Name: Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana do wizualizacji i kwantyfikacji leków w skórze ludzkiej i mysiej. Technika ta umożliwia analizę farmakokinetyczną na poziomie makro i mikro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Fotisowi Iliopoulosowi i Danielowi Greenfieldowi z Grupy Evansa za dyskusję i korektę tego manuskryptu. Ponadto autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony LEO Pharma. Rysunek 2 został stworzony za pomocą BioRender.com.

<ol><li>Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinnin%2C+B+%22Transdermal+and+topical+drug+delivery%3A+principles+and+practice%22">Transdermal and topical drug delivery: principles and practice</a>. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+road+to+development+of+an+in+vitro+permeation+test+%28IVPT%29+model+to+compare+heat+effects+on+transdermal+delivery+systems%3A+exploratory+studies+with+nicotine+and+fentanyl%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl.</a> Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).</li>
<li>Hossain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterisation%2C+and+topical+delivery+of+terbinafine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine.</a> Pharmaceutics. 11 (10), 548(2019).</li>
<li>Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+permeation+test+%28IVPT%29+for+pharmacokinetic+assessment+of+topical+dermatological+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations.</a> Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79(2020).</li>
<li>Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Franz+cell+diffusion+testing+andquantitative+confocal+Raman+spectroscopy%3A+In+vitro-in+vivo+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation.</a> Pharmaceutics. 12 (9), 887(2020).</li>
<li>Cordery, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+bioavailability+of+diclofenac+from+locally-acting%2C+dermatological+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).</li>
<li>Pensado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratum+corneum+sampling+to+assess+bioequivalence+between+topicalacyclovir+products%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products.</a> Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+delivery+of+niacinamide-in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies.</a> Pharmaceutics. 13 (5), 726(2021).</li>
<li>Bodenlenz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+flow+microperfusion+as+a+dermal+pharmacokinetic+approach+to+evaluate+topical+bioequivalence%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence.</a> Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).</li>
<li>Eirefelt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+dermal+pharmacokinetics+and+pharmacodymanic+effect+of+soft+topical+PDE4+inhibitors%3AOpen+flow+microperfusion+and+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies.</a> Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).</li>
<li>Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iontophoretic+current+and+intradermal+microdialysis+recovery+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).</li>
<li>Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+adultatopic+dermatitis+on+topical+drug+penetration%3A+assessment+by+cutaneous+microdialysis+and+tape+stripping%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping.</a> Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).</li>
<li>Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+applications+of+cutaneous+microdialysis%3A+Continuous%2Bintermittent+vs+continuous-only+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).</li>
<li>Kuzma, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+local+bioavailability+of+metronidazole+from+topical+formulations+using+dermal+microdialysis%3A+Preliminary+study+in+a+Yucatan+mini-pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741(2021).</li>
<li>Begley, R., Harvey, A., Byer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.Coherent+anti-Stokes+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy.</a> Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).</li>
<li>Evans, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).</li>
<li>Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantification+of+pharmacokinetics+in+skin+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning.</a> Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).</li>
<li>Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+skin+permeability+of+drugs+in+mice+and+human+cadaver+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin.</a> Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).</li>
<li>Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+conditions+of+skin+affect+tissue+structure+and+subsequent+in+vitro+percutaneous+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).</li>
<li>Barbero, A. M., Frasch, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+frozen+human+epidermis+storage+duration+and+cryoprotectant+on+barrier+function+using+two+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).</li>
<li>Babu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+various+methods+of+cold+storage+of+skin+on+the+permeation+of+melatonin+and+nimesulide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide.</a> Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).</li>
<li>Skelly, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+and+AAPS+report+of+the+workshop+on+principles+and+practices+of+in+vitro+percutaneous+penetration+studies%3A+relevance+to+bioavailability+and+bioequivalence%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence.</a> Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+for+the+conduct+of+skin+absorption+studies%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">Guidance document for the conduct of skin absorption studies.</a> OECD. , (2004).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+no.+428%3A+Skin+absorption%3A+In+vitro+method%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">Test no. 428: Skin absorption: In vitro method.</a> OECD. , (2004).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+drug+delivery+to+skin+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).</li>
<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-windowsparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Herkenne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+methods+for+the+assessment+of+topical+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability.</a> Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).</li>
<li>Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407(2014).</li>
<li>Osseiran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+monitoring+of+cancer+cell+subpopulations+in+monolayers%2C+3D+spheroids%2C+and+xenografts+using+the+photoconvertible+dye+DiR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Evennett, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kohler+illumination%3A+a+simple+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Kohler illumination: a simple interpretation.</a> Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microscopy.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hunter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matplotlib%3A+A+2D+graphics+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Computing+in+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Matplotlib: A 2D graphics environment.</a> Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer-Verlag. New York. (2016).</li>
<li>Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+R+packages%3A%27Non-Compart%27+and+%27ncar%27+for+noncompartmental+analysis+%28NCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+and+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA).</a> Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).</li>
</ol>

CLE jest wynalazcą patentów na mikroskopię CARS, które zostały licencjonowane przez wielu producentów mikroskopów. Wszyscy pozostali autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Ocena miejscowego BA/BE jest obszarem badań, który wymaga wieloaspektowego podejścia, ponieważ żadna pojedyncza metoda nie jest w stanie w pełni scharakteryzować cPK in vivo . W protokole tym przedstawiono metodologię oceny BA/BE produktu leczniczego stosowanego miejscowo w oparciu o spójne obrazowanie ramanowskie. Jednym z pierwszych punktów, które mogą zostać przeoczone, jest to, jak cienkie muszą być próbki skóry, szczególnie w przypadku ilościowego obrazowania SRS transmisyjnego. Jeśli skóra jest zbyt gruba ...

Metodologie oceny cPK po miejscowym zastosowaniu produktu leczniczego rozszerzyły się z klasycznych badań in vitro permeation testing (IVPT)1,2,3,4,5 i taśma-stripping6,7,8 do dodatkowych metodologii, takich jak mikroperfuzja z otwartym przepływem lub mikrodializa skórna9,10,11,12,13,14. Istnieją potencjalnie różne lokalne miejsca działania terapeutycznego w zależności od choroby będącej przedmiotem zainteresowania. W związku z tym może istnieć odpowiednia liczba metodologii do oceny szybkości i zakresu, w jakim API dociera do zamierzonego lokalnego miejsca działania. O ile każda z wyżej wymienionych metodyk ma swoje zalety, o tyle główną wadą jest brak informacji o cPK w mikroskali (tj. brak możliwości wizualizacji, dokąd zmierza API i jak się przenika).
Jedną z nieinwazyjnych metodologii oceny miejscowych BA i BE jest CRI, którą można podzielić na dwie metody obrazowania: mikroskopię CARS i SRS. Te spójne metody Ramana umożliwiają specyficzne chemicznie obrazowanie cząsteczek za pomocą nieliniowych efektów Ramana. W CRI dwa ciągi impulsów laserowych są ogniskowane i skanowane w próbce; Różnica energii między częstotliwościami lasera jest ustawiona tak, aby celować w tryby drgań specyficzne dla interesujących struktur chemicznych. Ponieważ procesy CRI są nieliniowe, sygnał jest generowany tylko w ognisku mikroskopu, co pozwala na trójwymiarowe farmakokinetyczne obrazowanie tomograficzne tkanki. W kontekście cPK, CARS został wykorzystany do uzyskania informacji o strukturze tkanki, takich jak lokalizacja bogatych w lipidy struktur skóry15. W przeciwieństwie do tego, SRS został wykorzystany do ilościowego określenia stężenia molekularnego, ponieważ jego sygnał jest liniowy ze stężeniem. W przypadku próbek skóry ex vivo korzystne jest przeprowadzenie CARS w epi-direction16 i SRS w trybie transmisji17. Dlatego próbki tkanek, które są cienkie, pozwolą na wykrycie sygnału SRS i określenie ilościowe.
Jako modelowa chusteczka, ucho myszy nude ma kilka zalet z niewielkimi wadami. Jedną z zalet jest to, że tkanka ma już grubość ~200-300 μm i nie wymaga dalszego przygotowania próbki. Ponadto kilka stratyfikacji skóry jest widocznych przez ogniskowanie osiowe w jednym polu widzenia (np. warstwa rogowa naskórka, gruczoły łojowe (SG), adipocyty i tłuszcz podskórny)16,18. Pozwala to na wstępną przedkliniczną ocenę szlaków przenikania skóry i miejscowe oszacowanie BA przed przejściem do próbek ludzkiej skóry. Jednak nagi model myszy ma ograniczenia, takie jak trudności w ekstrapolacji do scenariuszy in vivo ze względu na różnice w strukturze skóry19. Podczas gdy nagie ucho myszy jest doskonałym modelem do uzyskania wstępnych wyników, model ludzkiej skóry jest złotym standardem. Chociaż pojawiły się różne komentarze na temat przydatności i możliwości zastosowania zamrożonej ludzkiej skóry do dokładnego podsumowania kinetyki przenikania in vivo20,21,22, użycie zamrożonej ludzkiej skóry jest akceptowaną metodą oceny kinetyki przenikania API in vitro23,24,25. Protokół ten wizualizuje różne warstwy skóry w skórze myszy i człowieka, jednocześnie określając ilościowo stężenia API w strukturach bogatych w lipidy i ubogich w lipidy.
Chociaż CRI był wykorzystywany w wielu dziedzinach do specyficznej wizualizacji związków w tkankach, podjęto ograniczone wysiłki w celu zbadania cPK w produktach leczniczych stosowanych miejscowo. Aby ocenić miejscowe BA/BE produktów do stosowania miejscowego za pomocą CRI, konieczne jest najpierw posiadanie ustandaryzowanego protokołu w celu dokonania dokładnych porównań. Wcześniejsze próby wykorzystania CRI do dostarczania leków do skóry wykazały zmienność w obrębie danych. Ponieważ jest to stosunkowo nowe zastosowanie CRI, ustanowienie protokołu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników18,26,27. Podejście to jest ukierunkowane tylko na jedną konkretną liczbę falową w biologicznym cichym obszarze widma Ramana. Jednak większość API i składników nieaktywnych ma przesunięcia Ramana w obszarze odcisku palca. Wcześniej stanowiło to wyzwanie ze względu na nieodłączny sygnał pochodzący z tkanki w obszarze odcisku palca. Ostatnie postępy w dziedzinie laserów i obliczeń usunęły tę barierę, która może być również wykorzystana w połączeniu z podejściem przedstawionym tutaj28. Przedstawione tutaj podejście pozwala na ilościowe określenie API, który ma przesunięcie Ramana w cichym obszarze (2000-2300 cm-1). Nie ogranicza się to do właściwości fizykochemicznych leku, co może mieć miejsce w przypadku niektórych wcześniej wymienionych metodologii monitorowania cPK29.
Protokół musi redukować zmienność grubości skóry między próbkami dla różnych preparatów, ponieważ grube próbki ludzkiej skóry będą wytwarzać minimalny sygnał po zastosowaniu produktu leczniczego z powodu rozpraszania światła przez grubą próbkę. Celem niniejszego manuskryptu jest przedstawienie metodologii przygotowania tkanek, która zapewni powtarzalne standardy obrazowania. Ponadto system CRI jest skonfigurowany zgodnie z opisem, aby zmniejszyć potencjalne źródła błędów, a także zminimalizować stosunek sygnału do szumu.Jednak w tym artykule nie będzie omawiane zasady przewodnie i zalety techniczne mikroskopu CRI, ponieważ zostało to już wcześniej omówione30. Na koniec badana jest obszerna procedura analizy danych, która umożliwia interpretację wyników w celu określenia sukcesu lub porażki eksperymentu.

<table><tbody><tr><td>Preparat tkankowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowalne worki na zagrożenia biologiczne</td><td>FisherBrand</td><td>22-044562</td><td>Jak określono w tekście: worki na zagrożenia biologiczne https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& searchType=SZYBKI& matchedCatNo=22044562</td></tr><tr><td>do hodowli komórkowych: Roztwór soli buforowany fosforanem Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>MT21030CV</td><td>Jak określono w tekście: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& searchType= SZYBKI& matchedCatNo=21-030-cv</td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe</td><td>Exel International</td><td>14-840-00</td><td>Jak określono w tekście: skalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true</td></tr><tr><td>High Precision 45&deg; Pęseta kątowa z szerokim czubkiem</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-132</td><td>Jak określono w tekście: kleszcze https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=</td></tr><tr><td>Wycieraczki Kimwipes Delicate Task, 1-warstwowe</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science</td><td>06-666</td><td>Jak wspomniano w tekście: wycieraczka zadaniowa https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666</td></tr><tr><td>Laboratoryjna folia do owijania Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td>Jak określono w tekście: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412</td></tr><tr><td>Szalka Petriego (35 mm x 10 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875711YZ</td><td>Jak wspomniano w tekście: mała szalka Petriego https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true</td></tr><tr><td>szalka Petriego (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713A</td><td>Jak wspomniano w tekście: duża szalka Petriego https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Roboz</td><td>NC9411473</td><td>Jak określono w tekście: nożyczki https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& searchType=SZYBKI& dopasowanyNr kat.=RS-5915SC<</td></tr><tr><td>strong>Laser/mikroskop</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>650/60 nm jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine</td><td>Semrock</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Filtr CARS - drgania CH2 (filtr 645nm/60nm)</td></tr><tr><td>Skrzynka kontrolna IX2-UCB</td><td>Olympus</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Skrzynka kontrolna</td></tr><tr><td>D700/30m</td><td>Chroma</td><td></td><td>Jak wspomniano w tekście: Filtr CARS - pasmo deuterowane https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m</td></tr><tr><td>DeepSee Insight</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Jak wspomniano w tekście: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser</td></tr><tr><td>Cyfrowa ręczna konsola do pomiaru mocy optycznej i energii</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>Jak określono w tekście: miernik mocy https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>Fluoview Software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Oprogramowanie do sterowania</td></tr><tr><td>mikroskopem Matowe szkiełka mikroskopowe</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Szkiełka mikroskopowe https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446</td></tr><tr><td>FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Jak wspomniano w tekście:</td></tr><tr><td>Mikroskopowa komora inkubacyjna</td><td>Tokai Hit</td><td>GM-800</td><td>Jak wspomniano w tekście: komora inkubacyjna</td></tr><tr><td>Integrująca sferyczna fotodioda Czujnik mocy</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Jak wspomniano w tekście: fotodioda https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>Zasilacz FV31-PSU</td><td>Olympus</td><td></td><td>Jak wspomniano w tekście: Power Supply</td></tr><tr><td>Precision 4063, 80MHz Dwukanałowy generator funkcyjny</td><td>BK Precision</td><td></td><td>Jak określono w tekście: generator funkcji</td></tr><tr><td>ProScan &ndash; Automatyka mikroskopu precyzyjnego</td><td>Wcześniejsze instrumenty</td><td></td> naukowe <td>Jak określono w tekście: kontroler stopnia https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation</td></tr><tr><td>Dystanse obrazowania SecureSeal</td><td>Grace Biolabs</td><td>654004</td><td>Jak określono w tekście: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/</td></tr><tr><td>Zestaw detekcyjny SRS</td><td>APE</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Detektor SRS</td></tr><tr><td>UPLSAPO 20X NA:0,75</td><td>Olympus</td><td></td><td>Jak wspomniano w tekście: 20X Obiektyw https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/</td></tr><tr><td><silny>Lipid/Obrazowanie leków</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Talerz 35 mm, nr 0 Niepowlekane szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 14 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>NC9711297</td><td>Jak wspomniano w tekście: Naczynie ze szklanym dnem https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Aplikator z bawełnianą końcówką</td></tr><tr><td>Distriman Pipeta do dodatniego przemieszczenia</td><td>Gilson</td><td></td><td>Jak odniesiono się w tekście: Pipeta z przemieszczeniem dodatnim https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z dodatnim przemieszczeniem Distriman</td><td>Gilson</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Końcówki do pipety https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true</td></tr><tr><td>Analiza danych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open-source</td><td></td><td>Jak określono w tekście: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>Jupyter-Lab</td><td>open-source</td><td></td><td>Jak określono w tekście: JupyterLab https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>Open-source</td><td></td><td>Jak określono w tekście: Rstudio https://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem ramana

Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging

Farmakokinetyka skórna (cPK) po zastosowaniu preparatu miejscowego była obszarem badawczym szczególnie interesującym dla naukowców zajmujących się regulacjami i rozwojem leków, aby mechanistycznie zrozumieć miejscową biodostępność (BA). Techniki półinwazyjne, takie jak usuwanie taśmy, mikrodializa skórna lub mikroperfuzja skórna z otwartym przepływem, określają ilościowo cPK w makroskali. Chociaż techniki te dostarczyły ogromnej wiedzy na temat cPK, społeczność nie ma mechanistycznego zrozumienia penetracji i przenikania aktywnych składników farmaceutycznych (API) na poziomie komórkowym. 
Jednym z nieinwazyjnych podejść do rozwiązania problemu cPK w mikroskali jest koherentne obrazowanie rozpraszania Ramana (CRI), które selektywnie celuje w wewnętrzne drgania molekularne bez potrzeby stosowania zewnętrznych etykiet lub modyfikacji chemicznej. CRI ma dwie główne metody - koherentne rozpraszanie Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) i wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS) - które umożliwiają czułą i selektywną kwantyfikację API lub składników nieaktywnych. CARS jest zwykle wykorzystywany do uzyskiwania informacji strukturalnych skóry lub wizualizacji kontrastu chemicznego. Natomiast sygnał SRS, który jest liniowy ze stężeniem molekularnym, jest używany do ilościowego oznaczania API lub składników nieaktywnych w stratyfikacjach skóry. 
Chociaż tkanka myszy była powszechnie stosowana do cPK z CRI, miejscowe BA i biorównoważność (BE) muszą ostatecznie zostać ocenione w tkance ludzkiej przed zatwierdzeniem przez organy regulacyjne. W artykule przedstawiono metodologię przygotowania i obrazowania skóry ex vivo do wykorzystania w ilościowych badaniach farmakokinetycznych CRI w ocenie miejscowych BA i BE. Metodologia ta umożliwia wiarygodną i powtarzalną ocenę ilościową API w skórze człowieka i myszy w czasie. Stężenia w przedziałach bogatych i ubogich w lipidy, a także całkowite stężenie API w czasie są określane ilościowo; są one wykorzystywane do oszacowań BA w mikro- i makroskali oraz, potencjalnie, BE.

Obrazowanie uważa się za udane, jeśli tkanka nie przesunęła się znacząco ani w kierunku osiowym (&lt;10 μm), ani bocznym po zakończeniu eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Jest to natychmiastowa wskazówka, jeśli pomiar SRS dla substancji czynnej będącej przedmiotem zainteresowania nie jest reprezentatywny dla głębokości początkowej, dla której kwantyfikacja jest specyficzna dla warstwy. Jest to łagodzone przez obrazowanie stosów z dla każdej interesującej pozycji XY, przy czym kompromisem jest rozdzielczość cza...

Opisana jest spójna metodologia obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowego oznaczania związków farmaceutycznych w skórze. W artykule opisano przygotowanie tkanki skórnej (ludzkiej i mysiej) i miejscowe stosowanie preparatów, akwizycję obrazu w celu ilościowego określenia czasoprzestrzennych profili stężeń oraz wstępną analizę farmakokinetyczną w celu oceny miejscowego dostarczania leków.

Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana

Cutaneous pharmacokinetics (cPK) after topical formulation application has been a research area of particular interest for regulatory and drug development ...

Metodologia ta jest istotna, ponieważ pozwala na powtarzalne i dokładne określenie ilościowe produktów leczniczych stosowanych miejscowo przy użyciu spójnego obrazowania ramanowskiego. Inne metodologie dostarczają obszernych informacji farmakokinetycznych dotyczących skóry, podczas gdy ta metodologia może dostarczyć zarówno zbiorczych, jak i mikroskalowych informacji farmakokinetycznych skóry, takich jak droga przenikania leku. Wizualizacja i kwantyfikacja oraz ścieżki przenikania pozwolą na opracowanie produktów leczniczych z myślą o określonej ścieżce dotarcia do miejsca docelowego.Przygotowanie tkanek okaże się najtrudniejszą częścią tej metodologii. Tkanka powinna być na tyle cienka, aby można było czytać przez skórę. Aby rozpocząć przygotowanie tkanki skórnej ucha nagiej myszy, należy pozyskać uśpione nagie myszy i usunąć uszy myszy za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych.Następnie umieść jedno ucho na dużej szalce Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 15 milimetrów. Następnie dwukrotnie przepłucz ucho myszy PBS i za każdym razem osusz ucho wycieraczką zadaniową. Jeśli zostanie zużyty w ciągu 24 godzin, umieść ucho w PBS na małej szalce Petriego o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.Aby użyć po 24 godzinach od zbioru, umieść kłos na szalce Petriego bez PBS, a następnie przykryj naczynie parafilmem i przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pracując pod kapturem biologicznym, umieść ludzką tkankę skórną na dużej szalce Petriego stroną z warstwą rogową skierowaną w dół, tak aby podskórna tkanka tłuszczowa była dostępna. Następnie za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych usuń podskórną tkankę tłuszczową.Gdy tłuszczu podskórnego nie można już usunąć nożyczkami, użyj jednorazowego skalpela z 10 ostrzami pod kątem 45 stopni do skóry, aby usunąć pozostały tłuszcz podskórny, przytrzymując skórę nadal kleszczami. Po usunięciu tłuszczu pokrój ludzką skórę na kawałki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. W przypadku obrazowania lipidowego umieść przednią część ucha myszy skierowaną w stronę szklanego dna 35-milimetrowej naczynia o numerze zero.W przypadku skóry ludzkiej należy umieścić skórę warstwą rogową naskórka skierowaną w dół, aby umożliwić ilościowe określenie leku od powierzchownych do głębszych warstw. Po wyśrodkowaniu chusteczki na szklanym dnie użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby upewnić się, że skóra jest płaska i ma pełny kontakt z powierzchnią szkiełka nakrywkowego naczynia ze szklanym dnem. Aby zapobiec jakiemukolwiek ruchowi podczas obrazowania, umieść podkładkę na skórze i upewnij się, że tkanka jest widoczna przez środkowy otwór myjki w celu wykrycia wymuszonego rozpraszania Ramana lub transmisji SRS.Odpipetuj ustaloną wcześniej dawkę preparatu na skórę, a następnie użyj palca w rękawiczce, aby pocierać preparat zgodnie z ruchem wskazówek zegara przez 30 sekund. Po upływie wyznaczonego czasu na przenikanie preparatu, należy usunąć nadmiar preparatu przed umieszczeniem skórki stroną z preparatem skierowaną w stronę naczynia ze szklanym dnem. Następnie przejdź do konfiguracji eksperymentalnej, włączając oprogramowanie Microscope Control lub MC.Patrząc przez okular, wyreguluj ostrość osiową za pomocą pokrętła regulacyjnego, aby upewnić się, że tkanka jest w ostrości. Po zakończeniu odblokuj zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa i upewnij się, że kanały ALG1 i ALG2 są włączone. Upewnij się, że fotodioda SRS znajduje się nad kondensatorem, a następnie kliknij Focus x2 w oprogramowaniu MC, aby wyświetlić powłokę w kanałach CARS i SRS.W module Multi-Area Time Lapse lub MATL przejdź do zakładki View i kliknij na Registered Point List (Lista zarejestrowanych punktów), aby pojawiła się lista obrazowań. Po zidentyfikowaniu warstwy rogowej naskórka przewiń przez ognisko osiowe lub ognisko Z, aby zidentyfikować określone stratyfikacje tkanek. W obrębie skóry można dodać określone głębokości, takie jak warstwa rogowa naskórka, gruczoły łojowe, adipocyty lub tłuszcz podskórny, jak określono podczas obrazowania na żywo z kontrastem dostrojonym do lipidów.Jeśli jednak mają być wykonane całe stosy głębokości, można dodać pozycje XY, a względną pozycję Z można zignorować. W przypadku obrazowania określonej głębokości dla każdej stratyfikacji skóry należy wybrać Punkt Rejestru, aby dodać go do kolejki MATL. W przypadku stosów o pełnej głębokości kliknij przycisk Zarejestruj punkt dla każdej pozycji XY z wyborem głębokości w oknie Parametry akwizycji.Następnie ustaw liczbę powtórzeń na jeden w module MATL i kliknij Gotowy. Gdy strzałka odtwarzania zmieni kolor z szarego na, naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć obrazowanie wstępnego stosu lipidów. Po zakończeniu cyklu obrazowania zablokuj zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa i zmień długość fali w graficznym interfejsie użytkownika lasera na żądaną długość fali w oparciu o docelową liczbę fali lub drgania Ramana.Dostosuj ręczny etap opóźnienia czasowego, upewniając się, że te same uprawnienia są używane do obrazowania lipidów i aktywnych składników farmaceutycznych lub API, które są ustalane a priori. Po wybraniu całkowitej liczby powtórzeń cyklu odblokuj belkę pompy i sprawdź, czy moc odpowiada żądanej mocy za pomocą fotodiody przed naciśnięciem przycisku Play, aby rozpocząć automatyczne obrazowanie nastaw. Następnie przeprowadź analizę danych dla każdej stratyfikacji skóry, importując obraz lipidów gruczołów łojowych na Fidżi i zaznaczając pole oznaczone Podziel kanały, aby podzielić plik na kanały CARS i SRS.Aby otworzyć Region zainteresowania lub Menedżera ROI, kliknij Analizuj, Narzędzia i Menedżer ROI. Używając kanału SRS w taki sposób, aby C było równe jeden, usuń znacznik gruczołu łojowego na obrazie i dodaj oznaczenia do menedżera ROI, klikając Dodaj T w menedżerze ROI. Powtórz ten proces dla każdego gruczołu łojowego na obrazie.Aby zamaskować regiony bogate w lipidy, wybierz każdy ROI, a następnie kliknij karty Więcej, LUB Połącz i Dodaj. Aby zamaskować obszary ubogie w lipidy, użyj narzędzia Prostokąt w menu Fidżi i narysuj kwadrat wokół całego obrazu. Dodaj region do Menedżera ROI.Kliknij nowo dodany kwadratowy zwrot z inwestycji oprócz zwrotu z inwestycji, który wybiera wszystkie regiony bogate w lipidy w Menedżerze ROI. W obszarze Więcej wybierz opcję XOR, aby wygenerować maskę regionów ubogich w lipidy i dodać ją do Menedżera ROI. Połącz obrazy w kolejności numerycznej, przechodząc do Obraz, Stosy, Narzędzia i połącz karty w kolejności.Możesz też zaimportować obrazy, ładując jeden na Fidżi, a następnie wybierając opcję o nazwie Grupuj pliki o podobnych nazwach na stronie konfiguracji. Gdy połączony obraz jest aktywny, przejdź do Menedżera ROI, aby wybrać regiony bogate w lipidy i kliknij kartę Więcej przed wybraniem opcji Multi Measure, a następnie poczekaj, aż pojawi się okno Wyniki. W oknie Wyniki wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i dodaj kolumnę zatytułowaną Region, aby dodać regiony bogate w lipidy do każdego wiersza danych.Dodaj ubogie lipidy do regionów, które znajdowały się poza lipidami. Aby zwizualizować dane, zapisz i zaimportuj arkusz kalkulacyjny do pakietu R, ggplot2. Następnie wykreśl dane jako funkcję liczby obrazu w funkcji średniej intensywności, aby oszacować dane dotyczące stężenia-czasu.Uruchom analizę nieprzedziałową lub NCA w programie RStudio na danych czasu intensywności zaimportowanych z arkusza kalkulacyjnego z wywołaniem jednej warstwy. Po zakończeniu wykreśl i wizualnie porównaj wskaźniki Jmax i AUCflux-all. Dodatkowo przeprowadzaj porównania statystyczne w różnych warunkach eksperymentalnych.Reprezentatywna analiza przedstawia warstwę rogową naskórka, gruczoły łojowe, adipocyty, podskórną tkankę tłuszczową z nagiej skóry uszu myszy oraz warstwę rogową naskórka, brodawkowatą skórę właściwą i gruczoł łojowy ze skóry ludzkiej. W nagiej skórze uszu myszy zaobserwowano ograniczony ruch tkanek gruczołów łojowych przy tej samej głębokości tkanki gruczołów w momencie aplikacji preparatu i 120 minut po aplikacji. Znaczny ruch tkanek w skórze wykazał ledwo widoczne gruczoły łojowe po 120 minutach od podania leku, co świadczy o nieskuteczności oryginalnego protokołu.W kilku badaniach profile intensywności w funkcji czasu wykazały wysokie stężenia początkowe, po których następowały stężenia malejące, co wskazuje na brak dalszego wchłaniania leku do tkanki. Z drugiej strony, niektóre badania wykazały wzrost intensywności, która później zmniejszyła się w czasie trwania eksperymentu, co pokazuje, że strumień do tkanki nie osiągnął maksimum przed obrazowaniem. Przeprowadzona przez NCA analiza profili stężenie-czas dwóch preparatów dla tego samego API wykazała, że etoksyetoksyetanol zapewnia rozszerzoną przenikalność API w porównaniu z preparatem żelowym, niezależnie od warstwy skóry.Analiza całkowitej ekspozycji między tymi samymi preparatami wykazała podobne obserwacje w głębszych warstwach skóry. Przygotowanie ludzkiej skóry i właściwe ułożenie skóry na szklanym dnie naczynia po zastosowaniu leku mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Przejrzyste rozwiązania w tym zakresie wykazały przydatność tej metodologii.Dalsze badania będą obejmować preparaty wprowadzane do obrotu, takie jak kremy, aby zrozumieć, w jaki sposób preparat wpływa na penetrację i przenikanie API.

visualizing-quantifying-pharmaceutical-compounds-within-skin-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Mikroskopia CARS (Coherent anti-Stokes Raman scattering) jest połączona z wewnętrznym układem rozpuszczania przepływowego, aby umożliwić wizualizację in situ i w czasie rzeczywistym powierzchni tabletek farmaceutycznych ulegających rozkładowi. Korzystając z tej niestandardowej konfiguracji, możliwe jest skorelowanie filmów CARS z profilami rozpuszczania leków zarejestrowanymi za pomocą wbudowanej spektroskopii absorpcyjnej UV.

Koherentna mikroskopia rozpraszania Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) wizualizuje tabletki farmaceutyczne podczas rozpuszczania

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Tutaj prezentujemy protokół zbierania konfokalnych widm Ramana od ludzi w badaniach klinicznych w połączeniu z metodami chemometrycznymi do usuwania widmowych wartości odstających i późniejszej ekstrakcji kluczowych cech.

Rozpoznawanie wody, białek i lipidów z konfokalnych widm ramanowskich warstwy rogowej naskórka in vivo za pomocą podejścia chemometrycznego

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

To badanie przedstawia metodę korelacyjnego obrazowania leków w tkankach miękkich za pomocą nieliniowej spektroskopii optycznej i obrazowania spektrometrii mas. Połączenie obrazowania skóry w wysokiej rozdzielczości z czułym wykrywaniem leków stanowi cenne podejście do badania dystrybucji leków w skórze, co ma kluczowe znaczenie dla opracowania doskonałych produktów do stosowania miejscowego.

Korelacyjne metodologie obrazowania spektroskopii optycznej i spektrometrii mas w celu wizualizacji dystrybucji leku w skrawku tkanek miękkich

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Poznaj metodę obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana do wizualizacji i kwantyfikacji leków w skórze ludzkiej i mysiej. Technika ta umożliwia analizę farmakokinetyczną na poziomie makro i mikro.

Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana

Przeglądaj więcej filmów