Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Opracowaliśmy metodę reaktywacji spoczynkowych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu drosophila. Metoda ta może dostarczać czynniki egzogenne do pożywki hodowlanej i może oznaczać reaktywację neuroblastów. Lepsze terapie komórkami macierzystymi mogą zostać opracowane dzięki lepszemu zrozumieniu, w jaki sposób komórki macierzyste w stanie spoczynku reagują na sygnały zewnętrzne i wchodzą w cykl komórkowy.

Procedurę zademonstruje Susan Doyle, naukowiec z mojego laboratorium. Na początek ostrożnie wybierz około 20 do 25 świeżo wyklutych larw z talerza agaru winogronowego pod mikroskopem preparacyjnym. Napełnij szalkę Petriego około dwoma mililitrami PBS i zanurz końcówkę narzędzia zawierającą larwy w PBS na dwie minuty.

Po dwóch minutach przechyl naczynie pod kątem, aby zebrać płyn na dnie, a następnie za pomocą małego pędzla wyszczotkuj larwy z płynu na dnie szalki Petriego. Zbierz wszystkie larwy na pędzelku i krótko opłucz larwy w 70% etanolu przed przeniesieniem ich z powrotem na szalkę Petriego zawierającą PBS. Spryskaj obszar roboczy, narzędzia do preparacji, kleszcze i dwie szklane naczynia do zegarków 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na stole.

Przygotuj uzupełnioną pożywkę Schneidera lub SSM i umieść ją na lodzie. Odpipetować jeden mililitr pożywki do każdego szklanego naczynia do zegarka. Za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką przenieś świeżo wyklute larwy z płytki PBS do SSM w pierwszym szklanym naczyniu do zegarka.

Wypreparuj mózgi z larw umieszczonych w drugim szklanym naczyniu zegarkowym za pomocą SSM za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym i dostosowując powiększenie w razie potrzeby. Użyj jednego kleszczyka, aby chwycić haczyki do ust, a drugim delikatnie chwyć ciało do połowy i pociągnij w przeciwnym kierunku, aby podzielić larwę na dwie części. Po wypreparowaniu od 15 do 20 mózgów, dodaj jeden mililitr SSM do jednego dołka sterylnej 24-dołkowej tacki hodowlanej.

Za pomocą mikropipety i sterylnej końcówki przenieś świeżo wypreparowane mózgi do SSM, a następnie kontynuuj inkubację pożywki z mózgami przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odpipetować 10 mikrolitrów 10-milimolowego zapasu 5-etynylo-2'deoksyurydyny lub EDU z 990 mikrolitrami SSM do sterylnej probówki mikrowirówkowej, wymieszać, a następnie odpipetować jeden mililitr EDU SSM do jednego dołka sterylnej 12-dołkowej tacki hodowlanej. Przenieść mózgi za pomocą mikropipety ze sterylną końcówką z dołka zawierającego SSM do nowego dołka zawierającego roztwór SSM EDU i inkubować przez godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś mózgi znakowane EDU do innego dołka w tej samej tacce hodowlanej zawierającej jeden mililitr utrwalacza i pozwól mózgom na utrwalenie przez 20 minut. Po utrwaleniu szybko przenieś mózgi do 72-dołkowych minitac za pomocą mikropipety. Opłucz mózgi trzy razy w 10 mikrolitrach PBT i powtórz trzy płukania przez 10 minut każde, upewniając się, że mózgi są zawsze pokryte jakimś płynem.

Odpipetować 10 mikrolitrów roztworu blokującego na mózg. Przykryj tackę i uszczelnij ją paskiem parafilmu wokół krawędzi. Rysunek przedstawia duże komórki neuroblastów EDU-dodatnie i śmiertelnie dodatnie po 24 godzinach hodowli w SSM z insuliną i barwieniem.

Po 24 godzinach w pożywce Schneidera bez insuliny, świeżo wyklute mózgi dzikiego typu Oregon R nie miały dużych komórek neuroblastów EDU-dodatnich i śmiertelnie dodatnich, poza czterema komórkami neuroblastów grzybów i jedną komórką neuroblastów brzuszno-bocznych. Podczas obrazowania konfokalnego czasami obserwowano niektóre półkule mózgowe z uszkodzeniami, takie jak małe lub duże w eksplantowanej tkance mózgowej. Do analizy nie wykorzystano żadnych mózgów z.

Ostrożnie wypreparuj tkanki i delikatnie pipetuj, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Staraj się być tak sterylny, jak to tylko możliwe i nie zanieczyszczać swoich kultur. Ponieważ pożywką hodowlaną można łatwo manipulować, dodając różne czynniki, technika ta może być wykorzystana do rozwiązania przyszłych hipotez dotyczących sygnalizacji zewnętrznej oraz wchodzenia i wychodzenia neuroblastów w stanie spoczynku.