Zoptymalizowane protokoły pobierania próbek kości w celu odzyskania starożytnego DNA ze szczątków archeologicznych
30 listopada 2021
Protokół przedstawia serię najlepszych praktyk w zakresie pobierania proszku kostnego z ośmiu zalecanych miejsc pobierania próbek anatomicznych (konkretne miejsca na danym elemencie szkieletu) na pięciu różnych elementach szkieletu od średniowiecznych osobników (radiowęgiel datowany na okres ok. 1040-1400 CE, kalibrowany zakres 2-sigma).
Protokoły te służą jako wytyczne dotyczące najlepszych praktyk w zakresie wytwarzania proszku kostnego do stosowania w dalszej ekstrakcji DNA z szeregu elementów szkieletowych. Istnieje kilka opublikowanych starożytnych protokołów pobierania próbek DNA dla miejsc innych niż zębina i piramida skalista. Dzisiaj pokażemy szczegółowe metody pobierania próbek dla trzech alternatyw.
Metody te wykazują również duży potencjał do wykorzystania w przypadku zdegradowanych szczątków kryminalistycznych, ale także jako punkt odniesienia do opracowania podobnych technik z próbkami innymi niż ludzie. Wszystkie próbki należy pobrać w przeznaczonym do tego pomieszczeniu czystym, pod osłoną PCR wyposażoną w światło UV lub komorą bezpieczeństwa biologicznego. Wyłącz przepływ powietrza i rozprowadź sterylną folię aluminiową na blacie stołu, aby złapać zabłąkany proszek lub fragmenty kości.
Umieść arkusz papieru wagowego na sterylnej tacy wagowej. Przytrzymaj odkażony ząb trzonowy za szkliwo z korzeniem skierowanym w dół nad tacą wagową, za pomocą ręcznego zacisku. Wyposaż wiertło dentystyczne w okrągłą tarczę tnącą z diamentowymi krawędziami.
Gdy wiertło jest ustawione na średnią prędkość, delikatnie przyłóż krawędź wiertła do korzenia pod kątem około 20 stopni. Zeskrob próbkę w dół do tacy, aby zebrać żółty, najbardziej zewnętrzny materiał z korzenia. Przerwij zbieranie, gdy jaśniejszy materiał zębiny stanie się widoczny.
Przenieść proszek do dwumililitrowej probówki LoBind Safe-Lock i zapisać zebraną masę proszku za pomocą dołączonej wagi z dokładnością co najmniej 0,01 miligrama. Przenieść proszek z bibułki wagowej do dwumililitrowej probówki LoBind Safe-Lock w celu ekstrakcji. Przechowuj tę probówkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Upewnij się, że odzyskałeś wszystkie fragmenty kości i jak najwięcej proszku. Wymieniaj folię między każdym pobieraniem próbek, wyrzucając zużytą folię do autoklawowalnej torby na zagrożenie biologiczne. Odkaż obszar roboczy i rozprowadź sterylną folię aluminiową na blacie stołu za każdym razem przed przejściem do następnej kości.
Umieść mały arkusz papieru do ważenia w standardowej tacy do ważenia. Usuń i wyrzuć najbardziej zewnętrzną warstwę kości korowej górnego łuku kręgowego za pomocą wiertła dentystycznego. Następnie zabezpiecz kręgi w zacisku ręcznym, wyrostkiem kolczystym na zewnątrz i górnym aspektem w dół.
Trzymając kręg, wywierć w górę do środka wcięcia w kształcie litery V, utworzonego przez stopienie wyrostka kolczystego z blaszkami z niską prędkością i wysokim momentem obrotowym. Przerwij wiercenie, gdy zauważalny będzie spadek oporu. Zmień nieznacznie pozycję wiercenia i powtarzaj, aż zbierze się od 50 do 100 miligramów proszku kostnego.
Przenieś proszek kostny z papieru do ważenia do dwumililitrowej probówki LoBind w celu ekstrakcji i przechowuj go w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Upewnij się, że wszystkie fragmenty kości i jak najwięcej proszku zostało odzyskane przed wyrzuceniem folii. Odkazić obszar roboczy i przygotować się do pobrania próbki, jak opisano wcześniej.
Umieść mały arkusz papieru do ważenia w standardowej tacy do ważenia. Trzymaj kopułę kości skokowej do góry, a powierzchnię przyśrodkową w kierunku kolektora, nad tacą wagową. Zeskrob kość korową na głębokość około jednego milimetra od szyjki kości skokowej za pomocą wiertła dentystycznego z wiertłem o małej średnicy ustawionym na niską prędkość i wysoki moment obrotowy.
Zmień pozycję wiercenia i powtarzaj tę czynność, aż zbierze się około 50 do 100 miligramów proszku kostnego. Przenieś ten proszek kostny z bibułki do dwumililitrowej probówki LoBind w celu ekstrakcji. Przechowuj proszek w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez czas nieokreślony.
Przechowuj pozostałą kość i nadmiar proszku w suchym, sterylnym środowisku o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Wyrzuć wszystkie odpady do worków lub pojemników na autoklawy. Wysterylizuj lub odkaż cały sprzęt wielokrotnego użytku i wystaw go na działanie promieniowania UV między każdym pobraniem próbki.
Pars petrosa dały wyższy poziom endogennego DNA niż pozostałe 23 badane miejsca pobierania próbek anatomicznych. Siedem dodatkowych anatomicznych miejsc pobierania próbek przedstawionych w tym protokole dało kolejne najwyższe plony. Alternatywne lokalizacje konsekwentnie dawały plony DNA odpowiednie dla standardowych analiz genetyki populacyjnej.
Wskaźniki duplikacji w bibliotekach pochodzących ze wszystkich lokalizacji próbkowania anatomicznego były niskie, co wskazuje na wysoką złożoność. Zęby, a także kręgi piersiowe wykazywały odpowiednią regenerację molekularną. Jednym z najtrudniejszych aspektów pobierania próbek kości jest proces wiercenia, np. jak trzymać wiertło, gdzie wiercić i kiedy przerwać wiercenie.
Przegląd
Ten protokół przedstawia wytyczne dotyczące najlepszych praktyk w zbieraniu proszku kostnego z różnych miejsc anatomicznych na średniowiecznych szczątkach kostnych. Skupia się na metodach wytwarzania proszku kostnego nadającego się do ekstrakcji DNA, które mogą być również zastosowane do szczątków sądowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Analiza starożytnego DNA
- Nauka sądowa
Tło
- Istniejące protokoły koncentrują się głównie na pobieraniach próbek z kości gąbczastej i piramidy skalistej.
- To badanie wprowadza alternatywne miejsca anatomiczne do pobierania proszku kostnego.
- Protokoły są przeznaczone zarówno dla starożytnych, jak i zdegradowanych próbek sądowych.
- Nacisk na zachowanie środowiska sterylnego podczas pobierania próbek.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowych protokołów pobierania proszku kostnego ze średniowiecznych szczątków kostnych.
- Poprawa metod ekstrakcji DNA z różnych elementów szkieletu.
- Ustanowienie bazy dla przyszłych technik mających zastosowanie do szczątków nieludzkich.
Zastosowane metody
- Pobranie próbek w czystym pomieszczeniu ze światłem UV.
- Użycie wiertarki dentystycznej do precyzyjnego pobierania proszku kostnego.
- Pobranie z wielu miejsc anatomicznych w celu zmaksymalizowania wydajności DNA.
- Surowe protokoły dekontaminacji między próbkami.
Główne wyniki
- Lokalizacja Pars petrosa dała najwyższą endogenną ilość DNA.
- Inne miejsca anatomiczne również dostarczyły wystarczającej ilości DNA do analizy.
- Niskie współczynniki duplikacji w bibliotekach wskazują na wysoką złożoność próbek.
- Zęby i kręgi piersiowe wykazały dobre odzyskiwanie molekularne.
Wnioski
- Ustanowione protokoły są skuteczne w odzyskiwaniu starożytnego DNA.
- Metody można dostosować do zastosowań sądowych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych technikach dla szerszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Ancient DNA sampling protocols provide a framework for maximizing molecular yield from limited, precious biological specimens while minimizing specimen destruction. This approach supports target validation in discovery research by enabling reliable molecular recovery from challenging sample types. The methodology enhances predictive confidence in downstream genetic analyses by ensuring adequate DNA quality for population genetics applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of biological systems through molecular analysis of preserved specimens.
- Operational Value: Reduces sample input requirements while maintaining adequate DNA yield for downstream applications.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing in target validation by providing access to molecular data from rare or limited specimens.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized biological samples suitable for assay development and optimization.
- Operational Value: Ensures reproducibility through strict decontamination protocols and controlled sampling environments.
- Strategic Value: Enables reliable compound evaluation by delivering consistent, high-quality DNA inputs for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by enabling molecular analysis across diverse specimen types.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with standardized sampling approaches.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing molecular data quality metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The protocol integrates into discovery workflows by providing standardized methods for biological sample preparation that support hypothesis testing and molecular analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through reliable molecular recovery from anatomical sampling locations.
- Screening: Enables assay readiness by delivering standardized bone powder samples suitable for DNA extraction.
- Analytics: Provides quantitative DNA yield measurements that help teams compare sample quality and suitability for downstream applications.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through consistent molecular recovery across specimen types.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for biological sample preparation applicable across multiple research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in molecular analyses through adequate DNA yield and quality.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via strict decontamination and controlled sampling protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through reliable molecular data generation from limited specimens.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on molecular recovery potential from anatomical sampling locations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and contamination control for ancient DNA work.
- Needs dental drilling equipment and UV-equipped clean room infrastructure.
- Demands cross-team standardization of decontamination protocols between samples.
- Requires adaptation considerations when applying to different specimen preservation states.
- Involves practical limitations related to specimen availability and anatomical accessibility.
