Name: Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj metodę reaktywacji komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Technika umożliwia badanie wpływu czynników zewnętrznych na neuroblasty i może wspierać rozwój terapii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uznajemy program LSAMP Bridges to Doctorate do finansowania (CNK) oraz NIH/NIGMS (R01-GM120421 i R35-GM141886). Jesteśmy wdzięczni dr Conorowi Sipe'owi za rysunek 1. Dziękujemy również wszystkim członkom laboratorium Siegrist za ich nieustające wsparcie i mentoring. Szczególne podziękowania kierujemy do Chhavi Sooda i Gary'ego Teetersa za uważne zapoznanie się z manuskryptem i udzielenie komentarzy.

<ol><li>Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+applications+of+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).</li>
<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+challenges+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+the+evolving+notion+of+cellular+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem cells and the evolving notion of cellular identity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376(2015).</li>
<li>Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+A+cellular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Wound healing: A cellular perspective.</a> Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).</li>
<li>van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+quiescence%3A+Dynamism%2C+restraint%2C+and+cellular+idling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling.</a> Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).</li>
<li>Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+coordination+of+T+cell+quiescence+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic coordination of T cell quiescence and activation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).</li>
<li>Wosczyna, M. N., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+muscle+stem+cell+support+group%3A+Coordinated+cellular+responses+in+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration.</a> Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).</li>
<li>Chell, J. M., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition-responsive+glia+control+exit+of+neural+stem+cells+from+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence.</a> Cell. 143, 1161-1173 (2010).</li>
<li>Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+cells+reactivate+quiescent+neuroblasts+via+TOR+and+glial+insulin+relays+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila.</a> Nature. 471, 508-512 (2011).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremes+of+lineage+plasticity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain.</a> Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).</li>
<li>Sipe, C. W., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyeless+uncouples+mushroom+body+neuroblast+proliferation+from+dietary+amino+acids+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila.</a> Elife. 6, 26343(2017).</li>
<li>Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+local+cues+drive+neural+stem+cell+niche+remodelling+during+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila.</a> Elife. 7, 30413(2018).</li>
<li>Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilp-2-mediated+PI3-kinase+activation+coordinates+reactivation+of+quiescent+neuroblasts+with+growth+of+their+glial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche.</a> PLoS Biology. 18, 3000721(2020).</li>
<li>Colombani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+insulin+secretion+by+fat+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
<li>Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuroblast+proliferation+in+explant+culture+of+the+Drosophila+larval+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS.</a> Brain Research. 818, 77-83 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Opisana tutaj metoda hodowli eksplantatów mózgu może być przeprowadzona w większości środowisk laboratoryjnych. Wymagane narzędzia, a także procedura i gromadzenie danych są proste i nieskomplikowane. Za pomocą tej metody można testować różne hipotezy, w tym te związane z kaskadami sygnalizacji komórkowej i czynnikami zewnętrznymi, które regulują reaktywację i proliferację NB. Tutaj, wykorzystując dzikie zwierzęta OregonR, stwierdziliśmy, że egzogenna insulina była wystarczająca do reaktywacji NB ze stanu spoczynku, niez...

Komórki macierzyste budzą duże zainteresowanie ze względu na ich potencjał zastosowania w medycynie regeneracyjnej1,2. Wiele zwierząt, szczególnie gatunki długowieczne, posiada komórki macierzyste w obrębie tkanek dorosłego organizmu. Te rezydentne komórki macierzyste służą do utrzymania homeostazy tkankowej i są wykorzystywane do naprawy po urazach fizycznych lub w wyniku chorób3,4. Większość komórek macierzystych u dorosłych zwierząt znajduje się w stanie spoczynku (quiescence), czyli względnie uśpionym stanie charakteryzującym się zatrzymaniem cyklu komórkowego i nieaktywnością sygnałów wzrostu5. W odpowiedzi na sygnały zewnętrzne komórki macierzyste wychodzą ze stanu spoczynku, wchodzą w cykl komórkowy i zaczynają generować komórki potomne specyficzne dla danego typu tkanki. Na przykład, aby wywołać skuteczną odpowiedź immunologiczną, komórki prezentujące antygen indukują naiwne limfocyty T w stanie spoczynku do wejścia w cykl komórkowy i ekspansji klonalnej6. W odpowiedzi na uszkodzenie mięśni szkieletowych, komórki satelitarne mięśni wchodzą w cykl komórkowy i generują mioblasty potomne w celu zastąpienia uszkodzonych miofibryli5,7. Choć wiadomo, że spoczywające komórki macierzyste reagują na sygnały zewnętrzne, w wielu przypadkach natura tych sygnałów oraz mechanizm indukowanej przez nie aktywacji komórek macierzystych pozostaje niejasna. Lepsze zrozumienie sposobu, w jaki spoczywające komórki macierzyste reagują na sygnały zewnętrzne i wchodzą w cykl komórkowy, pomoże w opracowaniu skuteczniejszych terapii opartych na komórkach macierzystych w praktyce klinicznej oraz poszerzy wiedzę naukową.
Od dziesięcioleci organizmy modelowe są wykorzystywane do odkrywania genów i szlaków sygnalizacji komórkowej, które regulują proliferację komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym. U Drosophila neuralne komórki macierzyste (NSCs), znane jako neuroblasty (NBs), dzielą się w trakcie całego rozwoju, aby wytworzyć wszystkie neurony i glej, które ostatecznie integrują się, tworząc obwody neuronalne niezbędne do funkcjonowania mózgu8,9. Podobnie jak inne komórki macierzyste, neuroblasty dzielą się asymetrycznie w celu samoodnowienia, a w niektórych przypadkach symetrycznie, aby zwiększyć pulę komórek macierzystych. Neuroblasty są specyfikowane podczas embriogenezy, a większość z nich wchodzi w stan uśpienia (quiescence) pod koniec tego procesu, co zbiega się ze spadkiem zapasów składników odżywczych pochodzących od matki (Rysunek 1). Po zakończeniu embriogenezy wykluwają się larwy i zaczynają odżywiać. W odpowiedzi na żerowanie zwierzęcia neuroblasty aktywują się z okresu uśpienia i wznawiają podziały komórkowe10,11,12,13,14,15,16. Ze względu na to, że OUN Drosophila jest stosunkowo prosta, a neuroblasty wchodzą w stan uśpienia i opuszczają go w ściśle określonych momentach, wykorzystanie Drosophila do badania regulacji uśpienia, jego inicjacji i zakończenia, okazuje się idealnym rozwiązaniem.
<img alt="Schemat proliferacji neuroblastów Drosophila; aktywność MBNB, CBNB; stadia rozwoju, wpływ karmienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Względna proliferacja neuroblastów CB (neuroblasty centralne mózgu, kolor czerwony) oraz neuroblastów MB (neuroblasty ciał grzybkowatych, kolor niebieski) w czasie rozwoju. Pod koniec embriogenezy większość neuroblastów (linia czerwona) zaprzestaje proliferacji i wchodzi w stan spoczynku (quiescence). Stan spoczynku trwa do momentu, gdy nowo wyklute larwy spożyją swój pierwszy pełny posiłek. Punkty czasowe będące przedmiotem tej metodologii są zaznaczone czerwonymi okręgami (1, spoczynek oraz 2, reaktywacja). Neuroblasty MB (kolor niebieski) stanowią podgrupę neuroblastów centralnych mózgu, które dzielą się nieprzerwanie przez cały okres rozwoju (4 na półkulę mózgu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W odpowiedzi na karmienie zwierzęcia, szlaki sygnalizacyjne wzrostu PI3-kinazy i TOR stają się aktywne w NBs oraz w ich niszy glejowej i tchawkowej10,11,15,16. Gdy składniki odżywcze z diety zostaną wycofane lub gdy poziomy PI3-kinazy zostaną obniżone, NBs nie ulegają reaktywacji, a wzrost glejowców i tchawki jest również zredukowany10,11,15,16. Obecny model zakłada, że reaktywacja NBs jest sprzężona ze wzrostem larwy poprzez ciało tłuszczowe, które w odpowiedzi na karmienie zwierzęcia uwalnia sygnał systemowy12,17,18. Sygnał ten, który wciąż pozostaje nieznany, prawdopodobnie promuje ekspresję i uwalnianie insulinopodobnych peptydów Drosophila (Dilps) w mózgu, co prowadzi do kaskadowej aktywacji PI3-kinazy w NBs oraz w ich niszy glejowej i tchawkowej. Aby lepiej zrozumieć naturę systemowych sygnałów, opracowaliśmy metodę reaktywacji spoczywających NBs w hodowlanych eksplantach mózgu. Dzięki tej metodzie reaktywację NBs można badać w obecności systemowych sygnałów z całego organizmu. Czynniki egzogenne mogą być ponownie dostarczane do pożywki hodowlanej, a reaktywację NBs ocenia się na podstawie wbudowania analogu tymidyny, EdU. Stosując tę metodę, ustaliliśmy, że egzogenna insulina jest wystarczająca do reaktywacji spoczywających NBs w eksplantach mózgu. Przyszłe prace będą ukierunkowane na identyfikację dodatkowych czynników, które po ponownym dodaniu pozytywnie lub negatywnie regulują spoczynek NBs w eksplantach mózgu.

<table><tbody><tr><td>10 &mikro; L Końcówki do pipet</td><td>Denville Sci</td><td>P2102</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>Denville Sci</td><td>P2103-N</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipettor</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd (10 x 10 mL)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>2912.60.0000</td><td>Służy do utrwalania mózgów larw</td></tr><tr><td>20 &mikro; L Pipeta</td><td>Gilson</td><td>P20</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; L Końcówki do pipet</td><td>Denville Sci</td><td>1158U56</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli wielodołkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4477</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>Talerz winogronowy Składniki</td></tr><tr><td>4 & C lodówka</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Zapewnia idealną temperaturę do >24 h inkubacji w roztworze przeciwciał</td></tr><tr><td>63x Obiektyw</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aktywne suche drożdże</td><td>Większość supermarketów</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td>Składniki talerza winogronowego</td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>do oznaczania komórek proliferujących</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm x 1 mm, 10 sztuk po 4 uncje</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Dwa szkiełka nakrywkowe są super przyklejone do końców szkiełka mikroskopowego. Tworzy to przestrzeń, która pozwala mózgom unosić się w antifade podczas obrazowania.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, 22 mm x 50 mm x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Szkiełko nakrywkowe umieszcza się na dwóch kwadratowych szkiełkach nakrywkowych na szkiełku mikroskopowym, dzięki czemu mózg w antifade nie porusza się podczas obrazowania.</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof (100%), Decon Labs, butelka o pojemności 1 galona</td><td>Fisher Scientific</td><td>2701</td><td>Służy do zmywania larw przed 24-godzinnym trzymaniem w pożywce hodowlanej</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (10%)</td><td>Sigma</td><td>F4135-100ML</td><td>Suplement do pożywek do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze do preparacji</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Forcepty stosowane w sekcjach. Najlepiej sprawdzają się po naostrzeniu.</td></tr><tr><td>Butelki na muchy do krzyżowania</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-130</td><td>Ta butelka służy jako pojemnik, który pozwala muchom składać jaja na talerzu winogronowym.</td></tr><tr><td>Szklane naczynie preparacyjne (3 dołki)</td><td>Nie są już dostępne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>Zapewnia ochronę oksydacyjną podczas hodowli komórek.</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma</td><td>G9023- 10ML</td><td>Środek</td></tr><tr><td>blokujący Talerze winogronowe</td><td>Wykonane w domu</td><td>Wyprodukowane w domu</td><td>Talerze soku winogronowego/agarozy do zbierania świeżo wyklutych jaj</td></tr><tr><td>Obraz J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>Bezpłatne pobieranie:&nbsp; https://fiji.sc</td><td>Platforma obrazowania, która służy do liczenia komórek i reaktywacji Edu</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Zapewnia, że temperatura, wilgotność i ekspozycja na światło są dokładnie takie same przez cały eksperyment.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Zmienna niezależna eksperymentu</td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym Do</td><td></td><td></td><td>porcjowania pożywek hodowlanych</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Zapewnia wsparcie podczas hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Nunc 72-dołkowe mini tace Microwell</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-154</td><td>Etapy barwienia immunologicznego są wykonywane w tej tacy</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>Folia służąca do uszczelniania płytek w celu zapobiegania parowaniu</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>Antybiodyka stosowana w celu zapobiegania zanieczyszczeniu bakteryjnemu komórek podczas hodowli.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy, pH 7,4</td><td>Wyprodukowano w</td><td>domu Wyprodukowano w domu</td><td>Rozpuszczalnik używany do mycia mózgów po etapach mocowania i barwienia</td></tr><tr><td>Wybierz</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td>Służy do zbierania larw z talerza winogronowego</td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-258</td><td>Składniki na talerz winogronowy</td></tr><tr><td>Królik 405</td><td>Abcam</td><td>ab175653</td><td>Przeciwciała stosowane do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Szczur 555</td><td>Abcam</td><td>ab150166</td><td>Przeciwciała używane do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Rb Scribble</td><td>Prezent od Chrisa Doe</td><td></td><td>Przeciwciała używane do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Rt Deadpan</td><td>Abcam</td><td>ab195173</td><td>Przeciwciała używane do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Schneiders Culture Medium</td><td>Life Tech</td><td>21720024</td><td>Zawiera składniki odżywcze, które pomagają komórkom rosnąć i namnażać</td></tr><tr><td>się SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)</td><td>Life Tech</td><td>S36963</td><td>Odczynnik zapewniający ochronę przed blaknięciem fluoroforów</td></tr><tr><td>Autoklaw sterylnej wody</td><td>Woda Milli-Q wyprodukowana we własnym zakresie</td><td></td><td>Potrzebne do roztworów</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S2-12</td><td>Tabliczka winogronowa Składniki</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Większość supermarketów</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td>Grape Plate Składniki</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td>PBT</td></tr><tr><td>100% sok winogronowy Welch's</td><td>Większość supermarketów</td><td></td><td>Składniki na talerz winogronowy</td></tr></tbody></table>

reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu drosophila

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) mają zdolność do namnażania się, różnicowania, przechodzenia apoptozy, a nawet wchodzenia i wychodzenia ze stanu spoczynku. Wiele z tych procesów jest kontrolowanych przez złożone wzajemne oddziaływanie między wewnętrznymi programami genetycznymi NSC a zewnętrznymi czynnikami NSC, lokalnymi i ogólnoustrojowymi. W modelowym organizmie genetycznym, Drosophila melanogaster, NSC, znane jako neuroblasty (NB), przechodzą ze stanu spoczynku do proliferacji podczas przejścia embrionalnego do larwalnego. W tym czasie larwy wyłaniają się ze skorupek jaj i zaczynają pełzać, szukając składników odżywczych w diecie. W odpowiedzi na karmienie zwierząt ciało tłuszczowe, narząd endokrynny o zdolności magazynowania lipidów, wytwarza sygnał, który jest uwalniany ogólnoustrojowo do krążącej hemolimfy. W odpowiedzi na sygnał pochodzący od ciała tłuszczowego (FBDS), peptydy insulinopodobne Drosophila (Dilps) są wytwarzane i uwalniane z neuronów neurowydzielniczych mózgu i gleju, co prowadzi do dalszej aktywacji sygnalizacji wzrostu kinazy PI3 w NB oraz ich niszy glejowej i tchawicy. Chociaż jest to obecny model przechodzenia NB ze stanu spoczynku do proliferacji, natura zewnętrznej wskazówki FBDS pozostaje nieuchwytna. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zewnętrzne sygnały ogólnoustrojowe NB regulują wyjście ze stanu spoczynku, opracowano metodę hodowli wczesnych mózgów larw in vitro przed karmieniem zwierząt. Dzięki tej metodzie czynniki egzogenne mogą być dostarczane do pożywki hodowlanej i NB wychodzić z oznaczonego stanu spoczynku. Odkryliśmy, że egzogenna insulina jest wystarczająca do reaktywacji NB ze stanu spoczynku w eksplantatach całego mózgu. Ponieważ metoda ta dobrze nadaje się do badań przesiewowych na dużą skalę, naszym celem jest zidentyfikowanie dodatkowych zewnętrznych wskazówek, które regulują decyzje dotyczące spoczynku NB w porównaniu z decyzjami dotyczącymi proliferacji. Ponieważ geny i szlaki, które regulują decyzje dotyczące proliferacji NSC, są ewolucyjnie zachowane, wyniki tego testu mogą dostarczyć informacji na temat poprawy terapii regeneracyjnych w klinice.

Mózgi świeżo wyklutych osobników typu dzikiego OregonR wypreparowano i hodowano przez 24 h w suplementowanym medium Schneidera (SSM) z dodatkiem insuliny. Tkanki utrwalono i barwiono zgodnie z protokołem. Wykorzystano przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko Deadpan (Dpn) w celu wykrycia NB oraz przeciwko Scribble do znakowania błon komórkowych. W celu wykrycia wejścia w fazę S oraz reaktywacji NB dodano analog tymidyny 5-etynylo-2′-deoksyurydynę (Edu). Po 24 h hodowli stwierdzono obecność dużych, Edu-dodatnich ...

Ustalono metodę reaktywacji uśpionych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Za pomocą tej metody można oddzielić rolę sygnałów ogólnoustrojowych od sygnałów wewnętrznych w tkance w regulacji spoczynku, wejścia i wyjścia nerwowych komórek macierzystych.

Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

Opracowaliśmy metodę reaktywacji spoczynkowych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu drosophila. Metoda ta może dostarczać czynniki egzogenne do pożywki hodowlanej i może oznaczać reaktywację neuroblastów. Lepsze terapie komórkami macierzystymi mogą zostać opracowane dzięki lepszemu zrozumieniu, w jaki sposób komórki macierzyste w stanie spoczynku reagują na sygnały zewnętrzne i wchodzą w cykl komórkowy.Procedurę zademonstruje Susan Doyle, naukowiec z mojego laboratorium. Na początek ostrożnie wybierz około 20 do 25 świeżo wyklutych larw z talerza agaru winogronowego pod mikroskopem preparacyjnym. Napełnij szalkę Petriego około dwoma mililitrami PBS i zanurz końcówkę narzędzia zawierającą larwy w PBS na dwie minuty.Po dwóch minutach przechyl naczynie pod kątem, aby zebrać płyn na dnie, a następnie za pomocą małego pędzla wyszczotkuj larwy z płynu na dnie szalki Petriego. Zbierz wszystkie larwy na pędzelku i krótko opłucz larwy w 70% etanolu przed przeniesieniem ich z powrotem na szalkę Petriego zawierającą PBS. Spryskaj obszar roboczy, narzędzia do preparacji, kleszcze i dwie szklane naczynia do zegarków 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na stole.Przygotuj uzupełnioną pożywkę Schneidera lub SSM i umieść ją na lodzie. Odpipetować jeden mililitr pożywki do każdego szklanego naczynia do zegarka. Za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką przenieś świeżo wyklute larwy z płytki PBS do SSM w pierwszym szklanym naczyniu do zegarka.Wypreparuj mózgi z larw umieszczonych w drugim szklanym naczyniu zegarkowym za pomocą SSM za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym i dostosowując powiększenie w razie potrzeby. Użyj jednego kleszczyka, aby chwycić haczyki do ust, a drugim delikatnie chwyć ciało do połowy i pociągnij w przeciwnym kierunku, aby podzielić larwę na dwie części. Po wypreparowaniu od 15 do 20 mózgów, dodaj jeden mililitr SSM do jednego dołka sterylnej 24-dołkowej tacki hodowlanej.Za pomocą mikropipety i sterylnej końcówki przenieś świeżo wypreparowane mózgi do SSM, a następnie kontynuuj inkubację pożywki z mózgami przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odpipetować 10 mikrolitrów 10-milimolowego zapasu 5-etynylo-2'deoksyurydyny lub EDU z 990 mikrolitrami SSM do sterylnej probówki mikrowirówkowej, wymieszać, a następnie odpipetować jeden mililitr EDU SSM do jednego dołka sterylnej 12-dołkowej tacki hodowlanej. Przenieść mózgi za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką z dołka zawierającego SSM do nowego dołka zawierającego roztwór SSM EDU i inkubować przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnie przenieś mózgi znakowane EDU do innego dołka w tej samej tacce hodowlanej zawierającej jeden mililitr utrwalacza i pozwól mózgom na utrwalenie przez 20 minut. Po utrwaleniu szybko przenieś mózgi do 72-dołkowych minitac za pomocą mikropipety. Opłucz mózgi trzy razy w 10 mikrolitrach PBT i powtórz trzy płukania przez 10 minut każde, upewniając się, że mózgi są zawsze pokryte jakimś płynem.Odpipetować 10 mikrolitrów roztworu blokującego na mózg. Przykryj tackę i uszczelnij ją paskiem parafilmu wokół krawędzi. Rysunek przedstawia duże komórki neuroblastów EDU-dodatnie i śmiertelnie dodatnie po 24 godzinach hodowli w SSM z insuliną i barwieniem.Po 24 godzinach w pożywce Schneidera bez insuliny, świeżo wyklute mózgi dzikiego typu Oregon R nie miały dużych komórek neuroblastów EDU-dodatnich i śmiertelnie dodatnich, poza czterema komórkami neuroblastów grzybów i jedną komórką neuroblastów brzuszno-bocznych. Podczas obrazowania konfokalnego czasami obserwowano niektóre półkule mózgowe z uszkodzeniami, takie jak małe lub duże w eksplantowanej tkance mózgowej. Do analizy nie wykorzystano żadnych mózgów z.Ostrożnie wypreparuj tkanki i delikatnie pipetuj, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Staraj się być tak sterylny, jak to tylko możliwe i nie zanieczyszczać swoich kultur. Ponieważ pożywką hodowlaną można łatwo manipulować, dodając różne czynniki, technika ta może być wykorzystana do rozwiązania przyszłych hipotez dotyczących sygnalizacji zewnętrznej oraz wchodzenia i wychodzenia neuroblastów w stanie spoczynku.

neural-stem-cell-reactivation-in-cultured-drosophila-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy film prezentuje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Obrazy żywych kultur pokazują wypustki neurytów oraz obrazowanie poziomu wapnia z wykorzystaniem Fura-2.

Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Niniejszy artykuł opisuje metodę, za pomocą której można naśladować in vivo opracowanie Muszka owocówka ciało grzybowate w ex vivo system...

Hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów Drosophila

Ten film demonstruje protokół do identyfikacji czynników egzogennych, które inicjują reaktywację nerwowych komórek macierzystych mózgu Drosophila ze stanu spoczynku. Świeżo wyklute larwy są preparowane w celu wyizolowania ich mózgów, które są następnie hodowane w pożywce z lub bez hormonu testowego w celu oceny potencjału hormonu do indukowania reaktywacji i proliferacji nerwowych komórek macierzystych.

Analiza reaktywacji nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Opisano paradygmat uszkodzeń wykorzystujący brzuszny rdzeń nerwowy larw Drosophila do badania regeneracji i naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Dźganie, a następnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna w próbkach poklatkowych i utrwalonych, w połączeniu z analizą ilościową za pomocą celowo opracowanego oprogramowania i genetyki, są wykorzystywane do badania molekularnych mechanizmów regeneracji i naprawy OUN.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły zadawania penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu (PTBI) dorosłym Drosophila i badania wynikającej z tego neurogenezy.

Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

Tutaj omawiamy proces przygotowania, sekcji, montażu i obrazowania żywych mózgów eksplantatów z larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster, aby obserwować dynamikę komórkową i subkomórkową w warunkach fizjologicznych.

Obrazowanie żywymi komórkami mózgów larwalnych Drosophila melanogaster

Poznaj metodę reaktywacji komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Technika umożliwia badanie wpływu czynników zewnętrznych na neuroblasty i może wspierać rozwój terapii komórkowych.

Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Przeglądaj więcej filmów