Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana

Metodologia ta jest istotna, ponieważ pozwala na powtarzalne i dokładne określenie ilościowe produktów leczniczych stosowanych miejscowo przy użyciu spójnego obrazowania ramanowskiego. Inne metodologie dostarczają obszernych informacji farmakokinetycznych dotyczących skóry, podczas gdy ta metodologia może dostarczyć zarówno zbiorczych, jak i mikroskalowych informacji farmakokinetycznych skóry, takich jak droga przenikania leku. Wizualizacja i kwantyfikacja oraz ścieżki przenikania pozwolą na opracowanie produktów leczniczych z myślą o określonej ścieżce dotarcia do miejsca docelowego.

Przygotowanie tkanek okaże się najtrudniejszą częścią tej metodologii. Tkanka powinna być na tyle cienka, aby można było czytać przez skórę. Aby rozpocząć przygotowanie tkanki skórnej ucha nagiej myszy, należy pozyskać uśpione nagie myszy i usunąć uszy myszy za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych.

Następnie umieść jedno ucho na dużej szalce Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 15 milimetrów. Następnie dwukrotnie przepłucz ucho myszy PBS i za każdym razem osusz ucho wycieraczką zadaniową. Jeśli zostanie zużyty w ciągu 24 godzin, umieść ucho w PBS na małej szalce Petriego o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.

Aby użyć po 24 godzinach od zbioru, umieść kłos na szalce Petriego bez PBS, a następnie przykryj naczynie parafilmem i przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pracując pod kapturem biologicznym, umieść ludzką tkankę skórną na dużej szalce Petriego stroną z warstwą rogową skierowaną w dół, tak aby podskórna tkanka tłuszczowa była dostępna. Następnie za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych usuń podskórną tkankę tłuszczową.

Gdy tłuszczu podskórnego nie można już usunąć nożyczkami, użyj jednorazowego skalpela z 10 ostrzami pod kątem 45 stopni do skóry, aby usunąć pozostały tłuszcz podskórny, przytrzymując skórę nadal kleszczami. Po usunięciu tłuszczu pokrój ludzką skórę na kawałki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. W przypadku obrazowania lipidowego umieść przednią część ucha myszy skierowaną w stronę szklanego dna 35-milimetrowej naczynia o numerze zero.

W przypadku skóry ludzkiej należy umieścić skórę warstwą rogową naskórka skierowaną w dół, aby umożliwić ilościowe określenie leku od powierzchownych do głębszych warstw. Po wyśrodkowaniu chusteczki na szklanym dnie użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby upewnić się, że skóra jest płaska i ma pełny kontakt z powierzchnią szkiełka nakrywkowego naczynia ze szklanym dnem. Aby zapobiec jakiemukolwiek ruchowi podczas obrazowania, umieść podkładkę na skórze i upewnij się, że tkanka jest widoczna przez środkowy otwór myjki w celu wykrycia wymuszonego rozpraszania Ramana lub transmisji SRS.

Odpipetuj ustaloną wcześniej dawkę preparatu na skórę, a następnie użyj palca w rękawiczce, aby pocierać preparat zgodnie z ruchem wskazówek zegara przez 30 sekund. Po upływie wyznaczonego czasu na przenikanie preparatu, należy usunąć nadmiar preparatu przed umieszczeniem skórki stroną z preparatem skierowaną w stronę naczynia ze szklanym dnem. Następnie przejdź do konfiguracji eksperymentalnej, włączając oprogramowanie Microscope Control lub MC.

Patrząc przez okular, wyreguluj ostrość osiową za pomocą pokrętła regulacyjnego, aby upewnić się, że tkanka jest w ostrości. Po zakończeniu odblokuj zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa i upewnij się, że kanały ALG1 i ALG2 są włączone. Upewnij się, że fotodioda SRS znajduje się nad kondensatorem, a następnie kliknij Focus x2 w oprogramowaniu MC, aby wyświetlić powłokę w kanałach CARS i SRS.

W module Multi-Area Time Lapse lub MATL przejdź do zakładki View i kliknij na Registered Point List (Lista zarejestrowanych punktów), aby pojawiła się lista obrazowań. Po zidentyfikowaniu warstwy rogowej naskórka przewiń przez ognisko osiowe lub ognisko Z, aby zidentyfikować określone stratyfikacje tkanek. W obrębie skóry można dodać określone głębokości, takie jak warstwa rogowa naskórka, gruczoły łojowe, adipocyty lub tłuszcz podskórny, jak określono podczas obrazowania na żywo z kontrastem dostrojonym do lipidów.

Jeśli jednak mają być wykonane całe stosy głębokości, można dodać pozycje XY, a względną pozycję Z można zignorować. W przypadku obrazowania określonej głębokości dla każdej stratyfikacji skóry należy wybrać Punkt Rejestru, aby dodać go do kolejki MATL. W przypadku stosów o pełnej głębokości kliknij przycisk Zarejestruj punkt dla każdej pozycji XY z wyborem głębokości w oknie Parametry akwizycji.

Następnie ustaw liczbę powtórzeń na jeden w module MATL i kliknij Gotowy. Gdy strzałka odtwarzania zmieni kolor z szarego na, naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć obrazowanie wstępnego stosu lipidów. Po zakończeniu cyklu obrazowania zablokuj zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa i zmień długość fali w graficznym interfejsie użytkownika lasera na żądaną długość fali w oparciu o docelową liczbę fali lub drgania Ramana.

Dostosuj ręczny etap opóźnienia czasowego, upewniając się, że te same uprawnienia są używane do obrazowania lipidów i aktywnych składników farmaceutycznych lub API, które są ustalane a priori. Po wybraniu całkowitej liczby powtórzeń cyklu odblokuj belkę pompy i sprawdź, czy moc odpowiada żądanej mocy za pomocą fotodiody przed naciśnięciem przycisku Play, aby rozpocząć automatyczne obrazowanie nastaw. Następnie przeprowadź analizę danych dla każdej stratyfikacji skóry, importując obraz lipidów gruczołów łojowych na Fidżi i zaznaczając pole oznaczone Podziel kanały, aby podzielić plik na kanały CARS i SRS.

Aby otworzyć Region zainteresowania lub Menedżera ROI, kliknij Analizuj, Narzędzia i Menedżer ROI. Używając kanału SRS w taki sposób, aby C było równe jeden, usuń znacznik gruczołu łojowego na obrazie i dodaj oznaczenia do menedżera ROI, klikając Dodaj T w menedżerze ROI. Powtórz ten proces dla każdego gruczołu łojowego na obrazie.

Aby zamaskować regiony bogate w lipidy, wybierz każdy ROI, a następnie kliknij karty Więcej, LUB Połącz i Dodaj. Aby zamaskować obszary ubogie w lipidy, użyj narzędzia Prostokąt w menu Fidżi i narysuj kwadrat wokół całego obrazu. Dodaj region do Menedżera ROI.

Kliknij nowo dodany kwadratowy zwrot z inwestycji oprócz zwrotu z inwestycji, który wybiera wszystkie regiony bogate w lipidy w Menedżerze ROI. W obszarze Więcej wybierz opcję XOR, aby wygenerować maskę regionów ubogich w lipidy i dodać ją do Menedżera ROI. Połącz obrazy w kolejności numerycznej, przechodząc do Obraz, Stosy, Narzędzia i połącz karty w kolejności.

Możesz też zaimportować obrazy, ładując jeden na Fidżi, a następnie wybierając opcję o nazwie Grupuj pliki o podobnych nazwach na stronie konfiguracji. Gdy połączony obraz jest aktywny, przejdź do Menedżera ROI, aby wybrać regiony bogate w lipidy i kliknij kartę Więcej przed wybraniem opcji Multi Measure, a następnie poczekaj, aż pojawi się okno Wyniki. W oknie Wyniki wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i dodaj kolumnę zatytułowaną Region, aby dodać regiony bogate w lipidy do każdego wiersza danych.

Dodaj ubogie lipidy do regionów, które znajdowały się poza lipidami. Aby zwizualizować dane, zapisz i zaimportuj arkusz kalkulacyjny do pakietu R, ggplot2. Następnie wykreśl dane jako funkcję liczby obrazu w funkcji średniej intensywności, aby oszacować dane dotyczące stężenia-czasu.

Uruchom analizę nieprzedziałową lub NCA w programie RStudio na danych czasu intensywności zaimportowanych z arkusza kalkulacyjnego z wywołaniem jednej warstwy. Po zakończeniu wykreśl i wizualnie porównaj wskaźniki Jmax i AUCflux-all. Dodatkowo przeprowadzaj porównania statystyczne w różnych warunkach eksperymentalnych.

Reprezentatywna analiza przedstawia warstwę rogową naskórka, gruczoły łojowe, adipocyty, podskórną tkankę tłuszczową z nagiej skóry uszu myszy oraz warstwę rogową naskórka, brodawkowatą skórę właściwą i gruczoł łojowy ze skóry ludzkiej. W nagiej skórze uszu myszy zaobserwowano ograniczony ruch tkanek gruczołów łojowych przy tej samej głębokości tkanki gruczołów w momencie aplikacji preparatu i 120 minut po aplikacji. Znaczny ruch tkanek w skórze wykazał ledwo widoczne gruczoły łojowe po 120 minutach od podania leku, co świadczy o nieskuteczności oryginalnego protokołu.

W kilku badaniach profile intensywności w funkcji czasu wykazały wysokie stężenia początkowe, po których następowały stężenia malejące, co wskazuje na brak dalszego wchłaniania leku do tkanki. Z drugiej strony, niektóre badania wykazały wzrost intensywności, która później zmniejszyła się w czasie trwania eksperymentu, co pokazuje, że strumień do tkanki nie osiągnął maksimum przed obrazowaniem. Przeprowadzona przez NCA analiza profili stężenie-czas dwóch preparatów dla tego samego API wykazała, że etoksyetoksyetanol zapewnia rozszerzoną przenikalność API w porównaniu z preparatem żelowym, niezależnie od warstwy skóry.

Analiza całkowitej ekspozycji między tymi samymi preparatami wykazała podobne obserwacje w głębszych warstwach skóry. Przygotowanie ludzkiej skóry i właściwe ułożenie skóry na szklanym dnie naczynia po zastosowaniu leku mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Przejrzyste rozwiązania w tym zakresie wykazały przydatność tej metodologii.

Dalsze badania będą obejmować preparaty wprowadzane do obrotu, takie jak kremy, aby zrozumieć, w jaki sposób preparat wpływa na penetrację i przenikanie API.