Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana
24 listopada 2021
Opisana jest spójna metodologia obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowego oznaczania związków farmaceutycznych w skórze. W artykule opisano przygotowanie tkanki skórnej (ludzkiej i mysiej) i miejscowe stosowanie preparatów, akwizycję obrazu w celu ilościowego określenia czasoprzestrzennych profili stężeń oraz wstępną analizę farmakokinetyczną w celu oceny miejscowego dostarczania leków.
Metodologia ta jest istotna, ponieważ pozwala na powtarzalne i dokładne określenie ilościowe produktów leczniczych stosowanych miejscowo przy użyciu spójnego obrazowania ramanowskiego. Inne metodologie dostarczają obszernych informacji farmakokinetycznych dotyczących skóry, podczas gdy ta metodologia może dostarczyć zarówno zbiorczych, jak i mikroskalowych informacji farmakokinetycznych skóry, takich jak droga przenikania leku. Wizualizacja i kwantyfikacja oraz ścieżki przenikania pozwolą na opracowanie produktów leczniczych z myślą o określonej ścieżce dotarcia do miejsca docelowego.
Przygotowanie tkanek okaże się najtrudniejszą częścią tej metodologii. Tkanka powinna być na tyle cienka, aby można było czytać przez skórę. Aby rozpocząć przygotowanie tkanki skórnej ucha nagiej myszy, należy pozyskać uśpione nagie myszy i usunąć uszy myszy za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych.
Następnie umieść jedno ucho na dużej szalce Petriego o wymiarach 60 milimetrów na 15 milimetrów. Następnie dwukrotnie przepłucz ucho myszy PBS i za każdym razem osusz ucho wycieraczką zadaniową. Jeśli zostanie zużyty w ciągu 24 godzin, umieść ucho w PBS na małej szalce Petriego o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza.
Aby użyć po 24 godzinach od zbioru, umieść kłos na szalce Petriego bez PBS, a następnie przykryj naczynie parafilmem i przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pracując pod kapturem biologicznym, umieść ludzką tkankę skórną na dużej szalce Petriego stroną z warstwą rogową skierowaną w dół, tak aby podskórna tkanka tłuszczowa była dostępna. Następnie za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych usuń podskórną tkankę tłuszczową.
Gdy tłuszczu podskórnego nie można już usunąć nożyczkami, użyj jednorazowego skalpela z 10 ostrzami pod kątem 45 stopni do skóry, aby usunąć pozostały tłuszcz podskórny, przytrzymując skórę nadal kleszczami. Po usunięciu tłuszczu pokrój ludzką skórę na kawałki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr. W przypadku obrazowania lipidowego umieść przednią część ucha myszy skierowaną w stronę szklanego dna 35-milimetrowej naczynia o numerze zero.
W przypadku skóry ludzkiej należy umieścić skórę warstwą rogową naskórka skierowaną w dół, aby umożliwić ilościowe określenie leku od powierzchownych do głębszych warstw. Po wyśrodkowaniu chusteczki na szklanym dnie użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby upewnić się, że skóra jest płaska i ma pełny kontakt z powierzchnią szkiełka nakrywkowego naczynia ze szklanym dnem. Aby zapobiec jakiemukolwiek ruchowi podczas obrazowania, umieść podkładkę na skórze i upewnij się, że tkanka jest widoczna przez środkowy otwór myjki w celu wykrycia wymuszonego rozpraszania Ramana lub transmisji SRS.
Odpipetuj ustaloną wcześniej dawkę preparatu na skórę, a następnie użyj palca w rękawiczce, aby pocierać preparat zgodnie z ruchem wskazówek zegara przez 30 sekund. Po upływie wyznaczonego czasu na przenikanie preparatu, należy usunąć nadmiar preparatu przed umieszczeniem skórki stroną z preparatem skierowaną w stronę naczynia ze szklanym dnem. Następnie przejdź do konfiguracji eksperymentalnej, włączając oprogramowanie Microscope Control lub MC.
Patrząc przez okular, wyreguluj ostrość osiową za pomocą pokrętła regulacyjnego, aby upewnić się, że tkanka jest w ostrości. Po zakończeniu odblokuj zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa i upewnij się, że kanały ALG1 i ALG2 są włączone. Upewnij się, że fotodioda SRS znajduje się nad kondensatorem, a następnie kliknij Focus x2 w oprogramowaniu MC, aby wyświetlić powłokę w kanałach CARS i SRS.
W module Multi-Area Time Lapse lub MATL przejdź do zakładki View i kliknij na Registered Point List (Lista zarejestrowanych punktów), aby pojawiła się lista obrazowań. Po zidentyfikowaniu warstwy rogowej naskórka przewiń przez ognisko osiowe lub ognisko Z, aby zidentyfikować określone stratyfikacje tkanek. W obrębie skóry można dodać określone głębokości, takie jak warstwa rogowa naskórka, gruczoły łojowe, adipocyty lub tłuszcz podskórny, jak określono podczas obrazowania na żywo z kontrastem dostrojonym do lipidów.
Jeśli jednak mają być wykonane całe stosy głębokości, można dodać pozycje XY, a względną pozycję Z można zignorować. W przypadku obrazowania określonej głębokości dla każdej stratyfikacji skóry należy wybrać Punkt Rejestru, aby dodać go do kolejki MATL. W przypadku stosów o pełnej głębokości kliknij przycisk Zarejestruj punkt dla każdej pozycji XY z wyborem głębokości w oknie Parametry akwizycji.
Następnie ustaw liczbę powtórzeń na jeden w module MATL i kliknij Gotowy. Gdy strzałka odtwarzania zmieni kolor z szarego na, naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć obrazowanie wstępnego stosu lipidów. Po zakończeniu cyklu obrazowania zablokuj zarówno pompę, jak i wiązki Stokesa i zmień długość fali w graficznym interfejsie użytkownika lasera na żądaną długość fali w oparciu o docelową liczbę fali lub drgania Ramana.
Dostosuj ręczny etap opóźnienia czasowego, upewniając się, że te same uprawnienia są używane do obrazowania lipidów i aktywnych składników farmaceutycznych lub API, które są ustalane a priori. Po wybraniu całkowitej liczby powtórzeń cyklu odblokuj belkę pompy i sprawdź, czy moc odpowiada żądanej mocy za pomocą fotodiody przed naciśnięciem przycisku Play, aby rozpocząć automatyczne obrazowanie nastaw. Następnie przeprowadź analizę danych dla każdej stratyfikacji skóry, importując obraz lipidów gruczołów łojowych na Fidżi i zaznaczając pole oznaczone Podziel kanały, aby podzielić plik na kanały CARS i SRS.
Aby otworzyć Region zainteresowania lub Menedżera ROI, kliknij Analizuj, Narzędzia i Menedżer ROI. Używając kanału SRS w taki sposób, aby C było równe jeden, usuń znacznik gruczołu łojowego na obrazie i dodaj oznaczenia do menedżera ROI, klikając Dodaj T w menedżerze ROI. Powtórz ten proces dla każdego gruczołu łojowego na obrazie.
Aby zamaskować regiony bogate w lipidy, wybierz każdy ROI, a następnie kliknij karty Więcej, LUB Połącz i Dodaj. Aby zamaskować obszary ubogie w lipidy, użyj narzędzia Prostokąt w menu Fidżi i narysuj kwadrat wokół całego obrazu. Dodaj region do Menedżera ROI.
Kliknij nowo dodany kwadratowy zwrot z inwestycji oprócz zwrotu z inwestycji, który wybiera wszystkie regiony bogate w lipidy w Menedżerze ROI. W obszarze Więcej wybierz opcję XOR, aby wygenerować maskę regionów ubogich w lipidy i dodać ją do Menedżera ROI. Połącz obrazy w kolejności numerycznej, przechodząc do Obraz, Stosy, Narzędzia i połącz karty w kolejności.
Możesz też zaimportować obrazy, ładując jeden na Fidżi, a następnie wybierając opcję o nazwie Grupuj pliki o podobnych nazwach na stronie konfiguracji. Gdy połączony obraz jest aktywny, przejdź do Menedżera ROI, aby wybrać regiony bogate w lipidy i kliknij kartę Więcej przed wybraniem opcji Multi Measure, a następnie poczekaj, aż pojawi się okno Wyniki. W oknie Wyniki wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i dodaj kolumnę zatytułowaną Region, aby dodać regiony bogate w lipidy do każdego wiersza danych.
Dodaj ubogie lipidy do regionów, które znajdowały się poza lipidami. Aby zwizualizować dane, zapisz i zaimportuj arkusz kalkulacyjny do pakietu R, ggplot2. Następnie wykreśl dane jako funkcję liczby obrazu w funkcji średniej intensywności, aby oszacować dane dotyczące stężenia-czasu.
Uruchom analizę nieprzedziałową lub NCA w programie RStudio na danych czasu intensywności zaimportowanych z arkusza kalkulacyjnego z wywołaniem jednej warstwy. Po zakończeniu wykreśl i wizualnie porównaj wskaźniki Jmax i AUCflux-all. Dodatkowo przeprowadzaj porównania statystyczne w różnych warunkach eksperymentalnych.
Reprezentatywna analiza przedstawia warstwę rogową naskórka, gruczoły łojowe, adipocyty, podskórną tkankę tłuszczową z nagiej skóry uszu myszy oraz warstwę rogową naskórka, brodawkowatą skórę właściwą i gruczoł łojowy ze skóry ludzkiej. W nagiej skórze uszu myszy zaobserwowano ograniczony ruch tkanek gruczołów łojowych przy tej samej głębokości tkanki gruczołów w momencie aplikacji preparatu i 120 minut po aplikacji. Znaczny ruch tkanek w skórze wykazał ledwo widoczne gruczoły łojowe po 120 minutach od podania leku, co świadczy o nieskuteczności oryginalnego protokołu.
W kilku badaniach profile intensywności w funkcji czasu wykazały wysokie stężenia początkowe, po których następowały stężenia malejące, co wskazuje na brak dalszego wchłaniania leku do tkanki. Z drugiej strony, niektóre badania wykazały wzrost intensywności, która później zmniejszyła się w czasie trwania eksperymentu, co pokazuje, że strumień do tkanki nie osiągnął maksimum przed obrazowaniem. Przeprowadzona przez NCA analiza profili stężenie-czas dwóch preparatów dla tego samego API wykazała, że etoksyetoksyetanol zapewnia rozszerzoną przenikalność API w porównaniu z preparatem żelowym, niezależnie od warstwy skóry.
Analiza całkowitej ekspozycji między tymi samymi preparatami wykazała podobne obserwacje w głębszych warstwach skóry. Przygotowanie ludzkiej skóry i właściwe ułożenie skóry na szklanym dnie naczynia po zastosowaniu leku mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Przejrzyste rozwiązania w tym zakresie wykazały przydatność tej metodologii.
Dalsze badania będą obejmować preparaty wprowadzane do obrotu, takie jak kremy, aby zrozumieć, w jaki sposób preparat wpływa na penetrację i przenikanie API.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia spójną metodę obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowej oceny związków farmaceutycznych w skórze. Zawiera szczegółowe informacje o przygotowaniu tkanki skórnej i stosowaniu preparatów zewnętrznych, a także metody pozyskiwania obrazów i analizy farmakokinetycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nauki farmaceutyczne
- Dermatologia
- Techniki obrazowania
Tło
- Koherentne obrazowanie Ramana zapewnia nowatorskie podejście do badania dostarczania leków do skóry.
- Tradycyjne metody często dają dane farmakokinetyczne w skali makro.
- Ta metodyka pozwala na analizę zarówno w skali makro, jak i mikro.
- Zrozumienie szlaków przenikania jest kluczowe dla ukierunkowanego dostarczania leków.
Cel badania
- Opracowanie reprodukowalnej metody ilościowej oceny zewnętrznie stosowanych leków.
- Wizualizacja szlaków przenikania leków w tkankach skóry.
- Ulepszenie projektowania produktów leczniczych dla określonych miejsc docelowych.
Stosowane metody
- Przygotowanie tkanki skóry ludzkiej i mysiej.
- Stosowanie preparatów zewnętrznych.
- Pozyskiwanie obrazów do profilowania stężeń przestrzenno-czasowych.
- Wstępna analiza farmakokinetyczna dostarczania leków.
Główne wyniki
- Metodyka pozwala na dokładną ilościową ocenę produktów leczniczych.
- Dostarcza informacji na temat szlaków przenikania leków.
- Przygotowanie tkanki jest uznane za krytyczne wyzwanie.
- Wizualizacja szlaków przenikania leków pomaga w ukierunkowanym opracowaniu leków.
Wnioski
- Koherentne obrazowanie Ramana jest obiecującym narzędziem do badań farmakokinetyki skóry.
- To podejście może poprawić skuteczność zewnętrznych preparatów leczniczych.
- Przyszłe badania mogą skupić się na udoskonaleniu technik przygotowywania tkanek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Coherent Raman scattering imaging enables microscale quantification of active pharmaceutical ingredients in skin, addressing a critical gap in topical bioavailability assessment. This approach provides mechanistic insights into permeation pathways and compartment-specific drug distribution, supporting rational formulation design and go/no-go decisions in early development. By delivering both bulk and spatial pharmacokinetic data, it enhances predictive confidence in topical bioequivalence evaluations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing API localization within skin stratifications such as stratum corneum and sebaceous glands.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of permeation routes and retention in lipid-rich versus lipid-poor compartments.
- Predictive Value: Quantifies time-dependent concentration profiles to inform pharmacokinetic modeling and prioritize formulations with sustained flux.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, label-free concentration maps of APIs across skin layers, enabling mechanistic screening of formulation effects.
- Operational Value: Delivers reproducible spatiotemporal data through standardized tissue preparation and imaging protocols, reducing variability in comparative studies.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across human and mouse skin models, supporting cross-species extrapolation in preclinical evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical workflows by providing human-relevant microscale pharmacokinetic data essential for bioequivalence assessment.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed flux limitations stem from formulation properties or tissue barriers, informing mitigation strategies.
- Predictive Confidence: Enables estimation of micro- and macroscale bioavailability from compartment-specific accumulation, improving dose prediction accuracy.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for topical and dermal delivery programs requiring mechanistic permeability insights.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by mapping API distribution across anatomical structures like sebaceous glands and adipocytes, enabling target-site alignment.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via SRS signal linearity with concentration, allowing direct comparison of formulation performance across time points.
- Analytics: Enables non-compartmental analysis of intensity-time profiles to derive Jmax and AUCflux metrics, supporting statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through human skin applicability, ensuring relevance to regulatory bioavailability and bioequivalence studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, label-free imaging capability applicable across multiple APIs and formulations, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement by quantifying API accumulation in therapeutically relevant skin compartments.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue mounting, immobilization, and sequential imaging workflows minimizing artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying formulations with sustained permeation, reducing late-stage failure due to inadequate bioavailability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on mechanistic permeability data, optimizing capital allocation in topical development programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in coherent Raman imaging, tissue handling, and pharmacokinetic analysis to ensure accurate data interpretation.
- Demands laser scanning microscopy with tunable wavelength and photodiode detection for SRS, along with environmental control for tissue viability.
- Necessitates cross-team standardization of tissue preparation, mounting, and ROI definition to maintain consistency across sites and studies.
- Involves adaptation considerations for varying skin thickness, lipid content, and appendage density between species and anatomical sites.
- Includes practical limitations such as the need for thin tissue sections and potential signal interference from endogenous lipids or melanin.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of Nude Mouse Ear Skin Tissue
1:46
Preparation of Human Skin Tissue
2:26
Lipid Imaging and Application of Topical Formulation
3:11
Experimental Setup for Drug Quantification and Data Analysis
8:53
Results: Analysis of the Skin for Tissue Movement and Concentration of Drug at Different Timepoints
10:28
Conclusion
