie mają zarodka.
Używając końca kleszczy bez zębów, otwórz okno, stukając końcem jajka i usuń jednocentymetrowy fragment skorupy. Następnie przenieś jajko do kartonu lub plastikowego uchwytu i umieść je pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych usuń wszelkie małe kawałki skorupki jaja, które mogłyby zetknąć się z zarodkiem i usuń błonę powietrzną, nakłuwając ją i wyciągając.
Następnie za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych lekko rozerwij worek owodniowy, uważając, aby nie uszkodzić układu krwionośnego błony kosmówkowej. Etapuj zarodki in ovo, aby określić, czy są w pożądanym stadium. W celu przygotowania kulek heparyny Affi-gel wytnij kwadratowy fragment parafilmu, aby zmieścił się w 45-milimetrowej szalce Petriego.
Po umieszczeniu parafilmu na dnie szalki Petriego, za pomocą końcówki kleszczy niezębatych, popchnij każdy wierzchołek i przymocuj go do dna szalki. Następnie, za pomocą pipety lub szpatułki, przenieś kulki do probówki z mikrowirówką i umyj je dwukrotnie PBS, pozwalając im osiąść i odpipetować supernatant. Następnie, za pomocą mikropipety, przenieś od 40 do 50 kulek na środek pokrytej parafilmem szalki Petriego.
Pod mikroskopem wybierz 30 kulek Affi-gel lub heparyny o średnicy 100 mikrometrów. Zmierz rozmiar koralików, używając trzeciego palca zarodka w 28 stadium jako odniesienia. Koralik musi być mniejszy niż interdigen.
Po dokładnym usunięciu nadmiaru PBS otaczającego wybrane kulki, namocz je w dwóch do pięciu mikrolitrach roztworu zabiegowego. Inkubuj kulki w roztworze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji, aby zapobiec wysychaniu kulek, odpipetuj kilka kropel PBS lub wody wokół kulek, aby nawilżyć lokalną atmosferę i przykryj naczynie parafilmem, aby spowolnić parowanie.
Wlać preparat do kulek AG1X2. Za pomocą szpatułki przenieś kulki do mikroprobówki wirówkowej i dodaj 50 mikrolitrów roztworu zabiegowego o pożądanym stężeniu końcowym. Po owinięciu probówek folią, aby chronić je przed światłem, inkubuj koraliki przez 20 minut przy powolnym potrząsaniu.
Po inkubacji, za pomocą pipety, usunąć jak najwięcej roztworu leczniczego w barwie z 0,2% czerwienią fenolową rozpuszczoną w wodzie przez dwie minuty, lekko mieszając w wirze. Po zabarwieniu usuń barwnik, a następnie umyj koraliki dwukrotnie w PBS, aby usunąć resztki barwnika. Następnie, za pomocą końcówki do mikropipet, przenieś od 40 do 50 kulek AG1X2 na środek pokrytej paraformą szalki Petriego i namocz kulki w pięciu mikrolitrach PBS.
Następnie pod mikroskopem wybierz około 30 koralików o średnicy 100 mikrometrów. Zanurz wybrane koraliki w roztworze eksperymentalnym z kilkoma kroplami PBS lub wody wokół kulek, aby nawilżyć lokalną atmosferę. Przykryj naczynie parafilmem, aby spowolnić parowanie.
Przed manipulowaniem zarodkami ustaw dwa mikroskopy stereoskopowe obok siebie na blacie stołu. Następnie za pomocą kleszczy nieząbkowanych utwórz okienko w pozostałych jajach. Następnie pod mikroskopem rozerwać błonę owodniową w pobliżu prawej kończyny tylnej za pomocą cienkich kleszczy chirurgicznych.
Za pomocą cienkich kleszczy przytrzymaj zarodek za błonę owodniową, aby odsłonić prawą tylną kończynę. Następnie za pomocą cienkiej igły wolframowej wykonaj otwór wyśrodkowany w odległości trzeciego palca tylnej kończyny. Nie uwalniając zarodka i odsłoniętej kończyny tylnej, weź jeden leczony koralik z drugiego mikroskopu za pomocą jednej z końcówek kleszczy.
Kleszcze muszą być otwarte, aby jeden koralik przylegał do jego końcówki. Przenieś koralik do zarodka pisklęcia w pobliżu tylnej kończyny, umieszczając go na górze otworu międzypalcowego. Wywieraj nacisk na koralik, zamykając kleszcze, aż wejdzie do otworu.
Następnie uwolnij zarodek, uszczelnij okienko skorupki jajka taśmą i włóż jaja z powrotem do inkubatora, aż osiągną wymagany etap. Aby zapewnić skuteczność testu, stopka musi być umieszczona konsekwentnie i precyzyjnie we właściwym miejscu. W tym badaniu nasączony koralik umieszczono w rozkroku trzeciego palca poniżej wierzchołkowego grzbietu ektodermalnego.
Zarodki można barwić błękitem oceanicznym i czerwienią alizarynową, aby udowodnić tworzenie się elementów szkieletowych i ocenić wpływ na różnicowanie komórek. Ten test dobrze nadaje się również do oceny śmierci komórki z neutralną czerwienią i regulacją genów, kupując hybrydyzację C2. Główną zaletą tego eksperymentalnego narzędzia jest kontrolowanie czasu i lokalizacji namoczonych koralików.
Połączenie pozycjonowania rdzenia z precyzyjnym wyczuciem czasu rozwoju daje ogromne możliwości badania procesów różnicowania komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Test z nasączonymi koralikami umożliwia ukierunkowane dostarczanie reagentów testowych na różnych etapach rozwoju w celu zbadania różnicowania komórek i morfogenezy. Ten protokół jest zastosowany do każdego eksperymentalnego modelu zwierzęcego, w tym do zarodków kurczaka.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Różnicowanie komórek
- Embriologia
Tło
- Test z nasączonymi koralikami to metoda badania określonych cząstek zaangażowanych w procesy rozwojowe.
- Może być stosowany do różnych modeli eksperymentalnych, w tym modeli organotypowych i organoidalnych.
- Ta metoda służy jako narzędzie edukacyjne do nauki podstawowych pojęć w biologii rozwoju.
- Demonstrację procedury przeprowadza student pierwszego roku.
Cel badania
- Zbadać regulację różnicowania komórek i morfogenezy.
- Przedstawić szczegółowy protokół przygotowywania i implantacji nasączonych koralików.
- Poprawić doświadczenia edukacyjne w biologii rozwoju.
Zastosowane metody
- Inkubacja zapłodnionych jaj kurczaka w środowisku zwiększonej wilgotności.
- Przygotowanie nasączonych koralików do implantacji.
- Implantacja koralików do określonych regionów zarodka.
- Obserwacja procesów rozwojowych po implantacji.
Główne wyniki
- Test z powodzeniem wykazuje wpływ reagentów testowych na różnicowanie komórek.
- Dostarcza wglądu w procesy morfogenetyczne w zarodkach.
- Protokół jest przystosowany do różnych modeli zwierzęcych.
- Studenci zdobywają praktyczne doświadczenie w technikach biologii rozwoju.
Wnioski
- Test z nasączonymi koralikami jest wszechstronnym narzędziem do badania biologii rozwoju.
- Ułatwia zrozumienie złożonych procesów biologicznych.
- Ta metoda może być skutecznie wykorzystywana w środowiskach edukacyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The soaked-bead assay enables precise spatial and temporal delivery of morphogens or candidate molecules in embryonic models, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By controlling the local microenvironment, this method provides actionable insights into cell fate decisions, morphogenesis, and patterning, directly informing predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline. Its adaptability across model systems enhances portfolio-wide translational continuity and supports robust hypothesis testing for developmental targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of morphogen-driven pathways and cell fate specification in a controlled in vivo context.
- Supports functional validation of candidate targets by isolating the effects of specific molecules on tissue patterning.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct observation of developmental outcomes following localized perturbation.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of gene or protein function in embryonic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated embryonic systems for downstream screening of bioactive compounds or biologics.
- Enables reproducible, quantitative assessment of phenotypic changes in response to localized molecular delivery.
- Supports assay standardization through precise bead placement and developmental staging.
- Allows for scalable adaptation to other model organisms or organotypic systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental phenotypes with disease-relevant pathways for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying the functional impact of candidate molecules on tissue formation.
- Supports predictive de-risking for developmental and regenerative medicine programs.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging hypothesis-driven target validation with phenotypic screening in embryonic models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling localized delivery and observation of morphogen effects.
- Screening: Provides reproducible, quantitative phenotypic outputs for compound or protein evaluation.
- Analytics: Facilitates measurement of cell differentiation, patterning, and morphogenetic outcomes for comparative analysis.
- Translational Research: Connects developmental findings to preclinical model systems and potential biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse developmental and mechanistic studies across the portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for developmental assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of developmental and regenerative programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryology, developmental biology, and precise microsurgical manipulation.
- Needs access to stereomicroscopes, controlled incubators, and bead preparation infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for bead placement, developmental staging, and phenotypic assessment.
- Adaptable to various animal models and organotypic systems with protocol optimization.
- Limitations include technical variability in bead placement and the need for precise developmental timing.
